C21-孕甾烷及其衍生物在抗植物病毒中的应用
阅读说明：本技术 C21-孕甾烷及其衍生物在抗植物病毒中的应用 (Application of C21-pregnane and derivatives thereof in resisting plant viruses ) 是由 叶健 郝小江 李玉林 孙艳伟 赵平芝 黄烈军 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供C21-孕甾烷及其衍生物在抗植物病毒中的应用。所述植物病毒包括DNA和RNA病毒,DNA病毒毒具体可为双生病毒科病毒,所述双生病毒科病毒为菜豆金黄色花叶病毒属病毒Begomovirus,亦为粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminiviruses,WTG),包括单组分病毒(如番茄黄化曲叶病毒)和双组分病毒(如木薯花叶病毒(SiriLa-cassava mosaic virus,SLCMV))。通过接种双组份的双生病毒SLCMV-HN7,发现相对于DMSO对照,GSX3预处理过的植物病症明显减缓,说明GSX3对双生病毒的抗性具有广谱性。(The invention provides application of C21-pregnane and derivatives thereof in resisting plant viruses. The plant virus includes DNA and RNA viruses, and the DNA virus can be particularly geminiviridae virus which is Begomovirus of bean golden mosaic virus, and is also white-transmitted geminivirus (WTG), and comprises single-component virus (such as tomato yellow leaf curl virus) and double-component virus (such as cassava mosaic virus (SLCMV)). By inoculating the double-component geminivirus SLCMV-HN7, the disease of the plant pretreated by the GSX3 is obviously slowed compared with a DMSO control, which indicates that the GSX3 has broad spectrum of resistance to the geminivirus.)
技术领域
本发明属于新农药创制领域，具体涉及C21-孕甾烷及其衍生物在抗植物病毒中的应用。
背景技术
植物病虫害是农业生产中限制农作物优质稳产的主要因素，而植物病毒病素有“作物癌症”之称。由于缺乏有效的抗病毒病种质资源和防治方法，作物病毒病害每年对农作物生产造成的经济损失多达1000多亿美元。植物病毒种类繁多，全球目前已报道植物病毒约1480种，而由媒介昆虫传播的病毒约占植物病毒的三分之一。随着全球气候变暖，国际农产品贸易日趋频繁，双生病毒及其传播介体烟粉虱在最近20年间由局部发生的小病害衍变成目前全球性的最重要的植物病毒病害之一，造成的危害呈逐年加重趋势，并在全球多种作物上造成毁灭性危害，对农业生产构成严重的威胁。
菜豆金黄色花叶病毒属病毒(Begomovirus)是种类最多、危害农作物最为严重的一类双生病毒科病毒。根据其DNA基因组结构可以分为单组分病毒和双组分病毒。双组分病毒含有两条DNA分子，即DNA A和DNA B例如木薯花叶病毒(Cassava mosaic virus，CMV)。单组分病毒如番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV)，其基因组结构只有DNA A。菜豆金黄色花叶病毒属病毒Begomovirus只能通过烟粉虱(Bemisia tabaci(Gennadius))以持久、可循回的方式传播而扩散，因而也称粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminiviruses，WTG)。WTG不仅能直接造成危害，而且还促进介体昆虫的发生与爆发造成的危害。20世纪70年代，由于双生病毒的寄主范围窄且病毒发生范围较小，并未引起科学家们的广泛关注。在烟粉虱和双生病毒的长期共进化中，病毒可以通过调控烟粉虱和寄主植物的特性而促进其自身的传播。周雪平、刘树生等研究发现B型烟粉虱取食带有双生病毒的植物后，其繁殖能力就异乎寻常的强。随着B型烟粉虱的大暴发，由烟粉虱传播的双生病毒已在多个国家和地区作物上造成毁灭性危害，且有逐年加重的趋势。如20世纪90年代以来随着外来烟粉虱在我国境内的大范围入侵，WTG也随之蔓延至多个省区，目前已在18个省市自治区多个番茄产区爆发，2009年经济损失超过50亿，2010～2012年危害进一步扩大，年发生面积超过100万亩，已经成为我国番茄生产的一个重要制约因素。
水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)，白纤病毒科纤细病毒属病毒。此病毒仅依靠媒介介体昆虫灰飞虱传染，RSV一旦感染灰飞虱，则灰飞虱终生带毒并能持续传毒。被RSV感染病株常枯孕穗或穗小畸形不实。拔节后发病在剑叶下部出现黄绿色条纹，各类型稻均不枯心，但抽穗畸形，结实很少。严重制约着水稻的产量。
目前，生产上广泛应用的虫传病毒病害的防治措施是采用化学杀虫剂杀灭介体昆虫。然而，由于人们对化学药物的不合理使用和药物本身固有的缺点，致使化学农药在使用中产生了环境污染、人畜中毒、农药残留等问题，随着人们生活质量的提高和环保意识的增强，公众对限制化学杀虫剂的呼声越来越高。为了寻求有可能代替化学杀虫剂的新方法，人们把目光转向了安全、稳定、无污染、高效的天然药物。
C21-孕甾烷广泛应用于免疫功能调节、抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶、抗真菌等方面。
青阳参苷元(别名：青阳参甙元)，英文名(Qingyangshengenin)，本案例中简称为GSX3，CAS号(84745-94-8)，分子式(C28H36O8)，分子量(500.58064)，结构式如下：
发明内容
本发明的目的在于提供C21-孕甾烷及其衍生物的新用途。
本发明所提供的C21-孕甾烷及其衍生物的新用途，为：C21-孕甾烷及其衍生物在抗植物病毒中的应用。
所述应用中，C21-孕甾烷及其衍生物，其结构式如下所示：
所述植物病毒包括DNA病毒和RNA病毒，
所述DNA病毒具体可为双生病毒科病毒，所述双生病毒科病毒为菜豆金黄色花叶病毒属病毒Begomovirus，亦为粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminiviruses，WTG)，
所述双生病毒科病毒包括单组分病毒(如番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl virus，TYLCV))和双组分病毒(如木薯花叶病毒(Cassava mosaic virus，CMV))；
所述RNA病毒具体如水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)。
本发明还提供一种防治植物病毒毒害的方法。
本发明所提供的防治植物病毒毒害的方法，为：施用C21-孕甾烷及其衍生物来防治植物病毒毒害。
所述植物病毒毒害由植物病毒引起；
所述植物病毒包括DNA病毒和RNA病毒，
所述DNA病毒具体可为双生病毒科病毒，所述双生病毒科病毒为菜豆金黄色花叶病毒属病毒Begomovirus，亦为粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminiviruses，WTG)，
所述双生病毒科病毒包括单组分病毒(如番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl virus，TYLCV))和双组分病毒(如木薯花叶病毒(Cassava mosaic virus，CMV))；
所述RNA病毒具体如水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)。
本发明通过农杆菌注射法接种双生病毒，结合RT-qPCR测定感病植物的相对病毒滴度对植物来源的C21-孕甾烷类单体化合物及其衍生物进行了抗WTG活性的筛选，从中筛选出GSX3作为抗双生病毒的先导化合物。通过接种双组份的双生病毒 SLCMV-HN7，发现相对于DMSO对照，GSX3预处理过的植物病症明显减缓，说明 GSX3对双生病毒的抗性具有广谱性。
植物来源的抗病毒试剂GSX3具有环境友好，不易产生抗药性等优点。
附图说明
图1表明GSX3抗番茄黄化曲叶病毒活性；
图2表明GSX3抗木薯花叶病毒活性；
图3表明GSX3抗水稻条纹叶枯病毒活性；
图4表明GSX3及其衍生物抗番茄黄化曲叶病毒活性。
图5表明GSX3及其衍生物抗木薯花叶病毒活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的GSX2,GSX3,GSX4为从传统中药隔山消块茎中提取分离鉴定得到的单体化合物,具体操作见(Huang et al.,2015)中的化合物8,14,11。衍生物GSX3-10a,GSX3-12是以GSX3为原料合成的产物，具体合成路线见(Huang et al., 2016)中的化合物10c和10a。
[1]Huang L.J.,Wang B,Zhang J.X.,et al.Studies on cytotoxic pregnanesapogenins from Cynanchum wilfordii.Fitoterapia,2015,101:107-116.
[2]Huang L.J.,Wang B,Zhang J.X.,et al.Synthesis and evaluation ofantifungal activity of C21-steroidal derivatives.Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 2016, 26(8):2040-2043.
实施例1
选择含有4-6片真叶大小、生长良好的本生烟(Nicotiana benthamiana)；叶面喷施 0.5μM GSX3水溶液；处理6小时后，通过农杆菌注射法，将含有番茄黄化曲叶病毒质粒的农杆菌从叶背面注射入烟草中，溶剂DMSO为阴性对照。10天之后，称取0.1 g感病植物的系统叶样品，采用CTAB法提取DNA，然后采用TYLCV引物(见表1) 进行RT-qPCR测定感病植物的相对病毒滴度。图1表明GSX3抗番茄黄化曲叶病毒活性；由图1可知：相对于DMSO对照，GSX3预处理的植物，卷叶症状明显减缓(图 1A)，同时也表现在感病植物的相对病毒滴度上，有显著的降低(图1B)。说明GSX3 具有保护植物抗番茄黄化曲叶病毒活性的作用。
实施例2
选择含有4-6片真叶大小、生长良好的本生烟(Nicotiana benthamiana)；叶面喷施 0.5μM GSX3水溶液；处理6小时后，通过农杆菌注射法，将含有木薯花叶病毒质粒的农杆菌从叶背面注射入烟草中，溶剂DMSO为阴性对照，每个处理10棵植物，重复3次。10天之后，称取0.1g感病植物的系统叶样品，采用CTAB法提取DNA，然后采用SLCMV-HN7引物(见表1)进行RT-qPCR测定感病植物的相对病毒滴度。图 2表明GSX3抗木薯花叶病毒活性；由图2可知：相对于DMSO对照，GSX3预处理的植物，卷叶症状明显减缓(图2A)，qPCR结果也显示出GSX3预处理的植物，病毒积累量相较于DMSO对照有显著的降低(图2B)。说明GSX3具有保护植物抗木薯花叶病毒活性的作用。
实施例3
选择2周龄大小的水稻(Nipponbare)幼苗，叶面分别喷施0,0.1,1和10μM GSX3 水溶液，处理6小时后，采用塑料桶集团接种的方法，向水稻苗中释放携带RSV的 2-3龄灰飞虱(Laodelphax striatellus)，虫口密度为每棵植物10头感染RSV的灰飞虱， 3天后，将灰飞虱移除，再继续培养。移除灰飞虱两周后，拍照记录接种水稻的感病症状情况；同时，称取0.1g水稻样品，采用Trizol试剂盒法提取RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后采用RSV SP引物(见表1)进行RT-qPCR测定感病植物的相对病毒滴度。
图3表明GSX3抗水稻条纹叶枯病毒活性；由图3可知：RSV接种水稻幼苗两周后，阴性对照DMSO预处理的水稻植株新生植株心叶出现一定程度干枯，随着时间推移，叶尖处卷曲干枯逐渐向下蔓延，心叶枯死。而喷施了GSX3的植株，随着使用浓度的提高，新生叶片卷曲枯死的症状逐渐减缓，当浓度达到10μM时，新生叶片趋向于正常生长的Mock水稻(图3A)。RT-qPCR检测的结果也与症状表型一致(图3B)。以上结果说明GSX3具有抗水稻条纹叶枯病毒活性，且抗病毒活性呈浓度依赖性。
实施例4
参照实施例1的操作，对GSX3及其衍生物进行抗番茄黄化曲叶病毒活性试验，结果见图4。
实施例5
参照实施例2的操作，对GSX3及其衍生物进行抗木薯花叶病毒活性试验，结果见图5。
表1本发明中检测植物病毒滴度所用到的引物
引物 序列(5'-3') 目的 TYLCV-F TATGTTAGCTATTAAATATTTGC RT-qPCR TYLCV-R AGCACGGCTGCTGTATGGGC RT-qPCR SLCMV-HN7-F CACGATGTGGTCCATATAGGTAAG RT-qPCR SLCMV-HN7-R TACGATCCCTTACAAGGAAGAACA RT-qPCR Nb-EF1α-F TGGTGTCCTCAAGCCTGGTATGGTTG RT-qPCR Nb-EF1α-R ACGCTTGAGATCCTTAACCGCAACATTCTT RT-qPCR RSV-SP-q-F CTGCCTGAGACTGTTAGCGA RT-qPCR RSV-SP-q-R GTGTCAGTCTCCAAGGGGTG RT-qPCR OsActin2-F TGCTATGTACGTCGCCATCCAG RT-qPCR OsActin2-R AATGAGTAACCACGCTCCGTC RT-qPCR
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