具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

请参阅图1-3，本发明实施例提供一种生物样品中目标微小物质的分离方法，包括以下步骤：

a、提供表面修饰有特异性结合单元的捕获载体，所述表面修饰有特异性结合单元的捕获载体包括捕获载体11及所述捕获载体11表面修饰的特异性结合单元12；

b、将含有目标微小物质13的生物样品和所述表面修饰有特异性结合单元的捕获载体共孵育以使得目标微小物质13与所述特异性结合单元12特异性结合，得到含有捕获载体-目标微小物质复合体21的生物样品；

c、对所述含有捕获载体-目标微小物质复合体21的生物样品施加超声场15，使得所述捕获载体-目标微小物质复合体21沿所述超声场15方向运动，将所述捕获载体-目标微小物质复合体21从所述生物样品中分离出来。

本发明针对超声分离的特点进行设计，将对目标微小物质13的特异性识别与结合和超声场15力对生物样品中物质的非接触式操控有机结合，该方法利用超声场15利用体积分离物质的特点，将目标微小物质13特异性结合在捕获载体11上，实现目标微小物质13体积的扩大，从而解决了超声分离对于体积的限制，因此，即使再小的目标微小物质也能够利用该方法从生物样品中分离出来，利用超声场15自动化、集成化分离的灵活性能够实现与疾病相关的目标微小物质13的特异性分离、捕获、清洗和回收。这种方法可以广泛应用于在液体环境中对目标微小物质13的特异性分离和捕获，也可以用于进行样本制备与预处理，具有简单、快捷、高效的优点。在生物医学领域，这种方法有望从病患样本中高效提取疾病相关的目标微小物质并进行分析，为体外诊断、在体检测与疾病早期诊断和预后监测开辟新的路径。

本发明不仅可分离较大的物质，可分离的目标微小物质13的直径可低至 0.1nm到10μm。例如0.1nm、1nm、10nm、100nm、1μm、2μm、5μm、10 μm等。

本发明的所述目标微小物质13包括但不限于游离核酸、蛋白质、多肽、核苷酸、维生素、细胞外囊泡、病毒、细菌、真菌等中的至少一种。

本发明的所述生物样品包括但不限于全血、血清、血浆、细胞培养上清、精液、羊水、组织裂解液、尿液、脑脊液、泪液、汗液或唾液等。生物样品的组分由目标微小物质13和非目标微小物质14组成。非目标微小物质14指的是生物样品中不与捕获载体11结合的物质。

在一些实施例中，所述目标微小物质含有特定标志物，捕获载体11进行表面功能化修饰是针对目标微小物质13所含有的特定标志物进行选择，所述目标微小物质通过所述特定标志物与表面修饰有特异性结合单元的捕获载体11上的特异性结合单元12进行特异性识别并结合，目标微小物质13所含有的特定标志物是指目标微小物质13所特有的标志性生物化学分子、官能团。特定标志物包括且不限于蛋白质、核酸、肽、脂质等各种生物分子或者金属离子等。所述表面修饰有特异性结合单元的捕获载体11对于所述目标微小物质13会产生特异性吸附，所述特异性吸附包括且不限于抗原抗体的结合、受体与配体的结合、核酸序列的互补杂交、适配体与靶标的结合，以及各种化学键之间的结合。其中，适配体的靶标包括且不限于蛋白质、毒素、离子、肽、核苷酸、维生素、细菌、细胞、病毒、农药和过敏原等物质。

在一些实施例中，所述表面修饰有特异性结合单元的捕获载体11可通过物理吸附或共价键结合的方式将特异性结合单元12固定在捕获载体11上，可与目标微小物质13产生特异性吸附形成表面修饰有特异性结合单元的捕获载体- 目标微小物质复合体21。

在一些实施例中，步骤b中使得所述目标微小物质13与所述特异性结合单元12特异性结合的方式为静态混合或者动态混合。可通过机械扰动、流体运动、加热、超声振荡等方式实现动态混合。在一些实施例中，机械扰动实现所述动态混合的方式为在所述微流控芯片中设置能够形成动态的管道结构。优选的，所述能够形成动态混合的管道结构包括挡板状结构、高低起伏的管道和弯曲管道中的至少一种。

在不显著影响特异性结合单元12捕获微小物质13效率的前提下，特异性结合单元12可通过任意方式固定在捕获载体11上，例如，通过物理吸附方式或者共价键结合于捕获载体11上。

在一些实施方式中，所述捕获载体的表面修饰有一种或多种活性功能基团，所述活性功能基团包括-OH、-COOH、-NH₂、-CHO、以及-SO₃H中的一种或多种。在一些实施方式中，所述捕获分子通过物理吸附或直接化学缀合(例如通过桥接物进行桥接)与所述捕获载体缀合或结合。

所述物理吸附的方式包括且不限于通过静电力等分子间相互作用力将所述的特异性结合单元12固定在捕获载体11上。

桥接物可以选自化学偶联剂、蛋白、标记物-抗标记物复合物或适用于羧基和/或伯胺的交联剂中一种或多种；

所述蛋白可以选自牛血清白蛋白、卵白蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白、甲状腺球蛋白以及多聚赖氨酸中的至少一种。

所述适用于羧基和/或伯胺的交联剂选自二环己基碳二亚胺(DCC)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基苯并三氮唑(HOBt)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

“化学偶联剂”指能够与另一化学基团反应以形成共价键的基团，即在合适的反应条件下共价反应的基团。一般可以选则亲核基团、亲电子基团和光激活基团。示例性的化学偶联剂包括、但不局限于下列基团，烯烃、乙炔、醇、酸、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸盐/酯、异氰酸盐/酯、硫氰酸盐/酯、异硫氰酸盐/酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮、重盐、硝石(nitre)、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、硫酸、缩醛、缩酮、酐、硫酸盐/酯、次磺酸异腈、脒、二酰亚胺、亚氨酸盐/酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐/酯、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸盐/酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。化学偶联剂的反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。制备这些官能团中的每一种的方法在本领域中是公知的并且其出于特定目的的应用或改变在本领域技术人员的能力范围之内(参见，例如，Sandier和Karo，编辑，Organic Functional GroupPreparations.Academic Press，San Diego，1989)。

所述标记物-抗标记物复合物中标记物/抗标记物的组合选自生物素或其衍生物/链霉亲和素(streptavidin)，生物素或其衍生物/亲和素(avidin)，生物素或其衍生物/中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)，生物素或其衍生物/生物素或其衍生物抗体，半抗原/抗体，抗原/抗体，肽/抗体，受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素或多核苷酸/互补的多核苷酸；

其中生物素的衍生物为D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素及脱硫生物素中的任一种。

在一具体实施例中，通过物理吸附的方式将特异性结合单元12固定在捕获载体11上的步骤可以是：

1)在聚苯乙烯微球表面物理吸附生物素修饰的牛血清白蛋白(biotinylatedBSA)；

2)使链霉亲和素与生物素修饰的牛血清白蛋白反应，清洗；

3)生物素修饰的抗体与上述微球反应，反应条件为室温，15分钟；

4)离心取沉淀，离心参数为300g，5分钟；

5)加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬，再次离心，离心参数为300g，5分钟；

6)重复步骤(4)两次，离心取沉淀。

在一具体实施例中，通过共价键结合的方式将特异性结合单元12固定在捕获载体11上的步骤可以是：

7)在聚苯乙烯微球表面修饰-SH、-OH、-COOH等官能团，形成共价键固定链霉亲和素；

8)生物素修饰的适配体与上述微球反应，反应条件为室温，15分钟；

9)离心取沉淀，离心参数为300g，5分钟；

10)加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬，再次离心，离心参数为300g，5分钟；

重复步骤(9)两次，离心取沉淀。

当然，捕获载体11的表面功能化修饰方法不限于以上方法，常规的微球修饰方法只要能够将特异性结合单元12固定在捕获载体11上都可实现其目的，这里不再赘述。

所述捕获载体11的直径大于0.5μm，优选直径为0.5μm～500μm，具体可为0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、300μm、500μm，优选大于2μm。

在一些实施例中，所述捕获载体11的材质为聚苯乙烯、二氧化硅、乳胶、聚丙烯、聚丙烯酸酯及树脂中的任意一种。捕获载体11可以为磁珠或者非磁珠，即使为磁珠也并非利用磁珠的铁磁性实现本发明的技术方案。优选的，捕获载体11为球状或类球状，有利于在超声场15驱动下运动，也有利于表面功能化修饰。

表面修饰有特异性结合单元的捕获载体11可以被所述的超声场15力操纵，从而方便在溶液状态下进行目标微小物质13分离、捕获、清洗和回收等操作。捕获载体11的声学比对因子大于零，

声学比对因子的公式

其中，ρ_p与ρ_m分别为所述捕获载体与所述生物样品的密度，β_p与β_m分别为所述捕获载体与所述生物样品的压缩系数。

在一些实施方式中，所述捕获载体11有多种，不同种类的捕获载体11能够被超声场所区分。每种所述捕获载体11均修饰有不同的特异性结合单元12，以捕获不同的目标微小物质。因而，可实现在同一体系中实现多种目标组分的分离。

在一些实施例中，施加的所述超声场15的频率为20kHz～20MHz。受声场力作用捕获载体-目标微小物质复合体21向声场力方向运动，实现生物样品中捕获载体-目标微小物质复合体21的分离。该频率的超声场15会对生物样品本中的颗粒产生非接触式的作用以达到操控特定目标微小物质13及生物样品中其它组分的目的，其声场形式包括且不限于体超声、表面超声等；其声场包括且不限于谐振声场、沿特定方向传播的非谐振声场等，其中谐振声场包括且不限于驻点分布在一个平面的谐振声场、驻点分布为闭合区域的谐振声场等。在一些实施例中，所述超声场15选自纵波、横波、表面波和板波中的任意一种。超声场15对物质的操控，包括且不限于声场力直接作用改变物质的运动、形成驻点分布为闭合区域的超声谐振腔从而将物质固定于驻点等。所述驻点是指两个频率相同、幅值相同而相位不同的声波叠加产生的驻波16的波节或波腹，所述谐振声场是指形成驻波16的声场。

所述超声场15的来源包括但不限于将超声换能器附着于微流控芯片并以特定频率交流电信号驱动、在超声换能器基底上形成特定电极并以特定频率交流电信号激发、将两片或多片超声换能器平行或呈一定夹角置于微流控芯片管道侧面并以特定频率激发等形式。

在一些实施例中，施加超声场15的方式为将超声换能器结合在所述微流控芯片的特定位置并以交流电信号驱动形成超声场15，例如将超声换能器粘附在微流控芯片的外表面，如底部、侧部等。在一些实施例中，步骤c中没有与所述捕获载体11结合的生物样品组分所受声场力幅度与所述捕获载体11-目标微小物质复合体所受声场力幅度的比例范围为小于0.5:1，从而实现捕获载体11- 目标微小物质复合体与生物样品其它组分的分离。

在一些实施例中，步骤c包括：在所述超声场15的作用下，将缓冲液及所述含有捕获载体-目标微小物质复合体21的生物样品引入所述微流控芯片的反应室，所述捕获载体-目标微小物质复合体21与未结合在捕获载体上的生物样品 (非目标微小物质14)沿超声场的方向运动距离不同，实现所述捕获载体-目标微小物质复合体的分离。在一些实施例中，引入所述反应室的所述缓冲液与所述生物样品的流速比为(0.1～100):1。

步骤c可实现目标微小物质13的捕获，调节施加于步骤b获得的捕获载体- 目标微小物质复合体21的超声场15，当满足所述超声场15形成驻波16且驻点分布为闭合区域的条件时，捕获载体-目标微小物质复合体21在声场力的作用下向驻点运动并滞留在驻点区域，实现捕获载体-目标微小物质复合体21的捕获。例如，在一些实施例中，步骤c包括：向所述微流控芯片施加超声场15形成驻波16且驻点分布为闭合区域，使得捕获载体-目标微小物质复合体21向所述闭合区域运动并滞留在所述闭合区域。

步骤c可实现目标微小物质13的清洗，对滞留在闭合区域所捕获的捕获载体-目标微小物质复合体21，保持所施加的超声场15，使缓冲液流过捕获的捕获载体-目标微小物质复合体21，即可对捕获载体-目标微小物质复合体21实现清洗。例如，在一些实施例中，步骤c还包括：向所述闭合区域通入缓冲液，对所述捕获载体-目标微小物质复合体21进行冲洗，将所述闭合区域中未特异性结合在所述捕获载体11上的所述生物样品冲出所述闭合区域。在一些实施例中，通入的所述缓冲液的流速为2m/s～10m/s，实现目标微小物质的清洗。

步骤c可实现目标微小物质13的回收，清洗一段时间后，撤掉超声场15 力，将捕获的捕获载体-目标微小物质复合体21随缓冲液流出闭合区域并收集，即可回收有目标微小物质13的复合物即捕获载体11-目标微小物质13。

在一些实施例中，所述闭合区域分布于所述微流控芯片的圆形捕获室中，施加的所述超声场15波长的一半等于所述圆形捕获室的直径，使得所述捕获载体-目标微小物质复合体21滞留于所述圆形捕获室的圆心位置。

在一些实施例中，所述闭合区域分布于所述微流控芯片的捕获室中，所述微流控芯片的基底可以为超声换能器材料，所述捕获室的外表面的两侧平行分布有插齿电极，对插齿电极施加一定频率的电信号激发超声换能器材料的基底，在捕获室中形成超声驻波场，使得所述捕获载体-目标微小物质复合体滞留于所述捕获室的驻点位置。

在一些实施例中，所述闭合区域分布于所述微流控芯片的捕获室中，所述捕获室的外表面的对侧平行分布有超声换能器，所述超声换能器的间距离为a，激发所述超声换能器产生超声的波长为b，a与b之间的关系为：

a＝(n×b)/2，其中n为任意正整数。

本发明实施例还提供一种实现所述的生物样品中目标微小物质的分离方法的微流控装置，包括所述微流控芯片以及结合在所述微流控芯片上的超声换能器。

所述微流控芯片的材质包括且不限于玻璃、塑料、硅片、硅胶、高分子聚合物、纸等。

超声换能器材质可包括且不限于铌酸锂(LiNbO₃)、钛酸钡系、锆钛酸铅二元系及在二元系中添加第三种ABO₃(A表示二价金属离子，B表示四价金属离子或几种离子总和为正四价)型化合物、偏铌酸盐系压电陶瓷等。

超声换能器可以为在微流控芯片基底设置的插齿超声换能器，以一定频率正弦波信息激发超声换能器，形成表面声波。

在一些实施例中，所述微流控芯片包括依次连通的混合管道、分离室和捕获室，所述分离室的出口为叉口结构，所述叉口结构包括废液管道和捕获载体- 目标微小物质复合体21管道，所述捕获载体-目标微小物质复合体21管道与所述捕获室连通。在一些实施例中，所述超声换能器分布分别分布于所述分离室与所述捕获室的外表面。在一些实施例中，所述混合管道为弯曲管道结构。

如图4所示，微流控芯片包括依次连通的混合管道、分离室和捕获室，混合管道的起点具有捕获载体与生物样品入口41，混合管道内表面具有挡板42，分离室上具有缓冲液入口43，分离室的出口为叉口结构，具有非目标微小物质出口44和捕获载体-目标微小物质复合体出口47，捕获载体-目标微小物质复合体出口47与圆形捕获腔室45连通，圆形捕获腔室的末端具有捕获载体-目标微小物质复合体出口46。

如图5所示，微流控芯片包括依次连通的混合管道51、分离室，混合管道的起点具有捕获载体与生物样品入口51，混合管道51是多级弯曲管道，分离室的出口为叉口结构，具有非目标微小物质出口54和捕获载体-目标微小物质复合体出口55，分离室的底部设有插齿超声换能器53。

如图6所示，微流控芯片包括依次连通的混合管道、分离室和捕获室，混合管道的起点具有捕获载体与生物样品入口61，混合管道上设有空气管道62用于向所述混合管道通入空气以加速混合，分离室上具有缓冲液入口63，分离室的出口为叉口结构，具有非目标微小物质出口65和捕获载体-目标微小物质复合体出口67，捕获载体-目标微小物质复合体出口与捕获室68连通，捕获室68的末端具有捕获载体-目标微小物质复合体出口66。分离室的对侧外表面分别设有超声换能器64。捕获室68的对侧外表面分别设有超声换能器64。

以下为具体实施例。

实施例1.基于体超声特异性分离血浆生物样品中Her2⁺外泌体

(1)使用图4所示的微流控芯片，在芯片中加入Her2抗体修饰的捕获载体，在芯片混合管道中血浆与上述捕获载体混合。所述混匀管道内有挡板，可以引入湍流增强混合效果。混匀时间1分钟，完成所述捕获载体对Her2⁺外泌体的特异性结合，形成捕获载体-Her2⁺外泌体复合体。

(2)在微流控芯片中设计三叉分离结构，在微流控芯片底部粘附超声换能器。通过对超声换能器以一定频率的正弦波驱动在管道内形成超声驻波，所述超声场频率为20kHz以上。受声场力作用捕获载体-目标微小物质复合体向三叉管道的中间管道运动，而生物样品中其它微小物质从两侧管道排出，从而实现原生物样品中捕获载体-目标微小物质复合体的分离。

(3)在微流控芯片中设计圆形捕获腔室，在微流控芯片底部粘附的超声换能器以一定频率的正弦波驱动可以在腔室内形成体超声驻波。在优化的半波谐振频率超声场驱动下，可以在所述圆形捕获腔室的圆心形成驻波点，所述捕获载体-Her2⁺外泌体复合体向所述驻点运动，所述捕获载体-Her2⁺外泌体复合体会被超声场力捕获在圆心处。在捕获的同时，通入清洗液进行清洗，将Her2抗体修饰的捕获载体表面非特异性吸附的微小物质冲洗到下游，而表面特异性吸附的Her2⁺外泌体无法被冲洗掉从而保留在Her2抗体修饰的捕获载体的表面。

(4)撤掉超声场力，将步骤(2)捕获的捕获载体与Her2⁺外泌体复合体冲出，即得分离有目标外泌体的复合物即捕获载体-抗体-Her2⁺外泌体。

结果请参阅图7，结果表明，Her2⁺外泌体被抗体修饰捕获载体特异性捕获。

实施例2.基于表面超声特异性分离血浆生物样品中乙肝病毒

(1)使用图5所示的微流控芯片，在芯片中加入HBsAg抗体修饰的捕获载体，在芯片混合管道中血浆与上述捕获载体混合。所述芯片混匀管道为多级弯曲管道，可以引入湍流增强混合效果。混匀时间1分钟，完成所述捕获载体对乙肝病毒的特异性结合，形成捕获载体-乙肝病毒复合体。

(2)在微流控芯片分离室中设计叉口结构，在管道一侧布置插齿超声换能器，对(1)中获得的捕获载体-乙肝病毒复合体施加超声场，所述超声场频率为 20kHz以上。受声场力作用捕获载体-目标微小物质复合体向两叉管道的上侧管道运动，而生物样品中其它微小物质从右侧管道排出，从而实现原生物样品中捕获载体-目标微小物质复合体的分离，即得分离有目标病毒的复合物即捕获载体-抗体-乙肝病毒。

实施例3.基于对称超声换能器形成超声场特异性分离尿液生物样品中 EDIL3⁺外泌体

(1)使用图6所示的微流控芯片，在芯片中加入EDIL3抗体修饰的捕获载体，在芯片混匀管道中步骤(1)所得的去除细胞的外泌体悬液与上述捕获载体混合。所述芯片混匀管道两侧有空气管道，可以引入湍流增强混合效果。混匀时间1分钟，完成所述捕获载体对EDIL3⁺外泌体的特异性结合，形成捕获载体- EDIL3⁺外泌体复合体。

(2)在微流控芯片中设计分离结构，在分离式两侧对称布置超声换能器，对(1)中获得的捕获载体-EDIL3⁺外泌体复合体施加超声场，所述超声场频率为20kHz以上。受声场力作用捕获载体-EDIL3⁺外泌体复合体向两叉管道的上侧管道运动，而生物样品中其它微小物质从下侧管道排出，从而实现原生物样品中捕获载体-EDIL3⁺外泌体复合体的分离。

(3)在微流控芯片中设计矩形捕获室，在所述矩形捕获室各边对称布置超声换能器，以一定频率的正弦波驱动可以在所述矩形捕获室内形成超声驻波。在优化的谐振频率超声场驱动下，可以在所述矩形捕获室的中心形成驻波点，所述捕获载体-EDIL3⁺外泌体复合体向所述驻点运动，所述捕获载体-EDIL3⁺外泌体复合体会被超声场力捕获在矩形捕获室的中心处。在捕获的同时，通入清洗液进行清洗，将EDIL3抗体修饰的捕获载体表面非特异性吸附的微小物质冲洗到下游，而表面特异性吸附的EDIL3⁺外泌体无法被冲洗掉从而保留在EDIL3 抗体修饰的捕获载体的表面。

(4)撤掉超声场力，将步骤(3)捕获的捕获载体-EDIL3⁺外泌体复合体冲出，即得分离有目标外泌体的复合物即捕获载体-抗体-EDIL3⁺外泌体。分离得到的外泌体粒径分布如图8所示。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。