作为葡糖神经酰胺合酶的抑制剂的无定型和结晶形式的Genz 112638半酒石酸盐
阅读说明：本技术 作为葡糖神经酰胺合酶的抑制剂的无定型和结晶形式的Genz 112638半酒石酸盐 (Amorphous and crystalline forms of Genz 112638 hemitartrate as inhibitors of glucosylceramide synthase ) 是由 刘汉兰 C·威利斯 R·布哈德瓦杰 D·P·科佩兰德 A·哈里亚纳瓦拉 J·斯科尔 J· 于 2010-11-24 设计创作，主要内容包括：公开了由以下结构式代表的化合物的半酒石酸盐：(式I半酒石酸盐),其可用于药学应用。式(I)半酒石酸盐的特定单晶型的特征在于多种性质和物理测量。此外也公开了制备结晶的式(I)半酒石酸盐的方法、以及用它抑制受试者的葡糖神经酰胺合酶或降低受试者的鞘糖脂浓度,从而治疗多种疾病。也描述了药物组合物。(Disclosed are hemitartrates of compounds represented by the following structural formula: (hemitartrate salt of formula I) which is useful in pharmaceutical applications. Hemitartrate salt of formula (I)Is characterized by a variety of properties and physical measurements. Also disclosed are methods of preparing the crystalline hemitartrate salt of formula (I), and methods of using the same to inhibit glucosylceramide synthase or reduce glycosphingolipid concentration in a subject, thereby treating a variety of diseases. Pharmaceutical compositions are also described.)
具体实施方式
实施例1：式(I)盐的制备
与其他盐相比，式I的半酒石酸盐容易结晶并显示许多有利性质。 例如，以下酸用于制备由式(I)代表的化合物的盐：柠檬酸(生成1:1、 1:2和1:3(盐:式I)比例的盐)；L-苹果酸(1:1和1:2)；甲磺酸(1:1)； 富马酸(1:1和1:2)；盐酸(1:1)；乙酸(1:1)；和酒石酸(1:1和 1:2)。仅由盐酸(1:1)、酒石酸(1:1)和酒石酸(1:2)产生的盐是 固体形式。这三种盐中，发现盐酸(1:1)和酒石酸(1:1)是吸湿性的 和非结晶的，因此不能用于药物产品。发现由式(I)代表的化合物的半 酒石酸盐(1个盐:2个式I)是结晶的和非吸湿性的。
用丙酮制备式(I)半酒石酸盐
通过回流溶液将L-酒石酸(6.02g,40.11mmol,0.497当量)溶于丙 酮(175mL)中，然后冷却到室温。在室温下将式(I)游离碱(32.67g,80.76 mmol)溶于丙酮(300mL)中。在室温下在15分钟内将L-酒石酸溶液添 加至式(I)游离碱溶液中。添加中途便形成白色沉淀。混合物在室温下 搅拌0.5小时，然后短暂回流并冷却到室温。在室温下搅拌0.5小时后， 过滤该白色沉淀。所述白色固体用丙酮(2x 130mL)洗涤两次。所述固 体风干、然后在55-60℃下真空干燥。产量为36.66g(95％)。
用5％甲醇于丙酮中制备式(I)半酒石酸盐
将10g/24.7mmol式(I)游离碱溶于120mL或240mL的5％甲醇/丙 酮中。将1.85g/12.3mmol L-酒石酸通过加热至40-45℃而溶于60mL 或120mL的5％甲醇/丙酮(N或2N)中，并将该溶液添加至第一个溶液 中。1小时后无沉淀，添加1mg式(I)半酒石酸盐作为晶种。5分钟后发 生沉淀，再继续搅拌反应30分钟。然后反应加热回流5分钟(沉淀是 完全可溶的)，然后在20-22℃水浴中冷却到室温。形成沉淀并继续搅 拌反应3小时。最终产物通过过滤收集并用2x40mL的丙酮洗涤，然 后在55-60℃真空烘箱中干燥16小时。产物重量为8.72g/产率为74％。
用1％水于丙酮中制备式(I)半酒石酸盐
室温下将式(I)游离碱(10g/24.7mmol)溶于120mL或240mL的1％ 水/丙酮中。将1.85g/12.3mmol L-酒石酸通过加热至40-45℃而溶于 60mL或120mL的1％水/丙酮(N或2N)中，并将该溶液添加至第一个 溶液中。1小时后无沉淀，添加1mg式(I)半酒石酸盐作为晶种。5分钟 后发生沉淀，再继续搅拌反应30分钟。然后反应加热回流5分钟(沉 淀不是完全可溶的)，然后在20-22℃水浴中冷却到室温。形成沉淀并 继续搅拌反应3小时。最终产物通过过滤收集并用2x40mL的丙酮洗 涤，然后在55-60℃真空烘箱中干燥16小时。产物重量为8.62g，产率 为73％。
用5％甲醇于丙酮中重结晶式(I)半酒石酸盐
将式(I)半酒石酸盐(3.06g)在回流下溶于116mL的5％甲醇/丙酮中。 该溶液冷却至室温并在室温下搅拌2小时。过滤白色沉淀并用10mL 的5％甲醇/丙酮洗涤，然后用丙酮(15mL)洗涤。在55-60℃真空干燥18 小时后，获得2.38g式(I)半酒石酸盐(回收率78％)。
用1％H2O于丙酮中重结晶式(I)半酒石酸盐
将式(I)半酒石酸盐(3.05g)在回流下溶于125mL的1％H2O/丙酮中。 该溶液冷却至室温并在室温下搅拌2小时。过滤白色沉淀并用10mL 的1％H2O/丙酮洗涤，然后用丙酮(15mL)洗涤。在55-60℃真空干燥18 小时后，获得2.35g式(I)半酒石酸盐(回收率77％)。
实施例2：制备结晶的式(I)半酒石酸盐
式(I)半酒石酸盐通过若干方法结晶。批次1采用乙酸乙酯/丙酮溶 剂制备并在室温下干燥。批次3采用乙酸乙酯/丙酮溶剂制备并从乙酸 乙酯中重结晶。批次4采用批次1原料从丙酮中重结晶。批次5从异 丙醇中重结晶。批次7类似于批次1采用乙酸乙酯/丙酮溶剂制备，但 以大规模制备，批次8仅采用丙酮制备，不经进一步重结晶。批次9 仅采用丙酮和短暂回流制备，也不经进一步重结晶。
表1：批次1-9的式(I)半酒石酸盐的多态性筛选概要
*：DSC温谱图中包含一些游离碱。
**：这些批次包含从棒状、片状变为针状、棒状和不规则形的特 性。
式(I)半酒石酸盐的晶型也用多种溶剂通过缓慢蒸发、缓慢冷却、 快速冷却和抗溶剂沉淀来制备。
缓慢蒸发法。称重样品(通常为20mg)用等分试样的测试溶剂处 理。等分试样通常为100-200μL。在添加溶剂间隙，混合物进行振摇 或超声。当固体溶解时，根据肉眼检查判断，使溶剂在环境条件下在 覆盖有用针孔穿孔的铝箔的开放式小瓶中蒸发。从这些实验基于添加 以获得透明溶液的总溶剂来评估溶解度。
表2：式(I)半酒石酸盐在室温下(20-25℃)的近似溶解度
有机溶剂
近似溶解度(mg/mL)
庚烷
不可得
己烷
不可得
甲苯
<5
二氯甲烷
100
乙醇
29
异丙醇
<5
乙腈
<5
乙酸乙酯
<5
甲醇
>200
丙酮
<5
甲基叔丁基醚(TBME)
<5
对二噁烷
<5
四氢呋喃(THF)
<5
表3：采用缓慢蒸发法的多态性概要
**：颗粒为片状和棒状
缓慢/快速冷却法。在50-60℃下将式(I)半酒石酸盐溶于测试溶剂 中。然后使所得溶液冷却到环境温度(缓慢冷却)。如果一天后没有形 成固体，将小瓶置于冰箱中。对于快速冷却实验，则使所得溶液在冰 箱中冷却。所述固体通过过滤收集并空气干燥。
表4：采用缓慢冷却法的多态性概要
**：颗粒为片状和棒状
表5：采用快速冷却法的多态性概要
**：颗粒为片状和棒状
抗溶剂法。将式(I)半酒石酸盐溶于溶剂中。将抗溶剂添加至该溶 液。所形成的固体通过过滤收集并空气干燥。
表6：采用抗溶剂法的多态性筛选概要
：颗粒为片状和棒状
**：个别颗粒具有一种以上bifrigence色。
***：颗粒为针状和棒状。
实施例3：式(I)半酒石酸盐的物理性质
差示扫描量热法(DSC)。DSC数据在采用氮气作为吹扫气体的TA Q100仪器上收集。精密称量约2-5mg样品到铝DSC锅中。所述锅覆 盖有用镊子穿孔的盖子。样品室在30℃下平衡并以每分钟10℃的速度 加热至220℃的最终温度。
热台显微镜。热台显微镜采用设置在配有用于图像收集的索尼 DXC-970MD 3CCD照相机的Leica DM LP显微镜上的Linkam热台 (model FTIR 600)来进行。用40x物镜和偏振光观察样品。各样品置于 两层盖玻片之间。当热台加热时，各样品可目视观察到。采用Links 2.27 版(Linkam)获得图像。采用USP熔点标准校准热台。
证实了在DSC曲线中观察到的吸热转变是通过热台显微镜在 160-163℃的熔化转变。
实施例4：式(I)半酒石酸盐的X射线粉末衍射
所有的X射线粉末衍射(XRPD)分析在SSCI公司进行(West Lafayette,IN 47906)。XPRD分析采用XRD-6000X射线粉末衍射仪采 用Cu Kα辐射进行。该仪器配有细焦点X射线管。管电压和电流强度 分别设置为40kV和40mA。发散和散射狭缝设置为1°且接收狭缝设置为0.15mm。衍射辐射采用NaI闪烁检测器检测。采用以3°/min(0.4 秒/0.02°步)从2.5至40°2θ的θ-2θ连续扫描。分析硅标准从而检查仪 器校直。收集数据并采用XRD-6000v 4.1分析。
实施例5：式(I)半酒石酸盐与式(I)游离碱的比较
游离碱和半酒石酸盐的固体表征概括于表7。式I半酒石酸盐较之 式I游离碱具有更优异的性质。例如，式I半酒石酸盐较之式I游离碱 具有更高的熔点(>150℃)、更高的充填能(更大的吸热焓)、较小的粒径 差异、更高的水溶性(在水中大于300mg/mL)、合适的晶形和更高的体 积密度。
表7：固态式(I)游离碱和式(I)半酒石酸盐的物理和化学性质概要
实施例6：体外活性和特异性
式(I)半酒石酸盐在体外抑制鞘糖脂的活性。两种试验用于量化式(I) 半酒石酸盐对葡糖神经酰胺合酶的抑制活性。由于葡糖神经酰胺是鞘 糖脂生物合成的第一和速率限制步骤，测定GM1和GM3的细胞表面 水平的流式细胞计试验用于间接评估抑制剂在完整细胞中的活性。 K562或B16/F10细胞和渐增量的式(I)半酒石酸盐(0.6-1000nM)一起培 养72小时导致GM1和GM3的细胞表面水平的剂量依赖性降低。抑制 K562细胞中的GM1细胞表面呈递的平均IC50值是24nM(范围为 14-34nM)(表8)，且抑制B16/F10细胞中的GM3细胞表面呈递的平 均IC50值是29nM(范围为12-48nM)。即使以最高剂量测试时，任何一 个细胞系中没有观察到明显的细胞毒性。
用于活性的选择性试验测定人细胞来源的微粒体中葡糖神经酰胺 合酶的抑制。在该试验中，由人黑素瘤A375细胞通过超声和离心作用 制备微粒体。微粒体制剂用荧光性神经酰胺底物(NBD-C6-神经酰胺)、 UDP-葡萄糖和渐增量的式(I)半酒石酸盐(0-1000nM)在室温下培养一小 时。培养后，分离荧光性标记的葡糖神经酰胺和未反应的神经酰胺并通过反相HPLC和荧光检测测定。该试验中抑制葡糖神经酰胺合成的 IC50值为20到40nM。该值类似于GM1和GM3的上述获得的值，提 示这些细胞表面糖脂的测定是式(I)半酒石酸盐对于葡糖神经酰胺合酶 的活性的良好替代。
通过式(I)半酒石酸盐抑制底物合成的特异性。式(I)半酒石酸盐的 特异性在一系列体外基于细胞和无细胞试验中评价。肠内糖苷酶在大 鼠组织匀浆中分析(参见Andersson等人，Biochem.Pharm.59(2000) 821-829，其全部教导以引用方式合并于此)，且糖原脱支酶在所描述的 无细胞试验中分析(参见Andersson等人，Biochem.Pharm.67(2004) 697-705，其全部教导以引用方式合并于此)。在高达2500μM的浓度下 没有发现肠内糖苷酶(乳糖酶、麦芽糖酶、蔗糖酶)、α-萄糖苷酶I和II 以及细胞溶质脱支酶(α-1,6-萄糖苷酶)的可检测的抑制(表8)。
非-溶酶体葡糖神经酰胺酶和溶酶体葡糖脑苷脂酶在完整的人细胞 中采用C6-NBD-葡糖神经酰胺作为底物来分析(参见H.S.Overkleeft等 人，J.Biol.Chem.273(1998)26522-26527，其全部教导以引用方式合 并于此)。牛弥菜醇β环氧化物(溶酶体葡糖脑苷脂酶的特异性抑制剂) 用于区分溶酶体和非溶酶体活性。葡糖脑苷脂酶活性也通过荧光-激活 细胞分选(FACS)来测定。在1μM 5-(五氟苯甲酰基氨基)-荧光素二 -β-D-葡吡喃糖苷(PFB-FDGlu,Molecular Probes/Invitrogen. Carlsbad,CA)存在下使K562细胞与渐增量的式(I)半酒石酸盐培养30-60分钟。细胞立即在冰上冷却并如上测定荧光。非溶酶体葡糖神经 酰胺酶被微弱抑制，其中IC50为1600μM。直到2500μM的最高浓度， 溶酶体葡糖脑苷脂酶(戈谢病缺乏的酶)没有抑制(表8)。因此，与所 测试的任何其他酶相比，需要大约40000倍的浓度差异来抑制葡糖神 经酰胺合酶。
表8：式(I)半酒石酸盐体外生化活性
底物抑制功效(体外IC<sub>50</sub>)：
～0.024μM
酶特异性，IC<sub>50</sub>：
α-萄糖苷酶I和II：
>2500μM
溶酶体葡糖脑苷脂酶(GBA1)：
>2500μMμM
非溶酶体葡糖神经酰胺酶(GBA2)：
1600μM
糖原脱支酶：
>2500μM
酶特异性，K<sub>i</sub>：
蔗糖酶抑制：
10μM无抑制
麦芽糖酶抑制：
10μM无抑制
实施例7：小鼠模型中溶酶体葡糖神经酰胺水平的改进管理
A.法夫里病。
为确定酶替代治疗(ERT)和减少底物治疗(SRT)的联合使用是否可 以维持酶减量(debulking)或提供额外利益，比较了法夫里病小鼠模 型(法夫里-Rag)中单独和联合治疗的相对功效。亲本法夫里小鼠在 Wang,AM等人，Am.J.Hum.Genet.59:A208(1996)中描述。法夫里-Rag 与Rag-1小鼠杂交并且不生长成熟淋巴细胞或T细胞(免疫-减弱)。
动物研究。
对于单一治疗研究，法夫里小鼠在1个月大时(预防模型)开始研 究。处理组接受式(I)半酒石酸盐(Genzyme Corp.,Cambridge,MA)作为 颗粒饲料饮食成分。所述药物以0.15％(w/w)配制入标准5053小鼠饲料 (TestDiet,Richmond,IN)并且不限量提供。该制剂每天为25g小鼠提供 300mg/kg的式(I)半酒石酸盐。
对于联合治疗研究，法夫里-Rag小鼠在3个月大时(处理模型)开始 研究。组A小鼠以每2个月1mg/kg的剂量(即3、5、7和9个月大)通 过静脉内注射接受重组人α-半乳糖苷酶A(Genzyme Corp.)。组B接受 相同的静脉内酶剂量加之它接受式(I)半酒石酸盐(GenzymeCorp., Cambridge,MA)作为颗粒饲料饮食成分。所述药物以0.15％(w/w)配制 入标准5053小鼠饲料(TestDiet,Richmond,IN)并且不限量提供。该制剂 每天为25g小鼠提供300mg/kg的式(I)半酒石酸盐。组C每4个月(即3 和7个月大)接受酶注射剂并接受和组B相同的含药物饲料饮食。组D 仅接受(和组B和C相同的)含药物饲料饮食。群E是未经处理的法夫 里-Rag小鼠，以及组F是野生型对照。参见图10。
组织球形三酰神经酰胺(GL-3,Gb3)水平的定量
GL-3的定量通过基本上用于GL-1的Tandem Mass光谱测定法进 行。
热板试验如之前所述进行(Ziegler,RJ等人Molec.Ther.15(3), 492-500(2007)。
结果
用式(I)半酒石酸盐单一治疗法夫里小鼠
在由α-半乳糖苷酶A活性缺乏所引起的法夫里病的小鼠模型中评 价SRT。用式(I)半酒石酸盐的治疗从一个月大的法夫里小鼠开始并持 续直到该小鼠长到一岁。在动物每天的饮食中给予300mg/kg的式(I) 半酒石酸盐。每两月一次进行小鼠的行为测试(即热板试验)和生物化学 试验(即尿分析和组织/血液/尿中的GL-3水平分析)。
如图7所示，在11个月期间内将式(I)半酒石酸盐给予法夫里-Rag 小鼠使得机体器官(肝、肾、心和脾)中的球形三酰神经酰胺(GL-3)的溶 酶体积聚速率降低了大约50％。这转化为疾病进展的延迟，通过较晚 表现对令人厌恶的热刺激不敏感(参见图8)和阻止尿分析因子例如尿 体积、肌酐和钠水平的恶化(参见图9)来证实。因此，式(I)半酒石酸盐 介导的催化鞘糖脂合成第一步的葡糖神经酰胺合酶的抑制不仅在戈谢 病动物模型中有利，而且在法夫里病动物模型中有利，且也能在其他 鞘糖脂中具有正面效应。
用α-半乳糖苷酶A和式(I)半酒石酸盐联合治疗法夫里小鼠
单独使用ERT以及采用式(I)半酒石酸盐和SRT联合的功效在五群 法夫里-Rag小鼠(n＝12个/组)中评价。从三个月大开始，小鼠接受行为 测试(即热板试验)和生物化学试验(即组织/血液/尿中的GL-3水平分析) 的时间表，如图10所示。在接受ERT的小鼠中，如图10所示按时间 表给予1mg/kg剂量的α-半乳糖苷酶A。在接受SRT的小鼠中，在小 鼠饮食中每日给予300mg/kg剂量的式(I)半酒石酸盐。
如图11所示，ERT降低法夫里-Rag小鼠的血液GL-3水平，而SRT 不降低。如图12所示，联合ERT/SRT能最有效地降低法夫里-Rag小 鼠肝和肾中血液GL-3水平。如图13所示，SRT降低法夫里-Rag小鼠 的尿GL-3水平，而ERT不降低。如图14所示，SRT但不是ERT延 迟法夫里-Rag小鼠的热不敏感发作。
总之，用法布瑞酶和式(I)半酒石酸盐联合处理法夫里-Rag小鼠比 在处理模型中单独采用ERT或SRT以下列方式显示疾病标志物的改 善：用联合治疗时肝和肾GL-3积聚显著降低；SRT组中尿GL-3改善； ERT组中血液GL-3改善；以及SRT组中周围神经病延迟。
B.戈谢病。
为确定酶替代治疗(ERT)和减少底物治疗(SRT)的顺次使用是否可 以提供额外利益，比较了戈谢病小鼠模型(D409V/基因敲除)中单独和 顺次治疗的相对功效。
方法
动物研究。涉及动物的程序由Genzyme公司的机构动物管理与使 用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)根据由 实验动物评估和认可管理委员会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory AnimalCare，AAALAC)所发行的指南来评价 和批准。戈谢小鼠(D409V/基因敲除)是在肝、脾和肺显示葡糖神经酰 胺积聚的1型戈谢病模型，但其缺乏骨或脑病理学(参见Y-H.Xu等人，Am.J.Pathol.163,2003,2093-2101，其全部教导以引用方式合并于此)。 如之前实验从三个月大开始研究两种性别的动物，显示雄性和雌性之 间对于重组葡糖脑苷脂酶或式(I)半酒石酸盐的响应没有差异。该研究 采用6组小鼠，其中组A在2周后处死，以提供组织葡糖神经酰胺的 基线水平。组B、C和D都经由尾静脉静脉内接受重组人葡糖脑苷脂 酶(GenzymeCorp.,Cambridge,MA)(10mg/kg)注射剂(100μL)，每两天 一次，总共8次。组B在该疗法结束时处死(与组A同时)，以提供组 织葡糖神经酰胺的酶降低水平。组D和E都喂以式(I)半酒石酸盐 (Genzyme Corp.,Cambridge,MA)作为颗粒饲料饮食成分。所述药物以 0.075％(w/w)配制入标准5053小鼠饲料(TestDiet,Richmond,IN)并且不 限量提供。该制剂每天为25g小鼠提供150mg/kg的式(I)半酒石酸盐。 组F不接受处理并与组C、D和E一起在研究开始后12周处死。食物 消耗和小鼠体重每周监控三次从而确定药物摄入以及药物对总体健康 的潜在影响。动物通过吸入二氧化碳处死并立即收集其组织。各组织 的一半在干冰上快速冷冻并储存在-80℃直到进行进一步处理。处理另 一半用于组织学分析。
组织葡糖神经酰胺水平的定量。通过之前描述的质谱学来量化(参 见K.McEachern,等人，J.Gene.Med.8(2006)719-729；T.Doering,J. Biol.Chem.274(1999)11038-11045，两者的全部教导以引用方式合并 于此)。已知重量的组织在2:1(v/v)氯仿:甲醇中匀化并在37℃下培养15 分钟。离心样品并在4℃下用0.2倍体积的水萃取上清液过夜。离心样 品，弃去水相，有机相在氮气下干燥成膜。对于电喷射离子化质谱 (ESI/MS)分析，组织样品在1ml的氯仿:甲醇(2:1,v/v)中重组为等量的 50ng初始组织重量并涡流5分钟。将各样品的等分试样(40μL)转移至 Waters总回收率小瓶并添加50μL的10μg/mL d3-C16-GL-1内标 (Matreya,Inc.,Pleasant Gap,PA)。样品在氮气下干燥并用200μL的1:4(v/v)DMSO:甲醇重组。不同碳链长度的葡糖神经酰胺的ESI/MS分析 在与配有电喷射离子源的Micromass Quattro微系统偶联的Waters alliance HPLC(Separation Module 2695)上进行。在45℃下将脂质提取物 样品(20μL)注射在C8柱(4mL X 3mm i.d；Phenomenex,Torrance,CA) 上并以50到100％乙腈的梯度(2mM醋酸铵，0.1％甲酸)以0.5mL/min 洗脱。第一个0.5分钟保持为50％有机物，然后在最后3.5分钟快速转 变为100％。源温度恒定保持在150℃且氮气以670L/h的流速用作脱溶 气体。毛细管电压保持在3.80KV，其中锥孔电压为23V，同时各离子 类型的停留时间为100ms。通过MRM方式获得谱图以监控八个主要 的异构体(C16:0、C18:0、C20:0、C22:1、C22:0、C22:1-OH、C24:1和 C24:0)。葡糖神经酰胺的定量基于这八个异构体相对于内标的总和，其 中校准曲线为0.1到10μg/mL。
组织学。对于组织学分析，在室温下使组织在锌福尔马林(Electron MicroscopySciences,Hatfield,PA)中固定24小时，然后在4℃下储存在 PBS中直到进行进一步处理。所有样品在乙醇中脱水、在二甲苯中洗 净、渗透并埋入Surgipath R石蜡(Surgipath,Richmond,IL)中。采用转 动切片机切下五微米的切片，在60℃下干燥然后染色。切片在Hemo-De (Scientific Safety Solvents,Keller,TX)中脱石蜡并在浓度下降的乙醇中 再水化，然后用PBS洗涤。所述切片用苏木精和曙红(H&E)染色并采 用大鼠抗-小鼠CD68单克隆抗体(Serotec,Raleigh,NC)标记，以识别巨 噬细胞。在PBS中洗涤5分钟后，玻片在乙醇中脱水并在Hemo-De中 洗净，然后用SHUR/MountTM盖片固定介质(TBS,Durham,NC)固定。 肝中CD68免疫阳性的百分比面积采用MetaMorph(MDS Analytical Technologies,Toronto,Canada)分析十个400X图像/组织切片来量化。不 了解组别设计的经过委员会认证的兽医病理学家检查所有切片。
结果
用于减量三个月大的戈谢小鼠肝、脾和肺中积聚的GL1的葡糖脑 苷脂酶剂量法。为研究单一治疗和酶治疗或减少底物治疗的联合的相 对优点，首先测定最大限度地耗尽戈谢小鼠脏器中的GL1水平的酶法。 三个月大的戈谢小鼠(D409V/基因敲除)静脉内给予2、4或8剂10mg/kg 的重组人葡糖脑苷脂酶。用2或4剂酶处理的小鼠每三天接受药物滴 注，而用8剂处理的小鼠每两天接受酶。设计接受8次处理的动物的 滴注之间使用较短的时间间隔，从而使给予的人酶的任何免疫反应的 潜在影响最小化。最后一次酶滴注后7天处死动物，并测定其肝、脾 和肺中残留GL1的量。
用2剂葡糖脑苷脂酶处理使肝GL1水平降低50％。将酶滴注次数 增加到4或8次，正如所料，肝GL1水平降低了很大程度(大约75％)。 即使采用8剂也不能完全降低GL1水平，这与显示仅在延长期治疗后 肝脾肿大减少的戈谢受试者中的经验一致(参见G.A.Grabowski,等人, Ann.Int.Med.122(1995)33-39，其全部教导以引用方式合并于此)。戈 谢小鼠脾中底物水平更加耐受酶处理。与未经处理对照相比，给予2 剂葡糖脑苷脂酶不能显著改变GL1水平。将酶滴注次数增加到4或8 次使得脾GL1水平降低约50％。在肺中，8剂后观察到未经处理对照 的大约60％的降低。肺中底物减少的几乎可忽略的较低程度可能是由 于滴注的酶到脂质负载的肺泡巨噬细胞的差的可及性。当与脾和肺相 比时，在肝中观察到较大的GL1清除率可能反映全身滴注后酶的生物 分布(参见S.M.Van Patten,等人.Glycobiology 17(2007)467-478，其全 部教导以引用方式合并于此)。基于这些结果，由每两天给药一次的 10mg/kg葡糖脑苷脂酶的8次连续剂量组成的处理方法用于随后的研究。
酶和减少底物治疗降低戈谢小鼠肝GL1水平的相对能力。一组三 个月大的戈谢小鼠单独或顺次用重组葡糖脑苷脂酶或式(I)半酒石酸盐 处理。组B、C和D小鼠如同上述给予8剂酶(在两周的时间)以清 除积聚的GL1。然后不同的组以常规饲料或包含式(I)半酒石酸盐(150 mg/kg/天)的饲料饲养，再饲养10周，其中组F不接受处理，作为空白 对照(control)。不管饲料配方，小鼠食用相当量的食物且体重 增加中不存在可辨别的差异。单独的酶治疗2周后，大约80％的贮积 GL1水平从肝中清除。当使这些动物不经进一步处理发展10周，它们 的肝GL1水平增加，表明在干预期间发生底物的再积聚(图2，C柱)。 这些水平与未经处理对照的水平没有显著不同(图2，F柱)。然而，如 果小鼠用酶处理，然后用其食物中的式(I)半酒石酸盐处理10周时间， 它们的肝GL1水平显著低于未经处理的对照(图2，D&F柱)。该结果 表明用式(I)半酒石酸盐进一步处理降低底物的再积聚。有趣的是，在 整个研究期间(12周)期间仅用式(I)半酒石酸盐处理的戈谢小鼠与未经 处理的年龄匹配对照小鼠(图2，F柱)相比也显示GL-1水平降低(图2，E柱)，尽管差异不明显。仅SRT降低该动物模型GL1水平的能力与我 们之前的报告一致(参见K.A.McEachern,等人,Mol.Genet.Metab.91 (2007)259-267，其全部教导以引用方式合并于此)，并可能反映戈谢小 鼠(D409V/基因敲除)保持残留的酶活性的事实(参见Y-H.Xu,等人, Am.J.Pathol.163,2003,2093-2101，其全部教导以引用方式合并于此)。
酶和减少底物治疗降低戈谢小鼠脾GL1水平的相对能力。三个月 大的戈谢小鼠仅用重组葡糖脑苷脂酶处理2周使得脾GL1水平降低大 约60％(图3，B柱)。当使这些动物不经进一步干预再成熟10周时， 底物水平恢复到研究开始时所观察到的水平(图3，C柱)，且与未经处 理对照没有显著差异(图3，F柱)。这表明脾GL1再积聚速度高于肝。 这种推测也通过脾中底物的基础水平(～1500mg/g组织；图2；A柱)高 于肝(～500mg/g组织；图3，A柱)的观察来支持。用酶然后用式(I)半 酒石酸盐再处理10周的动物的脾GL1水平最大程度地降低(图3，D 柱)且这些水平显著低于未经处理的对照脾的水平(图3，F柱)。这表明 利用SRT不仅延迟底物的再积聚而且能进一步降低该器官的贮积负 担。似乎至少在这种情况下，残余内源酶和底物减少的净作用导致总 体底物水平的进一步下降。仅用式(I)半酒石酸盐处理12周的小鼠的脾 GL1水平(图3，E柱)低于未经处理对照(图3，F柱)与这种观点一致， 尽管差异不明显。因此，在具有高度残余酶活性的轻微戈谢1型患者 中，用ERT然后用SRT治疗可能可以促进不利底物的清除速度，也许 甚至是促进不利底物的清除程度。
酶和减少底物治疗降低戈谢小鼠肺GL1水平的相对能力。如之前 所述，肺GL1水平通过静脉内给予重组葡糖脑苷脂酶而清除的效果最 差。三个月大的戈谢小鼠用酶处理2周仅导致肺底物水平降低30％(图 4，B柱)。正如所料，用正常饲料再饲养10周的一组动物显示GL1的 再积聚，且与未经处理的水平没有明显差异(图4，C&F柱)。相反，在 相同干预时间内用含有式(I)半酒石酸盐的饲料饲养的动物显示底物水 平的降低低于仅给予酶的水平(图4，D柱)，且显著低于未经处理对照 的水平(图4，F柱)。这再一次提示在肺中，如同在脾中，式(I)半酒石 酸盐(在残余内源酶活性存在下)的净作用不仅延迟GL1的再积聚而且 能使其进一步降低，从而低于起始水平。如同在其他内脏器官中，当 与未经处理对照相比(图4，F柱)，仅通过式(I)半酒石酸盐处理能有效 降低肺GL1水平(图4，E柱)。
酶和减少底物处理后戈谢小鼠肝的组织病理学分析。为设想不同 治疗方法对肝的作用，组织切片用CD68(一种巨噬细胞标志物)染色。 未经处理的三个月大的戈谢小鼠肝切片的分析显示存在大量的脂质充 盈的、CD68-阳性的戈谢细胞，其在12周后分析时在很大程度上保持 不变。与上述生化数据一致，在2周时期内给予重组葡糖脑苷脂酶的 动物肝脏显示这些异常巨噬细胞中的脂质基本上清除。如果使这些动 物不经进一步处理再成熟10周，由戈谢细胞的再次出现表明GL1的 再积聚迹象。然而，如果在相同的干预期间内用式(I)半酒石酸盐给予 小鼠减少底物治疗，则戈谢细胞不增加。如之前所述，仅接受式(I)半酒石酸盐的戈谢小鼠也显示底物积聚减少，尽管程度与接收ERT和 SRT联合的小鼠不一样。各种切片上CD68-阳性染色的程度也采用 MetaMorph软件量化(图5)。这些切片的染色程度反映出生化测定的肝 GL1水平的量(图15)，进一步支持不同处理方法的相对优点的建议。
实施例8：式(I)半酒石酸盐对戈谢病小鼠模型的功效
动物研究。涉及动物的程序由机构动物管理与使用委员会(IACUC) 根据由实验动物评估和认可管理委员会(AAALAC)、国家和联邦指南来 评价和批准。使戈谢gbaD409V/基因敲除小鼠(参见Y.-H.Xu.等人,Am.J. Pathol.163(2003)2093-2101，其全部教导以引用方式合并于此)按照研 究要求成熟。雄性和雌性之间没有发现对式(I)半酒石酸盐的表型或响 应的差异，因此两种性别均用于该研究。式(I)半酒石酸盐通过每日一 次经口灌胃法以10mL/kg的体积递送。开始处理之前用相似体积的水 经口灌胃一周使动物适应。将式(I)半酒石酸盐溶于注射用水(WFI； VWR,West Chester,PA)并在九天时期内以从75mg/kg/天增加到150 mg/kg/天的剂量给予，其中三天采用各剂量且增量为25mg/kg/天。小 鼠每周称重三次以监控药物对其总体健康的潜在影响。动物通过吸入 二氧化碳处死并立即收集其组织。各组织的一半在干冰上快速冷冻并 储存在-80℃直到进行进一步处理。收集另一半用于组织学分析。
通过高效薄层色谱定量组织葡糖神经酰胺水平。高效薄层色谱 (HP-TLC)分析如(A.Abe,等人,J.Clin.Inv.105(2000)1563-1571；H. Zhao,等人.Diabetes 56(2007)1341-1349；和S.P.F.Miller,等.J.Lab. Clin.Med.127(1996)353-358，各自的全部教导以引用方式合并于此) 所述。简言之，通过在冷PBS中匀化获得总脂质部分，以2:1(v/v)氯仿: 甲醇萃取并在水浴超声发生器中超声。离心样品以分离两相并回收上 清液。沉淀在氯仿:甲醇:盐水中再超声、离心且收集所得第二部分上清 液并与第一部分上清液合并。用1:1(v/v)氯仿:盐水混合物帮助合并上清 液、涡流并离心。丢弃上层水层后，添加甲醇:盐水，涡流并再离心。 收集有机相并在氮气下干燥，以每0.1g原始组织重量1mL的浓度溶于 2:1(v/v)氯仿:甲醇并储存在-20℃。
一部分脂质提取物用于测定总磷酸盐(参见B.N.Ames,Methods Enzymol.8(1966)115-118，其全部教导以引用方式合并于此)，即，磷 脂含量用作内标。其余经历碱性甲醇醇解以移除在HP-TLC板上和葡 糖神经酰胺一起移动的磷脂。将含有等当量总磷酸盐的提取物的等分 试样和已知的葡糖神经酰胺标准(Matreya inc.Pleasant Gap,PA)一起点 在HP-TLC板上。脂质用3％乙酸铜一水合物(w/v)、15％磷酸(v/v)溶解 并显示，然后在150℃下烘干10分钟。在比重计(GS-700,Bio-Rad, Hercules,CA)上扫描脂质带并通过QuantityOne软件(Bio-Rad)分析。
通过质谱定量组织葡糖神经酰胺水平。葡糖神经酰胺通过如(参见 K.McEachern,等人J.Gene Med.8(2006)719-729；T.Doering,等人, J.Biol.Chem.274(1999)11038-11045，各自的全部教导以引用方式合 并于此)所述的质谱来量化。组织在2:1(v/v)的氯仿:甲醇中匀化并在37 ℃下培养。离心样品并用0.2倍体积的水萃取过夜。再次离心样品，弃 去水相，有机相在氮气下干燥成膜。
对于电喷射离子化质谱(ESI/MS)分析，组织样品在1ml的氯仿/甲 醇(2:1,v/v)中重组为等量的50ng初始组织重量并涡流5分钟。将各样 品的等分试样(40μL)转移至Waters总回收率小瓶并添加50μL的10 μg/mL d3-C16-GL-1内标(Matreya,Inc.,Pleasant Gap,PA)。样品在氮气 下干燥并用200μL的1:4DMSO:甲醇重组。不同碳链长度的葡糖神经 酰胺的ESI/MS分析在与配有电喷射离子源的Micromass Quattro微系 统偶联的Watersalliance HPLC(Separation Module 2695)上进行。在45 ℃下将二十微升脂质提取物样品注射在C8柱(4mL X 3mm i.d； Phenomenex,Torrance,CA)上并以50-100％乙腈的梯度(2mM醋酸铵， 0.1％甲酸)以0.5mL/min洗脱。第一个0.5分钟保持为50％有机物，然 后在最后3.5分钟快速转变为100％。源温度恒定保持在150℃且氮气 以670L/h的流速用作脱溶气体。毛细管电压保持在3.80KV，其中锥孔 电压为23V，同时各离子类型的停留时间为100ms。通过MRM方式获 得谱图以监控八个主要的异构体(C16:0、C18:0、C20:0、C22:1、C22:0、C22:1-OH、C24:1和C24:0)。葡糖神经酰胺的定量基于这八个异构体 相对于内标的总和，其中校准曲线为0.1到10μg/mL。
组织学。对于组织学分析，在室温下使组织在锌福尔马林(Electron MicroscopySciences,Hatfield,PA)中固定24小时，然后在4℃下储存在 PBS中直到进行进一步处理。所有样品在浓度升高的乙醇中脱水、在 二甲苯中洗净、渗透并埋入Surgipath R石蜡(Surgipath,Richmond,IL) 中。采用转动切片机切下五微米的切片，在60℃烘箱中干燥然后染色。 切片在二甲苯中脱石蜡，并在浓度下降的乙醇中再水化，然后用水洗 涤。在3％乙酸中冲洗1分钟后，玻片在pH 2.0的3％乙酸中的1％Alcian Blue 8GX(ElectronMicroscopy Sciences)中染色40分钟。在水中冲洗并 在1％高碘酸中氧化1分钟后，玻片以Schiff试剂(Surgipath)染色12分 钟。在热水中洗涤5分钟后，玻片在乙醇中脱水并在二甲苯中洗净， 然后用SHUR/MountTM盖片固定介质(TBS,Durham,NC)固定。采用每 10个高倍视野(HPFs,400x)人工细胞计数来量化肝脏的形态学上识别 的戈谢细胞。
结果
给药式(I)半酒石酸盐对D409V/基因敲除小鼠的影响。评估给药式 (I)半酒石酸盐对D409V/基因敲除小鼠的影响。大约七个月大的小鼠通 过经口灌胃法给予150mg/kg/天的式(I)半酒石酸盐(初步研究显示能有 效抑制葡糖神经酰胺合酶的剂量)10周。该处理对小鼠的总体健康或摄 食习性没有明显影响。在整个研究期间测量它们的体重显示与未经处 理的小鼠没有明显差异，提示式(I)半酒石酸盐在显示能有效抑制合酶 的剂量下是良好耐受的。
式(I)半酒石酸盐对处理年幼的、症状前戈谢小鼠的功效。评价式(I) 半酒石酸盐消除年幼(10周大)的D409V/基因敲除小鼠中葡糖神经酰胺 的溶酶体积聚和戈谢细胞出现。这些年幼的戈谢小鼠显示受影响组织 中GL-1的低水平。十周大动物通过经口灌胃法给予75或150mg/kg/ 天的式(I)半酒石酸盐10周。与年龄匹配介质处理的对照相比时，葡糖神经酰胺水平的测量显示剂量依赖性降低。在用150mg/kg/天处理的组 别中，肝、肺和脾的葡糖神经酰胺水平分别是对照水平的60、40和 75％(图6)。经处理的D409V/基因敲除小鼠的肝和肺中观察到的统计显 著低水平的葡糖神经酰胺表明式(I)半酒石酸盐能有效降低鞘糖脂在这 些组织中的积聚。
在研究结束时未经处理的D409V/基因敲除小鼠(20周大)肝脏的组 织病理学评价显示整个肝脏中戈谢细胞的存在。用150mg/kg/天的式(I) 半酒石酸盐处理10周的小鼠仅显示戈谢细胞的偶尔存在，且所述细胞 大小还总是在变小。许多不同的切片中这些细胞的定量证实经式(I)半 酒石酸盐处理的小鼠中戈谢细胞的频率显著降低。同样，这些生化和组织检查所见提示每日将给药式(I)半酒石酸盐给予症状前戈谢小鼠能 有效减少受影响组织中葡糖神经酰胺的积聚以及随后肝脏中戈谢细胞 的形成。
式(I)半酒石酸盐对处理有预先存在病理的年老戈谢小鼠的功效。 也评价式(I)半酒石酸盐在阻止或逆反年老有症状的戈谢小鼠的疾病进 展中的功效。七个月大的D409V/基因敲除小鼠通过经口灌胃法给予75 或150mg/kg/天的式(I)半酒石酸盐10周。处理5和10周后经处理小鼠 的肝、肺和脾中葡糖神经酰胺水平的分析显示除研究开始时观察到的 水平外没有增加。处理10周后，与介质处理小鼠相比，葡糖神经酰胺 水平测定为肝中降低60％、肺中降低50％和脾中降低40％。这些结果 显示式(I)半酒石酸盐能有效抑制具有贮积病理的已有负担的小鼠中葡 糖神经酰胺的进一步积聚。
组织切片的组织病理分析显示与未经处理的对照相比，经处理的 D409V/基因敲除小鼠肝中戈谢细胞数目减少。戈谢细胞数目的定量证 实了生化发现：经处理的D409V/基因敲除小鼠的戈谢细胞计数明显不 同于处理开始时5周和10周时间点的细胞计数。这些时间点的戈谢细 胞数均明显低于未经处理的D409V/基因敲除小鼠。同样，这些数据表 明式(I)半酒石酸盐能有效抑制具有预先存在病理的动物中葡糖神经酰 胺的进一步积聚和戈谢细胞的发育。
讨论
式(I)半酒石酸盐显示对于酶葡糖神经酰胺合酶的高度特异性。有 效剂量对葡糖脑苷脂酶活性没有可测量的抑制，当治疗1型戈谢病患 者时，这是一个重要的特征，因为大多数患者保持残余的葡糖脑苷脂 酶活性。在150mg/kg/天的有效剂量，没有可观察到的胃肠道问题，且 在处理组和对照未处理组之间没有体重差异。IC50(24-40nM)或高于 IC50(24-40nM)的血清浓度容易地以低于最大耐受水平的口服剂量获 得。式(I)半酒石酸盐也容易代谢并清除：母体化合物和代谢物均在24 小时内有效清除，如大鼠和狗中采用14C-放射性标记化合物的单次或 重复口服剂量ADME研究所示。
采用单次每日经口灌胃的非优化剂量法成功地抑制了年幼的症状 前小鼠和已经显示贮积病理的年老戈谢小鼠中葡糖神经酰胺的积聚。 年幼的10周大小鼠，尽管相对于野生型对照具有升高的葡糖神经酰胺 水平，还没有发展特征的充盈组织巨噬细胞(称为戈谢细胞)。用 150mg/kg/天的式(I)半酒石酸盐处理阻止了所有可测量的疾病发展并抑 制了戈谢细胞的生长。在显示高水平溶酶体葡糖神经酰胺和戈谢细胞 数目的年老小鼠中，处理5周或10周后鞘糖脂水平或贮积细胞数目没 有进一步增加。由于据报导戈谢细胞中主要的葡糖神经酰胺来源是来 源于胞外的，这些结果暗示式(I)半酒石酸盐对葡糖神经酰胺合酶的抑 制是全身的。
式(I)半酒石酸盐有效抑制葡糖神经酰胺的进一步积聚的观察提示 可以进一步增强戈谢病的治疗的治疗学策略。
总之，本发明提出的数据表明式(I)半酒石酸盐是葡糖神经酰胺合 酶的活性和特异性抑制剂，其在戈谢病小鼠模型中未显示明显的副作 用。它通过抑制葡糖神经酰胺积聚和戈谢细胞形成成功地阻止了症状 前和年老患病戈谢小鼠的疾病进展。这些发现提示式(I)半酒石酸盐可 以代表用于儿科和成人1型戈谢病以及可能的其他鞘糖脂贮积疾病的又一个治疗学选择。
实施例9：式(I)半酒石酸盐的2期临床试验
方法。每日两次经口给予50或100mg式(I)半酒石酸盐的该临床试 验治疗5个国家7个地区的26名患有1型戈谢病(GD1)的成人 (16F:10M；平均年龄为34岁，从18-60岁；均为白种人)。患者具有脾 肿大(正常体积的10倍)和血小板缺乏(血小板45,000-100,000/mm3)或贫 血(血色素8-10g/dl；女性；8-11g/dl，男性)。之前的12个月中没有人 接受酶替代或减少底物治疗。治疗52周后复合主要功效终点是球蛋白 水平(+0.5g/dl)或血小板计数(+15％)。也评价肝体积、壳三糖酶、葡糖 神经酰胺。患者继续治疗并长期监控。
结果。第52周高达20名患者的数据是有效的；其他4名提前退 出且2名继续进行。20名患者中的19名满足复合主要终点。第52周 与基线相比的平均(1SD)变化是：血色素+1.6(11.35)g/dL；血小板计数 +43.6％(137.59％)；脾和肝体积(正常倍数)分别为40.2％(110.44％)和 15.8％(110.39％)；以及壳三糖酶49.9％(120.75％)。所有患者4周后血 浆葡糖神经酰胺水平正常化，式(I)半酒石酸盐是良好耐受的且具有可 接受的安全曲线。6名患者中七种相关不良反应报告为相关；所有反应 在性质上均是温和且短暂的。
实施例10：式(I)半酒石酸盐药物组合物，100mg胶囊
制备100mg胶囊的方法：式(I)半酒石酸盐、微晶纤维素、乳糖一 水合物和羟丙甲纤维素，E15各自通过20目网筛。显示于表9的含量 的过筛组分在高切变制粒机中混合九到十二分钟。
表9：100mg胶囊的药物制剂
然后所述组分通过向制粒机盘中添加纯水(2.2kg；11.7％的组分干 重)直到如目视证实完成从而颗粒化。湿颗粒从盘中移除，并通过旋转 叶轮、筛分磨。然后湿颗粒在直接加热的固定的固体床的托盘烘箱中 在50±5℃下干燥，使得含水量不超过3.5％，如工艺间检查所证实。 然后干颗粒通过筛选磨且过筛颗粒转移至V型混合机中。将山嵛酸甘 油酯(0.2kg)添加至V型混合机中，混合最终混合物直到混合物均匀(在 线或线外混合均匀性测试所测定)，通常为10-20分钟。然后最终混 合物用半自动胶囊填充机包封入2#尺寸胶囊至适当的填充重量(平均 270mg)，且填充的胶囊在包装前除尘。
实施例11A：式(I)半酒石酸盐药物组合物，10mg胶囊
制备10mg胶囊的方法：按照实施例10的过程直到包封步骤。为 制备10mg胶囊，最终混合物用胶囊填充机包封入4#或5#尺寸胶囊至 适当的填充重量(平均27mg)，且填充的胶囊在包装前除尘。
实施例11B：式(I)半酒石酸盐药物组合物，50mg胶囊
制备50mg胶囊的方法：按照实施例10的过程直到包封步骤。为 制备50mg胶囊，最终混合物用胶囊填充机包封入3#尺寸胶囊至适当 的填充重量(平均135mg)，且填充的胶囊在包装前除尘。
实施例11C：式(I)半酒石酸盐药物组合物，150mg胶囊
制备150mg胶囊的方法：按照实施例10的过程直到包封步骤。为 制备150mg胶囊，最终混合物用胶囊填充机包封入0#尺寸胶囊至适当 的填充重量(平均405mg)，且填充的胶囊在包装前除尘。
实施例12：式(I)半酒石酸盐药物组合物，25mg胶囊
制备25mg胶囊的方法：按照实施例10的过程直到包封步骤。为 制备25mg胶囊，最终混合物用胶囊填充机包封入4#尺寸胶囊至适当 的填充重量(平均67.5mg)，且填充的胶囊在包装前除尘。
实施例13：式(I)半酒石酸盐药物相互作用-CYP2D6抑制剂
进行研究来评价在给予或不给予帕罗西汀(30mg，每日一次，一种 CYP2D6的有效抑制剂)的情况下口服多次剂量的式(I)半酒石酸盐 (100mg BID)的药代动力学、安全性和耐受性。这是在36名健康受试 者(17名男性和19名女性)中进行的开放标记、固定顺序式研究。第二 目的是评价健康受试者中帕罗西汀与多次剂量的式(I)半酒石酸盐 (100mg BID)联合的PK以及进一步评价与单剂量式(I)半酒石酸盐给药 相比，多次剂量后式(I)半酒石酸盐PK。
存在于血浆中的式(I)半酒石酸盐的游离碱的平均PK参数是非线 性的，并且与单剂量给药相比，重复给药(100mg BID)显示出AUC和 Cmax的2倍积聚。与仅多次剂量给药式(I)半酒石酸盐相比，同时给药 式(I)半酒石酸盐和帕罗西汀导致Cmax增加7倍以及AUC增加9倍。这 些结果表明帕罗西汀可抑制式(I)半酒石酸盐的代谢并增加药物的血浆 浓度。可预期使用其他有效CYP2D6抑制剂(例如氟苯氧丙胺和奎尼丁) 的类似效果，当式(I)半酒石酸盐和已知是有效CYP2D6抑制剂的药物 联合给药时，小心监控药物血浆水平和可能的剂量调整是必要的。帕 罗西汀浓度比所预期的高约1.5到2倍，这提示式(I)半酒石酸盐或其代 谢物之一可能是CYP2D6的温和抑制剂。
实施例14：式(I)半酒石酸盐药物相互作用-CYP3A4抑制剂和p-糖蛋白(PGP)抑制 剂
进行研究来评价健康的男性和女性受试者中在给予或不给予酮康 唑(400mg，每日一次)的情况下多次剂量的式(I)半酒石酸盐(100mg每 日两次)的药代动力学、安全性和耐受性。这是在36名健康受试者(18 名男性和女性)中进行的开放标记、固定顺序式研究，由三个周期组成， 其包括100mg单剂量给予式(I)半酒石酸盐、多剂量给予式(I)半酒石酸盐和同时给予式(I)半酒石酸盐100mg(每日两次)和酮康唑400mg(每日 一次)。重复给予式(I)半酒石酸盐、酮康唑(一种细胞色素p450 3A4的 强抑制剂(“CYP 3A4”))和p-糖蛋白导致以稳定状态存在于血浆中的式 (I)半酒石酸盐游离碱的暴露量增加4倍。因此，已经接受式(I)半酒石 酸盐的患者可能需要暂时减少剂量，而同时用CYP 3A4的强抑制剂或 p-糖蛋白治疗。
实施例15：式(I)半酒石酸盐制剂的稳定性研究
在闪烁小瓶中通过混合式(I)半酒石酸盐和赋形剂(胶囊级的乳糖一 水合物、Avicel PH 301(微晶纤维素)和Methocel E15 Prem LV(羟丙甲纤 维素)来制备大约两克规模的混合物。将15.6％的水添加至混合物中并 混合以形成湿颗粒。采用#10筛(开口为2000微米)筛选湿颗粒。然后 过筛颗粒在50℃烘箱中干燥2小时。采用#18筛(开口为1000微米)筛 选干燥颗粒。将润滑剂、山嵛酸甘油酯添加至混合物并混合以形成最 终混合物。所制备混合物显示于下表：
表
Methocel(HPMC)以2到4％范围使用
Compritol ATO 88以1到1.6％范围使用
具有不同的API:乳糖:Avicel比例的上列七种制剂混合物在高温85 ℃下暴露3天(强制降解研究条件)从而了解各制剂的降解速率和稳定 性。基于50mg药品在24个月的降解产物程度类似于在85℃下暴露3 天所获得程度的研究结果来选择加速条件。
强制降解研究采用反相梯度HPLC法进行，所述方法使用C18柱 (Waters T3,3μm,100x 4.6mm)，流动相由水和乙腈与0.1％三氟乙酸 (TFA)组成，UV检测为280nm，柱温为40℃，以及流速为2mL/min。 梯度从保持5％B(乙腈和0.1％TFA)0.5分钟开始，然后以4.83％B/分钟 增加有机组分直到15分钟。
总结各制剂混合物的总降解并相对于API:乳糖:Avicel的比率绘 图，结果显示于图15中。该研究结果表明当保持API与乳糖的比率不 变时，减少Avicel量将改进制剂的稳定性。当去除avicel时，制剂的 API:乳糖:avicel比率为1:2.1:0，它是最稳定的制剂。当去除乳糖时，制 剂的API:乳糖:avicel比率为1:0:2.1，且该制剂较之其他比率不是最不 稳定的。组合信息表明乳糖能使制剂稳定，而avicel使制剂不稳定。 然而，当两种赋形剂都存在时，它们彼此作用。必须调节比率以获得 稳定制剂。
对于如水溶性的式(I)半酒石酸盐的活性药物组分，在湿法制粒期 间微晶纤维素有助于形成颗粒，因为它不溶于水。如果不使用微晶纤 维素，将从颗粒阶段急速变为糊状物。糊状物难以操作，且干燥后所 得颗粒不具有适当的机械强度和粒径分布。药物组合物具有37wt％的 式(I)半酒石酸盐；41.0wt％的水溶性填充剂；16.7wt％的水不溶性填充剂；2wt％到约6wt％的粘合剂；和约0.1wt％到约2wt％的润滑剂，所有 组分基于干固体，并且就所形成的降解物的量而言，所述药物组合物 具有最佳的稳定性曲线。
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