结肠癌肿瘤特异tcr序列及其应用
阅读说明：本技术 结肠癌肿瘤特异tcr序列及其应用 (Colon cancer tumor specific TCR sequence and application thereof ) 是由 罗微 毛晓帆 余思菲 官展文 张贝莹 林凯容 金亚彬 于 2020-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了结肠癌肿瘤特异TCR序列及其应用,所述结肠癌肿瘤特异TCR序列包括9个序列。结肠癌肿瘤特异TCR序列在制备辅助诊断或结肠癌治疗或预后评估结肠癌的试剂或试剂盒中的应用,所述结肠癌肿瘤特异TCR去识别结肠癌的共同抗原后,T细胞增殖且针对结肠癌肿瘤发挥特异性杀伤作用,能够准确的识别结肠癌肿瘤,从而达到治疗或诊断的效果。(The invention provides a colon cancer tumor specific TCR sequence and application thereof, wherein the colon cancer tumor specific TCR sequence comprises 9 sequences. After the colon cancer tumor specific TCR identifies common antigens of colon cancer, T cells proliferate and play a specific killing role aiming at the colon cancer tumor, and the colon cancer tumor can be accurately identified, thereby achieving the effect of treatment or diagnosis.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及结肠癌肿瘤特异TCR序列及其应用。
背景技术
结肠癌每年夺走约70万人生命，是世界上第四大致死性癌症。随着饮食结构和生活方式改变，结肠癌患者的数量正以4％～5％的速率逐年增长，成为发病率上升最快的恶性肿瘤，每年新发病例约40万，死亡率接近60％，严重威胁人民的健康和生命。肿瘤免疫治疗发展迅速，靶向PD-1/PD-L1或CTLA-4药物的使用，已被证明对多种恶性肿瘤有明显疗效，但对结肠癌却疗效甚微。MSI-H/dMMR型结直肠癌患者，对PD-1抗体50％客观缓解率。然而不幸的是，约95％患者为MSI-L或MSS/pMMR型，对靶向PD-1等药物完全无应答。因此，亟需开发新的免疫治疗策略，提高结肠癌患者的生存。
近年来，肿瘤的免疫治疗取得了巨大进展，其旨在激活人体免疫系统，希望依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。过继性免疫细胞治疗(Adoptive cellular therapy,ACT)属于肿瘤免疫治疗的重要组成部分，其通过向患者回输在体外扩增的自身或同种(特异性或非特异性)免疫细胞，从而达到抗肿瘤目的。
T细胞受体(T cell receptor,TCR)是T细胞表面的一种受体分子，它特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽-MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答。由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，如果将肿瘤抗原特异性的TCR转入普通T细胞中，能够赋予该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再转输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效。因此利用TCR基因导入的方法可以方便地获得大量识别特定抗原的T细胞，经TCR基因修饰的T细胞被称为TCR-T，近年来TCR-T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。
TCR分子主要由α和β两条链组成，其编码基因V,(D)J,C在T细胞发育过程中经过胚系重排，在胸腺中经过阳性选择和阴性选择过程，成为具有MHC识别限制性。机体成熟T细胞所产生的TCRαβ组成了一个能与成千万种抗原结合的抗原识别受体库(Repertoire)，从理论上估计，TCRαβ受体库的容量在10的15次方以上。成功获得肿瘤抗原特异性的TCR是肿瘤TCR-T细胞治疗的重要前提，目前肿瘤特异性TCR基因的筛选主要通过获得肿瘤抗原特异性识别的T细胞，然后克隆其TCR基因。
结肠癌的发生发展与T细胞免疫关系密切，大量研究报道癌组织中T细胞浸润与预后相关。早期研究发现，治疗后T细胞丰度增加与结直肠癌缓解相关。T细胞介导肿瘤清除需满足三个条件：识别肿瘤并活化；解除免疫抑制；能归巢到肿瘤组织。为了让T细胞识别肿瘤，Eshhar、Carl June和Rosenberg等科学家们开发了T细胞受体重定向技术(T cellreceptor redirection)，通过基因工程手段，制备嵌合抗原受T细胞(CAR-T)或T细胞受体基因修饰T细胞(TCR-T)，提高对肿瘤的识别和杀伤。CAR-T和TCR-T作为免疫细胞过继回输治疗前沿技术，使得基于合成生物学，免疫学，遗传改造技术获得功能加强型T细胞成为可能。
发明内容
本发明的目的在于提供了结肠癌肿瘤特异TCR序列及其应用，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
本发明所采取的技术方案是：
利用特异TCR序列筛选方法筛选出一种结肠癌肿瘤特异TCR序列，所述结肠癌肿瘤特异TCR序列包括9种分别为：
Clonotype1，包括TRB1一个序列，序列如SEQ ID NO.1所示；
Clonotype2，包括TRA2和TRB2两个序列，其中TRA2如SEQ ID NO.2所示，TRB2如SEQID NO.3所示；
Clonotype3，包括TRA3和TRB3两个序列，其中TRA3如SEQ ID NO.4所示，TRB3如SEQID NO.5所示；
Clonotype4，包括TRA4和TRB4两个序列，其中TRA4如SEQ ID NO.6所示，TRB4如SEQID NO.7所示；
Clonotype5，包括TRA5和TRB5两个序列，其中TRA5如SEQ ID NO.8所示，TRB5如SEQID NO.9所示；
Clonotype6，包括TRB6一个序列，序列如SEQ ID NO.10所示；
Clonotype7，包括TRB7一个序列，序列如SEQ ID NO.11所示；
Clonotype8，包括TRA8和TRB8两个序列，其中TRA8如SEQ ID NO.12所示，TRB8如SEQ ID NO.13所示；
Clonotype9，包括TRA9和TRB9两个序列，其中TRA9如SEQ ID NO.14所示，TRB9如SEQ ID NO.15所示。
结肠癌肿瘤特异TCR序列在制备结肠癌辅助诊断或结肠癌治疗/预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供的结肠癌肿瘤特异TCR序列在制备辅助诊断或结肠癌治疗或预后评估结肠癌的试剂或试剂盒中上应用，在应用中通过本发明所述的结肠癌肿瘤特异TCR去识别结肠癌的共同抗原后，T细胞增殖且针对结肠癌肿瘤发挥特异性杀伤作用，能够准确的识别结肠癌肿瘤，从而达到治疗或诊断的效果。
附图说明
图1为利用Seurat对细胞第一步分群的结果图。
图2为根据ENCODE和BLUE PRINT各细胞亚群为参考注释31个细胞亚群图。
图3为最后细胞分群结果图，其中图3-a为细胞表达CD103(ITGAE)、CD159(KLRC2)、PD-1(PDCD1)、CTLA4、CD39(ENTPD1)、TIM-3(HAVCR2)、CD8A和CD4的水平图；图3-b为利用已发表的29种细胞亚群中各T细胞亚群为参考，定义T细胞亚群图；图3-c为TSNE可视化展示最终的细胞分群结果图。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各步骤技术方案的范围。
实施例1：结肠癌特异TCR序列的筛选
1.结肠癌病理组织浸润单个核细胞分离
结肠癌病理组织浸润单个核细胞分离方法步骤如下：
(1)将离体的新鲜的手术切除的结肠癌病理组织置于无菌平皿内，用无菌PBS或Hank’s反复冲洗，并减去四周结缔组织和脂肪组织，在平皿中用眼科镊将组织剪碎，尽量剪成1～2mm3大小的小块；
(2)倒入新鲜配置的组织消化液(20mg I型胶原酶+10μL DNA酶(10mg/mL)+10mL不完全RPMI1640)，混匀，于37℃摇床中消化1～2小时；
(3)加10mL HBSS终止消化，用无菌巴氏移液管将消化好的组织液转移至70μm的筛网中，过滤至新的50mL离心管中，离心(1800rpm，8min，常温)，在离心时转速要缓升缓降；
(4)弃去上清液，用Hank’s洗涤2次，如果肉眼可见细胞团块有红色血细胞，弃去上清液，加入5mL红细胞裂解液，轻轻吹散细胞团块，RT静置5～10min，随时观察液体的颜色，如果变成清亮透明的状态即可以终止，加20～30mLHank’s液终止，离心洗涤两次；
(5)末次离心后，弃上清，加入全完RPMI1640培养液(500mL不完全RPMI1640溶液+50mL灭活的胎牛血清+100μg/mL青霉素+100μg/mL链霉素)重悬细胞，计数细胞。
2.流式分选CD3+T细胞
将上述刚分离的10～50×106个组织浸润单个核细胞，离心后弃上清，用无菌的纯化缓冲液(1L 1×PBS+5g BSA+2mM EDTA-Na2，pH7.2～7.4)洗两遍，约4mL/管，1800rpm、4℃、离心8min；
弃去上清液，用200μL纯化缓冲液重悬，加荧光抗体(抗CD45-V450和抗CD3-PE-CF594各20μL)，4℃、避光孵育30min；用无菌的纯化缓冲液洗两遍，4mL/管，1800rpm、4℃、离心8min，弃去上清，用500μL纯化缓冲液重悬；
细胞悬液经40μm的筛网过滤去除粘连的细胞团块；
按照BD Aria II操作手册，无菌化处理分选系统，设置分选参数，上机分选前，经表面分子染色的细胞悬液加入10μL 7-AAD染料，避光孵育10min，上机分选，射门于单细胞中的7-AAD-CD45-V450+CD3-PE-CF594+细胞群，收集射门的细胞群。
3.去除死细胞
将上述流式分选的细胞进行离心后用无菌1×PBS洗涤2次，适量无菌1×PBS重悬细胞，取10μL细胞悬液，与10μL台盼蓝混合，用Life Count细胞计数仪计数细胞及细胞活率，细胞活率＜80％时，利用美天旎磁珠去死细胞磁珠做去死细胞处理。
4.单细胞转录组建库、VDJ建库及测序
将上述去除死细胞处理后的细胞，利用磁珠标签技术标记单细胞，使同一个细胞的每条RNA都标记上相同的标签，逆转录和酶切后，转录组和VDJ分别扩增，最后使用10×单细胞建库及Illumina Hiseq4000双端150测序，最后共获得22741个细胞的基因表达谱及其TCR序列。
5.数据分析及筛选结肠癌肿瘤特异CD8+TCR
将上述测序后获得的fastq文件，利用单细胞测序对应的数据处理方法，把fastq数据转换成细胞*基因的表达矩阵以及获得每个细胞的TCR；
利用Seurat软件读入表达矩阵，去除UMI过低或过高的细胞，以前后3％为阈值截取；
利用Seurat中提供的CCA方法，整合各样本的数据；
利用Seurat中提供的细胞聚类方法，把细胞分群，调整分辨率使细胞分群达30至35群，并计算每个细胞群体的均值表达谱，结果如图1所示分为31个群体；
利用SingleR软件，读入32个细胞群体均值表达谱，根据ENCODE和BLUEPRINT数据库初步定义细胞群体，并过滤数据中的非T细胞，结果如图2所示，第30和31群为非T细胞，过滤之；
过滤后，在CD8阳性细胞群体中，查看ITGAE基因的表达量，选出ITGAE高表达细胞群体，在这些群体中，观察KLRC2表达量，KLRC2表达高的细胞群体定义为IEL，在其余细胞群体中观察ENTPD1表达量，ENTPD1高表达细胞群体为CD8Trm Ex，其余细胞群体为CD8Trm，下载GEO数据库中GSE107011的数据，该数据包含了血液中29种免疫细胞的表达谱，并使用singleR，把细胞群体与GSE107011的数据作匹配，以此获取对剩余的细胞群体的定义和注释，细胞群体可被定义为：CD8EM、CD8EM Ex progenitor、CD8Naive、CD8Tcm、CD8TE、MAIT、CD4naive、CD4Tcm、Th1、Th17、Th1.Th17、Th2、TFH和Treg等细胞群体，结果如图3所示，其中图3-a为细胞表达CD103(ITGAE)、CD159(KLRC2)、PD-1(PDCD1)、CTLA4、CD39(ENTPD1)、TIM-3(HAVCR2)、CD8A和CD4的水平图；图3-b为利用已发表的29种细胞亚群中各T细胞亚群为参考，定义T细胞亚群图；图3-c为TSNE可视化展示最终的细胞分群结果图；
筛选肿瘤特异TCR，具有肿瘤特异TCR的CD8细胞是在肿瘤组织中CD8Tem和CD8TrmEx细胞中高度扩展的细胞，分别在CD8Tem和CD8Trm Ex细胞，寻找TCR频次最高的数条序列，均可入组肿瘤特异TCR序列，肿瘤中CD8EM及CD8Trm Ex高频CDR3序列，即肿瘤特异TCR序列，结果如表1所示，可以看出筛选出9条结肠癌特异性TCR序列。
利用上述结肠癌肿瘤特异TCR序列在制备辅助诊断或结肠癌治疗或预后评估结肠癌的试剂或试剂盒中上应用，在应用中一起使用上述筛选出的9条结肠癌特异性TCR序列识别结肠癌的共同抗原后，T细胞增殖，从而对结肠癌肿瘤的发挥特异性杀伤作用，能够准确的识别结肠癌肿瘤，从而到治疗或诊断的效果。
表1结肠癌特异TCR序列
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山市第一人民医院
<120> 结肠癌肿瘤特异TCR序列及其应用
<130> 2020.11.09
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Cys Ala Ser Ser Met Asp Arg Gly Asn Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Cys Ala Ala Arg Asn Arg Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Cys Ala Ser Ser Met Asp Arg Gly Asn Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Cys Ala Ala Leu Thr Asp Ser Trp Gly Lys Phe Gln Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Cys Ala Ser Arg Gln Gly Gly Asp Lys Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Cys Ala Thr Ser Trp Gly Lys Leu Gln Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Cys Ala Ser Ser Pro Gly Gln Gln Thr Gly Glu Leu Phe Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Cys Ala Gly Gly Leu Ile Ser Ser Gly Ser Ala Arg Gln Leu Thr Phe
1 5 10 15
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Cys Ala Ser Asn Ser Leu Gly Glu Thr Asn Arg Tyr Asn Glu Gln Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Cys Ala Ser Ser Leu Trp Glu Leu Thr Thr Ser Ala Glu Gln Phe Phe
1 5 10 15
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Cys Ala Ser Asn Ser Leu Gly Glu Thr Asn Arg Tyr Asn Glu Gln Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Cys Ala Met Arg Val Ile Ser Gly Gly Tyr Asn Lys Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Cys Ala Ser Ser Leu Ala Pro Thr Gly Asn Ser Gly Ala Asn Val Leu
1 5 10 15
Thr Phe
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Cys Ala Val Gln Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe
1 5 10 15
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Cys Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe
1 5 10