阅读说明：本技术 Wkh大鼠模型构建方法 (WKH rat model construction method ) 是由 王欢 朱经康 陈慧 洪辉武 毛高伟 孙红 程兰 于 2020-11-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及遗传性高血压大鼠模型的构建方法技术领域,是一种WKH大鼠模型构建方法,其其按下述步骤进行：采用基因测序技术,对临床具有家族聚集性青少年高血压患者进行单基因高血压相关43个致病基因的编码区及侧翼区检测,并经多个软件预测新发现的突变基因对蛋白结构和功能的影响,通过致病性的判定确定致病基因；然后利用基因工程CRISPR/Cas9技术构建这WKH大鼠模型,这种突变基因动物出生后血压随动物龄不断升高,绝大多数子代尾动物收缩压大于140mmHg。为该基因在高血压发生发展中的作用提供研究工具,为不断探明高血压相关发病机制,探索降压作用新的靶点提供研究模型。(The invention relates to the technical field of a method for constructing a hereditary hypertension rat model, in particular to a method for constructing a WKH rat model, which comprises the following steps: adopting gene sequencing technology to detect coding regions and flanking regions of 43 pathogenic genes related to single-gene hypertension of clinical teenager hypertension patients with familial aggregation, predicting the influence of newly-discovered mutant genes on protein structure and function through a plurality of software, and determining the pathogenic genes through pathogenicity judgment; then, the WKH rat model is constructed by utilizing the gene engineering CRISPR/Cas9 technology, the postnatal blood pressure of the mutant gene animal is continuously increased along with the age of the animal, and the systolic pressure of most offspring tail animals is more than 140 mmHg. Provides a research tool for the function of the gene in the development of hypertension, and provides a research model for continuously exploring the pathogenesis related to hypertension and exploring a new target point of the antihypertensive effect.)

WKH大鼠模型构建方法

技术领域

本发明涉及遗传性高血压大鼠模型的构建方法技术领域，是一种WKH大鼠模型构建方法即人源遗传性高血压大鼠模型构建方法。

背景技术

为人类高血压发病机制和防治方案研究，可通过遗传学方法构建遗传性高血压模型，如选择性近期繁殖高血压模型和基因工程高血压模型两种。前者模型是将筛选出的先天性高血压动物进行多代(20代以上)的近亲繁殖，得到稳定的高血压遗传性。已培育出高血压兔、大鼠和小鼠。常用的是大鼠，较成熟的品种包括：自发性高血压大鼠(SHR)，Dahl盐敏感大鼠(DS)、米兰种高血压大鼠(MHS)、遗传性高血压大鼠(GH)又称为新西兰种高血压大鼠、以色列种高血压大鼠(SBH)和里昂种高血压大鼠(LH)等。虽然这些模型与人类高血压病十分相似，但仍存在以下不足：①它是通过选择性繁殖得到的，与人类发病有一定区别。②甲状腺和免疫功能存在异常。

基因工程高血压模型可分为两类：一类是采用转基因技术将外源基因随机整合到动物基因组中并过分表达造成高血压，称为高血压转基因动物；另一类是采用基因打靶技术将动物内源基因定向敲除造成高血压，称为高血压基因敲除动物。由于基因工程高血压模型制备所需的技术和实验室要求较高，国内成功制备基因工程高血压模型的报道较少。随着 CRISPR-Cas9技术（一种基因操控工具）的发展，近来已广泛应用于各种实验模型如细胞系、实验室动物、植物，甚至人体临床试验。CRISPR-Cas9系统包括引导 Cas9核酸酶，以小RNA 分子为指导，创建定点导向的双链 DNA 断裂。允许基因组目标序列永久性修改的过程可以修复 DNA 受到的损伤。有人提出应用该系统可为治疗高血压和心血管疾病提供新的途径。为此，本动物模型拟从高血压家系筛查的致病基因，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建出特定基因变异遗传高血压大鼠模型（WKH大鼠模型），为筛选特定作用靶点的降压药提供新的工具。

Cav1.3 L-型钙通道α1 亚基编码基因 CACNA1D 与高血压相关，文献报道CACNA1D 基因是新发现的血压易 感区域 ， 我国学者 研究发现 rs9810888 多态性与 舒张 压和平 均动脉 压显著相关 ， 不良的生 活方式和 rs9810888 GG 基因型协同会影响中国少年血压水平，而CACNA1D 基因功能改变会影响钙离子通道阻滞剂的降压效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种WKH大鼠模型构建方法，其克服了上述现有技术之不足，其为在高血压发生发展中的作用提供研究工具，为不断探明高血压相关发病机制，探索降压作用新的靶点提供研究模型。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种WKH大鼠模型构建方法，其按下述步骤进行：采用基因测序技术，对临床具有家族聚集性青少年高血压患者进行单基因高血压相关43个致病基因的编码区及侧翼区检测，并经多个软件预测新发现的突变基因对蛋白结构和功能的影响，通过致病性的判定确定致病基因；然后利用基因工程CRISPR/Cas9 技术构建这WKH大鼠模型，这种突变基因动物出生后血压随动物龄不断升高，绝大多数子代尾动物收缩压大于140mmHg。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

所述突变基因为特殊类型高血压患者的基因检测结果。

所述实验动物选小鼠或大鼠或兔。

所述特定基因点突变F0鼠是通过CRISPR/Cas9技术构建而成。

所述特定基因突变鼠为构建的F0鼠繁育的后代。

所述突变鼠饲养条件为SPF级动物饲养室，保持室温22±2℃，12h昼夜周期，自由采食、饮水。

本发明WKH大鼠模型构建方法提供人源Cav1.3遗传性高血压大鼠模型（Wang-Kang-Hui，WKH大鼠模型）构建方法。首先从临床发现高血压新的可致病Cav1.3基因变异位点，通过文献检索，软件预测确定研究目的基因，利用基因工程CRISPR/Cas9 技术构建筛选特定Cav1.3基因位点变异（WKH）大鼠模型，与野生型WKH大鼠比，筛选出的WKH特定单基因变异大鼠从6月龄启血压开始升高，8月龄时肾小球体积增大，出现固缩，肾囊肿大，肾小管扩张，管腔结构不清和肾小动脉管壁增厚，纤维组织增多；心肌细胞增大；肠系膜次级动脉增厚，内皮舒缩功能异常等病理生理变化；而用降压药物等治疗措施可预防或减轻这些病变的进展；若进一步杂交Cav1.3基因两个位点变异WKH大鼠三个月全部出现高血压。根据NCBIblasts搜索相似性蛋白结构显示，这些Cav1.3基因变异位点可进行同源模建。总之，WKH大鼠模型具有特定的人源突变，可为该基因在高血压发生发展中的作用提供研究工具，为不断探明高血压相关发病机制，探索降压作用新的靶点提供研究模型。

附图说明

附图1为 WKH野生型SD大鼠与WKH基因杂合变异和纯合变异鼠7-32周收缩压（systolic blood pressure，SBP，各组均为6只）比较：^*P<0.05和^**P<0.01：杂合子鼠与野生型鼠比较，^#P<0.05：纯合子鼠与杂合型鼠比较。A: CACNA1D p.307位点雄鼠SBP随时间变化趋势图；B：CACNA1D p.307位点雌鼠SBP随时间变化趋势图；C：CACNA1D p.936位点雄鼠SBP随时间变化趋势图；D：CACNA1D p.936位点雌鼠SBP随时间变化趋势图；E：CACNA1D p.1516位点雄鼠SBP随时间变化趋势图；F：CACNA1D p.1516位点雌鼠SBP随时间变化趋势图；G：CACNA1D p.307位点、CACNA1D p.936位点单基因杂合位点变异与其两位点联合变异雄性鼠SBP随时间变化趋势图；H：CACNA1D p.307位点、CACNA1D p.1516位点单位点杂合变异与其两位点联合变异雄性鼠SBP随时间变化趋势图。

附图2为 ACNA1D p.307不同基因型6个月WKY雄性大鼠（各组分别6只）血浆缩血管物质—内皮素-1检测结果：*：与野生型鼠比P<0.05。

附图3、附图4和附图5分别为表示8个月 CACNA1D p.307 WKH大鼠不同基因型肾脏组织形态学的变化。

附图6为不同基因型WKH大鼠肠系膜次级小动脉EH染色比较（从左到右分别为AA，AG和GG基因型）。

附图7为表示不同基因型8月龄WKH大鼠心脏组织形态学与统计结果。

附图8为可见A: CACNA1D p.307位点、CACNA1D p.936位点和CACNA1D p.1516位点在L型钙通道cav1.3的位置，B：二氢吡啶类硝苯吡啶钙通道拮抗剂硝苯吡啶在L型钙通道cav1.3的作用位置、C：非二氢吡啶类硝苯吡啶钙通道拮抗剂在L型钙通道cav1.3作用的位置。

具体实施方式

实施例一，该WKH大鼠模型构建方法按下述步骤进行：采用基因测序技术，对临床具有家族聚集性青少年高血压患者进行单基因高血压相关43个致病基因的编码区及侧翼区检测，并经多个软件预测新发现的突变基因对蛋白结构和功能的影响，通过致病性的判定确定致病基因；然后利用基因工程CRISPR/Cas9 技术构建这WKH大鼠模型，这种突变基因动物出生后血压随动物龄不断升高，绝大多数子代尾动物收缩压大于140mmHg。

下面是对上述实施例一的进一步优化或/和改进：

上所述突变基因为特殊类型高血压患者的基因检测结果。

上述实验动物选小鼠或大鼠或兔。

上述特定基因点突变F0鼠是通过CRISPR/Cas9技术构建而成。

上述特定基因突变鼠为构建的F0鼠繁育的后代。

上述突变鼠饲养条件为SPF级动物饲养室，保持室温22±2℃，12h昼夜周期，自由采食、饮水。

实施例二，该WKH大鼠模型构建方法包括以下步骤：选取高血压患者致病基因，用基因工程CRISPR/Cas9 技术构建这种人源基因遗传性高血压动物模型。

模型建立后，实验动物维持日常饲养，剪尾用PCR方法确定模型动物基因型。

从上述实验动物选出杂合和纯合突变基因型，用BP-98A智能无创血压计鼠仪确定这些鼠尾动脉血压大于140mmHg个体作为人源遗传性高血压模型。

所述实验动物选自小鼠或大鼠或兔，所有实验动物优级自SD大鼠。

模拟人源Cav1.3基因突变因素对高血压发生发展的影响，更接近人类高血压病理生理过程。

由于是Cav1.3基因突变引起的高血压，可开发新的高血压精准（靶向）治疗药物。

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

实施例三，为了实现人基因突变对高血压病发生发展的影响，探索高血压治疗的新靶点，本发明提供了一种通过基因测序发现高血压患者新的可致病基因，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建人源遗传性高血压动物模型的方法。本发明中的动物包括但不限于：小鼠、大鼠、兔等与科学实验和人们生活的息息相关动物（以下以大鼠为例）。

一、动物准备

清洁级野生型SD大鼠以及CACNA1D基因点突变大鼠共24只（雌雄各半），鼠龄为4周龄。自由饮食、饮水，生活节律按照昼夜节律。

二、动物分组和模型构建

大鼠CACNA1D基因（GenBank accession number：NM_017298.1;Ensembl：ENSRNOG00000013147）位于大鼠16号染色体上。含有51个外显子，其中ATG起始密码子位于第1外显子，TAG终止密码子位于第51外显子。选择本课题组前期筛选的位点所在的外显子作为目标位点。设计gRNA靶向载体和供体寡核苷酸（具有靶向序列，两侧为130 bp同源序列）：供体寡核苷酸中的突变位点将通过同源性定向修复引入该外显子。也将引入沉默突变（从GAG到GAA或从GAC到GAT），以防止同源指导修复后gRNA结合和重新切割序列。将Cas9mRNA、体外转录产生的gRNA和供体寡核苷酸共同注入受精卵中，以繁育出基因敲入大鼠。将对这些幼崽进行序列分析。

将大鼠CACNA1D基因的gRNA、含突变位点和沉默突变（GAG to GAA）位点的供体寡核苷酸和Cas9 mRNA共注入受精的大鼠卵中，以产生靶向的敲入后代。对F0大鼠进行序列分析，随后与野生型SD大鼠交配以产生F1代大鼠。

将F1代之间进行交配，获得F2代，随后根据基因型不同，分为野生型组、杂合子组以及纯合子组，具体分组及建模方法如下：

	野生型组	杂合子组	纯合子组
				处理	保持室温22±2℃，12h昼夜周期，自由采食、饮水	保持室温22±2℃，12h昼夜周期，自由采食、饮水	保持室温22±2℃，12h昼夜周期，自由采食、饮水
时长（月）	8	8	8

生理生化指标测定：从50天鼠龄开始，每周测量其血压，饲养8个月后，对各组大鼠禁食12h后取静脉血，血清中内皮素-1的含量，处死后收集心脏和主动脉，对心脏、肾脏以及主动脉的形态学进行检测。

模型的验证:以SBP≥140mmHg作为高血压WKH大鼠建模成功的标准。