具体实施方式

提供了包括IL-13超级因子序列的免疫细胞靶向性构建体。如上所述，超级因子对选自IL-13Rα1、IL-13Rα2和IL-4R的一个或多个受体具有改变的亲和力。超级因子可用于将免疫细胞靶向表达至少一个受体(例如IL-13α2)的细胞，例如肿瘤细胞。

构建体的IL-13超级因子组分的长度可以为至少约50个氨基酸、长度为至少约75个、至少约100个、至少约110个、至少约115个氨基酸，直至跨膜结构域处的野生型蛋白的全长，即约116个氨基酸。例如，超级因子可以与CAR的铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域融合。SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:63中提供了示例性多肽序列。在一些实施例中，多肽序列如SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中的任何一个所提供。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:2。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:2。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:3。在一些实施例中，多肽序列是SEQ IDNO:4。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:5。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:6。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:7。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:8。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:9。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:10。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:11。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:12。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:13。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:14。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:15。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:16。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:17。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:18。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:19。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:20。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:21。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:22。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:23。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:24。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:25。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:26。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:27。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:28。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:29。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:30。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:31。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:32。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:33。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:34。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:35。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:36。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:37。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:38。在一些实施例中，多肽序列与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中的任何一个具有90％同一性。在一些实施例中，多肽序列与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中的任何一个具有95％同一性。在一些实施例中，多肽序列与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中的任何一个具有98％同一性。在一些实施例中，多肽序列与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中的任何一个具有99％同一性。在一些实施例中，SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中的任何一个与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:2与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:3与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:4与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:5与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:6与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:7与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:8与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:9与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:10与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:11与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:12与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:13与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:14与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:15与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:16与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:17与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:18与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:19与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:20与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:21与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:22与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:23与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:24与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:25与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:26与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:27与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:28与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:29与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:30与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:31与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:32与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:33与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:34与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:35与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:36与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:37与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:38与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:40与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:41与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:43与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:44与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:45与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:46与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:47与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQ ID NO:48与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。

在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自DAP10的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自OX-40的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，本发明的IL-13肽包括一个或多个氨基酸取代：(1)L10F、L10I、L10V、L10A、L10D、L10T、L10H；(2)R11S、R11N、R11H、R11L、R11I；(3)I14L、I14F、114V、I14M；(4)V18L、V18F、V18I；(5)E12A、(6)R65D、(7)R86K、R86T、R86M；(8)D87E、D87K、D87R、D87G、D87S；(9)T88I、T88K、T88R；(10)K89R、K89T、K89M；(11)L101F、L101I、L101Y、L101H、L101N；(12)K104R、K104T、K104M；(13)K105T、K105A、K105R、K105E；(14)F107L、F107I、F107V、F107M；和(15)R108K、R108T、R108M，所述取代导致对IL-13Rα1和IL-13Rα2之一或两者的亲和力改变。在其它实施例中，经修饰的残基位于以上定义的接触残基的组合集合内的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个且不超过14个氨基酸处。如国际专利公开WO 2013/112871中所述，所述国际专利公开的公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，氨基酸取代包含但不限于图2中提供的氨基酸取代。

修饰集合可以包含以下特定变化：(1)L10H；L10A；(2)R11L；(4)V18I；(7)R86M；R86K；R86T；(8)D87K；D87G；(9)T88R、T88S；T88K；(10)K89R；(11)L101N；(12)K104R；(13)K105A；K105E；(14)R108K。在一些实施例中，修饰包含所列举的具体变化中的任何一个变化。在一些实施例中，修饰包含L10H。在一些实施例中，修饰包含L10A。在一些实施例中，修饰包含R11L。在一些实施例中，修饰包含V18I。在一些实施例中，修饰包含R86M。在一些实施例中，修饰包含R86K。在一些实施例中，修饰包含R86T。在一些实施例中，修饰包含D87K。在一些实施例中，修饰包含D87G。在一些实施例中，修饰包含T88R。在一些实施例中，修饰包含T88S。在一些实施例中，修饰包含T88K。在一些实施例中，修饰包含K89R。在一些实施例中，修饰包含L101N。在一些实施例中，修饰包含K104R。在一些实施例中，修饰包含K105A。在一些实施例中，修饰包含K105E。在一些实施例中，修饰包含R108K。在一些实施例中，包括一种或多种修饰的多肽与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自DAP10的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自OX-40的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，氨基酸取代包含但不限于图2中提供的氨基酸取代。

相对于天然IL-13序列，在结合IL-13Rα2和IL-13Rα1方面提供更大选择性的修饰的特定集合可以包含但不限于：

·[L10D、R11I、V18I、R86K、D87K、k89R、R108K](例如，C2，例如SEQ ID NO:11或SEQID NO:29)

·[L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A、R108K](例如C3，例如SEQID NO:12或SEQ ID NO:30)

·[L10V、K89R、L101N、K105E、R108T](例如，C4，例如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31)

·[R11S、I14M、T88S、L101N、K105A、R108K](例如，C7，例如SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:32)

·[L10H、R11L、V18I、R86K、D87E、K89R、L101N、K105T、R108K](C9，例如SEQ ID NO:33)

·[L10H、R86T、D87G、T88R、R108K](C11，例如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:35)

·[L10A、V18F、R86K、D87K、K89R、L101I、K104R、R108K](D7，例如SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:37)

·[L10T/D；R11I；V18I；R86K；D87K/G；T88S；K89R；L101Y；K104R；K105T；R108K]

·[L10A/V；R86T；D87G；T88K；K89R；L101N；K104R；K105A/E；R108K/T]

在一些实施例中，修饰集合包括L10V、K89R、L101N、K105E、R108T。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、I14M、T88S、L101N、K105A和R108K(C7，例如SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:32)。在一些实施例中，修饰集合包括L10H、R11L、V18I、R86K、D87E、K89R、L101N、K105T和R108K(C9，例如SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:33)。在一些实施例中，修饰集合包括L10H、R86T、D87G、T88R和R108K(C11，例如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:35)。在一些实施例中，修饰集合包括L10A、V18F、R86K、D87K、K89R、L101I、K104R和R108K(D7，例如SEQ ID NO:20或SEQID NO:37)。在一些实施例中，修饰集合包括L10T/D、R11I、V18I、R86K、D87K/G、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10T、R11I、V18I、R86K、D87K、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10T、R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10D、R11I、V18I、R86K、D87K、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10D、R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T、R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10A/V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A/E和R108K/T。在一些实施例中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和R108T。在一些实施例中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108T。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108K。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和dR108T。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108T。在一些实施例中，氨基酸序列具有90％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有95％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有98％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有99％同一性。在一些实施例中，包括一种或多种修饰的多肽与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自DAP10的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自OX-40的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，氨基酸取代包含但不限于图2中提供的氨基酸取代。

相对于天然IL-13序列，在结合IL-13Rα1和IL-13Rα2方面提供更大选择性的修饰的特定集合可以包含但不限于：

·[L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T]

·[R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T]

·[L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T]

·[L10V/I；D87S；T88S；K89R；L101H/F；K104R；K105T]

·[L10I；V18I；R86T；D87G；T88S；K89R；L101Y/H；K104R；K105A]

·[L10V；V18I；D87S；T88S；L101F；K104R；K105T]

·[V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A]

·[R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M]

所述取代任选地与取代[E12A/G/S、R65D/E]组合。

在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R和K105T。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R和K105T。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R和K105A。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R和K105A。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A和F107M。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12G和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12G和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12G和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12S和R65D/E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12G和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12G和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12G和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12S和R65D。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12G和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12G和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12G和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A/G/S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12S和R65E。在一些实施例中，修饰集合包括L10V、E12A、V18I、R65D、D87S、T88S、L101F、K104R和K105T(参见例如IL-13dn；SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和/或SEQ ID NO:41)在一些实施例中，氨基酸序列具有90％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有95％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有98％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有99％同一性。在一些实施例中，包括一种或多种修饰的多肽与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自DAP10的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自OX-40的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，氨基酸取代包含但不限于图2中提供的氨基酸取代。

在一些实施例中，与野生型IL-4相比，对于I型和II型受体的第二链，IL-4突变蛋白具有改变的相对结合活性。在一些实施例中，IL-4突变蛋白调节或增强信号传导，而不是阻断信号传导。在一些实施例中，被称为“超级因子”的IL-4突变蛋白对γc具有非常高的亲和力，而对IL13Rα1的亲和力却降低，相反，与IL-13Rα1结合的亲和力比IL-4高得多的超级因子对γc的亲和力几乎没有变化。在一些实施例中，IL-4突变蛋白对γc具有相对高的亲和力，而对IL13Rα1的亲和力却降低。在其它实施例中，IL-4突变蛋白相对于IL-13Rα1具有比IL-4相对高得多的亲和力，其对γc的亲和力几乎没有变化。

在一些实施例中，IL-4突变蛋白是超级因子。在各个实施例中，本公开提供了IL-4突变型多肽，其可以是但不一定是基本上纯化的，并且可以充当野生型IL-4的激动剂；进行IL-4的一种或多种生物学活动(例如，刺激细胞增殖)。在一些实施例中，突变型IL-4多肽包含与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50具有至少约80％同一性的氨基酸序列，与由SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50表示的多肽结合γc的亲和力相比，所述突变型IL-4多肽以更大的亲和力结合γc，而对IL13Rα1的亲和力却降低。例如，相对于野生型IL-4，突变型IL-4多肽可以具有至少一个突变(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸残基的缺失、添加或取代)，并且以比SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的IL-4更大的亲和力结合γc，而与SEQ ID NO:49相比，对IL13Rα1的亲和力降低。在一些实施例中，突变型IL-4多肽包含与SEQ ID NO:49或SEQID NO:50具有至少约80％同一性的氨基酸序列，所述突变型IL-4多肽以比IL-4(SEQ IDNO:49或SEQ ID NO:50)更高的亲和力结合IL-13Rα1，而相对于SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的多肽，对γc的相对亲和力几乎没有变化。例如，相对于野生型IL-4，突变型IL-4多肽可以具有至少一个突变(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸残基的缺失、添加或取代)，并且以比IL-4(SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50)更高的亲和力结合IL-13Rα1，而相对于SEQ IDNO:49或SEQ ID NO:50的多肽，对γc的相对亲和力几乎没有变化。

示例性突变型IL-4多肽可以与野生型IL-4具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。突变可以由氨基酸残基的数量或含量的变化组成。例如，突变型IL-4可以比野生型IL-4具有更多或更少的氨基酸残基。可替代地或另外，示例性突变型多肽可以含有野生型IL-4中存在的一个或多个氨基酸残基的取代。在各个实施例中，突变型IL-4多肽可以通过添加、缺失或取代单个氨基酸残基(例如取代121位上的残基)而与野生型IL-4不同。类似地，示例性突变型IL-4多肽可以通过取代两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的位置117、118、21、122、124、125、128和129上的残基)而与野生型不同。

在一些实施例中，包含与本文公开的任何SEQ ID NO:的参考氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽是这样一种多肽：其包含与参考序列相同的序列，不同之处在于本文公开的任何SEQ ID NO:的参考氨基酸包含至多13个改变。例如，可以将参考序列中至多10％的氨基酸残基缺失或用一个氨基酸取代，或者可以将至多占参考序列中总氨基酸残基10％的氨基酸残基插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基(N--)或羧基C--)末端位置或者这些末端位置之间的任何位置，所述位置分别散布于参考序列中的残基之间或者散布于参考序列内的一个或多个连续基团中。

在一些实施例中，突变型IL-4多肽可以具有表现出与γc受体亚基的结合速率增加的能力。本公开中还提供了突变型IL-4多肽，其以比野生型IL-4多肽低至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约40％或更多的亲和力结合γc。示例性公开的突变型IL-4多肽的结合亲和力也可以表达为比野生型IL-4对γc的亲和力低1.2倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。

关于亲和力，在一些实施例中，突变型IL-4多肽以比野生型IL-4多肽高至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约40％或更多的亲和力结合IL-13Rα1。野生型IL-4多肽以约4200nM的Kd结合IL-13Rα1。示例性公开的突变型IL-4多肽的结合亲和力也可以表达为比野生型IL-4对IL-13Rα1的亲和力高1.2倍、1.4倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、100倍、200倍、250倍、400倍、450倍、500倍、1000倍、1500倍、2000倍或更多倍。

在一些实施例中，突变型IL-4多肽可以具有表现出与IL-13Rα1受体亚基的结合速率增加的能力。

在一些实施例中，突变型IL-4多肽以比野生型IL-4多肽低至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约40％或更多的亲和力结合IL-13Rα1。示例性公开的突变型IL-4多肽的结合亲和力也可以表达为比野生型IL-4对IL-13Rα1的亲和力低1.2倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍。

在一些实施例中，与野生型IL-4相比，突变型IL-4多肽具有对γc的亲和力增加和对IL-13Rα1的亲和力降低的特性。在一些实施例中，与野生型IL-4相比，突变型IL-4多肽具有对γc的亲和力和对IL-13Rα1的亲和力均增加的特性。在一些实施例中，还公开了与野生型IL-4相比，具有对γc的亲和力降低和对IL-13Rα1的亲和力增加的特性的突变型IL4多肽。

在一些实施例中，IL-4突变蛋白在位置117、118、121、122、124、125、128和/或129处包括一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，提供了在位置117、118、121、122、124、125、128和/或129处涵盖两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代的IL-4突变蛋白，其中氨基酸编号与野生型人IL-4(SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50)一致。在一些实施例中，IL-4突变蛋白包括氨基酸取代中的一个或多个：在一些实施例中，提供了在位置K117、T118、R121、E122、Y124、S125、S128和/或S129处涵盖两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代的IL-4突变蛋白，其中氨基酸编号与野生型人IL-4(SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50)一致。在一些实施例中，在IL-4的位置121处进行取代(例如，R121)。在一些实施例中，在IL-4的位置121和124处进行取代(例如，R121和Y124)。在一些实施例中，在IL-4的位置128和129处进行取代(例如，S128G和S129A)。在其它实施例中，在位置121、124和125处进行取代。在一些实施例中，在IL-4的位置117、118、121、122、124、125、128和129处进行取代。在其它实施例中，IL-4突变蛋白具有序列117R、118V、121Q、122S、124W、125F、128G和129A。在其它实施例中，IL-4突变蛋白具有序列K117R、T118V、R121Q、E122S、Y124W、S125F、S128G和S129A。在一些实施例中，IL-4突变蛋白的取代引起对IL-13Rα1和IL-13Rα2之一或两者的亲和力改变。在一些实施例中，IL-4突变蛋白中在位置117、118、121、122、124、125、128和/或129处的一个或多个取代引起对IL-13Rα1和IL-13Rα2之一或二者的亲和力改变。在一些实施例中，IL-4突变蛋白中在位置K117、T118、R121、E122、Y124、S125、S128和/或S129处的一个或多个取代引起对IL-13Rα1和IL-13Rα2之一或二者的亲和力改变。在一些实施例中，IL-4突变蛋白中在位置K117R、T118V、R121Q、E122S、Y124W、S125F、S128G和S129A处的一个或多个取代引起对IL-13Rα1和IL-13Rα2之一或二者的亲和力改变。在其它实施例中，经修饰的残基位于以上定义的接触残基的组合集合内的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个、六个、七个或18个氨基酸处。

在一些实施例中，IL-4突变蛋白导致相对于野生型细胞因子对共享细胞因子受体具有更高亲和力的结合，并且IL-4突变蛋白包括位置S128和/或S129处的一个或两个氨基酸取代，其中氨基酸编号与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的野生型人IL-4一致。在一些实施例中，IL-4突变蛋白导致相对于野生型细胞因子对第一共享细胞因子受体具有更高亲和力的结合，而相对于野生型细胞因子对第二共享细胞因子受体的亲和力降低。在一些实施例中，与第二共享细胞因子受体相比，IL-4突变蛋白第一共享细胞因子受体以更低的水平表达。在一些实施例中，与第二共享细胞因子受体相比，IL-4突变蛋白第一共享细胞因子受体以更高的水平表达。在一些实施例中，IL-4突变蛋白亲和力的降低是至少5倍。在一些实施例中，IL-4突变蛋白第一共享细胞因子受体是γc，而第二共享细胞因子受体是IL-13Rα1。在一些实施例中，IL-4突变蛋白第一共享细胞因子受体是IL-13Rα1，而第二共享细胞因子受体是γc。在一些实施例中，IL-4突变蛋白第一共享细胞因子受体和第二共享细胞因子受体是γc和IL-13Rα1。在一些实施例中，IL-4突变蛋白IL-4突变蛋白导致相对于野生型细胞因子对第一共享细胞因子受体和第二共享细胞因子受体具有更高亲和力的结合。在一些实施例中，IL-4突变蛋白亲和力的增加是至少10倍。在一些实施例中，IL-4突变蛋白共享细胞因子受体是常见的γ链(γc)或白介素13受体α1(IL-13Rα1)。在一些实施例中，IL-4突变蛋白IL-4突变蛋白在选自由以下组成的组的位置处进一步包括一个或多个氨基酸取代：K117、T118、R121、E122、Y124和S125，其中氨基酸编号与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的野生型人IL-4一致。在一些实施例中，IL-4突变蛋白IL-4突变蛋白包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：K117R、T118V、R121Q、E122S、Y124W、S125F、S128G和S129A，其中氨基酸编号与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的野生型人IL-4一致。在一些实施例中，IL-4突变蛋白IL-4突变蛋白包括以下氨基酸取代：K117R、T118V、R121Q、E122S、Y124W、S125F、S128G和S129A，其中氨基酸编号与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的野生型人IL-4一致。在一些实施例中，IL-4突变蛋白是如美国专利第9,738,696号中所述的突变蛋白，所述美国专利的公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，氨基酸取代包含但不限于美国专利第9,738,696号中公开的任何序列中提供的氨基酸取代。在一些实施例中，氨基酸序列与本文公开的IL-4序列具有90％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列与本文公开的IL-4序列具有95％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列与本文公开的IL-4序列具有98％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列与本文公开的IL-4序列具有99％同一性。在一些实施例中，包括一种或多种修饰的多肽与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自DAP10的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自OX-40的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD137的信号传导结构域。

构建体的IL-4超级因子组分的长度可以为至少约50个氨基酸、长度为至少约75个、至少约100个、至少约110个、至少约115个氨基酸，直至跨膜结构域处的野生型蛋白的全长，即约116个氨基酸。例如，超级因子可以与CAR的铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域融合。SEQ ID NO:51-SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58-SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64-SEQ ID NO:69中提供了示例性多肽序列。在一些实施例中，多肽序列如SEQ ID NO到51-SEQID NO:55、SEQ ID NO:58到SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:64到SEQ ID NO:66中的任何一个所提供。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:51。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:52。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:53。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:54。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:55。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:58。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:59。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:60。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:61。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:62。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:64。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:65。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:66。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:67。在一些实施例中，多肽序列是SEQ ID NO:68。在一些实施例中，多肽序列是SEQID NO:69。在一些实施例中，多肽序列与SEQ ID NO到51-SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58到SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:64到SEQ ID NO:66中的任何一个具有98％同一性。在一些实施例中，多肽序列与SEQ ID NO到51-SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58到SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:64到SEQ ID NO:66中的任何一个具有99％同一性。在一些实施例中，SEQ ID NO到51-SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58到SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:64到SEQ ID NO:66中的任何一个与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:51与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:52与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:53与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:54与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:55与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:58与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:59与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:60与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:61与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:62与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:64与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:65与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:66与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:67与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:68与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，SEQID NO:69与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。

下面提供了IL-13序列的表。

表2：IL-13氨基酸序列的列表

下面提供了IL-4序列的表。

表3：IL-4氨基酸序列的列表

体面提供了含有IL-4序列或IL-13序列的细胞因子融合体的表。

表4：氨基酸序列的列表

IL-4和/或IL-13突变蛋白融合蛋白

可以将IL-4和/或IL-13突变蛋白制备为融合或嵌合多肽，具体地说，本文列出的融合或嵌合多肽，其包含主题IL-4和/或IL-13突变蛋白和异源多肽(即，非IL-4和/或IL-13的多肽或其突变体)(参见例如，美国专利第6,451,308号)。示例性异源多肽可以增加嵌合多肽在体内的循环半衰期，并因此可以进一步增强突变型IL-4和/或IL-13多肽的特性。在各个实施例中，增加循环半衰期的多肽可以是血清白蛋白，如人血清白蛋白、PEG、PEG衍生物或缺少IgG重链可变区的抗体的IgG亚类的Fc区。示例性Fc区可以包含抑制补体固定和Fc受体结合的突变，或者其可以是裂解的，即能够通过另一种机制(如抗体依赖性补体裂解(ADCC；于1994年12月12日提交的USSN 08/355,502))结合补体或裂解细胞。

“Fc区”可以是天然存在的或合成的多肽，其与通过用木瓜蛋白酶消化IgG而产生的IgG C端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。突变型IL-4和/或IL-13多肽可以包含完整的Fc区或较小部分，所述较小部分保留了延长其所在的嵌合多肽的循环半衰期的能力。另外，全长或片段化的Fc区可以是野生型分子的变体。在一些实施例中，IL-4和/或IL-13突变蛋白融合蛋白(例如，如本文所述的IL-4和/或IL-13突变蛋白)包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区(参见例如，图2A-2B中的序列)。在一些实施例中，Fc区包括取代N297A。

在一些实施例中，IL-4和/或IL-13突变蛋白直接或间接地与异源融合多肽连接。

在一些实施例中，IL-4和/或IL-13突变蛋白直接与Fc区连接。在一些实施例中，IL-4和/或IL-13突变蛋白通过接头肽(如GGGGS)与Fc区连接。在一些实施例中，接头是(GGGGS)n，其中n是介于1和10之间的整数。在一些实施例中，接头是GGGGS(SEQ ID NO:117)。在一些实施例中，接头是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118)。在一些实施例中，接头是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119)。在一些实施例中，接头是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:120)。在一些实施例中，接头是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:121)。

Fc区可以是“裂解的”或“非裂解的”，但是通常是非裂解的。非裂解性Fc区通常缺乏高亲和力Fc受体结合位点和C'1q结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点在IgGFc的位置235处包含Leu残基。因此，可以通过突变或缺失Leu 235来破坏Fc受体结合位点。例如，用Glu取代Leu 235可抑制Fc区结合高亲和力Fc受体的能力。可以通过突变或缺失IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基在功能上破坏鼠C'1q结合位点。例如，用Ala残基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322使IgG1Fc无法定向抗体依赖性补体裂解。相反，裂解性IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和C'1q结合位点。高亲和力Fc受体结合位点在IgG Fc的位置235处包含Leu残基，而C'1q结合位点包含IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。裂解性IgG Fc在这些位点处具有野生型残基或保守氨基酸取代。裂解性IgG Fc可以靶向细胞以产生抗体依赖性细胞毒性或补体定向的细胞溶解(CDC)。还已知人IgG的适当突变(参见例如，Morrison等人,《免疫学家(The Immunologist)》2:119-124,1994；和Brekke等人,《免疫学家》2:125,1994)。

在其它实施例中，嵌合多肽可以包含受试者IL-4和/或IL-13突变蛋白和充当抗原标签(如FLAG序列)的多肽。如本文所述，FLAG序列被生物素化的高度特异性的抗FLAG抗体识别(还参见Blanar等人,《科学(Science)》256:1014,1992；LeClair等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》89:8145,1992)。在一些实施例中，嵌合多肽进一步包括C端c-myc表位标签。

在其它实施例中，嵌合多肽包含突变型IL-4和/或IL-13多肽以及具有增强突变型IL-4和/或IL-13多肽的表达或直接细胞定位的功能的异源多肽，如Aga2p凝集素亚基(参见例如，Boder和Wittrup,《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》15:553-7,1997)。

在其它实施例中，可以产生包含突变型IL-4和/或IL-13以及抗体或其抗原结合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗体或抗原结合性组分可以充当靶向部分。例如，其可以用于将嵌合蛋白定位至细胞或靶分子的特定子集。产生细胞因子-抗体嵌合多肽的方法描述于例如美国专利第6,617,135号中。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗体或其抗原结合部分的融合体，所述融合体破坏PD-1受体与其配体PD-L1之间的相互作用，或者是针对PD-1/PD-L1信号传导通路的组分的抗体。结合PD-1并破坏PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的本领域已知的抗体适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。例如，靶向PD-1并且可以在本发明中发现使用的抗体包含例如但不限于尼武单抗(BMS-936558，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、派姆单抗(lambrolizumab，MK03475或MK-3475，默克公司(Merck))、人源化抗PD-1抗体JS001(上海君士公司(ShangHai JunShi))、单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro公司)、匹地利珠单抗(Pidilizumab，抗PD-1mAb CT-011，麦迪韦逊医疗公司(Medivation))、抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(百济神州公司(BeiGene))和/或抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞公司(ShangHaiHengRui))、人单克隆抗体REGN2810(cemiplimab，再生元制药公司(Regeneron))、人单克隆抗体MDX-1106(百时美施贵宝公司)和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(诺华公司(Novartis))。在一些实施例中，PD-1抗体来自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。其它合适的抗体包含在美国专利第8,008,449号中公开的抗PD-1抗体，所述美国专利通过引用并入本文。在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分与PD-L1特异性结合并抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。结合PD-L1并破坏PD-1与其PD-L1之间的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的本领域已知的任何抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。例如，靶向PD-L1并处于临床试验中的抗体包含BMS-936559(百时美施贵宝公司)和MPDL3280A(基因泰克公司(Genetech))。靶向PD-Ll的其它合适的抗体在美国专利第7,943,743号中公开，所述美国专利通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与PD-1或PD-L1结合、破坏PD-1/PD-L1相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗PD-1抗体的融合体。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗PD-L1抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向CTLA-4并破坏其与CD80和CD86的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。靶向CTLA-4的示例性抗体包含FDA批准的伊匹单抗(MDX-010、MDX-101，百时美施贵宝公司)和替西木单抗(ticilimumab，CP-675、206，辉瑞公司(Pfizer))，二者目前正在进行人体试验。靶向CTLA-4的其它合适的抗体公开于WO 2012/120125、美国专利第6,984720号、美国专利第6,682,7368号以及美国专利申请2002/0039581、2002/0086014和2005/0201994中，所述文献均通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与CTLA-4结合、破坏其与CD80和CD86的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗CTLA-4抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向LAG-3并破坏其与MHC II类分子的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。靶向LAG-3的示例性抗体是IMP321(Immutep公司)，其目前正在进行人体试验。靶向LAG-3的其它合适的抗体在美国专利申请2011/0150892中公开，所述美国专利申请通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与LAG-3结合、破坏其与MHC II类分子的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗LAG-3抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向B7-H3或B7-H4的抗体或其抗原结合部分的融合体。B7家族没有任何定义的受体，但是这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上被上调。靶向B7-H3的示例性抗体是MGA271(Macrogenics公司)，其目前正在进行人体试验。靶向B7家族成员的其它合适的抗体在美国专利申请2013/0149236中公开，所述美国专利申请通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与B7-H3或H4结合并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗B7-H3抗体或抗B7-H4抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向TIM-3并破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。靶向TIM-3的合适的抗体在美国专利申请2013/0022623中公开，所述美国专利申请通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与TIM-3结合、破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗TIM-3抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向4-1BB/CD137并破坏其与CD137L的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，任何与4-1BB/CD137结合、破坏其与CD137L或其它配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗4-1BB/CD137抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向GITR并破坏其与其配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，任何与GITR结合、破坏其与GITRL或另一种配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗GITR抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向OX40并破坏其与其配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，任何与OX40结合、破坏其与OX40L或另一种配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗OX40抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向CD40并破坏其与其配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，任何与CD40结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗CD40抗体的融合体

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向ICOS并破坏其与其配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，任何与ICOS结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗ICOS抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向CD28并破坏其与其配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，任何与CD28结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗CD28抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与靶向IFNα并破坏其与其配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，任何与IFNα结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的嵌合多肽。在一些实施例中，嵌合多肽包括与抗IFNα抗体的融合体。

在一些实施例中，嵌合多肽包括与肿瘤抗原或靶向肿瘤抗原的多肽的融合体。通常，肿瘤抗原允许将肿瘤细胞与其正常细胞对应物区分开，并且可以包含例如肿瘤特异性抗原(TSA)以及肿瘤相关性抗原(TAA)。在一些实施例中，肿瘤抗原是原癌基因和/或肿瘤抑制物，以及过表达或异常表达的细胞蛋白，由致癌病毒产生的肿瘤抗原、胎粪抗原、改变的细胞表面糖脂和糖蛋白和/或细胞类型特异性分化抗原。此类肿瘤抗原可以包含黑色素瘤抗原、癌症-睾丸抗原、上皮肿瘤抗原、细胞周期调节蛋白、前列腺特异性抗原(包含前列腺癌抗原，如在美国专利第5,538,866中所公开的前列腺癌抗原)、淋巴瘤(美国专利第4,816,249号；第5,068,177号；和第5,227,159号)。肿瘤抗原可以包含例如但不限于与2G3和369F10结合的HMW粘蛋白、与c-erbB-2相关的肿瘤抗原(约42kD或55kD糖蛋白)、约40、60、100和200kD与113F1、9-O-乙酰基GD3、p97、α甲胎蛋白(AFP)结合的抗原(例如，针对生殖细胞肿瘤和/或肝细胞癌)、癌胚抗原(CEA)(例如，针对肠癌、偶发性肺癌或乳腺癌)、CA-125(例如，针对卵巢癌)、MUC-1(例如，针对乳腺癌)、上皮肿瘤抗原(ETA)(例如，针对乳腺癌)、酪氨酸酶(例如，针对恶性黑色素瘤)、黑色素瘤相关性抗原(MAGE)(例如，针对恶性黑色素瘤)、癌症/睾丸抗原1(CTAG1B)、黑色素瘤相关性抗原1(MAGEA1)、异常Ras产物、异常p53产物、细胞周期蛋白(包含例如，细胞周期蛋白B1)的过表达、纤连蛋白的突变、MUC1糖蛋白的翻译后改变、分泌的肿瘤抗原(包含例如神经节苷脂)。

作为超级因子被包含的是与这些序列具有90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸和核酸编码序列、包括所述序列但在3'端或5'端还包含另外的核苷酸(例如任何数量的另外的核苷酸或密码子，如3个、6个、9个、12个或更多个核苷酸，或至多约12个、20个、50个或100个另外的核苷酸)的更长序列以及由于遗传密码的简并性而编码与这些核酸相同的氨基酸序列的任何序列。具体地说，经密码子优化(CO)以由期望的宿主表达的序列被认为是本发明的一部分。在一些实施例中，氨基酸序列具有90％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有95％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有98％同一性。在一些实施例中，氨基酸序列具有99％同一性。在一些实施例中，多肽与IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体连接。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自DAP10的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自OX-40的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括一个或多个衍生自CD137的信号传导结构域。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含图2中提供的那些。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含SEQ IDNO:2到SEQ ID NO:38中提供的那些。

在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中提供的那些，其靶向TME(肿瘤微环境)的免疫抑制细胞，如肿瘤相关性巨噬细胞和MDSC(骨髓来源的抑制细胞)，以便T细胞(包含CAR-T细胞)提供更好的治疗效益。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含靶向2型IL4R和/或靶向IL13ra2的那些，其可以将T细胞导向肿瘤抗原。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中提供的那些，其也可以将T细胞(包含CAR-T细胞)导向肿瘤抗原。

本发明还考虑了T细胞靶向(如例如CAR-T细胞靶向)用于将IL-4和/或Il-13突变蛋白或变体递送至肿瘤位点和/或在肿瘤位点上表达的用途。在一些实施例中，采用T细胞靶向(如例如CAR-T细胞靶向)的用途，将IL-4和/或IL-13突变蛋白或变体递送至肿瘤位点。在一些实施例中，采用T细胞靶向(如例如CAR-T细胞靶向)的用途，来获得IL-4和/或IL-13突变蛋白或变体在肿瘤位点处的表达。这样，本发明还提供了免疫细胞表达性构建体，其中用于靶向的免疫细胞还包括编码IL-4/和/或IL-13突变蛋白或其变体的转基因，其中所述IL-4/和/或IL-13突变蛋白或其变体在肿瘤位点处表达。提供了包括IL-4和/或IL-13超级因子序列的免疫细胞表达性构建体，并且可以包含本文所述的任何IL-4和/或IL-13序列。在一些实施方案中，IL-4和/或IL-13突变蛋白是本文公开的任何IL-4/和/或IL-13突变蛋白或变体。在一些实施例中，IL-4和/或IL-13突变蛋白序列与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中的任何一个具有90％同一性。在一些实施例中，病毒通过另一种细胞因子(如IL-4或IL-13)靶向肿瘤，并表达IL-4或IL-13突变蛋白或IL-4或IL-13变体，或者在一些情况下，表达IL-4/Il-13变体双重细胞因子。在一些实施例中，如本文所述的IL-4和/或IL-13和/或IL-4/IL-13双重细胞因子用于将免疫细胞靶向肿瘤细胞，并且IL-2或IL-2变体由免疫细胞中的转基因表达。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中提供的那些，其可以由T细胞(包含CAR-T细胞)表达。在一些实施例中，IL-13Rα2靶向部分将被用作靶向部分，并且IL-2突变蛋白可能是由被靶向的免疫细胞表达的转基因。

表5：示例性IL-2突变蛋白的列表

下面提供了细胞因子和含有IL-4序列或IL-13序列的细胞因子融合体的所选核酸序列的表。

表6：所选核酸序列的列表

表7：所选融合伴侣的列表

NK细胞

在一些实施例中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。NK细胞通过多种细胞表面受体(包含NKG2D、CD16和自然细胞毒性受体(NCR)，如NKp44、NKp46和NKp30)识别被感染或转化的细胞。这些受体激活信号传导衔接蛋白，如DAP10、DAP12和CD3ζ，其含有免疫酪氨酸激活基序(ITAM)，所述基序会引发含有穿孔素和颗粒酶的溶细胞性颗粒的释放，并介导细胞因子和趋化因子(如IFN-γ和TNF-α)的产生和释放。重要的是，NK细胞介导的细胞毒性不依赖于自身HLA的表现。因此，由于NK细胞可用于同种异体环境并有可能提供现成的细胞产物，因此作为基于细胞的癌症疗法，NK细胞具有重要的临床意义。

自然杀伤细胞由于不需要HLA匹配，因此可以替代T细胞用于过继免疫疗法，因此可以用作同种异体效应细胞。过继转移的同种异体NK细胞的临床试验表明，这些细胞可以在患者体内存活数周至数月。另外，与通常对NK细胞敏感的血液系统恶性肿瘤(尤其是急性骨髓性白血病)相比，NK细胞中CAR的表达使这些细胞能够更有效地杀死通常对NK细胞介导的活性具有抗性的实体瘤。可用于NK细胞靶向的CAR包含例如第一代CAR构建体，所述构建体含有CD3ζ作为唯一信号传导结构域。第二代和第三代CAR也可用于NK细胞。在一些实施例中，NK细胞活化受体NKG2D的胞外域直接与CD3ζ连接。

用于修饰的NK细胞包含细胞系或外周血NK细胞，如果需要大量细胞，则可以通过简单的抽血或单采血液分离术将其从供体中分离出来。活化的PB-NK细胞表达更广泛的活化受体，如CD16、NKp44和NKp46以及KIR，它们在NK细胞许可中发挥重要作用。另外，PB-NK细胞可以不进行照射的情况下给予，因此具有体内扩增的能力。适合用于CAR表达的NK细胞的另一个来源是源自人多能干细胞的NK细胞-诱导多能干细胞(iPSC)或人胚胎干细胞(hESC)。这些NK细胞表现出与PB-NK细胞相似的表型，并且hESC/iPSC-NK细胞可以在临床规模上生长。

嵌合抗原受体(CAR)

除超级因子序列外，CAR还含有CD3ζ的信号传导结构域和一种或多种共刺激受体的信号传导结构域，所述一种或多种共刺激受体进一步促进表达CAR的免疫细胞的再循环、存活和/或扩增。共刺激受体的信号传导结构域是每种受体蛋白的细胞内部分，所述细胞内部分在细胞中产生激活信号。实例是天然CD28分子的氨基酸180-220和天然4-1BB分子的氨基酸214-255。

将超级因子连接至信号传导区的合适的铰链区和跨膜区的实例可以包含但不限于免疫球蛋白、人CD8a的恒定(Fc)区，以及用于将靶向部分从细胞表面移走从而改善对靶细胞的访问和结合的人工接头。合适的跨膜结构域的实例包含白细胞CD标志物的跨膜结构域，优选地，CD4或CD28的跨膜结构域。细胞内受体信号传导结构域的实例包含T细胞抗原受体复合物，优选地，CD3的ζ链，但是可以使用任何足以将CAR锚定在膜中的跨膜区域。技术人员知道许多跨膜区域和结构元件(如亲脂性氨基酸区域)，所述结构元件在许多膜蛋白中产生跨膜结构域，并因此可以取代任何方便的序列。适合用于改善表达CAR的细胞的功能和活性的T细胞共刺激信号传导受体包含但不限于CD28、CD137和OX-40。

IL2的产生和增殖需要经由CD28的信号传导，但所述信号传导在维持T细胞功能和活性方面不起主要作用。CD137(在CD28活化后表达的肿瘤坏死因子受体家族成员)和OX-40参与驱动T细胞的长期存活和T细胞的积累。这些受体的配体通常在专业抗原呈递细胞(如树突状细胞和活化的巨噬细胞)上表达，但在肿瘤细胞上不表达。与表达仅含有CD3ζ信号传导结构域的CAR(所述构建体可能被称为第二代或第三代CAR)相比，表达在CD4⁺ T细胞中掺入CD28和/或4-1BB信号传导结构域的CAR可增强这些细胞的活性和抗肿瘤能力。

作为所关注的CAR构建体被包含的是串联CAR，例如，参见Hegde等人(2016)《临床研究期刊(J.Clin.Invest)》126(8):3036-3052，所述文献通过引用特别地并入本文。在这种构建物中，肿瘤特异性抗原的结合部分与IL-13超级因子串联结合。结合部分可以是例如对肿瘤细胞抗原具有特异性的scFv，包含但不限于本领域已知的HER-2、EGFR、CD20等。

在各个实施例中，抗原结合结构域与靶细胞(例如，癌细胞)上的抗原结合。抗原结合结构域可以结合抗原，如但不限于肿瘤靶抗原。在一些情况下，抗原结合结构域结合一种或多种抗原。示例性抗原结合结构域可以结合抗原，所述抗原包含但不限于D19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称被为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcαSer/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面缔合(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延伸因子2突变(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-1受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp 100)；癌基因融合蛋白，由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)(bcr-abl)组成；酪氨酸酶ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸化的路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关性抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；claudin 6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关性抗原1(MAGE-A1)；位于12p染色体上的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；surviving；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-1或Galectin 8)，被T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART 1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾ubiquitous1(RU1)；肾ubiquitous2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；热激蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

在一些实施例中，抗原结合结构域包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、纳米抗体、单链可变片段(scFv)、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv等。抗原结合结构域可以与CAR的跨膜结构域连接。在一些实施例中，编码抗原结合结构域的核酸可操作地连接至编码CAR的跨膜结构域的核酸。

在一些实施例中，跨膜结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白。在某些实施例中，与膜结合蛋白或跨膜蛋白的跨膜结构域的野生型氨基酸序列相比，所述跨膜结构域包括一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)氨基酸修饰(例如，取代、插入和缺失)。CAR的跨膜结构域的非限制性实例至少包含以下的一个或多个跨膜区：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε(CD3ξ)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或促红细胞生成素受体。在一些实施例中，跨膜结构域包含人免疫球蛋白(Ig)铰链区，例如，IgG4Fc铰链。在其它实施例中，跨膜结构域是包括疏水性氨基酸残基(例如，亮氨酸和缬氨酸)的重组结构域或合成结构域。在一些情况下，跨膜结构域在该结构域的一个或两个末端处包含苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。

跨膜结构域将抗原结合结构域连接至CAR的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，编码抗原结合结构域的核酸可操作地连接至编码跨膜结构域的核酸，后者可操作地连接至编码胞内信号传导结构域的核酸。

在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包括信号活化或信号转导结构域。这样，细胞内信号传导结构域包含蛋白质的细胞内信号传导结构域的足以转导或传递信号(例如，活化信号)或介导细胞内的细胞应答的任何部分。非限制性实例包含TCR、CD2、CD3ξ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD7、CD27、CD86、常见的FcRγ、FcRβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、其任何衍生物、变体或片段。在某些实施例中，细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的细胞内结构域，如来自CD3、CD27、CD28、CD127、ICOS、4-1BB(CD137)、PD-1、T细胞受体(TCR)、其任何衍生物或其任何变体的共刺激分子。在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导性淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化的NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及与CD83特异性结合的配体。

BiTES

双特异性T细胞衔接子(BiTE)是融合蛋白，其包括与特异性结合CD3的抗体可变区融合的IL-13超级因子。在一些实施例中，单链可变片段(scFv)中的抗体可变区。超级因子可以通过接头融合至可变区。任选地提供Fc区。

TAC

TAC构建体包括IL-13超级因子，所述IL-13超级因子融合至结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体；融合至T细胞受体信号传导结构域多肽。结构域可以通过接头分隔开。与TCR复合物相关联的蛋白质可以是CD3。结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体可以是单链抗体。结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体可以是UCHT1或其变体。T细胞受体信号传导结构域多肽可以包括胞质结构域和跨膜结构域。胞质结构域可以是CD4胞质结构域，并且跨膜结构域是CD4跨膜结构域。

ACTR

ACTR是CAR与已建立的单克隆抗体肿瘤治疗剂的混合方法。ACTR由典型的CAR构建体组成，所述典型的CAR构建体可以通过Fc受体CD16的高亲和力变体结合抗体的重链。超级因子融合至CAR识别的部分，所述部分可以包含但不限于对CD16具有高亲和力的抗体的Fc区。

可以通过本领域已知的任何手段(包含重组DNA技术)产生免疫细胞靶向性构建体编码序列。可以通过本领域已知的分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助的连接、定点诱变等)来方便地制备编码嵌合受体几个区域的核酸，并将其组装成完整的编码序列。可以将所得的编码区插入表达载体中，并用于转化合适的表达宿主细胞系，例如异体或自体T淋巴细胞、异体或自体NK细胞的群体，包含原代培养物、细胞系、iPSC衍生的细胞等。所述方法可用于体外(例如，无细胞系统中)的细胞、培养物(例如体外或离体)中的细胞。例如，可以在体外培养基中培养和扩增IL-13超级因子CAR表达性细胞。

IL13超级因子免疫细胞靶向性构建体可以以MHC非依赖性方式特异性地引导免疫细胞靶向表达IL13Rα2的神经胶质瘤细胞、肾癌细胞和表达IL13Rα2的任何癌症的细胞。IL13Rα2已被鉴定为多种人类肿瘤(包含乳腺癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌和卡波西氏肉瘤以及神经胶质瘤)上过度表达的细胞表面靶标。通过将IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体引入T细胞中，产生抗肿瘤效应细胞(例如CD4⁺或CD8⁺效应T细胞)以进行重新定向，从而识别此类肿瘤细胞，所述构建体包括衍生自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的一个或多个信号传导结构域。

使用如本领域已知的方法(例如非病毒质粒载体和电穿孔方法；病毒载体和感染方法等)将IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体感染或转染到人免疫细胞中。包括共刺激性信号传导结构域的CAR可以以能够显著改善过继疗法方案的临床功效的方式来增强抗肿瘤活性的持续时间和/或保留。CD4⁺和CD8⁺ T细胞效应子功能以及NK细胞功能可以通过这些受体触发，因此这些细胞类型被考虑用于本发明。表达本发明的IL13超级因子CAR的CD8⁺T细胞可用于裂解靶细胞并在靶细胞存在的情况下产生IL-2，以及这些细胞的其它功能。在CD4⁺和CD8⁺ T细胞之一或两者中表达适当的共刺激性CAR可为过继免疫疗法提供最有效的细胞群体，因此由表现出增强和/或长期生存能力和抗肿瘤活性的专业辅助性和杀伤性T细胞之一或两者组成。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含图2中提供的那些。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中提供的那些。

出于各种目的，本发明的多肽可以被进一步修饰，例如，与多种其它寡肽或蛋白质连接。例如，翻译后修饰，例如通过异戊烯基化、乙酰化、酰胺化、羧化、糖基化、聚乙二醇化等。此类修饰也可包含糖基化的修饰，例如通过在多肽的合成和加工过程中或在进一步的加工步骤中修饰多肽的糖基化模式而进行的修饰；例如通过使多肽暴露于影响糖基化的酶，如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶。

本领域技术人员众所周知的方法可用于构建含有编码序列和适当的转录/翻译控制信号的T细胞靶向性构建体表达载体。这些方法包含例如体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。可替代地，可以化学合成能够编码所关注的多肽的RNA。本领域技术人员可以容易地利用众所周知的密码子使用表和合成方法来为本发明的多肽中的任何一种多肽提供合适的编码序列。可以分离核酸并以基本纯度获得。通常，将获得基本上不含其它天然存在的核酸序列的核酸，无论是DNA还是RNA，所述核酸序列通常具有至少约50％(通常至少约90％)的纯度并且通常是“重组的”，例如，侧翼是天然存在的染色体上通常与其不相关的一个或多个核苷酸。本发明的核酸可以作为线性分子提供或在环状分子内提供，并且可以在自主复制的分子(载体)内提供或在没有复制序列的分子内提供。核酸的表达可以通过其自身或通过本领域已知的其它调节序列来调节。可以使用本领域中可用的多种技术将本发明的核酸引入合适的宿主细胞中。

根据本发明，可以在适合用于治疗用途(例如用于人类治疗)的药物组合物中提供免疫细胞靶向性构建体载体和经免疫细胞靶向性构建体修饰的细胞。在一些实施例中，本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的治疗实体或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物。在一些其它实施例中，本发明的药物组合物包含与另一种治疗剂(例如，另一种抗肿瘤剂)组合的一种或多种本发明的治疗实体。

本发明的治疗实体通常以药物组合物的形式施用，所述药物组合物包括活性治疗剂和其它药学上可接受的赋形剂。此类调配物可以包含一种或多种无毒的药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。根据期望的调配物，组合物还可以包含被定义为通常用于配制药物组合物以供动物或人类施用的媒剂的药学上可接受的无毒载体或稀释剂。选择稀释剂以致于不影响该组合物的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克(Hank)溶液。另外，药物组合物或调配物还可以包含其它载体、佐剂、或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。

在另一些其它实施例中，本发明的药物组合物还可以包含大型缓慢代谢的大分子(如蛋白质)、多糖(如壳聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(如乳胶官能化的Sepharose^TM、琼脂糖、纤维素等)、聚氨基酸、氨基酸共聚物以及脂质聚集体(如油滴或脂质体)。

可在临床试验开发过程中确定CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)，例如至多约10⁴个T细胞/kg体重、至多约10⁵个细胞/kg体重、至多约10⁶个细胞/kg体重、至多约5x10⁶个细胞/kg体重、至多约10⁷个细胞/kg体重、至多约5x10⁷个细胞/kg体重或更多，如根据经验所确定的。在一些实施例中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)为至多约10⁴个T细胞/kg体重。在一些实施例中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)为至多约10⁵个T细胞/kg体重。在一些实施例中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)为至多约10⁶个T细胞/kg体重。在一些实施例中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)为至多约10⁷个T细胞/kg体重。在一些实施例中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)为至多约5x10⁶个T细胞/kg体重。在一些实施例中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)为至多约5x10⁷个T细胞/kg体重。

可以通过在细胞培养物或实验用动物中的标准药物程序来确定本文所述的细胞的毒性，例如通过确定LD₅₀(致死50％的群体的剂量)或LD₁₀₀(致死100％的群体的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于制定对于在人类中使用无毒的剂量范围。本文所述的剂量优选地处于循环浓度的范围内，所述循环浓度包含低毒性或无毒性的效剂量。根据所采用的剂型和所利用的施用途径，剂量可以在此范围内变化。精确的调配物、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的病状来选择。

在剂量增加阶段之后，用免疫细胞以MTD治疗扩展队列中的患者。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3到6个月一次施用。通常在多种场合下施用本发明的治疗实体。单一剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中治疗实体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规律的。

在预防性应用中，例如为了维持患者的缓解，可以在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在其它治疗性应用中，有时需要相对较短的间隔下相对高的剂量，直到疾病进展减少或终止，并且优选地直到患者显示出疾病症状部分改善或完全改善。此后，可以对患者施用预防方案。

可以与免疫细胞靶向形构建体共同施用和/或共同配制的另外的治疗剂的实例包含：抗增殖或细胞还原疗法，其在治疗上用于消除宿主中的肿瘤细胞和其它不良细胞，并且包含如电离辐射的递送和化学治疗剂的施用等疗法的使用。化学治疗剂是本领域众所周知的，并且以常规剂量和方案或以降低的剂量或方案使用，包含例如拓扑异构酶抑制剂，如蒽环类，包含化合物柔红霉素、阿霉素(多柔比星)、表柔比星、伊达比星、阿米霉素、MEN 10755等。其它拓扑异构酶抑制剂包含鬼臼毒素类似物依托泊苷和替尼泊苷，以及蒽二酮、米托蒽醌和安吖啶。其它抗增殖剂会干扰微管的组装，例如长春花生物碱家族。长春花生物碱的实例包含长春碱、长春新碱；长春瑞滨(NAVELBINE)；长春地碱；长春花碱；长春胺等。DNA破坏剂包含核苷酸类似物、烷基化剂等。烷基化剂包含氮芥子油，例如氮芥、环磷酰胺、美法仑(L-岩溶素)等；和亚硝基脲，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链佐星、氯唑霉素等。核苷酸类似物包含嘧啶，例如阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、阿糖胞嘧啶、氟脲嘧啶(5-FU)、氟脲苷(FUdR)等；嘌呤，例如硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤)、巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、氟脲嘧啶(5-FU)等；和叶酸类似物，例如甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-二氮杂叶酸酯(PDDF，CB3717)、5,8-二氮杂四氢叶酸(DDATHF)、亚叶酸钙等。其它所关注的化学治疗剂包含金属复合物，例如顺铂(cis-DDP)、卡铂、奥沙利铂等；脲类，例如羟基脲；和肼类，例如N-甲基肼。

例如，电离辐射(IR)通过沉积会损伤或破坏被治疗区域中的细胞的能量而用于治疗约60％的癌症患者，并且出于本发明的目的，可以以常规剂量和方案进行递送，或以减少的剂量进行递送。细胞的辐射损伤是非特异性的，对DNA具有复杂的作用。治疗的功效取决于对癌细胞的细胞损伤大于对正常细胞的损伤。放射疗法可用于治疗每种类型的癌症。某些类型的放射疗法涉及光子，如X射线或γ射线。另一种用于将放射线传递给癌细胞的技术是内部放射疗法，所述内部放射疗法将放射性植入物直接置于肿瘤或体腔中，从而使放射剂量集中在较小的区域。电离辐射的合适剂量可以在至少约2Gy到不大于约10Gy的范围内，通常为约5Gy。紫外线辐射的合适剂量可以在至少约5J/m²到不大于约50J/m²的范围内，通常为约10J/m²。可以在紫外线辐射后至少约4小时且不超过约72小时(通常为约4小时)收集样品。

治疗也可以与免疫调节性调节剂组合，所述免疫调节性调节剂包含激动免疫共刺激分子(例如CD40、OX40等)的试剂；和/或(iii)拮抗免疫抑制分子(例如CTLA-4、PD-1、PD-L1等)的试剂。在一段时间内施用活性剂以对宿主中的癌细胞耗竭产生累加或协同作用。施用方法包含但不限于全身给药、肿瘤内施用等。

在一些实施例中，选择单个癌症用于组合疗法治疗，因为所述癌症是对检查点抑制剂(例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、BTLA拮抗剂、VISTA拮抗剂、LAG3拮抗剂等)有反应的癌症类型。在一些实施例中，这种免疫调节剂是CTLA-4、PD1或PDL1拮抗剂，例如avelumab、纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗等。在一些这种实施例中，癌症是但(不限于)黑色素瘤或小细胞肺癌。在一些这种实施例中，癌症是具有高新抗原或诱变负担的类型(参见Vogelstein等人(2013)《科学》339(6127):1546-1558，所述文献通过引用特别地并入本文)。

在一些实施例中，选择单个癌症用于用本发明的族合疗法治疗，因为所述癌症是对免疫应答激动剂(例如CD28激动剂、OX40激动剂；GITR激动剂、CD137激动剂、CD27激动剂、HVEM激动剂等)有反应的癌症类型。在一些实施例中，此类免疫调节剂为OX40、CD137或GITR激动剂，例如替西木单抗等。在一些这种实施例中，癌症是但(不限于)黑色素瘤或小细胞肺癌。在一些这种实施例中，癌症是具有高新抗原或诱变负担的类型。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合PD-1并破坏PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用，并刺激抗肿瘤免疫应答。在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。例如，靶向PD-1并且可以在本发明中发现使用的抗体包含例如但不限于尼武单抗(BMS-936558，百时美施贵宝公司)、派姆单抗(lambrolizumab，MK03475或MK-3475，默克公司)、人源化抗PD-1抗体JS001(上海君士公司)、单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro公司)、匹地利珠单抗(抗PD-1mAb CT-011，麦迪韦逊医疗公司)、抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(百济神州公司)和/或抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞公司)、人单克隆抗体REGN2810(再生元制药公司)、人单克隆抗体MDX-1106(百时美施贵宝公司)和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(诺华公司)。在一些实施例中，PD-1抗体来自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。其它合适的抗体包含在美国专利第8,008,449号中公开的抗PD-1抗体，所述美国专利通过引用并入本文。在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分与PD-L1特异性结合并抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。结合PD-L1并破坏PD-1与其PD-L1之间的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的本领域已知的任何抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。例如，靶向PD-L1并处于临床试验中的抗体包含BMS-936559(百时美施贵宝公司)和MPDL3280A(基因泰克公司(Genetech))。靶向PD-Ll的其它合适的抗体在美国专利第7,943,743号中公开，所述美国专利通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与PD-1或PD-L1结合、破坏PD-1/PD-L1相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合CTLA-4并破坏其与CD80和CD86的相互作用。靶向CTLA-4的示例性抗体包含FDA批准的伊匹单抗(MDX-010、MDX-101，百时美施贵宝公司)和替西木单抗(ticilimumab，CP-675、206，辉瑞公司(Pfizer))，二者目前正在进行人体试验。靶向CTLA-4的其它合适的抗体公开于WO 2012/120125、美国专利第6,984720号、美国专利第6,682,7368号以及美国专利申请2002/0039581、2002/0086014和2005/0201994中，所述文献均通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与CTLA-4结合、破坏其与CD80和CD86的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合LAG-3并破坏其与MHC II类分子的相互作用。靶向LAG-3的示例性抗体是IMP321(Immutep公司)，其目前正在进行人体试验。靶向LAG-3的其它合适的抗体在美国专利申请2011/0150892中公开，所述美国专利申请通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与LAG-3结合、破坏其与MHC II类分子的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合TIM-3并破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用。靶向TIM-3的合适的抗体在美国专利申请2013/0022623中公开，所述美国专利申请通过引用并入本文。普通技术人员将理解，任何与TIM-3结合、破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合4-1BB/CD137并破坏其与CD137L的相互作用。普通技术人员将理解，任何与4-1BB/CD137结合、破坏其与CD137L或其它配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合GITR并破坏其与其配体的相互作用。普通技术人员将理解，任何与GITR结合、破坏其与GITRL或另一种配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合OX40并破坏其与其配体的相互作用。普通技术人员将理解，任何与OX40结合、破坏其与OX40L或另一种配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合CD40并破坏其与其配体的相互作用。普通技术人员将理解，任何CD40结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合ICOS并破坏其与其配体的相互作用。普通技术人员将理解，任何与ICOS结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合CD28并破坏其与其配体的相互作用。普通技术人员将理解，任何CD28结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

在一些实施例中，组合疗法包含本领域已知的抗体，其结合IFNα并破坏其与其配体的相互作用。普通技术人员将理解，任何与IFNα结合、破坏其与其配体的相互作用并刺激产生总体抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫应答或免疫刺激应答的抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。

“抗癌治疗”是预防或延迟癌细胞的生长和/或转移的化合物、组合物或治疗(例如，手术)。此类抗癌治疗包含但不限于手术(例如，切除全部或部分肿瘤)、化学治疗药物治疗、放射、基因疗法、激素操纵、免疫疗法(例如，治疗性抗体和癌症疫苗)以及反义或RNAi寡核苷酸疗法。有用的化学治疗药物的实例包含但不限于羟基脲、布舒芬、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺、丹诺比星、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、长春新碱、长春花碱、Navelbine.RTM.(长春瑞滨)、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、胞嘧啶、阿糖胞苷、博来霉素、新癌抑素、苏拉明、他克唑、丝裂霉素C、阿瓦斯汀、Herceptin.RTM、氟脲嘧啶和替莫唑胺等。化合物也适合用于与采用两种或多种化学治疗剂的标准组合疗法一起使用。应当理解，抗癌治疗包含未来开发的新型化合物或治疗。

上述药物组合物和/或调配物包含达到预期目的的有效量的一种或多种治疗实体。因此，术语“治疗有效剂量”是指可改善癌症症状的治疗实体的量。化合物的治疗有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以在细胞培养测定中或在动物模型(如本文所述的动物模型)中初步估计治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定合适的浓度范围和施用途径。然后，可以使用本领域普通技术人员已知的标准方法，使用此类信息确定在其它动物(包含人类)中的有用剂量和施用途径。

包括本发明的组合物和使用说明书的试剂盒也在本发明范围内的。试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂，例如化学治疗药物、抗肿瘤抗体等。试剂盒通常包含标明试剂盒内含物的预期用途的标签。术语标签包含在试剂盒上或与试剂盒上一起提供的任何书写或记录材料，或者以其它方式随附于试剂盒的书写或记录材料。

现在已经充分描述了本发明，对于本领域普通技术人员而言将显而易见的是，可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下对本发明进行各种改变和修改。在一些实施例中，试剂盒包括IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体，所述构建体包括本文所述的IL-13变体/IL-13超级因子。在一些实施例中，试剂盒包括IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体，所述构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含图2中提供的那些。在一些实施例中，IL-13和/或IL-4超级因子免疫细胞靶向性构建体包括IL-13变体/IL-13超级因子，包含SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:38中提供的那些。

实验

提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开内容和描述，并且不旨在限制诸位发明人看待其发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已努力确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当对一些实验误差和偏差进行解释。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是在大气压下或接近大气压。

本说明书中所引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，如同具体地和单独地指示将每个单独的出版物或专利申请通过引用并入本文。

已经根据本发明人发现或提出的特定实施例描述了本发明，以包括用于实践本发明的优选模式。本领域技术人员将理解的是，鉴于本公开，在不脱离本发明的预期范围的情况下，可以对例示的特定实施例进行多种修改和改变。例如，由于密码子冗余，可以在不影响蛋白质序列的情况下在底层DNA序列中进行改变。此外，由于生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物作用的种类或数量的情况下在蛋白质结构中进行改变。所有这种修改旨在包含在所附权利要求书的范围内。

实例1：

方法：

蛋白质表达和纯化。将人IL-13和人IL-13Rα1和IL-13Rα2选择性变体克隆到具有C端6x组氨酸标签的昆虫表达载体pAcGP67(BD Biosciences)中，并使用重组杆状病毒在昆虫Hi5细胞中产生所述抗体。在用镍琼脂糖感染60小时后，将蛋白质从Hi5上清液中回收，并通过尺寸排阻色谱法在Superdex-200色谱柱上浓缩并纯化到HBS(10mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl)中。通过用C端生物素受体肽(BAP)-LNDIFEAQKIEWHE和六组氨酸标签克隆到pAcGP67-A载体中，获得了生物素化的IL-13Rα1(氨基酸1-310)和IL-4Rα1(氨基酸1-202)胞外域。受体蛋白与BirA连接酶与过量的生物素(100μM)共表达。

表面等离子体共振。SPR实验是在Biacore T100仪器上进行的。实验使用了Biacore SA传感器芯片(GE Healthcare)。以低密度(100–200RU)捕获生物素化的IL-13Rα1和IL-13Rα2受体，并以40微升/分钟的速度进行动力学运行。将无关的生物素化的蛋白固定为SA传感器芯片的参考表面，并将RU与实验表面匹配。使用具有1:1Langmuir结合模型的Biacore T100评估软件2.0版分析所有数据。将连续缓冲液中未生物素化的IL-13变体的连续稀释液[1xHBS-P(GE Healthcare)+0.5％BSA]流过芯片，并通过7mM甘氨酸(pH3.0)的60秒注射使IL-13Rα1/IL-13Rα2再生。

磷酸流式细胞术测定。用所示剂量的IL-13和IL-13特异性变体刺激IL-13反应性细胞系A549，持续15分钟。然后将样品在室温下固定在PFA中，持续15分钟，用PBS 0.5％BSA洗涤，并用冷(4℃)甲醇渗透10分钟。使用偶联至荧光团Alexi 488(BD Bioscience)的抗pY641Stat6检测磷酸化Stat6的水平。在配备有405、488和640nm激光器的BectonDickinson LSRII上进行分析。在花旗银行软件中进行数据分析。将对数中值荧光强度值相对于细胞因子浓度作图，以产生剂量-反应曲线。

TF-1细胞增殖测定。在存在指定剂量的IL-13或不同的IL-13变体的情况下，将TF-1细胞接种至2x10⁵个细胞/ml，持续96小时。将细胞用冷(4C)PBS洗涤3次，并在室温下用4％PFA固定15分钟。通过流式细胞术确定每个孔中的细胞数。将细胞数以百分比表示，并相对于细胞因子浓度作图以获得剂量-反应曲线。

树突状细胞分化测定。通过用抗CD14共轭微珠(Miltenyi Biotec)进行磁分离，从外周血单核细胞中分离出CD14⁺单核细胞(纯度>97％)。随后在存在2μg/ml同型对照抗体、抗IL-4Rα1抗体或IL-13dn的情况下，将5x10⁵个CD14⁺单核细胞单独地或连同指定浓度的IL-13一起与50ng/mL GM-CSF一起培养在含有IMDM培养基(Gibco)的2ml孔板中，所述培养基补充有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸和50μM 2-ME。在第6天用5mM EDTA处理细胞，随后用DAPI(英杰公司(Invitrogen))、荧光标记的同种型对照mAb或针对CD14、CD86、CD209和HLA-DR的mAb(BD Biosciences)进行染色。通过使用BD LSRII流式细胞仪的流式细胞术评估树突状细胞的分化，并通过FlowJo(Treestar)产生中值荧光强度。

IL-13dn功效的体内测试。在第0天、第3天和第5天，在注入或不注入150μg IL-13dn的情况下，气管内注射360ng小鼠IL-13。在第六天收获肺。提取RNA并通过定量PCR评估Muc5ac、骨膜素、Arg1、CHIA、YM1、Fizz1的表达水平。

实例2：

该实施例提供了本发明呈现的CAR构建体的示例性突变蛋白序列。

所制备的构建体是基于单独的SEQ ID NO:18的IL-13序列以及其与SEQ ID NO:107(H9)的IL-2突变蛋白的组合而合成的。N端的信号肽序列在下面列出的序列中用下划线标出。CAR序列紧随SEQ ID NO:18的IL-13序列。

图8的PMC 393含有SEQ ID NO:18的IL-13序列。对于所述载体，与CAR关联的序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARPASPGPVPPSTAHRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVTGRKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFN-[CAR…]

图9的PMC 394含有SEQ ID NO:18的IL-13序列以及SEQ ID NO:107(H9)的IL-2突变蛋白。对于所述载体，与CAR关联的序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARPASPGPVPPSTAHRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVTGRKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFN-[CAR…]

IL-2突变蛋白为SEQ ID NO:107(H9)，其分泌为：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT。

设计：

转导前分析：使用慢病毒质粒瞬时转染HEK293细胞作为验证。结果表明存在表达。

产生了第二批慢病毒。

将含有IL13RA-CAR的慢病毒用于转导人PBMC(供体871)，并扩增14天。

FACS分析示出了分别来自PMC 393和394的99％和96％表达(flag标签)(参见图10)。另请参见图12-20中提供的数据。

FACS分析

总共从培养物中新鲜收获了6个细胞系。用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤细胞3次，并用1:100正常小鼠血清封闭FcR。

将细胞用以下物质染色：

a)抗IL13RA2克隆47

b)抗IL13RA2克隆SHM38

c)7-AAD(死亡细胞)-门输出

染色包含在FACS染色缓冲液中于4℃下，每个20ul，持续30分钟。

在FACSCalibur上获得细胞，并如图17-20中提供的进行测定。

本文提及的所有专利、专利出版物和其它公开的参考文献均通过引用整体并入本文，其程度如同每个文献均已单独地且具体地通过引用并入本文。

虽然已经提供了具体实例，但是以上描述是说明性而非限制性的。前述实施例中的所述特征中的任何一个或多个特征可以以任何方式与本发明中的任何其它实施例的一个或多个特征组合。此外，在阅读了本说明书后，本发明的许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。因此，本发明的范围应该通过参考所附权利要求及其等效物的全部范围来确定。

提供上述实例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物、系统和方法的实施例的完整公开和描述，而不是旨在限制发明人认为是其发明的范围。对于本领域技术人员而言显而易见，用于执行本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个参考文献已经以全文引用的方式单独地并入。

使用所有标题和章节命名仅仅是出于清楚和参考的目的，并且不应当被视为以任何方式进行限制。例如，本领域的技术人员将认识到根据本文所描述的本发明的精神和范围，适当地组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。

本文中所引用的所有参考文献在此通过引用以其整体并入本文中，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地或单独地被指示出于所有目的以其整体通过引用并入。

在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的具体实施例和实例仅通过举例的方式提供，并且本申请仅受所附权利要求的条款以及权利要求有权获得的等效物的全部范围的限制。