具体实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义，例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。将标准技术用于分子生物学、遗传和生化方法(参见，Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版,JohnWiley&Sons,Inc.),其通过引用并入本文。

本发明涉及选择多肽配体的靶标的方法、所述靶标、所述配体以及所述靶标和配体的使用和制备方法。

在最优选的实施方案中，本发明涉及一种选择配体的靶标的方法，所述配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，所述方法包括：

(a)筛选一种或多种存在口袋的蛋白，所述口袋包括以下特征：

(i)约1000至的体积；和

(ii)至少一个溶剂可及的末端；和

(b)选择至少一种具有至少一个如(a)中所限定的口袋的蛋白。

配体

如本文所用，术语“配体”是指与任何分子、分子的部分、离子、原子、基序、抗体、表位、受体或其任何部分结合的离子或分子。本发明中使用的配体优选包含肽或由肽组成，在大多数实施方案中包含多肽或由多肽组成。

本文所指的(多)肽“配体”或(多)肽“缀合物”(有时在本文的上下文中简称为“肽”或“多肽”)是指与分子支架共价结合的多肽。通常，这样的多肽包含两个或更多个能够与支架形成共价键的反应性基团，并且包含在所述反应性基团之间相对(subtended)的序列，因为当肽与支架结合，该序列形成环，所述称为“环序列”。在当前情况下，多肽配体包含至少三个反应性基团，并在支架上形成至少两个环。

本发明的多肽配体可以是天然存在的。优选地，本发明的多肽配体是从天然存在的那些合成或修饰的。

如本文所用，术语“蛋白”具有本领域的通常含义，并且包括衍生化的蛋白、膜蛋白、细胞骨架蛋白和胞质蛋白。蛋白包含任意数目的氨基酸，包括天然存在的氨基酸和合成的氨基酸。任何多肽也构成蛋白。

优选地，多肽配体是

在一个实施方案中，在本发明的方法中使用的肽配体与靶标口袋相互作用，所述靶标口袋具有至少1000至的体积，更优选至少1250至最优选至少1400至的体积。

在一个实施方案中，在本发明的方法中使用的肽配体具有至少700至的表面积，最优选900至的表面积。

如本文所用，术语“反应性基团”是指能够与分子支架形成共价键的基团。通常，反应性基团存在于肽配体的氨基酸侧链上。示例是含氨基的基团，例如半胱氨酸、赖氨酸和硒代半胱氨酸。

在本文的上下文中，术语“特异性”是指配体与其同源靶标结合或与其相互作用的能力，而不与靶标相似的实体结合或相互作用。例如，特异性可以指配体抑制人酶的相互作用的能力，而不抑制来自不同物种的同源酶。使用本文描述的方法，可以调节特异性，使其增加或降低，以使配体能够更多或更少地与预期靶标的同源物或旁系同源物相互作用。特异性并不旨在与活性、亲和力或亲和性同义，并且配体对其靶标的作用效力(例如，结合亲和力或抑制水平)并不一定与其特异性相关。

如本文所用，术语“结合活性”是指从结合测定法中获得的定量的结合度量。因此，结合活性是指在给定的靶标浓度下结合的肽配体的量。在一级结合测定法中，优选的靶标结合在10至20微摩尔的区间内。开发的亲和力成熟的分子可以与改善的亲和力结合。

根据本领域众所周知的方法(例如根据噬菌体展示技术)进行活性筛选，如结合活性或任何其他期望的活性。例如，固定在固相上的靶标可以用于鉴定和分离库中的结合成员。筛选允许根据期望的特征选择库中的成员。

可以首先通过计算机进行存在口袋的蛋白的筛选。

多特异性是与两个或多个靶标结合的能力。通常，由于结合肽的构象性质，其能够结合单个靶标，例如在抗体情况下所述靶标为表位。但是，可以开发能够结合两个或多个靶标的肽；例如，双特异性抗体。在本发明中，肽配体能够结合两个或多个靶标，因此是多特异性的。优选地，它们结合两个靶标，是双特异性的。结合可以是非依赖性的，这意味着肽上针对靶标的结合位点在结构上不受一个或另一个靶标结合的阻碍。在这种情况下，两个靶标都可以独立地结合。更普遍地，预期一个靶标的结合将至少部分地阻碍另一个靶标的结合。

如本文所用且在下文进一步定义的术语“分子支架”，是指能够在多个点连接如本发明所用的肽配体以赋予该肽配体一个或多个结构特征的任何分子。分子支架不是交联剂，因为它不仅取代了二硫键；相反，它为肽提供了两个或多个附着点。优选地，分子支架包含至少三个肽的附着点，称为支架反应性基团。这些基团能够与肽上的反应性基团反应以形成共价键。优选的分子支架的结构描述如下。

靶标

靶标-配体复合物显示出广泛的分子间和分子内H键。β-发夹和γ-转角是所述复合物中共同的结构基序。存在至少一个溶剂可及的末端，以便使双环进入口袋进行结合。

本发明的靶标与配体结合或相互作用，所述配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环。具体而言，靶标与肽结合，或相互作用。

最优选地，靶标具有如下定义的口袋。

优选地，靶标是酶、受体、生长因子、补体成分、细胞壁成分、激素、凝血因子、抗体、表位、白细胞介素、生长因子、金属肽酶、坏死因子或坏死因子受体或其任何部分。

最优选地，靶标选自：

α-2-巨球蛋白；ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员6；ADAM金属肽酶结构域17；ADAM金属肽酶结构域33；ADAM金属肽酶结构域9；脂联素，包含C1Q和胶原蛋白结构域；腺苷A3受体；肾上腺素受体β3，刺鼠相关蛋白同源物(小鼠)；1型血管紧张素II受体；活化的白细胞粘附分子；载脂蛋白E；载脂蛋白H(β-2-糖蛋白I)；淀粉样β(A4)前体蛋白；水通道蛋白4；水通道蛋白5；β位APP裂解酶1；杀菌/通透性增强蛋白；补体成分1，q子成分，B链；补体成分1，q子成分，C链；补体成分1，r子成分；补体成分1，s子成分；补体成分2；补体成分6；补体成分7；补体成分8，β多肽；碳酸酐酶XII；碳酸酐酶IV；碳酸酐酶VI；CART前肽；胆囊收缩素B受体；趋化因子(C-C基序)配体11；CD3e分子，ε(CD3-TCR复合物)；CD3g分子，γ(CD3-TCR复合物)；CD40分子，TNF受体超家族成员5；CD8a分子；胞苷脱氨酶；钙粘蛋白13，H-钙粘蛋白(心脏)；钙粘蛋白相关23；补体因子B；补体因子D(降脂蛋白(adipsin))；补体因子H；绒毛膜促性腺激素，β多肽；几丁质酶3样1(软骨糖蛋白39)；几丁质酶，酸性；几丁质酶1(壳三糖苷酶)；糜蛋白酶1，肥大细胞；肌肽二肽酶1(金属肽酶M20家族)；接触蛋白1；儿茶酚-O-甲基转移酶；羧肽酶A4；羧肽酶B2(血浆)；铜蓝蛋白(铁氧化酶)；羧肽酶N，多肽1；补体成分(3d/EB病毒)受体2；组织蛋白酶B；组织蛋白酶D；趋化因子(C-X-C基序)受体4；表皮生长因子受体；弹性蛋白酶，中性粒细胞表达；EPH受体A2；v-erb-b2幼红细胞白血病病毒致癌基因同源物2，神经/胶质母细胞瘤衍生的致癌基因同源物(禽)；v-erb-b2幼红细胞白血病病毒致癌基因同源物3(禽)；v-erb-a幼红细胞白血病病毒致癌基因同源物4(禽)；凝血因子X；凝血因子XI；凝血因子XIII，A1多肽；凝血因子II(凝血酶)；凝血因子II(凝血酶)受体；凝血因子III(促凝血酶原激酶，组织因子)；凝血因子VII(血清凝血酶原转化促进剂)；凝血因子VIII，促凝血成分；凝血因子IX；IgE的Fc片段，低亲和力II，(CD23)的受体；IgG的Fc片段，高亲和力Ia，受体(CD64)；IgG的Fc片段，受体，转运蛋白，α；无花果酶(含胶原蛋白/纤维蛋白原结构域的凝集素)2(hucolin)；无花果酶(含胶原蛋白/纤维蛋白原结构域)3(博多抗原)；叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1；卵泡刺激素，β多肽；γ-氨基丁酸(GABA)B受体，2；UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(GalNAc-T2)；生长停滞特异性6；组特异性成分(维生素D结合蛋白)；γ-谷氨酰水解酶(缀合酶，叶酰多γ-谷氨酰水解酶)；生长激素1；生长激素受体；胃饥饿素/肥胖抑制素前肽；胃内在因子(维生素B合成)；胃抑制性多肽受体；间隙连接蛋白，β2，26kDa；糖蛋白Ib(血小板)，α多肽；糖蛋白Ib(血小板)，β多肽；糖蛋白VI(血小板)；6-磷酸葡萄糖异构酶；谷氨酸受体，离子型，红藻酸盐1；谷氨酸受体，离子型，红藻酸盐2；谷氨酸受体，代谢型1；谷氨酸受体，代谢型3；谷氨酸受体，代谢型5；谷氨酸受体，代谢型7；凝溶胶蛋白；血色素沉着症；肝细胞生长因子(hepapoietin A；扩散因子)；hedgehog相互作用蛋白；主要组织相容性复合物，I型，G；硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2；HtrA丝氨酸肽酶1；透明质酸氨基葡萄糖苷酶1；胰岛素降解酶；干扰素(α，β和ω)受体1；干扰素(α，β和ω)受体2；干扰素，γ；干扰素γ受体1；胰岛素样生长因子1(生长调节素C)；胰岛素样生长因子1受体；胰岛素样生长因子2(生长调节素A)；胰岛素样生长因子2受体；胰岛素样生长因子结合蛋白1；免疫球蛋白重链恒定区α1；免疫球蛋白重链恒定区γ1(G1m标记物)；免疫球蛋白重链恒定区γ2(G2m标记物)；免疫球蛋白重链恒定区γ4(G4m标记物)；免疫球蛋白重链恒定区μ；免疫球蛋白κ恒定区；免疫球蛋白λ样多肽1；印度hedgehog；白细胞介素10；白细胞介素10受体，α；白细胞介素12A(自然杀伤细胞刺激因子1，细胞毒性淋巴细胞成熟因子1，p35)；白细胞介素12B(自然杀伤细胞刺激因子2，细胞毒性淋巴细胞成熟因子2，p40)；白细胞介素17A；白细胞介素17F；白细胞介素17受体A；白细胞介素1受体，I型；白细胞介素1受体拮抗剂；白细胞介素21受体；白细胞介素2受体，α；白细胞介素2受体，γ；白细胞介素3(集落刺激因子，多重)；白细胞介素4受体；白细胞介素6受体；白细胞介素7受体；整联蛋白连接激酶；胰岛素受体；itchy E3泛素蛋白连接酶；整联蛋白，α2b(IIb/IIIa复合物的血小板糖蛋白IIb，抗原CD41)；整联蛋白，α4(抗原CD49D，VLA-4受体的α4亚基)；整联蛋白，β3(血小板糖蛋白IIIa，抗原CD61)；jagged 1；赖氨酰-tRNA合成酶；激酶插入结构域受体(III型受体酪氨酸激酶)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体，两个结构域，长的胞质尾，1；杀伤细胞免疫球蛋白样受体，两个结构域，长的胞质尾，2；杀伤细胞免疫球蛋白样受体，两个结构域，长的胞质尾，3；杀伤细胞免疫球蛋白样受体，三个结构域，长的胞质尾，1；IRRE样kin 3(果蝇)；KIT配体；v-kit Hardy-Zuckerman4猫肉瘤病毒致癌基因同源物；激肽释放酶相关肽酶3；KRIT1，含有锚蛋白重复；低密度脂蛋白受体；瘦素受体；白血病抑制因子；白血病抑制因子受体α；凝集素，甘露糖结合，1；低密度脂蛋白受体相关蛋白6；基质金属肽酶12(巨噬细胞弹性蛋白酶)；基质金属肽酶13(胶原酶3)；基质金属肽酶14(膜插入型)；基质金属肽酶1(间质胶原酶)；基质金属肽酶7(基质溶解素，子宫)；基质金属肽酶8(中性粒细胞胶原酶)；髓过氧化物酶；神经元导向因子2；天然细胞毒性触发受体3；神经连接蛋白4，X-连接；头蛋白；甲状旁腺激素1受体；蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，D；蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，F；脊髓灰质炎病毒受体；肾素；核糖核酸酶，RNA酶A家族，3；肾胺酶，FAD依赖性胺氧化酶；轴突导向因子7A，GPI膜锚蛋白(John Milton Hagen血型)；丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂，进化枝A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员10；丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂，进化枝C(抗凝血酶)，成员1；丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂，进化枝F(α-2抗纤溶酶，色素上皮衍生因子)，成员1；丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂，进化枝I(neuroserpin)，成员1；超氧化物歧化酶3，细胞外；山梨糖醇脱氢酶；生长抑素；抑制致瘤性14(结肠癌)；突触蛋白III；钴胺传递蛋白I(维生素B12结合蛋白，R结合物家族)；钴胺传递蛋白II；TEK酪氨酸激酶，内皮；转铁蛋白受体(p90，CD71)；转铁蛋白；转化生长因子，β1；转化生长因子，β2；转化生长因子，β3；转化生长因子β受体1；转化生长因子β受体II(70/80kDa)；TIMP金属肽酶抑制剂1；TIMP金属肽酶抑制剂2；TIMP金属肽酶抑制剂3；tolloid样1；toll样受体1；toll样受体2；toll样受体3；toll样受体4；toll样受体5；肿瘤坏死因子受体超家族，成员10b；肿瘤坏死因子受体超家族，成员13C；肿瘤坏死因子受体超家族，成员1A；肿瘤坏死因子受体超家族，成员1B；肿瘤坏死因子受体超家族，成员4；肿瘤坏死因子；类胰蛋白酶β2(基因/假基因)；甲状腺刺激激素受体；转甲状腺蛋白；tubby同源物(小鼠)；tubby样蛋白1；血管细胞粘附分子1；血管活性肠肽受体2；前B淋巴细胞1；含有V-set和免疫球蛋白结构域，4；黄嘌呤脱氢酶；和酪氨酰-tRNA合成酶。

靶标可以是选自以上列出的任何分子中的整个分子、其基团或其部分(例如活性位点或表位)。

优选地，肽配体与靶标的活性位点相互作用，最优选地，与所述活性位点结合。

靶标可以具有多于一个的针对多肽配体的结合位点。靶标可以与一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个肽配体结合。所述配体可以不同或相同。与不同肽配体的结合可以对靶标具有不同的影响，或可以具有相同的影响。增加与靶标结合的肽配体的数目可以增加或减少肽配体对靶标的作用。例如，可以增加或减少激动剂或拮抗剂作用。

在一实施方案中，多肽配体与靶标的结合具有激动剂作用。在另一个实施方案中，所述结合具有抑制或拮抗剂作用。在另一个实施方案中，所述结合具有中性作用。

口袋

如本文所用，术语“口袋”是指靶标分子的三维(二级、三级或四级)结构中的凹痕、凹陷、孔或空间(参见Ryan G.Coleman and Kim A.Sharp J Chem Inf Model.2010 April26；50(4):589–603.doi:10.1021/ci900397t)。所述口袋对一种或多种配体具有结合亲和力。结合可以通过任何类型的键或结合发生，例如氢键、共价键、离子键或其任何组合。

本发明的口袋包括特定的物理特征。

本发明的口袋必须足够大以包含肽配体的某些部分。优选地，口袋足够大以包含全部或大部分肽配体。换句话说，肽配体可以至少部分地，优选完全地匹配到口袋中。与靶标结合时，配体至少部分地埋在口袋中。

在一个实施方案中，本发明方法的靶标的口袋包含至少1000至的体积，更优选至少的体积，最优选至少的体积。

在一个实施方案中，本发明方法的靶标的口袋具有至少的表面积，最优选至少的表面积。

在一个实施方案中，本发明方法的靶标的口袋具有至少30×30×(5至10)的尺寸。

在一个实施方案中，所述口袋具有至少的溶剂可及表面积，优选至少优选至少最优选至少的溶剂可及表面积。

短语“溶剂可及表面积”是指分子的三维结构的面积，例如蛋白用于与溶剂接触的可及二级、三级或四级结构。优选地，所述溶剂是液体溶剂，最优选地是水性液体，并且优选地，这种接触导致结合。

在一实施方案中，口袋包含至少一个溶剂可及的末端。在一些实施方案中，配体包含至少一个溶剂可及的末端。

如上所述，本发明的配体在与本发明的口袋相互作用时，优选至少部分地埋在口袋中。优选地，配体的溶剂可及表面积的1/3至2/3被埋在口袋中。

口袋可以位于靶标的多个结构域中。靶标的口袋倾向于与生物学相关。例如，口袋可包含酶活性位点或其部分、针对其他或多个配体或其部分的结合位点、以及蛋白-蛋白相互作用位点或其部分。

本发明的一个方面是一种方法，该方法包括确定口袋是否位于蛋白结构域中的步骤，所述蛋白结构域参与与其他蛋白的蛋白-蛋白相互作用。可以通过本领域中任何合理的方法来进行该确定，包括例如NMR、质谱、X射线晶体学、振动光谱、电子显微镜、冷冻电子显微镜或生物信息学(计算机)方法，或这些方法的任意组合。

描述方法时使用的其他术语

如本文所用，术语“接触”采用其在本领域中的通常含义，指使一个分子与另一个分子物理接触，优选通过溶剂。

可以使用任何合适的技术来确定在本发明中使用或产生的任何配体、靶标或其他蛋白的任何多肽组分的氨基酸序列。技术包括质谱法、Edman降解法和生物信息学技术。

可以使用任何合适的技术来“合成”在本发明的任何方面中使用、鉴定或产生的多肽、蛋白、氨基酸或任何其他分子。多肽可以生物合成。肽合成优选基于Fmoc化学，使用由Peptide Instruments制造的Symphony肽合成仪。

如本文所用，术语“反应”是指任何化学反应。优选地，指形成化学键，优选氢键或共价键的反应。

如本文所用，术语“制备”是指制造或产生该术语所应用于的物品。

文库

在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括以下步骤：将靶标蛋白暴露于配体文库(优选如权利要求1中所定义的文库)，和选择一种或多种与靶标蛋白结合的配体。

如本文所用，术语“文库”是指异源多肽或核酸的混合物。该文库由不同的成员组成。在这个意义上，文库是库的同义词。文库成员之间的序列差异是造成文库中存在多样性的原因。文库可以采取多肽或核酸的简单混合物的形式、或者可以是用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。优选地，每个单独的生物体或细胞仅包含一个或有限数目的文库成员。

在一个实施方案中，将核酸并入表达载体中，以允许表达由核酸编码的多肽。因此，在一个优选的方面，文库可以采取宿主生物体群的形式，每个生物体包含一个或多个拷贝的表达载体，所述表达载体包含核酸形式的文库的单个成员，其可以被表达以产生其相应的多肽成员。因此，宿主生物体群具有编码大量遗传多样性多肽变体的潜力。

在一个实施方案中，核酸文库编码多肽库。文库的每个核酸成员优选具有与文库的一个或多个其他成员相关的序列。相关序列是指与该文库的至少一个其他成员具有至少50％同一性的氨基酸序列，例如至少60％同一性、例如至少70％同一性、例如至少80％同一性、例如至少90％同一性、例如至少95％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性。可以在参考序列的至少3个氨基酸，例如至少4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，例如至少12个氨基酸，例如至少14个氨基酸，例如至少16个氨基酸，例如至少17个氨基酸或全长的连续区段上判断同一性。

可以使用例如WO2004/077062中阐述的本领域已知的技术或生物系统(包括本文所述的噬菌体载体系统)来构建用于本发明的文库。其他载体系统是本领域已知的，包括其他噬菌体(例如λ噬菌体)、细菌质粒表达载体、基于真核细胞的表达载体，包括酵母载体等。例如，参见WO2009/098450或Heinis等人，Nat Chem Biol 2009,5(7),502-7。

分子支架

分子支架描述于例如WO2009/098450和其中引用的参考文献，特别是WO2004077062和WO2006078161。

如上所述，术语“分子支架”在本文中是指能够在多个点连接如本发明所用的肽配体以赋予该肽配体一个或多个结构特征的任何分子。

分子支架可以是小分子，例如有机小分子。

在一个实施方案中，分子支架可以是或可以基于天然单体，例如核苷、糖或类固醇。例如，分子支架可包含此类实体的短聚合物，例如二聚体或三聚体。

在一个实施方案中，分子支架是已知毒性的化合物，例如低毒性的化合物。合适的化合物的示例包括胆固醇、核苷酸、类固醇或现有药物如替马西泮(tamazepam)。

在一个实施方案中，分子支架可以是大分子。在一个实施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。

在一个实施方案中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应以形成共价键的反应性基团。

分子支架可包含化学基团，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤化物和酰基卤化物。

在一个实施方案中，分子支架可包含三(溴甲基)苯，尤其由1,3,5-三(溴甲基)苯(‘TBMB’)或其衍生物，或者可由其组成。

在一个实施方案中，分子支架是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。其类似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但另外包含三个附着于苯环的甲基。这样做的优点是，额外的甲基可以与多肽形成进一步的接触，因此增加了额外的结构限制。

其他分子支架包括1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)、N,N’,N”-(苯-1,3,5-三基)-三(2-溴乙酰胺)(TBAB)和N,N’,N”-苯-1,3,5-三基三丙-2-烯酰胺(TAAB)。参见Chen等人，ChemBioChem 2012,13,1032-1038。优选地，分子支架包含结构上刚性的化学基团。

用于本发明方法的分子支架包含化学基团，该化学基团允许用于本发明方法的配体多肽的官能团与分子支架形成共价连接。所述化学基团选自多种官能团，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤化物和酰基卤化物。

优选地，对应于将所述分子支架附着至多肽的共价键数目，分子支架具有分子对称性。优选地，分子支架具有三重分子对称性，并且分子支架通过三个共价键附着至多肽。

计算机执行

本发明包括计算机执行的方法。优选地，由计算机执行的选择配体的靶标，所述配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，所述方法包括：

(a)询问多肽结构的数据库,以鉴定包含至少一个口袋的蛋白，所述口袋包含以下特征：

(i)约1000至的体积；和

(ii)至少一个溶剂可及的末端；

(b)在所述数据库中鉴定包含至少一个如(a)中所定义的口袋的第一组蛋白；

(c)将所述第一组蛋白与参与蛋白-蛋白相互作用的蛋白结构域的数据库进行比较；和

(d)在所述第一组蛋白中鉴定一种或多种蛋白，所述蛋白包含至少一个定位于推定负责与另一蛋白相互作用的结构域中的口袋。

本发明的其他方法也可以是计算机执行的。

医学用途

本发明的方法可以用于治疗、预防、抑制和/或改善疾病、疾病症状和医学病症、以及用于诊断。

本发明使用的肽配体通常可用于预防、抑制或治疗炎性状态、过敏性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染以及自身免疫性疾患(包括但不限于I型糖尿病、牛皮癣、多发性硬化症、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病和重症肌无力)。使用本发明的方法鉴定此类配体的靶标，也有助于鉴定配体可用于治疗、预防和/或改善哪些疾病。

在本申请中，术语“预防”包括在诱发疾病之前施用保护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后、但在疾病的临床表现之前施用组合物。“治疗”包括在疾病症状变得明显之后施用保护性组合物。

在进行本发明的选择配体的靶标的方法之后、或者在进行选择配体的方法之后，进一步进行治疗、减轻或改善医学病症的步骤。优选地，这可以通过用配体治疗人类或动物患者来进行。本发明的配体可以用作药物或药物样分子。配体可以配制成用于注射、吸入、鼻、眼、口或局部施用。

因此，本发明包括一种选择配体的靶标的方法，所述配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，所述方法包括：

(a)筛选一种或多种存在口袋的蛋白，所述口袋包括以下特征：

(i)约1000至的体积；和

(ii)至少一个溶剂可及的末端；

(b)选择至少一种具有至少一个如(a)中所限定的口袋的蛋白；和

(c)在医学治疗或诊断方法中使用与靶标结合或相互作用的配体。

下面进一步讨论本发明的方法。所述方法优选在体外进行。本发明的方法可以在体内进行。

本发明的方法可以在取自人类或动物患者的样品上进行。这样的样品可以是例如血液、粘液、皮肤或血浆。这样的方法优选是诊断方法，并且优选在体外进行并且不直接在人类或动物体上实施。

本发明还考虑了通过本发明的方法选择的配体在药物中的用途。

通常，肽配体将以纯化形式与药理学上合适的载体一起使用。通常，这些载体包括水性或醇/水性溶液、乳剂或混悬剂，包括任何盐和/或缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏溶液。如果需要使多肽复合物保持悬浮，则合适的生理学可接受的佐剂可以选自增稠剂，例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。

静脉内载剂包括液体和营养补充剂以及电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。

本发明的肽配体可以用作单独施用的组合物或与其他试剂联用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，例如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、以及免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒性剂或其他试剂与本发明所选抗体、受体或其结合蛋白联合的“鸡尾酒混合物”、或者与具有不同特异性的根据本发明所选择的多肽(例如使用不同的靶标配体所选择的多肽)联合的“鸡尾酒混合物”，无论是否在施用前合并。

本发明还考虑了本发明的配体在制备用于治疗、预防、抑制和/或减轻疾病、疾病症状和医学病症的药物中的用途。

方法

本发明的方法可以使用本领域已知的任何技术和/或设备进行。优选地，所述方法是使用实验室技术进行的。

本发明的第一种方法是选择配体的靶标的方法，所述配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，所述方法包括：

(a)筛选一种或多种存在口袋的蛋白，所述口袋包括以下特征：

(i)约1000至的体积；和

(ii)至少一个溶剂可及的末端；

(b)选择至少一种具有至少一个如(a)中所限定的口袋的蛋白。

本文还考虑了选择配体的方法，所述配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，所述方法包括以下步骤：

(a)根据权利要求1或权利要求2筛选一种或多种存在口袋的蛋白，并选择至少一种具有至少一个这样的口袋的蛋白；和

(b)使所述至少一种蛋白与一种或多种所述配体接触，并选择至少一种与所述蛋白结合的配体。

本发明的一个实施方案包括一种制备配体的方法，所述配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环，所述方法包括：

(a)确定根据前述方法之一选择的配体的多肽组分的氨基酸序列；

(b)合成具有(a)中确定的序列的多肽；

(c)使所述多肽与分子支架反应以生成配体。

还考虑了鉴定根据前述任一方法的配体的方法，其中所述配体能够结合靶标。该方法包括：

(i)根据前述任一方法提供多个配体；

(ii)使所述多个配体与靶标接触，和

(iii)选择与所述靶标结合的那些配体。

所述方法可以进一步包括制备一定量的通过方法分离或鉴定的多肽-分子支架缀合物配体的步骤，优选地，其中所述制备包括使分子支架附着至多肽，优选地，其中所述多肽被重组表达或化学合成。

所述鉴定配体的方法可以进一步包括在多肽的N-末端或C-末端的一处或多处延伸多肽的步骤。

所述鉴定配体的方法可以进一步包括将所述多肽-分子支架缀合物配体与其他多肽缀合的步骤。优选地，所述缀合通过以下进行：

(i)在结合至分子支架后，将另外的半胱氨酸附加至所述多肽，和

(ii)通过二硫键结合至所述另外的半胱氨酸，将所述多肽与所述另外的多肽缀合。

本发明的方法优选在体外进行。

本发明的方法可以在任何样品上进行。优选地，所述样品是液体样品。本发明的方法还可用于从文库中选择靶标(如上所述)。

本发明的方法或所述方法的一些步骤可以是计算机执行的。

在不脱离本发明的范围的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的发明不应不适当地限于这样的特定实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言，对描述的用于执行本发明的方式进行各种修改，使其落入以下权利要求的范围内，是显而易见的。

通过以下实施例进一步说明本发明。

参考资料

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