一种银杏酚酸的酰胺化合物的制备及应用
阅读说明：本技术 一种银杏酚酸的酰胺化合物的制备及应用 (Preparation and application of amide compound of ginkgolic acid ) 是由 赵俸艺 徐莉 吴文龙 王未凡 曹福亮 李维林 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具体的银杏酚酸(C13:0)与具有抗癌活性的脱氢枞胺的改性产物,即一种银杏酚酸的酰胺化合物的制备方法及其在抗癌活性方面的应用。该酰胺化合物的制备方法易操作。结合两种经济林树种中的活性化合物,富有创新性。其对Hela细胞的IC-(50)值为1.83μM,对HepG2细胞的IC-(50)值为3.31μM,对MCF-7细胞的IC-(50)值为9.98μM,对A549细胞的IC-(50)值为5.80μM。具有较好的抗Hela细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞和A549细胞活性,且毒性较小,改变了传统概念中“银杏有毒,生食或过量食用会引起过敏反应,甚至导致死亡等现象”,为抗癌药的开发提供了新的思路。该化合物结构新颖,含有长链供电子基团(#C-(13)H-(27)),具有低毒性及独特的抗癌活性,是一类具有优良前景的抗癌药剂,为研究化合物的抗癌活性与结构的关系创造条件,为新药研发奠定基础。(The invention discloses a preparation method of a modified product of ginkgolic acid (C13: 0) and dehydroabietylamine with anticancer activity, namely an amide compound of ginkgolic acid and application of the amide compound in the aspect of anticancer activity. The preparation method of the amide compound is easy to operate. The combination of active compounds in two economic forest species is innovative. Its IC on Hela cells 50 IC value of 1.83. mu.M for HepG2 cells 50 IC value of 3.31. mu.M for MCF-7 cells 50 IC for A549 cells with a value of 9.98. mu.M 50 The value was 5.80. mu.M. Has better activity of resisting Hela cells, HepG2 cells, MCF-7 cells and A549 cells, has less toxicity, and changes the traditional concept that gingko is toxicThe phenomenon that the raw or excessive eating can cause anaphylactic reaction and even death and the like provides a new idea for the development of anti-cancer drugs. The compound has novel structure and contains long-chain electron-donating groups (-C) 13 H 27 ) The compound has low toxicity and unique anticancer activity, is an anticancer medicament with excellent prospect, creates conditions for researching the relation between the anticancer activity and the structure of the compound and lays a foundation for the research and development of new drugs.)
技术领域
本发明属于天然产物化学领域，具体涉及银杏酚酸（C13:0）与脱氢枞胺的改性产物——酰胺化合物的制备方法及其在抗癌活性方面的应用。
背景技术
近年来很多研究表明，多种银杏提取物对于许多人源和鼠源的瘤株均具有显著的抗癌活性。Itokawa等研究了银杏外种皮中的长链酚酸类物质的抗癌活性，结果表明该类化合物能够抑制小鼠肉瘤S180和中国大田鼠V-79细胞。[Itokawa H, Totsuka N, NakaharaK, Takeya K, Lepoittevin J P, Asakawa Y. Anticancer principles from Ginkgo biloba L.[J]. Chem Pharm Bull, 1987, 35(7): 3016-3020.] Lee等从银杏外种皮的提取物中分离得到银杏酚酸，发现了其极强的磷脂酰肌醇专属磷脂酶的抑制活性，其中抑制活性最强的银杏酚酸的IC50为2.22 μmol/L；同时还证明银杏酚酸能有效抑制多种人源的癌细胞如A-549、MCF-7、HCT-15、SKOV-3和HT-1197的增殖，并且对正常结肠细胞（CCD-18Co）的毒性比相应的结肠癌细胞小。[Lee J S, Cho Y S, Park E J, et al. Phospholipase Cγ1 inhibitory principles from the sarcotestas of Ginlgo biloba L.[J]. J.Nat. Proud, 1998, 61(7): 867-871.] 倪学文等发现银杏酚酸可抑制Hela细胞增殖，并呈时间和剂量依赖性，但银杏酚酸调节荷瘤小鼠免疫力有着最佳剂量范围，如果剂量过高可能会抑制小鼠的免疫功能。随着银杏酚酸浓度的增加，对肿瘤细胞的抑制率增加，但同时对正常细胞的毒副作用也会增加，即高浓度银杏酚酸对正常细胞与肿瘤细胞的杀伤率趋向一致。[倪学文, 吴谋成. 银杏外种皮中银杏酚酸抗肿瘤活性的研究[J]. 华中农业大学学报, 2006, 25(4): 449-451.]
有研究表明，银杏酚酸有引起变态反应、非免疫毒性以及诱导有机体突变和致癌的可能性。[Helke H, Reiner J, Egon K, et al. In vitro evaluation of thecytotoxic potential of alkylphenols from Ginkgo biloba L.[J]. Toxicology,2002, 177(2/3): 167-177; Ahlemeyer B, Selke D, Schaper C, et al. Ginkgolicacids induce neuronal death and activate protein phosphatase type-2C[J].European Journal of Pharmacology, 2001, 430(1): 1-7.] Lepoittevin等考察了豚鼠的过敏试验，结果表明银杏酚酸是主要的过敏原。[Lepoittevin J P, Benezra C,Asakawa Y. Allergic contact dermatitis to Ginkgo biloba L.: relationship withurushiol[J]. Archives of Dermatological Research, 1989, 281(4): 227-230.] “银杏有毒”，生食或过量食用会引起过敏反应，甚至导致死亡等现象，目前普遍认为是由于银杏中的银杏酚酸所致。
松香的重要改性产品——脱氢枞胺（dehydroabietylamine，DHAA）是歧化松香胺的主要成分，近年来，DHAA衍生物抗癌活性研究引起了广泛关注。DHAA可作为一种多靶点药物，通过破坏胆固醇转运抑制黑色素瘤中解除控制的三种主要信号通路，导致细胞增殖减少，与细胞凋亡增加和癌血管化减少。国内外学者们都在集中研究DHAA衍生物的生物活性，Vicky等研究发现脱氢枞酸和DHAA类化合物有着很好的抗病毒活性。[Roa-Linares V C,Brand Y M, Agudelo-Gomez L S, et al. Anti-herpetic and anti-dengue activityof abietane ferruginol analogues synthesized from (+)-dehydroabietylamine[J].Eur. J. Med. Chem., 2016, 108: 79-88.] Ling等研究发现DHAA衍生物在抗癌方面有着巨大的潜力，通过试验，发现此类化合物能够有效地抑制乳腺癌细胞的生长。[Ling T, MyT, et al. (+)-Dehydroabietylamine derivatives target triple-negative breastcancer[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 102: 9-13.] 饶小平等筛选了一系列的DHAA酰胺衍生物的抗癌活性，发现其对肝癌细胞 SMMC7721，肺癌细胞A549，神经胶质瘤细胞C6 和乳腺癌细胞MCF-7的IC50值分别为 6.65，0.75，0.81和10.65 μM。[Rao X, Huang X, He L, et al. Anticancer Activity and Structure-ActivityRelationship of Diterpenoids with a Dehydroabietyl Skeleton[J]. Comb. Chem.High T. Scr., 2012, 15(10): 840-844.]
如果我们能将“有毒的”银杏酚酸改性为具有抗癌活性的化合物，这将会为抗癌药的开发提供一个新的思路。因此，本工作选取一种银杏酚酸与具有抗活性的DHAA结合后得到抗癌活性更好的新型化合物，提高经济林的栽培利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具体的银杏酚酸（C13:0）与脱氢枞胺的改性产物，一种银杏酚酸的酰胺化合物的制备方法及其在抗癌活性方面的应用。
进一步公开该酰胺化合物的制备方法，该制备方法易操作，实验中所需物品毒性小，结合两种经济林树种中的活性化合物，富有创新性。
进一步公开了该酰胺化合物的应用，即在制备抗癌药物方面的应用。
本酰胺化合物结构新颖，含有长链供电子基团（−C13H27），具有低毒性及独特的抗癌活性，是一类具有优良前景的抗癌药剂，为研究化合物的抗癌活性与结构的关系创造条件，为新药研发奠定基础。
银杏酚酸酰胺化合物，它的结构式见附图1。
1.银杏酚酸酰胺化合物的制备方法，其步骤如下：
采用DCC-HoBt缩合法，0.04 mmol银杏酚酸（C13:0），0.04 mmol HoBt，用10 mL乙酸乙酯溶解，0℃搅拌30分钟后加入0.04 mmol DCC，0℃反应2.5 h。再滴加0.04 mmol 脱氢枞胺的乙酸乙酯溶液2 mL，TLC跟踪反应，再冰浴搅拌30分钟，使得DCU充分析出。过滤除去DCU过滤，减压旋蒸后产物用柱层析（V乙酸乙酯：V正己烷=1:3）分离提纯，最终得到淡褐色油状物，0.014 g，产率60%。
所述的步骤银杏酚酸（C13:0）与脱氢枞胺摩尔比1:1.0。
2.银杏酚酸酰胺化合物的抗癌活性的应用。
采用MTT噻唑蓝比色法研究银杏酚酸酰胺化合物对宫颈癌细胞（Hela），肝癌细胞（HepG2），乳腺癌细胞（MCF-7），非小细胞肺癌细胞（A549）及对正常细胞人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的毒活性。取对数生长期的待测试细胞，配制成105个/mL的单细胞悬液，在96孔培养板上接种，每孔100 μL，于体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度、37℃培养箱中培养24 h后，将100 μL不同浓度的待测样品加入到培养板上，每种浓度均为6个复孔；继续培养48 h后，每孔加100 μL 1mg/mL的MTT染色液，在培养箱中继续培养4 h，去除上层清液，然后每孔加200 μL DMSO，充分震荡15分钟后，在酶标仪上595nm波长处测定OD样值，试验的空白组是用100 μL无血清的DMEM培养液加入DMSO试剂代替样品，这时的吸光度值为OD空白值，通过以下公式计算银杏酚酸酰胺化合物对Hela、HepG2、MCF-7、A549、HUVEC细胞抑制率，最后通过软件origin分析得出IC50。
m=1−n=1−OD样/OD空白 m：抑制率 n：细胞存活率 。
有益效果：
本发明保护的银杏酚酸酰胺化合物，对Hela细胞的IC50值为1.83 μM，对HepG2细胞的IC50值为3.31 μM，对MCF-7细胞的IC50值为9.98 μM，对A549细胞的IC50值为5.80 μM。具有较好的抗Hela细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞和A549细胞活性，且毒性较小，改变了传统概念中“银杏有毒，生食或过量食用会引起过敏反应，甚至导致死亡等现象”，为抗癌药的开发提供了新的思路。
银杏酚酸酰胺化合物的制备方法易操作，实验中所需物品毒性小，将两种经济林树种中的活性物质相结合，富有创新性。
银杏酚酸酰胺化合物结构新颖，含有长链供电子基团（−C13H27），具有低毒性及独特的抗癌活性，是一类具有优良前景的抗癌药剂，为研究化合物的抗癌活性与结构的关系创造条件，为新药研发奠定基础。
附图说明
图1为银杏酚酸酰胺化合物的结构式。
图2为本发明实施例1中银杏酚酸酰胺化合物的核磁氢谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
银杏酚酸酰胺化合物的制备方法：采用DCC-HoBt缩合法，0.04 mmol银杏酚酸（C13:0），0.04 mmol HoBt，用10 mL乙酸乙酯溶解，0℃搅拌30分钟后加入0.04 mmol DCC，0℃反应2.5 h。再滴加0.04 mmol 脱氢枞胺的乙酸乙酯溶液2 mL，TLC跟踪反应，再冰浴搅拌30分钟，使得DCU充分析出。过滤除去DCU过滤，减压旋蒸后产物用柱层析（V乙酸乙酯：V正己烷=1:3）分离提纯，最终得到淡褐色油状物，0.014 g，产率60%。
所述的步骤银杏酚酸（C13:0）与脱氢枞胺摩尔比1:1.0。
测试结果如下：m.p. 38-39°C; IR (neat) νmax 3416, 2924, 2852, 1630,1534, 1454, 1375, 1280, 1216, 819, 739, 628; 1H NMR(DMSO-d6, 600MHz): δ(ppm)0.90 (3H, s), 1.13-1.15 (3H, s), 1.18 (9H, t, J = 11.4 Hz), 1.23-1.28 (22H,m), 1.30-1.35 (2H, m), 1.38-1.45 (2H, m), 1.50-1.62 (2H, m), 1.67-1.74 (1H,m), 1.92-2.01 (1H, m), 2.23 (1H, d, J = 12.6 Hz), 2.39-2.41 (2H, m), 2.74-2.78 (2H, m), 2.87-2.92 (1H, m), 2.99 (1H, d, J = 7.8 Hz), 3.23 (1H, d, J =13.8 Hz), 6.57 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.62 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.81 (1H, s),6.91 (1H, d, J = 4.2 Hz), 6.98 (1H, dd, J =3.6, 4.8 Hz), 7.06 (1H, d, J = 8.4Hz), 7.99 (1H, s), 9.33 (1H, s, −OH); 13C NMR (DMSO-d6, 151MHz): δ (ppm)23.95, 25.24, 28.74, 28.85, 28.91, 28.92, 29.05, 29.08, 29.41, 30.36, 30.97,31.32, 32.77, 32.87, 35.39, 36.93. 37.55, 37.88, 43.72, 49.33, 112.69,119.09, 123.29, 123.78, 126.33, 126.53, 128.41, 134.70, 140.41, 144.64,147.11, 153.73, 167.69; ESI-MS [M+Na]+ m/z 610.4594 (calcd for C40H61NO2587.4702). Anal. calcd for C40H61NO2: C, 81.72; H, 10.46; N, 2.38. Found: C,81.79; H, 10.41; N, 2.41。
采用MTT噻唑蓝比色法研究宫颈癌细胞（Hela），肝癌细胞（HepG2），乳腺癌细胞（MCF-7），非小细胞肺癌细胞（A549）及对正常细胞人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的毒活性。银杏酚酸酰胺化合物，对Hela细胞的IC50值为1.83 μM，对HepG2细胞的IC50值为3.31 μM，对MCF-7细胞的IC50值为9.98 μM，对A549细胞的IC50值为5.80 μM。具有较好的抗Hela细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞和A549细胞活性，且毒性较小，改变了传统概念中“银杏有毒，生食或过量食用会引起过敏反应，甚至导致死亡等现象”，为抗癌药的开发提供了新的思路。
实施例2
银杏酚酸酰胺化合物的制备方法：采用DCC-HoBt缩合法，0.04 mmol银杏酚酸（C13:0），0.04 mmol HoBt，用10 mL乙酸乙酯溶解，0℃搅拌30分钟后加入0.04 mmol DCC，0℃反应2.5 h。再滴加0.044 mmol 脱氢枞胺的乙酸乙酯溶液2 mL，TLC跟踪反应，再冰浴搅拌30分钟，使得DCU充分析出。过滤除去DCU过滤，减压旋蒸后产物用柱层析（V乙酸乙酯：V正己烷=1:3）分离提纯，最终得到淡褐色油状物，0.015 g，产率64%。
所述的步骤银杏酚酸（C13:0）与脱氢枞胺摩尔比1:1.1。测试结果表明与实施例1结果相同。
实施例3
银杏酚酸酰胺化合物的制备方法：采用DCC-HoBt缩合法，0.04 mmol银杏酚酸（C13:0），0.04 mmol HoBt，用10 mL乙酸乙酯溶解，0℃搅拌30分钟后加入0.04 mmol DCC，0℃反应2.5 h。再滴加0.048 mmol 脱氢枞胺的乙酸乙酯溶液2 mL，TLC跟踪反应，再冰浴搅拌30分钟，使得DCU充分析出。过滤除去DCU过滤，减压旋蒸后产物用柱层析（V乙酸乙酯：V正己烷=1:3）分离提纯，最终得到淡褐色油状物，0.014 g，产率60%。
所述的步骤银杏酚酸（C13:0）与脱氢枞胺摩尔比1:1.2。测试结果表明与实施例1结果相同。
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