阅读说明：本技术 一种从人羊膜上皮细胞建立诱导性多能干细胞的方法 (Method for establishing induced pluripotent stem cells from human amniotic epithelial cells ) 是由 陆建峰 张传宇 蒙都 曹立宁 于 2020-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种将人羊膜上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞的新方法：利用非脂阳离子转染试剂Neofect~(TM)将携带OCT4、SOX2、KLF4、LIN28、L-MYC等5个转基因和1个P53基因shRNA共6个重编程因子的多个oriP/EBNA1游离型质粒载体导入hAECs。该方法过程简单、操作方便、费用低廉,且游离型质粒载体是非基因整合型的重编程方法,减少致瘤性；整个重编程过程耗时较短、效率较高；获得的hAE-iPSCs克隆在无动物源性的TeSR~(TM)-E8~(TM)-人重组玻连蛋白体系中扩大培养,为临床应用奠定基础。(The invention provides a novel method for reprogramming human amniotic epithelial cells into induced pluripotent stem cells, which comprises the following steps: neofect using non-lipid cation transfection reagent TM A plurality of oriP/EBNA1 episomal plasmid vectors carrying 6 reprogramming factors in total, such as 5 transgenes including OCT4, SOX2, KLF4, LIN28 and L-MYC, and 1 shRNA of the P53 gene, were introduced into hAECs. The method has simple process, convenient operation and low cost, and the free plasmid vector is a non-gene integration type reprogramming method, thereby reducing the tumorigenicity; the whole reprogramming process is short in time consumption and high in efficiency; the obtained hAE-iPSCs are cloned in animal origin-free TeSR TM ‑E8 TM And the expanded culture in a human recombinant vitronectin system lays a foundation for clinical application.)

一种从人羊膜上皮细胞建立诱导性多能干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人羊膜上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技术是通过导入外源基因或基因产物，使体细胞去分化而获得自我更新能力和多向分化潜能的技术。iPSCs在细胞替代疗法、基因疗法、疾病模型、发育模型、药物筛选上有很大的应用前景。病人特异性或疾病特异性的iPSCs可以帮助我们更好地了解疾病、治疗疾病。目前iPSCs已被应用于一些疾病的治疗，包括遗传性疾病、退行性疾病等。iPSCs的优势在于，可用成年人的体细胞产生，无伦理问题，并且病人特性的iPSCs用于自体移植免疫原性低。然而重编程步骤繁琐、所用培养体系中有动物源性成分、成本高是iPSCs技术向临床应用存在的难题。

至今已有方法将多种体细胞(如成纤维细胞、外周血单核细胞等)重编程为人iPSCs。为了更高效地获得高质量的、适合临床应用的人iPSCs，应考虑选择何种类型的体细胞作为种子细胞重编程为iPSCs。人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)来源于胎儿的羊膜，是胎儿附属物、医疗废弃物，因而不涉及伦理问题，且来源丰富。hAECs与胎儿成纤维细胞类似，和成年人体细胞相比，细胞年龄小，受环境影响少，因环境刺激与年龄增长积累的DNA损伤或突变少、表观遗传记忆没有成年人体细胞明显。因此，hAECs重编程得到的iPSCs具有较高的应用价值。

2011年Easley等人发表的研究成果表明hAECs比成年人及新生儿的真皮成纤维细胞重编程为iPSC所需时间更短，获得的iPSCs克隆数更多，并且hAECs重编程得到的iPSCs比成纤维细胞重编程得到的iPSCs更接近胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)，在基因表达水平、功能、代谢上与ESCs更接近(Easley等人Cell Reprogram，2012年7月第14卷第3期，第193-203页)。然而，hAECs重编程为iPSCs的效率更高的具体原因并未明了。根据他们的实验以及之前的研究，可能是因为hAECs有OCT4(OCT4基因又名POU5F1或OCT3/4)、SOX2、KLF4、c-MYC的基础表达，而这4个基因与重编程息息相关。hAECs的KLF4、c-MYC基因相对表达量与人胚胎干细胞的相差不大，而OCT4与SOX2表达量却很低，说明hAECs可能处于重编程的准备状态。与外源基因在细胞内异位表达相比，内源基因的基础表达通常更稳定。而在非基因整合的iPSCs技术中，随着时间推移，导入体细胞的外源重编程因子逐渐丢失，hAECs内源性重编程因子的表达有利于维持其重编程状态。此外hAECs有三个胚层分化的潜能，hAECs表达OCT4，NANOG，REX-1，SSEA-3，SSEA4，TDGF1，DNMT3B，GBRB3，GDF3，TRA-1-60与TRA-1-81等干细胞标志物，其中一些基因是维持自我更新能力与多能性很重要的转录因子。除了最主要的重编程四因子(OCT4，NANOG，c-MYC,KLF4)，这些次要的辅助性因子可能是hAECs重编程效率更高的原因之一。重编程的初始时期会发生间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)，使用hAECs作为种子细胞，也许跳过了MET过程，因此比成纤维细胞更快获得的iPSCs克隆。羊水细胞(amniotic fluid cells)在重编程为iPSCs上也具有类似hAECs的优势，但羊水细胞一般通过羊膜穿刺获得，是侵入性操作，并且细胞量远低于hAECs，而胎盘可通过无侵入性操作获得，一个人类胎盘可以收获1～10×10⁷个人羊膜上皮细胞。综上，hAECs是建立iPSCs比较理想的细胞类型。

最早将hAECs重编程为iPSCs的是Easley等人，他们通过慢病毒载体将4个重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC导入hAECs中，24小时后重复一次病毒转导过程，再24小时后将hAECs转移到matrigel包被的6孔培养板上，第二天更换mTeSR-1干细胞培养基。在第14天iPSCs克隆出现。最终6孔培养板的每个孔平均获得3个iPSCs克隆，这些iPSCs在无滋养层的matrigel-mTeSR-1系统中增殖传代(Easley等人Cell Reprogram，2012年7月第14卷第3期，第193-203页)。Zhao等人在2017年也成功将hAECs重编程为iPSCs。他们的方法中只用了3个重编程因子OCT4、SOX2与YAP，优点是用YAP激活Hippo-YAP通路，从而替代原癌基因c-MYC与KLF4(Zhao等人Exp Ther Med，2017年7月第14卷第1期，第199-206页)。但他们将重编程因子导入细胞的方式仍是基因整合型的慢病毒载体。

自2006年Yamanaka团队通过病毒载体将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种基因导入小鼠成纤维细胞获得iPSCs以来，iPSCs技术迅速发展，产生了许多建立iPSCs的方法。慢病毒载体导入重编程因子的方法应用广泛，但慢病毒载体使外源基因随机整合宿主细胞基因组，增加了致瘤的风险。因此人们开发了非基因整合的方法，包括腺病毒、仙台病毒、游离型质粒、piggyBac转座子系统、直接导入重编程蛋白或mRNA、使用化学物质诱导等。非基因整合型方法虽然安全性更高，但一般而言效率比传统的基因整合型方法低，其中仙台病毒与直接导入蛋白等方法价格昂贵，导入蛋白或mRNA的方法由于需要重复导入重编程因子而使工作量大增。更安全、高效、经济、简单快捷iPSC技术仍待开发。

Thomson团队发现使用含四因子OCT4、SOX2、NANOG和LIN28的慢病毒载体足以将成年人的成纤维细胞诱导重编程为iPSCs，然而效率很低。若将慢病毒载体更换为非基因整合的游离型质粒载体，重编程效率将更低。因此他们在开发oriP/EBNA1游离型质粒载体的非基因整合方法时，在OCT4、SOX2、NANOG和LIN28四因子的基础上，引入c-MYC、KLF4以提高重编程效率，再加上SV40TL抵消c-MYC的细胞毒性，最终形成包含7个因子的三质粒方法(Yu等人Science，2009年5月，第324第5928期，第797-801页)。

Okita等人延用oriP/EBNA1游离型质粒载体，携带6个因子OCT4、SOX2、KLF4、LIN28、L-MYC、p53的shRNA，成功建立人真皮成纤维细胞与牙髓细胞的iPSCs。其中，p53的shRNA用来抑制p53，提高重编程效率；L-MYC替换c-MYC，效率更高。6个因子包含在3个游离型质粒中，通过电转导入人真皮成纤维细胞与牙髓细胞(Okita等人Nature Methods，2011年5月第8卷第5期，第409-412页)。电转时需将细胞从培养板上消化下来，用电转缓冲液重悬细胞，电转结束后将细胞种在新的培养板上。七天后用胰酶消化将细胞转移到滋养层(小鼠胚胎成纤维细胞)上。电转两周后出现iPSCs克隆。此方法虽然能较快获得iPSCs，但过程稍繁琐，而且引入了动物源性物质。

因此，本领域迫切需要开发出一个更简单的、符合临床应用标准的方法，使hAECs重编程为iPSCs。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的建立iPSCs难题，提供简单、快速、经济、高效并且符合临床应用标准的iPSCs的建立方法。

本发明提供一种从人羊膜上皮细胞建立诱导性多能干细胞的方法，所述方法通过将包含OCT4、SOX2、KLF4、LIN28、L-MYC的cDNA以及p53的shRNA的6个重编程因子的2个以上oriP/EBNA1游离型质粒通过非脂阳离子转染试剂Neofect^TM导入人羊膜上皮细胞，使人羊膜上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞。

上述人羊膜上皮细胞为体外培养两代以内的人羊膜上皮细胞。

上述2个以上oriP/EBNA1游离型质粒同时导入人羊膜上皮细胞。

上述oriP/EBNA1游离型质粒为三个质粒，分别为pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(Addgene,27077)、pCXLE-hSK(Addgene,27078)、pCXLE-hUL(Addgene,27078)。

上述转染后的人羊膜上皮细胞在原培养板上继续培养至诱导性多能干细胞克隆长大挑出。

上述方法还包括步骤，获得的诱导性多能干细胞克隆挑出后，种在人重组玻连蛋白包被的培养板上，在TeSR^TM-E8^TM培养基中扩大培养。

上述方法包括以下步骤：

(1)将人羊膜上皮细胞接种到培养板中，以人羊膜上皮细胞培养基培养2天；

(2)更换新鲜的人羊膜上皮细胞培养基后，加入非脂阳离子转染试剂Neofect^TM和含有游离型质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL的混合物，然后将混合物加入人羊膜上皮细胞培养基中；

(3)转染24小时后，更换TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基，隔天换液；

(4)挑出诱导性多能干细胞克隆，种在人重组玻连蛋白包被的培养板上，采用TeSR^TM-E8^TM培养基进行扩大培养，获得诱导性多能干细胞。

上述方法还包括以下步骤：

(5)步骤(4)扩大培养后的诱导性多能干细胞，采用无血清细胞冻存液冻存；

(6)取步骤(5)中少量细胞进行鉴定，表达干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60，即为诱导性多能干细胞。

上述方法还包括以下步骤：

(7)对步骤(4)扩大培养后的细胞进行筛选，获得表达干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60的诱导性多能干细胞。筛选获得的干细胞可以直接应用于临床。

上述步骤(2)中，先将游离型质粒一起加入DMEM稀释至每种质粒浓度为0.05-0.01μg/μL，再与非脂阳离子转染试剂Neofect^TM混合均匀，并静置20分钟后，加入人羊膜上皮细胞培养基中。

本发明提供hAECs重编程为iPSCs的新方法，即利用非脂阳离子转染试剂Neofect^TM将Okita等人报道的3个oriP/EBNA1游离型质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL(包含OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28的cDNA以及p53的shRNA共六个因子)导入hAECs，通过一步法重编程为iPSCs，并培养在TeSR^TM-E8^TM-人重组玻连蛋白无动物源性系统中。

本发明在Okita的方法(OKITA,K et al.A more efficient method to generateintegration-free human iPS cells.《Nature Methods》.2011May；8(5):409-412)上做了以下4点改进：

1.选择hAECs作为种子细胞重编程为iPSCs而不是人真皮成纤维细胞或牙髓细胞，充分利用hAECs的优势；选择hAECs作为种子细胞重编程为iPSCs而不是人真皮成纤维细胞或牙髓细胞，充分利用hAECs的优势；

2.在转染方法上摒弃电转而采用操作简单的非脂阳离子转染试剂Neofect^TM，转染时只需将转染试剂与游离型质粒混合，滴入培养物中，在第二天更换新鲜培养基，此过程无需胰酶消化及重悬细胞；

3.转染后第2天将人羊膜上皮细胞培养基更换为TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基，此后隔天换液直到iPSCs克隆出现，与Okita的方法相比省去将细胞转移到滋养层上的步骤，是一步法；

4.重编程得到的iPSCs克隆挑到人重组玻连蛋白包被的培养板上，iPSCs培养在无动物源性的TeSR^TM-E8^TM-人重组玻连蛋白系统，更符合临床应用标准。

另外，游离型质粒载体是非基因整合型的重编程方法，减少致瘤性。

本发明所述的方法能快速地将hAECs重编程为iPSCs。hAE-iPSCs克隆在转染后第10天出现，转染后第23天可挑出，能在TeSR^TM-E8^TM-人重组玻连蛋白系统中增殖传代。收获的hAE-iPSCs核质比大，细胞群边缘锐利，形态与ESCs类似，且核型正常。体外实验表明hAE-iPSCs表达干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60。hAE-iPSCs在免疫缺陷小鼠体内形成畸胎瘤，证明其多向分化潜能。然而用本发明的方法重编程人真皮成纤维细胞，虽然在最初形成iPSCs克隆，但由于此方法不包含转染后将细胞转移到滋养层的步骤，人真皮成纤维细胞在TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基中不凋亡也不脱离培养板，致使iPSCs克隆无法长大，最终不能获得成人真皮纤维细胞来源的iPSCs克隆。故在本发明的方法中使用人羊膜上皮细胞作为起始细胞进行重编程是必须的，亦是本发明的创造性所在，重编程人真皮成纤维细胞为iPSCs不能达到“一步法”及“无动物源性”的效果，而本发明的方法重编程人羊膜上皮细胞为hAE-iPSCs有“一步法”及“无动物源性”的效果，可以直接应用于临床。

附图说明

图1hAECs重编程为iPSCs的基本操作流程图示。

图2hAE-iPSCs形成过程图示。

a)转染前hAECs形态正常，融合度约为60％；b)转染后第10天hAE-iPSCs克隆出现(箭头所指)，未成功重编程为iPSCs的细胞在TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基中逐渐凋亡并脱离培养板；c)转染后第16天hAE-iPSCs克隆形态明显；d)转染后第23天hAE-iPSCs克隆长大，细胞群边缘锐利；e)hAE-iPSCs细胞间紧密相接，细胞核质比大；f)hAE-iPSCs转移到人重组玻连蛋白包被的培养板上能存活并增殖，克隆形态与细胞形态维持类似胚胎干细胞的形态。

图3人真皮成纤维细胞用本方法重编程为iPSCs效果图示。

a)转染前人真皮成纤维细胞形态正常，融合度约为60％；b)转染后第16天培养板中有iPSCs克隆(箭头所指)，未成功重编程为iPSCs的细胞在TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基中未脱离培养板；c)转染后第33天iPSCs克隆仍未长大，人真皮成纤维细胞大部分也未脱离培养板；d)转染后第45天，人真皮成纤维细胞形态异常，但大部分贴附在培养板上，而iPSCs克隆从培养板上脱落。

图4hAE-iPSCs核型鉴定为正常人类核型。

图5细胞免疫荧光染色实验显示hAE-iPSCs表达干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60。

图6hAE-iPSCs形成畸胎瘤图示。

本方法得到的hAE-iPSCs注射到SCID-beige免疫缺陷小鼠背部双侧皮下，45天后形成瘤体。瘤体经HE染色可见3个胚层的细胞。

具体实施方式

以下所有细胞均在5％CO₂、恒温37℃的细胞培养箱中培养。

实施例1人羊膜上皮细胞的重编程步骤及效果

本发明中将人羊膜上皮细胞重编程为hAE-iPSCs的步骤(图1)及效果如下：第-2天：种下细胞

以5×10⁴个细胞每平方厘米的密度将体外培养两代以内的hAECs铺在6孔培养板中，即6孔培养板的每个孔种4.8×10⁵个hAECs。

第0天：转染

以6孔培养板的一个孔为例

1)转染前两小时，给细胞更换新鲜的人羊膜上皮细胞培养基hAECM；

2)稀释质粒：取质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL各1μg与100μL DMEM混合均匀；

3)向DNA稀释液中直接加入3μL Neofect^TM转染试剂，轻柔混匀，室温静置20分钟，转染复合物制备完成；

4)将转染复合物加入细胞中，轻柔混匀。

第1天：

给转染后的细胞更换新鲜的hAECM。

第2天：

吸去hAECM，更换为TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基，隔天换液。

第23天及以后：挑克隆与扩大培养

6孔培养板的一个孔中平均可获得8个hAE-iPSCs克隆，得率为0.0017％；

1)用10μL枪头将单个干细胞克隆挑到人重组玻连蛋白(0.5μg/cm²)包被的24孔培养板的一个孔中，并在TeSR^TM-E8^TM培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10μM)；

2)挑出的克隆长大后用ReLeSR传代至12孔培养板的一个孔(图2f)，同样是人重组玻连蛋白(0.5μg/cm²)包被并在TeSR^TM-E8^TM培养基中添加Y-27632；

3)再过一周左右用同样方法将hAE-iPSCs传代到6孔培养板的一个孔中；

4)此后可将hAE-iPSCs扩大培养、冻存并鉴定；

5)为保证hAE-iPSCs不含异种动物成分，冻存细胞时使用无血清细胞冻存液。

转染前hAECs在培养板中形态与活力正常(图2a)，转染后第10天hAE-iPSCs克隆出现，未成功重编程为iPSCs的细胞在TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基中逐渐凋亡并脱离培养板(图2b)。转染后第16天hAE-iPSCs克隆形态明显(图2c)。转染后第23天hAE-iPSCs克隆长大，细胞群边缘锐利(图2d)，hAE-iPSCs细胞间紧密相接，细胞核质比大(图2e)。hAE-iPSCs转移到人重组玻连蛋白包被的培养板上能存活并增殖，克隆形态与细胞形态维持类似胚胎干细胞的形态(图2f)。hAE-iPSCs经核型鉴定为正常人类核型(图4)。细胞免疫荧光染色实验显示hAE-iPSCs表达干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60(图5)。hAE-iPSCs注射到SCID-beige免疫缺陷小鼠背部双侧皮下，45天后形成瘤体。瘤体经HE染色可见神经上皮、横纹肌、腺体3种组织，分别来自外胚层、中胚层、内胚层(图6)。

实施例2人真皮成纤维细胞的重编程步骤及效果

用以上方法在人真皮成纤维细胞的重编程步骤及效果如下：

第-2天：种下细胞

以5×10⁴个细胞每平方厘米的密度将体外培养四代以内的人真皮成纤维细胞铺在6孔培养板中，即6孔培养板的每个孔种4.8×10⁵个人真皮成纤维细胞。

转染前观察到人真皮成纤维细胞在培养板中形态与活力正常(图3a)。

第0天：转染

以6孔培养板的一个孔为例

1)转染前两小时，给细胞更换新鲜的人成纤维细胞培养基；

2)稀释质粒：取质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL各1μg与100μL DMEM混合均匀；

3)向DNA稀释液中直接加入3μL Neofect^TM转染试剂，轻柔混匀，室温静置20分钟，转染复合物制备完成；

4)将转染复合物加入细胞中，轻柔混匀。

第1天：

给转染后的细胞更换新鲜的人成纤维细胞培养基。

第2天：

吸去人成纤维细胞培养基，更换为TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基，隔天换液。第16天：培养板中有iPSCs克隆，未成功重编程为iPSCs的人成纤维细胞在TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基中未脱离培养板(图3b)。

第33天：人成纤维细胞来源的iPSCs克隆仍未长大，人成纤维细胞大部分也未脱离培养板(图3c)。

第45天：人成纤维细胞形态异常，但大部分仍贴附在培养板上，而人成纤维细胞来源的iPSCs克隆从培养板上脱落(图3d)。

所需试剂

1.羊膜上皮细胞培养基hAECM【F12/DMEM,10％KSR(KnockOut SerumReplacement),2mmol/L L-glutamine,1％nonessential amino acid,55μmol/L 2-mercaptoethanol,1mmol/L sodium pyruvate,1％antibiotic-antimycotic(all fromGibco)and 10ng/mL EGF(Peprotech)】

2. 3个游离型质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(Addgene,27077)、pCXLE-hSK(Addgene,27078)、pCXLE-hUL(Addgene,27080)

3.Neofect^TMDNA转染试剂(零客创智，TF201201)

4.DMEM(HyClone,SH30243.01)

5.人成纤维细胞培养基：90％DMEM(HyClone,SH30243.01)，10％FBS(ThermoFisher Scientific,10100147)

6.TeSR^TM-E8^TM干细胞培养基(Stemcell Technologies,#05990)

7.人重组玻连蛋白(Thermo Fisher Scientific,A14700)

8.ReLeSR(Stemcell Technologies,#05872)

9.Y-27632(Topscience,129830-38-2)

10.无血清细胞冻存液(依科赛生物，VUC00-N011)

11.pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(Addgene,27077)、pCXLE-hSK(Addgene,27078)、pCXLE-hUL(Addgene,27078)