异种移植制品和方法
阅读说明：本技术 异种移植制品和方法 (Xenograft articles and methods ) 是由 P·霍泽尔 J·阿德金斯 R·L·蒙罗伊 E·J·常 于 2019-10-04 设计创作，主要内容包括：一种用于临床异种移植到人中的生物制品和一种制备用于临床异种移植到人中的生物制品的方法,所述方法涉及生产非野生型生物工程化猪,所述非野生型生物工程化猪具有生物工程化的基因组使得所述猪不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位,不含某些病原体,在无指定病原体的封闭畜群中按照减少生物负荷的程序饲养,其中在对所述猪实施安乐死之后收获所述生物制品并且将所述制品从所述猪中无菌地取出,对所述生物制品进行处理,所述处理涉及灭菌和将所述制品储存在无菌容器中,并且所述制品不含有一种或多种细胞外表面聚糖,不含某些指定病原体,是有生物活性的并且包含能够在异种移植后形成血管的活细胞和组织。(A biological product for clinical xenotransplantation into a human and a method of preparing a biological product for clinical xenotransplantation into a human, the method involves producing a non-wild type bioengineered pig having a genome bioengineered such that the pig does not express one or more extracellular surface glycan epitopes, is free of certain pathogens, is fed according to a bioburden reduction procedure in a closed herd free of the specified pathogens, wherein the biological product is harvested after euthanizing the swine and the product is removed aseptically from the swine, subjecting the biological product to a treatment involving sterilization and storing the product in a sterile container, and said preparation is free of one or more extracellular surface glycans, free of certain specified pathogens, biologically active and comprises living cells and tissue capable of forming blood vessels following xenotransplantation.)
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请号的优先权权益：2018年10月5日提交的62/742,188；2018年11月7日提交62/756,925；2018年11月7日提交的US 62/756,955；2018年11月7日提交的US 62/756,977；2018年11月7日提交的US 62/756,993；2019年1月14日提交的US62/792,282；2019年1月22日提交的US 62/795,527；2019年3月25日提交的US 62/823,455；和2019年5月15日提交的US 62/848,272，所有美国临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本文所公开的主题涉及用于在异种移植中使用的源自基因工程化生物体的生物制品以及相关方法。
背景技术
根据器官共享联合网络(United Network for Organ Sharing，“UNOS”)的数据，每十分钟就有一个人被添加到国家移植等候列表中，并且每天有20人死于等待移植。截至2019年8月，美国有约114,000个人需要进行挽救生命的器官移植，其中仅鉴定了约10,000名供体，并且2018年进行了约36,000例移植(来自器官共享联合网络(UNOS)的数据)。美国对特定器官的需求如下(截至2019年8月12日)：
在2016年有超过7,000名候选人在等候列表上时或者在出于个人或医疗原因离开列表的30天内死亡，而没有接受器官移植。不幸的是，由于这种器官供应不足，每天有30人死亡或被从等候列表中移除(因为他们病得太重而无法进行必要的手术)。尽管可用供体和接受者未满足的需求之间的分歧率已有些许改善，但是这种差异一直持续到今天并且仍然很大；供应仍然严重不足。对于这些患者，以及不包括在这些统计数据中的也将从组织移植物诸如角膜或胰岛细胞中大大受益的数百万人，“同种异体移植将永远不会被证明是足够的来源。”Ekser B,Cooper DKC,Tector AJ(2015)The Need for Xenotransplantation asa Source of Organs and Cells for Clinical Transplantation.Internationaljournal of surgery(London,England),23(00):199-204。
除了器官短缺之外，还存在与同种异体移植有关的其他重要问题，并提出了涉及安全性、后勤、伦理、法律、体制和文化复杂性的多方面问题。从逻辑上讲，在成功进行器官捐赠和移植程序之前，必须考虑许多因素。必须评估每个捐赠器官的血型和其他医学因素，但此外，每个器官类型都呈现也必须权衡的独特特征，诸如死后缺血、免疫相容性、患者位置和机构能力。来自人供体的同种异体组织具有重大的感染疾病风险。Denner在2018年报告：“[人]CMV是影响器官移植接受者的最重要的单一感染因子，其中这些患者中的至少三分之二在移植之后具有CMV感染。”Denner J(2018)Reduction of the survival time ofpig xenotransplants by porcine cytomegalovirus.Virology Journal,15(1):171；Rubin RH(1990)Impact of cytomegalovirus infection on organ transplantrecipients.Reviews of Infectious Diseases,12增刊7:S754-766。
有关组织移植的法规包括供体筛选和不定因子测试的标准，以及管理组织移植物处理和分配的严格法规。已经发生由于同种异体移植引起的病毒传播。外源性逆转录病毒(人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)、人T细胞白血病病毒2型(HTLV-2)和人免疫缺陷病毒(HIV))已在器官和细胞移植过程中由于具有病毒(诸如人巨细胞病毒以及甚至狂犬病)而通过人组织传播。由于围绕器官生存能力和验尸筛选的技术和时间限制，绝对测试受到阻碍，并且这种风险无法消除。接受者和供体之间的免疫学差异阻止移植物存活延长的时间段，而没有造成他们自身的一系列并发症和额外风险的免疫抑制方案。当患者从(非自身)供体(活着的或死去的)接受器官时，接受者的免疫系统会将移植物识别为异物。这种识别将导致他们的免疫系统动员并“排斥”器官，除非使用抑制免疫系统的自然过程的附随药物。Benichou等人将对同种异体皮肤移植物的反应描述为涉及先天和适应性免疫系统的“有效”免疫反应。Abbas AK,Lichtman AHH,Pillai S(2017)Cellular and MolecularImmunology可以钝化天然免疫过程；不幸的是，这些药物通常是器官移植后的终生需求，并增加了接受者对其他常规病原体的敏感性。尽管这些药物允许移植接受者耐受外来器官的存在，但它们也增加了与免疫系统受损相关的感染疾病和症状的风险，因为“人同种异体移植物可能会传播大量的生物体。”Fishman JA,Greenwald MA,Grossi PA(2012)Transmission of lnfection With Human Allografts:Essential Considerations inDonor Screening.Clinical Infectious Diseases,55(5):720-727。
一种经常被忽视的后勤限制涉及在获得和移植时间之间维持生存能力所必需的复杂而及时的捐赠器官保存方法。这是移植作为医学领域和作为有希望的临床辅助疗法的后勤和科学基础。器官保存的局限性很大，并且直接影响手术能力。常见的最大器官保存时间的实例包括：肾，24-36小时；胰腺，12-18小时；肝，8-12小时；心脏或肺，4-6小时。这些限制性的极限时间期限的根本原因是由于无法保存组成较大组织或器官的众多且不同细胞的基本生活力。必要的和高度复杂的、相互依赖的细胞活性的中断或完全终止由此削弱了移植物的潜在临床用途。
尽管有这些缺点，器官移植无疑是大多数患有晚期器官衰竭的患者的首选疗法，这在很大程度上是由于缺乏可行的替代方法。然而，器官移植作为一种成功的挽救生命的治疗干预的出现、以及可用于移植的器官的匮乏不幸地使医学专业人员处于必须决定谁存活和谁死去的思想上令人困惑的位置。最终，替代和辅助治疗选择将最大程度地减少同种异体移植材料的严重缺点，同时提供使它们如此有效的相同作用机制，将对全世界的患者带来巨大的益处。
关于皮肤器官，具有严重且广泛的深度部分厚度和全层厚度烧伤伤口的患者在进行更永久的治疗之前迫切需要临时治疗选择以桥接它们。在此关键时期，由于机会病原体感染、皮肤屏障破坏和免疫反应受损以及烧伤部位处液体损失引起的血容量不足，重度烧伤患者处于恶化临床状况的风险中。通常随之而来的是电解质、温度和pH失衡，继而导致器官衰竭、甚至可能死亡。尽管理想的是利用自体移植来治疗此类损伤，但在烧伤护理的急性期(损伤的96小时内)，尤其是在烧伤覆盖全身表面积的20％或更多的情况下，患者自身皮肤的供应通常会受到限制。更重要的是，自体移植物的收获通常在临床上是禁忌的，因为它会进一步导致刺激患者本已受损的体内平衡并恶化发病率。参见例如，Johnson,“Partial-thickness burns:identification and management,”Adv Skin.Wound Care.2003；16(4):178-87。因此，在无法获得和/或禁用自体移植物的情形中，当前方法是利用人尸体同种异体移植物(“HCA”)提供临时的伤口覆盖，直到获得和/或指示自体移植物为止。不幸的是，考虑到固有的后勤和供应限制，以及传染因子问题，HCA的可用性受到严重限制。
为了解决由于自体移植物和同种异体移植物解决方案的有限可用性而导致的未满足的临床需求，通常使用其他“权宜之计”临时覆盖材料。这些包括由主要用于试图治疗浅表烧伤并为感染提供屏障的最终灭菌的无活力细胞构成的各种合成的或其他基于组织的制品。此类制品的实例包括培养的表皮同种异体角质形成细胞、Dermagraft、和水胶体敷料(诸如)。其他伤口闭合制品包括非遗传改变的猪异种移植物(Gal+)和组织工程化递送系统。如文献中所述，这些伤口覆盖和闭合制品中的许多具有有限的适应症和其他限制。参见例如，Thornton JF和Gosman AA,“Skin Grafts and Skin Substitutes and Principles of Flaps,”Baylor UniversityMedical Center,2004 10(1):2-78。此类制品不会血管化，并且不旨在用于治疗严重且广泛的深度部分厚度和全层厚度烧伤伤口，并允许伤口床的血管形成。在本发明之前，没有任何皮肤替代品能够近似有活力的人皮肤的生物学特性，并且没有令人满意的人同种异体皮肤的替代品。因此，特别是对于皮肤，仍然需要一种覆盖严重且广泛的深度部分厚度和全层厚度烧伤伤口以提供屏障功能(相当于或优于同种异体移植物)并在伤口床中形成血管的高质量临时方法。
通常对器官和其他移植组织的迫切需要，包括用于在定位和利用更永久的器官或其他组织的同时进行临时治疗，导致对利用来自非人来源(包括其他动物)的器官、细胞和组织进行临时和/或永久异种移植进行了调查。
鉴于猪的大小和生理学与人相容，长期以来猪一直被认为是用于人异种移植中潜在的非人器官、组织和/或细胞来源。然而，从猪到人的异种移植具有明显的障碍，最重要的就是超急性排斥，其中天然人抗体靶向动物细胞上的表位，从而导致移植器官、细胞或组织的排斥和衰竭。其他障碍包括异种移植排斥延迟、急性细胞排斥、慢性排斥、疾病或寄生虫跨物种传播的风险。
超急性排斥的原因之一是猪细胞中α-1,3-半乳糖基转移酶(“α-1,3-GT”)的表达，这导致α-1,3-半乳糖表位的合成。除人、猿猴和旧世界猴以外，大多数哺乳动物在其细胞表面均携带含有半乳糖α-1,3-半乳糖的糖蛋白(参见例如，Galili等人,“Man,apes,and oldworld monkeys differ from other mammals in the expression ofα-galactosylepitopes on nucleated cells,”J.Biol.Chem.263:17755-17762(1988)。人、猿猴和旧世界猴均具有天然存在的抗αgal抗体，其被产生并与具有半乳糖(α-1,3半乳糖)的糖蛋白和糖脂结合(参见例如,Cooper等人,“Genetically engineered pigs,”Lancet 342:682-683(1993))。因此，当在异种移植中使用天然类型的猪制品时，将调用人抗体来对抗外来的α-1,3-半乳糖表位，并且通常跟随而来的是超急性排斥。
已经尝试了多种方法来修饰猪以消除α-1,3-半乳糖基转移酶的表达，所述经修饰的诸与野生型猪相比已显示出降低超急性排斥。例如，在美国专利第7,795,493号(“Phelps”)、第7,547,816号(“Day”)和第,547,522号(“Hawley”)中公开了“敲除”和“敲入”猪。那些参考文献中的每一篇均以全文引用的方式并入本文。
除了消除α-1,3-半乳糖基转移酶的表达外，对猪的其他遗传修饰也可以用于减少人接受者对移植的猪细胞、组织和/或器官的免疫排斥。例如，消除Neu5Gc的表达是减少免疫排斥的另一种方法。参见例如，Scobie,L.,“Long-Term IgG Response to PorcineNeu5Gc Antigens without Transmission of PERV in Burn Patients Treated withPorcine Skin Xenografts,”The Journal of Immunology,191:2907-2915(2013)(“Scobie”)，其全部公开内容以引用的方式并入本文。所有哺乳动物都表达Neu5Ac(唾液酸)。除人以外，所有动物都使用由CMAH基因编码的Neu5Ac羟化酶将Neu5Ac转化为Neu5Gc。因此，与α-1,3-半乳糖基转移酶表位相似，Neu5Gc在猪细胞上表达，但被异种移植制品的人接受者识别为异物，从而导致最终排斥。因此，消除负责将Neu5Ac转化为Neu5Gc的酶CMAH可以进一步将源自猪的器官的细胞工程化以进行异种移植并降低人接受者排斥的风险。
除了α-1,3-半乳糖基转移酶和Neu5Gc之外，消除β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的表达是减少免疫排斥的另一种方法。B4GALNT2可能有助于在猪至人移植中观察到的抗体反应，并且在猪至狒狒模型中表明B4GALNT2会产生引起接受者的免疫反应的聚糖。参见例如，Byrne,G.,“Cloning and expression of porcineβ1,4-N-acetylgalactosaminyl transferase encoding q new xenoreactive antigen,”Xenotransplantation,21:543-554(2014)(“Byrne”)，其全部公开内容以引用的方式并入本文。破坏B4GALNT2基因可能降低对猪细胞的免疫反应，尤其是当那些细胞也已去除了α-1,3-半乳糖基转移酶和CMAH时。参见例如，Byrne。在美国专利公开第US2017/0311579号(其全部公开内容以引用的方式并入本文)中描述了α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的组合去除的方面，也称为“三重敲除”。在许多情况下，现有技术方法涉及例如通过施用免疫抑制剂来解决异种移植所产生的负面影响的尝试。尽管先前使用的方法需要免疫抑制药物，但是使用免疫抑制剂通常会导致威胁生命的恶性肿瘤和感染。在其他情况下，现有技术方法决定敲除动物基因和/或插入人基因以产生转基因动物，但是这样做导致动物由于免疫系统受损和其他表型并发症而无法存活和繁衍。在此类情况下，猪聚糖和/或SLA基因的破坏使得细胞易于被自然杀伤细胞裂解。自然杀伤细胞是发挥先天免疫、适应性免疫和再生功能的快速、万能的淋巴细胞。每个人都具有大量的自然杀伤细胞。先前的异种移植研究已经报告了包括移植后自然杀伤细胞介导的裂解、以及维持抗病毒免疫力的困难和供体动物的自身免疫性病症在内的问题。
尽管有此类出版物，但是关于人的异种移植制品的复杂问题仍未解决，并且在对于安全性和有效性而需要特异性的情况下，提供有活力的异种移植制品的指南仍然含糊、矛盾和通用。不存在批准用于市场销售和存在用于很少临床试验的包含活的动物细胞、组织或器官的异种移植制品。该行业面临安全性的忧虑，例如潜在的病原体传播，以及缺乏有关批准的制造程序和制品特性的有意义的法规指导。尽管各种出版物已经报告了例如在学术环境中的进展，但是没有一种出版物产生了包含活的动物细胞、组织或器官的经批准的异种移植制品，并且尚未针对此类制品或制造过程颁布良好的生产规范(GMP)法规。因此，本发明解决了将异种移植科学转化为临床现实的长期但未满足的需求。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种生产用于异种移植到人接受者中的生物制品的方法，所述生物制品包含在异种移植后形成血管的活的细胞和组织，所述方法包括：生产非野生型生物工程化的猪，其中所述猪具有生物工程化的基因组使得所述猪不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位；确认所述猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属(Ascaris)种、隐孢子虫属(cryptosporidium)种、棘球属(Echinococcus)、粪类圆线虫(Strongyloids sterocolis)和弓形虫(Toxoplasmagondii)；
(ii)抗体滴度中的钩端螺旋体属(Leptospira)种、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、弓形虫；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌(Bordetellabronchisceptica)、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(LA MRSA)、亮毛杜鹃(Microphyton)和毛癣菌属(Trichophyton)种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌(Brucella suis)；
根据减少生物负荷的程序来维持猪，所述程序包括将猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述猪被隔离免于与在隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触；从所述猪中收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪实施安乐死并从所述猪中无菌地去除所述生物制品；在收获后使用不会在3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定中将细胞生存能力降低至小于50％细胞生存能力并且不会将线粒体活性降低至小于50％线粒体活性的灭菌过程对所述生物制品进行处理，包括灭菌；并且将所述生物制品储存在无菌容器中。
根据本发明的一个方面，提供了生产适于异种移植到人接受者中的生物制品的方法，所述方法包括：生产非野生型生物工程化的猪，其中所述猪是通过自然配种和自然分娩产生的，其中所述猪具有生物工程化的基因组，使得所述猪不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位，并且其中所述猪不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属(Staphylococcus)种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒；根据减少生物负荷的程序饲养猪并维持猪，所述程序包括将所述猪维持在封闭畜群中，其中已确认在封闭畜群中的所有其他动物不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，其中所述猪被隔离免于与在封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触；从所述猪中收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪实施安乐死并从所述猪中无菌地去除所述生物制品；在收获的15小时内对所述生物制品进行处理，包括灭菌，并将所述生物制品储存在无菌容器中，其中所述生物制品不含有一种或多种细胞外表面聚糖，其中所述制品不含蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，并且其中所述制品是有生物活性的并且包含在异种移植后能够形成血管的活的细胞和组织，其中所述制品的细胞线粒体活性通过MTT测定测量为大于50％；其中如与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品当移植到人异种移植接受者中时具有较低的免疫原性，其中如与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品当移植到人异种移植接受者中时具有较低的抗原性，并且
其中所述制品在没有向人异种移植接受者施用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法的情况下抵抗人异种移植接受者的排斥。
在本发明的另外方面，在将制品临床异种移植到人接受者中之后，所述制品表现出与同种异体移植制品同等或增强的临床益处。在本发明的另外方面，所述制品包括器官或组织，例如包括肝、肾、肺、皮肤或神经。在本发明的另外方面，所述制品与异种移植后患者体内移植区域中的血管形成相容。在本发明的另外方面，关于皮肤，所述制品与异种移植后患者体内移植区域中胶原的产生相容。在一些方面，临床益处可能包括：移植物脱位减少；移植物附着增加；与周围组织水平上的肉芽形成；少于20％、10％、5％或2％的过度肉芽形成；血肿少于伤口大小的20％、10％、5％或2％；以及纤维蛋白沉积少于伤口大小的20％、10％、5％或2％；与同种异体移植物相比细菌感染减少，例如菌落计数少于105g/组织；蜂窝组织炎减少；红斑减少；水肿减少；感觉过敏减少；硬结减少；压痛减少；瘙痒减少；脓肿减少；中毒性休克综合征的发生率降低；产生毒素1的金黄色葡萄球菌的定殖减少；脓毒症和脓毒性休克的发生率降低；大肠杆菌(E.coli)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)种、普罗威登斯菌属(Providencia spp.)种、肠杆菌科(enterobacteriaceae)和酵母诸如白色念珠菌(C.albicans)的定殖减少。在另外方面，所述制品可以形成闭塞性纤维蛋白印记。在另外方面，所述制品可以掺入移植部位或愈合部位中。在另外方面，所述制品可以减少或防止在移植部位或愈合部位的感染，增加或保留在移植部位或愈合部位的流体，增加或保留在移植部位或愈合部位的电解质，增加或保留在移植部位或愈合部位的温度体内平衡，减少在移植部位或愈合部位的瘢痕形成，减少或消除脓毒症，减少或消除蛋白质损失，提供、改善或促进正常身体功能的恢复，或其组合。在本发明的另外方面，所述制品能够在不存在免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法的情况下被移植。在一些方面，在移植本公开的异种移植制品之前、期间和/或之后，根据本公开不使用免疫抑制剂。在一些方面，在移植本公开的异种移植制品之前、期间和/或之后，根据本公开可以使用免疫抑制剂。在一些方面，在移植本公开的异种移植制品之后，根据本公开使用免疫抑制剂以延长已经移植的异种移植制品的附着。
根据本发明的另一个示例性方面，本公开提供了制备用于临床异种移植到人中的生物制品的方法，所述方法包括选择已知的人主要组织相容性复合物基因序列或对人接受者的主要组织相容性复合物基因进行测序；遗传修饰猪的细胞以将猪的主要组织相容性复合物基因序列的一部分替换成已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分，从而使得所述猪细胞表达已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分；从表达已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分的所述猪中分离出一种或多种细胞、组织和/或器官，其中所述分离的细胞、组织和/或器官是所述生物制品。
根据本发明的另一个示例性方面，本公开提供了制备遗传重新编程的猪的方法，所述遗传重新编程的猪包含核基因组，所述核基因组具有破坏的α-1,3半乳糖基转移酶基因并且被遗传修饰使得其表达从所述遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官的已知的人序列或人接受者的主要组织相容性复合物，所述方法包括选择已知的人主要组织相容性复合物序列或对所述人接受者的主要组织相容性复合物基因进行测序，获得包含具有至少一个破坏的猪表面聚糖基因的核基因组的猪，遗传修饰猪细胞以将猪的主要组织相容性复合物基因的部分替换成已知的人主要组织相容性复合物基因的对应部分或人接受者的主要组织相容性复合物的对应部分，使得所述猪的细胞表达所述人接受者的主要组织相容性复合物的部分。
根据本发明的另一个示例性方面，本公开提供了延迟、减少或防止人接受者中对异种移植组织的排斥、分离或不良反应的方法，所述方法包括选择已知的人主要组织相容性复合物基因序列或对人接受者的主要组织相容性复合物基因进行测序；获得包含具有破坏的α-1,3半乳糖基转移酶基因的核基因组的猪；遗传修饰猪的细胞以将猪的主要组织相容性复合物基因的一部分替换成已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分，使得所述猪细胞表达已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分；从表达已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分的所述遗传重新编程的猪中分离出细胞、组织和/或器官；以及将来自所述遗传重新编程的猪的所述分离的细胞、组织和/或器官移植到所述人接受者中。
根据本发明的另一个示例性方面，本公开提供了用于临床异种移植的源自非野生型生物工程化的非人生物体的生物制品，其中所述生物制品源自的所述生物体是通过自然配种和/或辅助生殖技术产生的，并且其中所述生物体具有生物工程化的基因组，使得其不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位，并且其中所述生物体不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，其中所述生物体不是转基因的，其中所述制品不含有一种或多种细胞外表面聚糖，其中所述制品不含：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，其中所述制品尚未进行最终灭菌，其中与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品具有较低的免疫原性，其中如与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品当移植到人异种移植接受者中时具有较低的抗原性，并且其中所述制品是有生物活性的并且包含异种移植后能够形成血管的活的细胞和组织。
根据本发明的另一个示例性方面，本公开提供了生产第二代非野生型生物工程化仔猪的方法，所述方法包括：通过剖腹产术从怀孕的母猪分娩非野生型生物工程化仔猪，其中所述母猪是通过自然配种和/或辅助生殖技术生产的；并且将所述分娩的仔猪保持在隔离的封闭畜群中，其中在隔离的封闭畜群中的所有其他猪均被确认不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，其中所述仔猪不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒；将所述仔猪饲养在所述隔离的封闭畜群中；在性成熟时使所述仔猪与也维持在所述隔离的封闭畜群中且不含所述病原体的另一只猪交配；以及分娩由所述交配产生的新仔猪，其中所述新仔猪是也不含所述病原体的第二代非野生型生物工程化仔猪。
根据本发明的另一个示例性方面，本公开提供了治疗已经遭受需要器官、神经、细胞或组织移植的损伤的人受试者的方法，所述方法包括将来自第二代非野生型生物工程化仔猪的器官、神经、细胞或组织移植到所述受试者中，其中所述第二代非野生型生物工程化仔猪是通过本公开的方法生产的，并且其中不向所述受试者施用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法。
根据本发明的另一个示例性方面，本公开提供了生产仔猪的方法，所述方法包括：通过剖腹产术从怀孕的母猪分娩仔猪，其中所述母猪是通过自然配种和/或辅助生殖技术生产的；并且将分娩的仔猪保持在不含指定病原体的环境中，其中所述仔猪不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒；将所述仔猪饲养在所述环境中；在性成熟时将所述仔猪与也维持在所述环境中且不含病原体的另一只猪交配；以及分娩由所述交配产生的新仔猪，其中所述新仔猪也不含所述病原体。在本发明的另外方面，猪是通过这样的方法生产的。所述方法的另外方面包括从新仔猪收获生物制品，其中所述制品包括器官或组织，所述器官包括肝、肾或皮肤，和/或所述组织包括神经。
根据本发明的另一个示例性方面，提供了将制品异种移植到人患者中的方法，所述方法包括获得源自具有破坏的α-1,3半乳糖基转移酶基因的基因组的非野生型基因工程化非人生物体的制品，其中所述生物体被维持在不含指定病原体的环境中并且不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，并且其中所述制品是有生物活性的；以及将所述制品移植到人接受者中，其中在所述移植后，所述制品表现出临床益处。所述方法的另外方面包括：所述制品包括器官或组织，所述器官包括肝、肾或皮肤，所述组织包括神经，所述移植在没有免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法的情况下发生，所述制品与在异种移植后患者体内的移植区域中的血管形成相容，所述制品例如皮肤与在异种移植后患者体内移植区域中的胶原的产生相容，所述临床益处与同种异体移植物制品相比有所增强，所述生物制品源自的生物体是通过自然配种和/或辅助生殖技术生产的。在一些方面，将制品异种移植到人患者中的方法还可以包括：将人接受者样品(诸如血液和组织样品)存档以允许将来监测潜在的感染，终生跟踪所述接受者以检测任何异常症状，和/或将所述异种移植制品的样品存档。用于共培养过程的任何非人动物细胞也应存档。
猪的又其他遗传修饰也可以用于减少人接受者对移植的猪细胞、组织和/或器官的免疫排斥。例如，主要组织相容性复合物(MHC)(包括I类、II类和III类亚组)包含对于获得性免疫系统识别脊椎动物中的外来分子必不可少的一组细胞表面蛋白，并且MHC分子与源自病原体的抗原结合并将所述抗原展示在细胞表面上以被适当的T细胞识别。参见图25。
主要组织相容性复合物I类(MHCI)和II类(MHCII)分子在抗原呈递细胞表面上展示肽，用于随后的T细胞识别。参见图22。在人群体中，经典MHCI和II基因产物之间的等位基因变异是差异肽结合、胸腺库偏倚和同种异体移植物排斥的基础。MHC分子是对适应性免疫过程至关重要的细胞表面糖蛋白，发挥在抗原呈递细胞(APC)的表面上捕获和展示肽的功能。MHC I类(MHCI)分子在大多数细胞上表达，结合大小范围为8至10个氨基酸残基的内源性衍生的肽，并且被CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别。参见图18和图27。在另一方面，MHCII类(MHCII)仅存在于专职APC上，结合大小从9至22个残基变化的外源性衍生的肽，并被CD4辅助T细胞识别。参见图28。这些差异表明，MHCI和MHCII分子接合T细胞介导的免疫反应的两个不同的分支，前者靶向侵入性病原体诸如通过CD8 CTL破坏的病毒，而后者诱导基于细胞因子的炎症介质来刺激CD4辅助T细胞活性，包括B细胞激活、成熟和抗体产生。在一些方面，本公开的生物制品未被CD8+T细胞识别，不结合抗HLA抗体，并且对NK介导的裂解具有抗性。
在人中，MHC分子被称为HLA(人白细胞抗原的首字母缩写)，并且由位于染色体6p21.3-上的HLA区域编码。8,9所述HLA区段被分成三个区域(从着丝粒到端粒)：II类、III类和I类。参见图19。经典的I类和II类HLA基因分别包含在I类和II类区域中，然而III类基因座带有编码参与免疫系统但与MHC分子在结构上不相关的蛋白质的基因。经典的HLA I类分子具有三种类型：HLA-A、HLA-B和HLA-C。这些成熟的HLA I类分子中只有α链由各自的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因编码在I类HLA基因座内。参见图13。相比之下，由β2m基因编码的β2微球蛋白β2m链位于染色体15上。经典的HLA II类分子也具有三种类型(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)，每个分子的α和β链均由一对相邻的基因座编码。除了这些经典的HLA I类和HLAII类基因之外，人MHC基因座还包括许多HLA假基因以及编码非经典MHCI和MHCII分子的基因。HLA假基因表明基因复制是HLA进化的主要驱动力，然而非经典的MHCI和MHCII分子通常在免疫系统内发挥有限的功能，这与抗原呈递至αβTCR的功能截然不同。
在移植中，MHC分子它们自身充当抗原，引起接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。因此，从供体动物中消除特定MHC分子的表达将有助于减少在人接受者中对移植的猪细胞、组织和/或器官的免疫排斥。人MHC I类和II类也被称为人白细胞抗原(HLA)。本发明人已经发现，为了使供体动物存活和茁壮成长，有必要保留为供体动物提供最低限度能力的免疫系统的某些MHC分子(例如SLA)。依赖于MHC基因缺失的现有技术策略对供体动物造成很大的风险，例如严重的组合免疫缺陷(SCID)。不对猪基因组重新编程的现有技术策略对人接受者造成很大的排斥风险，或者需要大量且无休止使用抗抑制剂。本公开的生物制品避免了许多人免疫途径，包括抗原呈递和适应性免疫力产生、自然杀伤细胞介导的裂解、T细胞介导的裂解和/或巨噬细胞吞噬作用。因此，本公开的生物制品提供了异种移植制品在人接受者中的长期存活，而无需全身免疫抑制。
人白细胞抗原(HLA)系统或复合物是编码人体中的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。这些细胞表面蛋白负责调节人体中的免疫系统。HLA基因复合物位于染色体6p21内的3Mbp延伸段上。参见图14。HLA基因高度多态，这意味着它们具有许多不同的等位基因，从而允许它们微调适应性免疫系统。参见图15。由某些基因编码的蛋白质也被称为抗原，这是由于其作为器官移植中的因子的历史发现。不同的类别具有不同的功能。参见图16和图17。
全部都属于HLA 1类组的与MHC I类(A、B和C)对应的HLA从细胞内部呈递肽。例如，如果细胞受到病毒感染，则HLA系统将病毒的片段带到细胞表面，以便免疫系统可以破坏细胞。这些肽是由在蛋白酶体中分解的消化蛋白质产生的。通常，这些特定的肽是小的聚合物，长度为约9个氨基酸。由MHC I类呈递的外来抗原吸引了破坏细胞的杀伤性T细胞(也称为CD8阳性或细胞毒性T细胞)。MHC I类蛋白与β2微球蛋白缔合，其与HLA蛋白不同，由染色体15上的基因编码。
与MHC II类(DP、DM、DO、DQ和DR)对应的HLA将抗原从细胞外部呈递给T淋巴细胞。这些特定的抗原刺激T辅助细胞(也称为CD4阳性T细胞)的增殖，其进而刺激产生抗体的B细胞产生针对该特定抗原的抗体。自身抗原被调节性T细胞抑制。已知受影响的基因编码控制MHC II类基因转录的4种不同的调节因子。这些反式作用因子为II类反式激活因子以及调节因子X(RFX)的3个亚基：含有锚定蛋白重复序列的RFX(RFXANK)、RFX家族的第五个成员(RFX5)和RFX相关蛋白(RFXAP)。每个之一的突变限定了4种不同的互补基团，分别称为A、B、C和D。
与MHC III类对应的HLA编码补体系统的组分。HLA具有其他角色。它们在疾病防御中很重要。它们是器官移植排斥的主要原因。它们可能预防癌症，或者未能预防(如果由于感染而被下调)癌症。HLA的突变可能与自身免疫性疾病有关(实例：I型糖尿病、腹部疾病)。HLA也可能与人们对其他人的气味感知有关，并且可能参与伴侣选择，因为至少一项研究发现在隔离的社区中配偶之间的HLA相似性低于预期比率。
除了编码6种主要抗原呈递蛋白的基因外，位于HLA复合物上的还有大量的其他基因，其中许多参与免疫功能。人群体中HLA的多样性是疾病防御的一个方面，并且因此，两个不相关个体在所有基因座上具有相同HLA分子的机会极低。HLA基因在历史上已被鉴定为能够在HLA相似个体之间成功移植器官的能力的结果。
每个人细胞表达六个MHC I类等位基因(来自每个亲本的一个HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因)和六至八个MHC II类等位基因(来自每个亲本的一个HLA-DP和HLA-DQ、以及一个或两个HLA-DR、以及这些的组合)。人群体中的MHC变异很高，对于HLA-A基因有至少350个等位基因，对于HLA-B基因有620个等位基因，对于DR有400个等位基因，并且对于DQ有90个等位基因。在人中，MHC II类分子由彼此之间显示出约70％相似性的三个不同的基因座HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP编码。多态性是MHC II类基因的显著特征。本公开包括鉴定在供体动物中重新编程的核苷酸序列，找到并选择性地将SLA的对应部分替换成要重新编程的核苷酸序列(例如50-80个核苷酸、60-72个核苷酸、62-68个核苷酸)。在一些方面，MHC II类基因被重新编程。SLA基因的图谱是可用的。参见图25和图26。因此，本公开包括对小部分的遗传密码进行重新编程，而不是制造使人基因插入动物基因组中的转基因动物。本公开相对于现有技术MHC沉默技术的优点包括提供生物学上重新编程的猪，所述生物学上重新编程的猪具有功能良好的免疫系统、基本上不含由本发明人鉴定出的对于实现所公开的发明的优点而排除在外至关重要的特定组的病原体，以及提供了对人接受者的免疫系统“不可见”(即显著延迟或避免了被人接受者的免疫系统的排斥)的异种移植制品。
不是相同的双胞胎的任何两个个体将表达不同的MHC分子。尽管已经制备MHC基因敲除细胞，但是由于MHC等位基因的缺失，此类细胞遭受的问题包括下游适应性免疫反应的激活受到损害。通过替换猪的MHC等位基因，本公开提供了改进的供体-接受者匹配，因为维持了完整的免疫功能。具体而言，通过基因编辑技术修饰猪供体细胞致使供体细胞表达人接受者的MHC分子，将有助于减少在人接受者中对移植的猪细胞、组织和/或器官的免疫排斥。这是令人期望的，因为人群体中的MHC变异非常高，并且具有表达与接受者实际上相同的MHC分子的移植细胞、组织或器官将有助于减少对此类移植的猪细胞、组织和/或器官的免疫排斥。
根据本公开的一个方面，进行基因编辑以将HLA-E和HLA-G构建体敲入猪MHC区域I类区域中。根据本公开的一个方面，进行基因编辑以将HLA-C、HLA-E和HLA-G构建体敲入猪MHC区域I类区域中。CD94/NKG2是在自然杀伤(NK)细胞和一小部分的T细胞上表达的异二聚体。该受体根据表达哪种NKG2同种型而在作为抑制剂或激活剂的功能方面有所不同。CD94/NKG2的配体是人中的HLA-E，其与其他I类分子的前导肽结合。与NK细胞相似，表达高水平CD94的大多数CD8 T细胞共表达抑制同工型NKG2A。该受体的接合可以导致细胞毒性的阻断。然而，这些受体也与NK细胞和CD8 T细胞两者的细胞存活有关。CD94表达水平与培养物中的凋亡水平成反比。因此，CD94/NKG2受体可以调节NK细胞和CD8 T细胞的效应功能和细胞存活，从而在对病原体的先天性和适应性免疫反应中起关键作用。在某些方面，本公开包括例如通过质谱流式细胞术测试供体动物和/或异种移植制品接受者的自然杀伤细胞增加。
猪的其他遗传修饰也可以减少免疫排斥。例如，已对猪进行了许多转基因修饰，以降低免疫原性和免疫排斥(参见例如，Denner J,“Xenotransplantation-Progress andProblems:A Review,”J Transplant Technol Res 4(2):133(2014)(“Denner”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文)。这些包括但不限于用于抑制人补体调节的hCD46(hMCP，人膜辅因子)、hCD55、hCD59、hCD39、血栓调节蛋白、血红素加氧酶1、A20、HLA-E和CD47及其组合、以及在Denner和本文中所阐述的其他修饰。在US2018/0184630、US2017/0216358、US2019/0004063和美国专利第9,888,673号(所述专利以全文引用的方式并入本文)中描述了另外的修饰。
从本发明也将理解，用于异种移植的源自猪的制品的其他特征引起增强的来自人体的免疫反应。例如，猪可能携带多种病原体，包括但不限于猪巨细胞病毒(“pCMV”)、钩端螺旋体属种、动脉炎病毒、猪冠状病毒、弓形虫和其他病原体。本发明人已经鉴定出对于实现所公开的发明的优点而排除在外至关重要的特定组的病原体。因此，本发明的目的是，用于猪至人的异种移植程序的源自猪的制品不含本文所述的特定组的病原体。
先天免疫系统通过人模式识别受体(PRR)和Toll样受体(TLR)检测非自身的、位于细胞表面上或原本与此类病原体相关的结构(例如病原体相关的分子模式(PAMP))，从而导致对本主题异种移植制品的排斥。因此，本发明的目的是从本主题制品中去除、消除、杀灭、破坏和/或以其他方式中和此类结构，以最小化或甚至消除在异种移植此类制品后的免疫反应和/或排斥。
本发明的另一目的是从具有一个或多个独特特征(例如，为非野生型遗传重新编程的、工程化的和/或经修饰的)的猪(包括但不限于缺乏表面聚糖表位的表达的猪、经遗传修饰的猪、经生物学重新编程的猪以及如本文所述和公开的其他猪)中生产不含这种特定病原体的猪制品。
本发明的另一目的是对此类制品进行最小程度的操作。操作超出其自然状态的异种移植制品(例如，固定在醛中)有助于使此类制品成为无活力的。因此，本发明的目的是本文所公开和描述的制品是最小程度操作的有活力的活细胞，并能够与移植接受者形成有机结合，包括但不限于诱导移植接受者中的血管形成和/或胶原产生。
本发明的另一目的是在一些情形中以保持此类制品的生存能力和活细胞特性的方式保存此类制品，包括但不限于通过冷冻保存。将理解的是，此类制品也可以从收获到移植连续新鲜地储存，而不是冷冻保存。本发明的另一目的是此类制品在移植之前的冻融循环后具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的线粒体活性。本发明的另一目的是此类制品在用于移植的新鲜制品中具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的线粒体活性。本发明的另一目的是此类制品在3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定中具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的细胞生存能力。本发明不限于使用MTT还原测定的检测，并且也可以使用其他检测测定。在这样的示例性测定中，100％代谢活性的水平被定义为，例如，从获得自单一源动物供体的新鲜(非冷冻保存的)组织样品中的MTT还原测定的结果，其构成制品批次的生存能力的基线阳性对照。没有代谢活性(0％)被定义为从获得自单一源动物供体的热灭活(沸腾或类似)的组织样品的MTT还原测定的结果，其构成了制品批次的生存能力的基线阴性对照。制品生存能力是与上述100％和0％边界条件相比测试制品的代谢活性的比较。行业规范和已发布的参考标准支持50％的生物活性是可接受的，以提供一致的临床上有用的材料。
本发明的另一目的是将此类制品用于同源用途，即用执行与供体相同的一种或多种基本功能的对应器官、细胞和/或组织修复、重建、替换或补充接受者的器官、细胞和/或组织(例如，将猪皮肤用作人皮肤的移植体，将猪肾用作人肾的移植体，将猪肝用作人肝的移植体，将猪神经用作人神经的移植体，等等)。
本发明的另一目的是在需要使用或不需要使用抑制或干扰正常免疫功能的免疫抑制剂药物或疗法的情况下进行此类制品在异种移植中的利用。尽管已知免疫抑制药物可以用于防止对异种移植制品的排斥，但是此类药物也抑制针对例如病毒和细菌感染的免疫反应，从而使接受者处于风险中。异种移植后通常产生对移植组织的排斥。排斥可以是细胞排斥(淋巴细胞介导的)或体液(抗体介导的)排斥(包括但不限于超急性排斥、急性排斥、慢性排斥)，可能涉及生存限制性血小板减少性凝血病和急性体液异种移植反应(AHXR)。尽管不受机制的限制，但是体液排斥和细胞排斥过程都可能靶向MHC分子。人对移植组织上存在的猪聚糖和蛋白质的超急性排斥反应是如此强烈，以至于移植物组织通常在移植到人体内的几分钟或几小时内就被人免疫系统破坏。
此外，不同的排斥机制可能以器官优选的方式占主导。急性或快速体液排斥可能在移植的几分钟内开始；急性或快速细胞排斥可能在移植的几天内开始。体液排斥和细胞排斥也都可能具有较慢或慢性排斥阶段；慢性阶段可能持续几年。参见Demetris等人1998“Antibody-mediated Rejection of Human Orthotopic Liver Allografts.A study ofliver transplantation across ABO blood group barriers”,Am J.Pathol 132:489-502；Nakamura等人1993“Liver allograft rejection in sensitizedrecipients.Observations in a Clinically Relevant Small Animal Model”AmJ.Pathol.142:1383-91；Furuya等人1992.“Preformed Lymphocytotoxic Antibodies:theEffects of Class,Titer and Specificity on Liver v Heart Allografts”Hepatology16:1415-22；Tector等人2001.“Rejection of Pig Liver Xenografts in Patients withLiver Failure:Implications for Xenotransplantation”,Liver Transpl第82-9页；以全文引用的方式并入本文。
猪细胞表达在人细胞中不存在的多种蛋白质。这些包括但不限于α1,3-半乳糖基转移酶(αGal)、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1-4N-乙酰半乳糖氨基转移酶。针对CMAH(和Neu5GC)、α-Gal和Sda样抗原的抗体在异种组织植入之前已存在于人血液中，并参与抗体介导的对植入组织的强烈和立即的排斥。另外，猪细胞表达多种猪白细胞抗原(SLA)。与人不同，猪在内皮细胞上组成型地表达I类和II类SLA。SLA和HLA共享相当大的序列同源性(Varela等人2003J.Am.Soc.Nephrol 14:2677-2683)。在人血清中存在的抗HLA抗体在猪组织植入前与SLA抗原在猪组织上发生交叉反应。SLA交叉反应性抗体有助于对植入猪组织的强烈和立即的排斥。SLA抗原也可能参与接受者的T细胞介导的免疫反应。猪SLA可以包括但不限于由SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-4、SLA-5、SLA-6、SLA-8、SLA-9、SLA-11和SLA-12基因座编码的抗原。猪II类SLA包括由SLA-DQ和SLA-DR基因座编码的抗原。参见图26。
本公开包括重新编程供体动物细胞，使得供体动物中的全部免疫功能得以保留，但是对细胞表面表达蛋白和聚糖进行重新编程，使得人接受者的免疫系统不将它们识别为异物。因此，与要求敲除MHC和SLA或将转基因插入动物基因组中的现有技术公开相反，本公开涉及通过仅重新编程离散和小部分以使动物保留功能性免疫系统来重新编程动物基因组，但是动物的重新编程的细胞不表达引起人接受者免疫系统攻击的细胞表面表达蛋白质和聚糖。
对于使用CRISPR的免疫原性重新编程，引导RNA首先与靶位点处的基因组DNA的互补序列结合。然后，Cas9在靶位点进行双链断裂(DSB)。然而，对靶标的切割取决于核酸酶与切割位点下游3-4个核苷酸的前间区序列邻近基序(PAM)的初始结合。SpCas9的PAM基序是5’-NGG-3’(其中N表示任何核苷酸)。不同类型的CRISPR核酸酶识别不同的PAM序列。一旦进行DSB后，细胞将激活机制以修复切割位点。正是在这种修复过程中，对基因组进行了编辑。
在一些方面，实现敲除以便进行致使基因无效的突变。在真核细胞中，DSB通常通过非同源末端连接(NHEJ)进行修复，这是一种涉及将每条DNA链的末端连接在一起的快速固定修复机制。NHEJ容易出错，通常导致在断裂位点核苷酸的插入或缺失(称为插入缺失(indel))。不是三的倍数的蛋白质编码区的插入缺失诱导移码突变。由于基因的阅读框发生变化，因此这些突变通常导致基因功能丧失(即敲除，不产生功能蛋白)。此类改变可以用于各种功能丧失应用中。
在一些方面，实现敲入以便插入外来的遗传序列。
重要的是，普通技术人员现在已经能够使用可商购获得的CRISPR试剂盒以及通过提供设计、咨询和实验室服务对使用CRISPR技术的任何期望的敲除或敲入实验提供有保证的结果的众多商业服务组织来对细胞进行遗传修饰。因此，本领域技术人员可以使用本公开来制造和使用所公开的发明，而无需过多的实验。
在某些方面，本公开包括对接受者的HLA/MHC基因进行测序；制备模板HLA/MHC序列；例如使用聚合酶链式反应制备CRISPR-Cas9质粒；将模板HLA/MHC序列克隆到质粒中；确定在猪细胞中的HLA/MHC基因座处的CRISPR切割位点；将gRNA序列克隆到一个或多个CRISPR-Cas9质粒中；将CRISPR-Cas9质粒施用到猪细胞中；在猪细胞的MHC基因座处进行CRIPSR/Cas9切割；将猪细胞中的HLA/MHC基因座替换成与接受者的测序HLA/MHC基因匹配的一个或多个模板HLA/MHC序列。在Cas9系统中，鉴于细菌CRISPR系统的自然多样性，开发了许多Cas9样核酸酶。Cpf1(一种推定的2类CRISPR效应子)介导具有来自Cas9的独特功能的靶DNA编辑。与Cas9产生平末端形成对比，Cpf1产生具有5'突出端的5-nt交错切口，这在促进基于NHEJ的基因插入(敲入)到基因组方面特别有利。组合Cas9切口酶和PmCDA1(一种激活诱导的胞苷脱氨酶)的杂合酶可以在不使用模板DNA的情况下进行靶向核苷酸取代(C-U)，从而为点突变提供了一条新途径。最近还开发了靶向RNA的CRISPR系统(Cas13a)。也可以使用由识别3'瓣状结构的瓣状核酸内切酶-1和切割DNA链的Fok I切割结构域组成的结构引导的核酸内切酶(SGN)。需要与具有不配对的3'末端的靶标互补的引导DNA以形成3'瓣状结构。SGN基于在靶标和引导DNA之间形成的双瓣状复合物的3'瓣状结构识别并切割靶DNA。SGN提供了一种基于结构的识别、捕获和编辑任何期望的靶DNA的策略，从而扩展了用于遗传修饰的工具包。在某些方面，本公开还包括在进行HLA/MHC替换步骤之后对猪的细胞进行测序，以便确定猪细胞中的HLA/MHC序列是否已被成功替换。在某些方面，本公开还包括将来自HLA/MHC序列替换的猪的一种或多种细胞、组织和/或器官移植到人接受者中。在某些方面，本公开还包括在将HLA/MHC序列替换的猪用作异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源之前，使其进行繁殖至少一代或至少两代。
在某些方面，例如在IPD-IMGT/HLA数据库或文库(可获自ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)和international ImMunoGeneTics information (可获自imgt.org)中可获得已知的人序列信息。此类基因的命名法在图20中展示出。例如，HLA-A1、B8，DR17是白种人中最常见的HLA单倍型，频率为5％。此外，可获得人基因组信息到动物基因组信息的图谱。例如，如图23和图24所示，人和猪的主要组织相容性复合物I类和II类区域的图谱是已知的，并且可以用于根据本公开对猪细胞进行重新编程，以便保留供体动物的免疫功能，同时降低或消除人接受者身体对来自供体动物的异种移植制品的反应性。因此，可以使用已知的MHC/HLA序列信息来执行所公开的方法。
在某些方面，本公开包括用于临床异种移植的源自非野生型基因工程化猪的生物制品，其中所述猪具有带有破坏的α-1,3半乳糖基转移酶基因的基因组，并且其中来自猪的细胞已经被遗传修饰，使得所述细胞表达所述生物制品的接受者的主要组织相容性复合物。
上面和其他各个方面以及方面在下面参考附图进行描述。
附图说明
并入本文并构成本公开的一部分的附图帮助说明本发明的各个方面，并且与本说明书一起进一步用于描述本发明以使相关领域的技术人员能够制造和使用本文所公开的方面。在附图中，相同的附图标记指示相同或功能上类似的元件。
图1示出了根据本发明的源动物设施和对应的无指定病原体的设施、动物和畜群。
图2示出了制备根据本发明的皮肤制品的方法。
图3示出了根据本发明的组合皮肤制品。
图4示出了根据本发明的体外肝过滤器和回路。
图5A描绘了在POD-12下从左到右分别在伤口部位1、2、3和4处的猪分层厚度(split-thickness)皮肤移植物。图5B描绘了在POD-12(左)和POD-14(右)下在伤口部位4处的猪分层厚度皮肤移植物。
图6A绘制了在新鲜与冷冻保存(7年)的猪组织样品中的MTT还原测定，显示出无统计学差异。图6B绘制了在热失活与冷冻保存(7年)的猪组织样品中的MTT还原测定，显示出所产生的甲臜的量具有统计学显著差异。
图7显示了来自冷冻保存并储存了7年的移植物的H&E染色切片的组织学图像，显示出具有完整表皮的有活力的正常皮肤。血管和附件结构也正常。基于储存的持续时间在组织学水平上不可以看到明显的差异。从左到右(存储持续时间)：15分钟、7年、7年。
图8描绘了在非人灵长类动物接受者中用作治疗全层厚度伤口缺损的临时伤口闭合的猪分层厚度皮肤移植物的纵向进展。左：POD-0，在伤口部位2处的异种移植制品。右：POD-30，在伤口部位2处的相同异种移植制品。
图9A描绘了POD-15。H&E，H&E高倍图像描绘了具有表面和滤泡上皮坏死的组织生存能力。图9B描绘了展示具有良好总体生存能力的残留自体移植物(星号)的POD-22H&E高倍图像。观察到没有表面上皮坏死和一些表面坏死，以及广泛的纤维化和渗入自体移植物中(箭头)。
图10显示了以下的POD-30组织学图像：顶部、中心：H&E，伤口部位的低倍图像描绘了完整的上皮覆盖。虚线圈住的是残留的异种移植制品。
图11A绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgMELISA(μg/mL)。图11B绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgG ELISA(μg/mL)。
图12A绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的可溶性CD40L的全身浓度。图12B绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的TGF-α的全身浓度。图12C绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的IL-12/23(p40)的全身浓度。
图13示意性地示出了人MHC I类和II类同种型。
图14示意性地示出了HLA基因的共显性表达和HLA基因在人染色体6上的位置。
图15是列出用于人MHC I类和II类同种型的血清抗原、蛋白质和等位基因的数目的表。
图16示意性地示出了细胞表面上的HLA I类和II类。
图17显示了MHC I类蛋白(A)和II类蛋白(B)的结构。形成肽结合区(PBR)的距质膜最远的两个球状结构域用蓝色阴影表示。包括β2微球蛋白在内的两个Ig样结构域以灰色阴影显示。
图18示意性地示出了细胞表面上的HLA I类。
图19显示了人白细胞抗原复合物(HLA)。HLA基因在基因组中具有最高的多态性。HLA I类和II类基因座的等位基因多样性很广泛，描述了>13,000个等位基因。
图20示出了HLA等位基因的命名法。每个HLA等位基因名称都具有与由冒号分隔的至多四组数字对应的唯一编号。等位基因名称的长度取决于等位基因的序列及其最接近的亲缘的序列。所有等位基因收到至少一个四位数字的名称，其与前两组数字对应，只有在必要时才分配更长的名称。在第一个冒号之前的数字描述类型，其通常对应于由同种异型携带的血清抗原。下一组数字用于列出亚型，数字按DNA序列被确定的顺序分配。其编号在两组数字中不同的等位基因必须在改变所编码蛋白质的氨基酸序列的一个或多个核苷酸取代上有所不同。通过使用第三组数字来区分仅在编码序列内的同义核苷酸取代(也称为沉默或非编码取代)不同的等位基因。通过使用第四组数字来区分仅在内含子或在外显子和内含子侧翼的5'或3'非翻译区中的序列多态性不同的等位基因。
图21A-21B显示了来自Tsurui等人(General Med 2013,2:1)的TCR-pMHC复合物的字符串模型。在此简化模型中，TCR的CDR1和CDR2主要与沿着MHC分子两侧行进的螺旋相互作用，所呈递的肽位于所述螺旋之间。在这种情况下，CDR3(LKVEGTRVY)与所呈递的肽(LDIRASELT)相互作用，从而形成带有9个梯级(L–L、K–D、V–I、E–R、G–A、T–S、R–E、V–L、Y–T)的梯子。为简单起见，仅考虑CDR3与所呈递的肽之间的相互作用(SI 1)。(图21A)通过M-J矩阵分别将AA接触能分配给这些梯级(AA对)，并且可以通过将这些值相加来计算在CDR3与所呈递的肽之间的结合能。(图21B)显示了TCR-pMHC复合物(PDBID:1AO7)的实际3维结构。两个CDR3环均包含横穿而不是平行于所呈递的肽延伸的α链和β链。CDR2主要与螺旋相互作用，然而CDR1与MHC螺旋和所呈递的肽两者都相互作用。TCR-pMHC的结合方式也变化很大。
图22示意性地示出了结合MHC I类和肽的T细胞受体(TCR)。
图23是人和猪MHC I类区域的比较基因组组织。
图24是人和猪MHC II类区域的比较基因组组织。
图25显示了SLA复合物的物理图谱。黑色框：含有MHC相关序列的基因座。白色框：没有MHC相关序列的基因座。从染色体的长臂到短臂，区域的顺序为II类(II)、III类(III)和I类(I)。
图26显示了SLA基因的示意性分子组织。外显子用灰色椭圆形表示，并且内含子用线表示。基因长度近似于Hp-1.1基因组序列的长度。
图27示意性地示出了细胞毒性T细胞(CD8+)-靶细胞相互作用。
图28示意性地示出了细胞毒性T细胞(CD4+)-靶细胞相互作用。
图29显示了异种移植制品的运输过程。
图30显示了用于储存异种移植制品的冷冻小瓶。
图31显示了用于在低于环境温度的温度(包括但不限于-150摄氏度和其他温度)下储存异种移植制品的辅助封闭或容器系统。
图32显示了根据本发明的一个方面的临床伤口评估量表。
具体实施方式
尽管本公开的主题的方面可以以各种形式体现，但是以下描述仅旨在公开这些形式中的一些作为本公开所涵盖的主题的特定实例。因此，本公开的主题并非旨在限于所描述的形式和方面。
除非上下文中另外明确指定，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。
如本文所用并如在本领域中很好理解的，术语“治疗(treating或treatment)”意指获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于，减轻或改善一种或多种症状或病况、减小疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减慢疾病进展、改善或缓解疾病状态、减少疾病复发、以及缓和(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗(Treating和treatment)”还可以意指与如果不接受治疗的预期生存相比延长生存。除了可用作治疗方法外，本文所述的方法还可用于预防(prevention或prophylaxis)疾病。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围的形式表示或呈现。应当理解的是，这样的范围形式仅是为了方便和简洁而使用，并且因此应该灵活地解释为不仅包括明确列举为范围极限的数值，而且还包括在该范围内涵盖的所有单独的数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确叙述一样。作为说明，数值范围“约0.01至2.0”应当解释为不仅包括明确列举的约0.01至约2.0的值，而且还包括在所指示范围内的单独的值和子范围。因此，包括在该数值范围内的是诸如0.5、0.7和1.5之类的单独的值，以及诸如0.5至1.7、0.7至1.5、以及1.0至1.5等等之类的子范围。此外，这样的解释应适用于范围的广度或所描述的特征。另外，应当注意的是，除非另有说明，否则所有百分比均以重量计。
在理解本公开的范围时，如本文所用的术语“包括”或“包含”及其派生词旨在为开放式术语，其指定所陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在，但不排除其他未陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在。前述内容也适用于具有类似含义的词，诸如术语“包括”、“具有”及其派生词。如本文所用，术语“由……组成”及其派生词旨在为封闭式术语，其指定所陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在，但排除其他未陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在。如本文所用，术语“基本上由……组成”旨在指定所陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤以及不会实质性影响特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的一个或多个基本和新颖特性的那些的存在。应当理解，对这些过渡术语(即“包含”、“由……组成”或“基本上由……组成”)中的任何一个的提及提供了对替换成未具体使用的任何其他过渡术语的直接支持。例如，由于该限定，将术语从“包含”修改为“基本上由……组成”将获得直接支持。
如本文所用，术语“约”用于通过假定给定值可以在端点“之上一点”或“之下一点”来为数值范围端点提供灵活性。该术语的灵活性程度可以由特定变量决定，并且将在本领域技术人员的知识范围内以基于经验和本文的相关描述来确定。例如，在一个方面，灵活性程度可以在数值的约±10％以内。在另一个方面，灵活性程度可以在数值的约±5％以内。在另一方面，灵活性程度可以在数值的约±2％、±1％或±0.05％以内。
通常，在本文中，术语“或”包括“和/或”。
如本文所用，为了方便，可以在共同的列表中呈现多个化合物或步骤。然而，这些列表应被解释为好像列表的每个成员都被单独标识为单独且唯一的成员。因此，仅基于它们在共同的组中呈现而没有相反指示，这种列表的任何单独成员都不应被解释为同一列表的任何其他成员的事实上的等效物。
本公开提供了异种移植制品的连续制造方法，所述异种移植制品在进行冷冻保存的异种移植组织中具有降低的免疫原性、降低的抗原性、增加的生存能力、增加的线粒体活性、特别需要的病原体特征以及出乎意料的长保质期。连续制造方法在避免超急性排斥、延迟异种移植物排斥、急性细胞排斥、慢性排斥、疾病的跨物种传播、寄生物的跨物种传播、细菌的跨物种传播、真菌的跨物种传播、病毒的跨物种传播方面令人惊讶且出乎意料地有效。连续制造方法在产生其中供体动物正常生存而没有可检测的病理变化的封闭畜群方面令人惊讶且出乎意料地有效。
源动物设施(“SAF”)
参考图1，显示了屏障源动物位置，包括但不限于可以用于安置、繁殖、维持、照料和利用封闭的猪群体(包括被指定为无病原体(“DPF”)的封闭群体(“DPF封闭群体”)102)的源动物设施(“SAF”)100。如本文所包含，SAF具有在特定的隔离屏障条件下操作的正压、生物收容特性。
如本文所描述，DPF封闭群体102由维持和繁殖以收获用于人异种移植和其他疗法的各种生物制品的源动物构成，其中此类制品具有减少的生物负荷并表现出由异种移植和其他治疗程序导致的降低的免疫原性。在一些方面，本公开的异种移植制品的免疫原性低于由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品和/或同种异体移植物。例如，如实施例1和2所示，当使用单一敲除猪作为供体动物时根据本公开制备的生物制品提供了出乎意料的高临床益处，因为尽管存在Neu5Gc和猪B4GALNT2，但是根据本公开制备的生物制品比同种异体移植物具有较低的免疫原性，具有血管形成，并且在整个研究期间内均对排斥具有抗性。
如本文中进一步所描述，SAF 100及其每个附随区域(例如，房间、套房或其他区域)可以用于安置和维持从其收获和/或处理生物制品的源动物。SAF 100及其区域被设计成最小化和消除对所收获和/或处理的生物制品的污染以及此类制品之间的交叉污染的可能性。
在SAF 100内，在一些方面，对所利用的动物区域进行通风。例如，用经过高效微粒空气(HEPA)过滤的新鲜空气从建筑物的屋顶对动物区域进行通风，例如每小时有至少10-15次换气。另外，在SAF房间(包括在异种移植药物处理套房中)中使用了一个或多个层流通风橱(例如，II类A2型层流空气生物安全柜)，以提供额外的通风，从而最小化或消除交叉污染。
在一些方面，也对所利用的区域进行温度控制和监测。例如，加热和冷却所述区域以将温度维持在例如《实验动物的护理和使用指南》(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)规定的范围内。所使用的动物饲养房间也会发出警报并集中监测高温或低温，并且如果温度超过所要求的温度，则会立即通知工作人员。
在一些方面，SAF 100对源动物具有多个级别的围堵。例如，源动物被收容在由被不锈钢闩锁固定的围栏和笼子组成的主要收容层中。关于第二收容层，功能指定区域(例如，房间、套房或其他区域)可以具有闩锁的内门、以及用卡控制访问过道的前房间。第三收容层可以包括外围栅栏。
整个SAF位于单一建筑物内。主要入口是通过经由可编程识别(ID)卡进入的单门。所有其他外门均会发出警报，保持锁定，并且仅供紧急使用。
总体上，安全性也是考虑因素以确保SAF 100的安全性，并控制进入SAF 100的个体，从而使外部污染物进入SAF 100并到达源动物的风险最小化。因此，在一个方面，SAF100的主要入口是经由可编程识别(ID)卡118通过单门116。所有其他外门120均会发出警报，保持锁定，并且仅供紧急使用。
将理解的是，如本文所公开的SAF 100及其特征被设置为实例，并且将进一步理解的是，具有各种特征的其他设施也可以用于执行本文所公开的方法和生产制品。
在一些方面，SAF 100动物计划由经验丰富的专业工作人员的团队进行许可和/或认证和监督、评估和操作。例如，所述程序已在美国国立卫生研究院(NIH)实验动物福利办公室(OLAW)的USDA动植物健康检查服务(USDA Animal and Plant Health InspectionService)(作为获得许可的动物研究机构)中注册和/或认证(确认符合公共卫生和安全(PHS)法规，实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)(在主治兽医的指导下对安置在SAF的源动物进行兽医护理)、以及其他联邦、州和地方监管机构)。
在一些方面，为了确保源动物的福利，SAF人员和源动物的看护者应根据由AAALAC认证的《动物福利法》(Animal Welfare Act)(7U.S.C.2131,以及下列等等)并按照《实验动物的护理和使用指南》(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)中所阐述的标准遵守由适当的机构动物护理和使用委员会批准的动物畜牧、组织收获和动物终止的程序。
在一些方面，看护者在根据本发明处理和护理被管理的源动物方面具有广泛的训练和经验。例如，每位看护者都接受文件化的培训计划(其涉及管理这些源动物的处理和护理的标准操作程序)，并且熟练地进行日常健康评估并确保对需要的任何动物进行及时护理。此外，在进入如本文所述的隔离区域(例如房间、套房或其他区域)之前以及按照医疗监督计划，可以对看护者进行擦洗和换衣程序的培训，以确保工作人员的健康和源动物的健康。
为了最小化和消除SAF的污染风险，进入SAF的任何人员或访客都应穿戴人员防护设备，或在进入任何收容区域之前换上设施专用的服装和鞋类。希望进入动物区域的访客必须在探访前至少24小时没有任何与活猪的接触，或者必须在进入之前在设施内冲淋。
将理解的是，本文所阐述的方法和程序是关于如何确保污染不会到达SAF 100内的源动物的实例。将进一步理解的是，还可以使用多种方法来实现源动物的无指定病原体的环境。
源动物
在一些方面，如本文所述，可以将猪用作源动物。如本文所用，除非另有说明，否则术语“猪”(swine)、“猪”(pig)和“猪”(porcine)是通用术语，是指相同类型的动物，而不考虑性别、大小或品种。将理解的是，根据本发明可以利用任何数量的源动物，包括但不限于猪、非人灵长类动物、猴、绵羊、山羊、小鼠、牛、鹿、马、狗、猫、大鼠、骡子和任何其他哺乳动物。源动物也可以包括任何其他动物，包括但不限于鸟类、鱼类、爬行动物和两栖动物。将理解的是，如本文所用，术语“破坏”(disrupting)或“破坏”(disrupt)或“破坏”(disrupted)或类似术语可以包括对基因和相关材料的任何和/或所有修饰，包括但不限于去除、编辑、沉默、修饰、重新编程、免疫基因组学重新编程、改变、变更、工程化、敲入、添加、敲除和/或任何或所有其他此类修饰。
缺乏细胞外表面聚糖表位的表达的猪
在一些方面，猪源动物是经遗传修饰的(即非野生型)。例如，在一些方面，猪包括具有在美国专利第7,795,493号(“Phelps”)中公开的猪的一个或多个特征的“敲除”和/或“敲入”猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。这种猪缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位，所述表位负责移植后在人体内的超急性排斥。在Phelps中公开了多种生产敲除/敲入猪的方法，所述方法包括：通过一个或多个点突变(例如，通过在外显子9的第二个碱基处的T至G点突变)和/或如在第9列第6行至第10列第13行；第21列第53行至第28列第47行；以及第31列第48行至第38列第22行处所公开的遗传靶向事件来使α-1,3-GT基因的一个或两个等位基因失活。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
类似地，在其他方面，猪源动物包括具有在美国专利第7,547,816号(“Day”)中公开的猪的一个或多个特征的“敲除”和“敲入”猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。这种猪也缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位，所述表位负责移植后在人体内的超急性排斥。在Day中公开了多种生产敲除/敲入猪的方法，所述方法包括：将卵母细胞去核，将卵母细胞与具有无功能的α-1,3-GT基因的猪细胞融合，随后植入代孕母亲体内，如在第4列第61行至第18列第55行更全面地描述的。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
类似地，在其他方面，猪源动物包括具有在美国专利第7,547,522号(“Hawley”)中公开的猪的一个或多个特征的GGTA Null(“敲除”和“敲入”)猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。这种猪也缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位，所述表位负责移植后在人体内的超急性排斥。如在Hawley中所公开，敲除/敲入猪的生产包括利用同源重组技术，并且将卵母细胞去核，随后与具有无功能的α-1,3-GT基因的细胞融合并植入代孕母亲体内(如在第6列第1行至第14列第31行更全面地公开的)。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
在又其他方面，猪源动物包括具有如在美国专利第9,883,939号(“Yamada”)中描述的猪的一个或多个特征的猪和缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-(1,3)半乳糖基表位的猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。在某些方面，用于根据本公开使用或修饰的猪源动物包括具有在U.S.2018/0184630(Tector,III)中描述的猪的一个或多个特征的猪，所述专利的公开内容以全文引用的方式并入本文。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
在又其他方面，猪源动物包括具有在美国专利第8,106,251号(Ayares)、第6,469,229号(Sachs)、第7,141,716号(Sachs)中公开的猪的一个或多个特征的猪，每篇所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
在一些方面，猪可以来源于一个或多个近亲繁殖系数为0.50或更高的高度近交的猪畜群(无论经遗传修饰与否(即，野生型))。近亲繁殖系数较高表示源自源动物的制品可能具有用于猪至人异种移植的更一致的生物学特性(例如，在一个方面近亲繁殖系数为0.80或更大)。在Mezrich等人,“Histocompatible Miniature Swine:An Inbred Large-Animal Model,”Transplantation,75(6):904-907(2003)中公开了动物的近亲繁殖系数。高度近交的猪畜群的实例包括在以下文献中公开的小型猪的后代小型猪：Sachs等人,“Transplantation in Miniature Swine.I.Fixation of the MajorHistocompatibility Complex,”Transplantation 22:559(1976)，其是特别是对于最终用于临床移植的器官具有合理的大小匹配的高度近交系。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
源动物也可以包括如在美国专利公开第US2017/0311579号(Tector)中描述的缺乏有活性的(和/或具有破坏的)α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的动物猪，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。通过所描述的方法产生这种猪，和/或在产生之后利用这种猪和后代，可以用于本发明的实践中，包括但不限于利用源自这种猪的器官、组织和/或细胞。
免疫基因组学重新编程的猪
缺乏细胞外表面聚糖表位的表达
如本文所用，“免疫基因组学重新编程”包括例如通过使用用于靶向操作供体猪基因组的位点特异性核酸内切酶来替换、沉默、改变或破坏供体动物基因组的保守遗传材料。可以利用已知的基因组编辑技术进行遗传修饰，所述基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑、以及成簇的规则间隔回文重复序列Cas9(CRISPR-Cas9)。这些可编程核酸酶能够实现DNA双链断裂(DSB)的靶向产生，这促进了细胞修复机制的上调，从而导致非同源末端连接(NHEJ)或同源指导的修复(HDR)的易错过程，后者可以用于整合外源供体DNA模板。在一个方面，对供体猪基因组的某些区域进行重新编程，包括但不限于与人MHC区域同源/类似/直系同源的供体猪的MHC区域。例如，根据一个非限制性方面，可以对猪基因组进行免疫基因组学重新编程以表达HLA-DQ(αβ)而不是SLA-DQ。可以在包括例如以下的文献中找到对在猪与人之间的对应区域的鉴定：Ando等人Immunogenetics(2005)57:864-873；Lunney,J.,“Moleculargenetics of the swine major histocompatibility complex,the SLA complex,”Developmental and Comparative Immunology 33:362-374(2009)；Shigenari等人,Immunogenetics(2004)55:696-705；Gao等人,Developmental and ComparativeImmunology,(2014)45:87-96；Bentley等人,Tissue Antigens,(2009)74,393-403，出于包括但不限于遗传信息、序列和作图在内的所有目的，所述文献中的每一篇以全文引用的方式并入本文。
如本文所述，这种“免疫基因组学重新编程”不会在供体动物中产生转基因特征，因为被重新编程的供体动物基因组的一个或多个保守区域是天然的且自然存在于供体动物内。这与具有已被修饰以引入来自不同动物物种的非天然基因的基因组的转基因动物(例如但不限于，具有或表达hCD46人膜辅因子蛋白MCP、hCD55-人衰变加速因子DAF和在本文表1中列出并且在本领域已知的其他人基因的猪)形成对比。
在一些方面，提供了缺乏细胞外表面聚糖表位的表达的免疫基因组学重新编程的猪。在一些方面，源动物可以包括其基因组通过遗传修饰包括去除α-1,3-半乳糖基转移酶(单敲除)加上免疫基因组学重新编程以改变如本文所述的MHC的表达的猪。在其他方面，源动物也可以包括其基因组通过遗传修饰包括去除α-1,3-半乳糖基转移酶和Neu5Gc(双重敲除)加上免疫基因组学重新编程以改变如本文所述的MHC的表达的猪。在又其他方面，源动物可以包括其基因组通过遗传修饰包括去除α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(三重敲除)加上免疫基因组学重新编程以修饰如本文所述的MHC的表达的猪。在又其他方面，源动物也可以包括其基因组表达人接受者的一种或多种特定MHC分子或已知人序列的动物，如本文所述。
在一些方面，免疫基因组学重新编程导致MHC在如本文所述的源动物中的表达、不表达或调节表达。对于这些另外的免疫基因组学重新编程方面，可以采用三种通用方法来产生低免疫原性耐受性供体细胞。这些方法对于实现用于异种移植的低免疫原性耐受性供体细胞是互补的和协同的，这不同于如本文所述的其他人在异种移植空间中使用的“下游”方法。
在第一种方法中，本发明利用免疫基因组学重新编程来减少或消除MHC-I(A类)组分，以避免接受者激发天然细胞介导的免疫反应。在另一个方面，与HLA-A和HLA-B的外显子区域对应的供体动物(例如猪)基因组中的外显子区域被从供体动物的基因组中沉默、完全去除或敲除。在另一个方面，与HLA-A和HLA-B的外显子区域对应的在供体动物(例如猪)基因组中的外显子区域被从供体动物基因组中沉默、完全去除或敲除，并且与HLA-C的外显子区域对应的在供体动物(例如猪)基因组中的外显子区域可以被调节，例如减少。在一个方面，本公开包括与没有这种免疫基因组学重新编程的情况下如何表达相比，沉默、敲除或引起源动物的同源/类似/直系同源的HLA-C的最低表达。在另一个方面，免疫基因组学重新编程包括猪供体细胞具有II类主要组织相容性复合物反式激活因子(CIITA)的调节表达(以影响HLA-C在源动物中的交替表达，同时保留源动物的免疫功能)。
在另外的或替代的方法中，本公开包括重新编程或利用MHC-I(B类)分子的抑制和共刺激作用。具体而言，本公开包括“寻找和替换”供体动物基因组中与HLA基因的部分对应的部分，例如以在可能的情况下过表达HLA-G，保留和过表达与HLA-E对应的部分，和/或“寻找和替换”与HLA-F对应的部分的过程。如本文所用，术语“寻找和替换”包括鉴定同源/类似/直系同源的保守遗传区域，并通过基因编辑技术用对应的人组分替换一个或多个部分。另一个方面包括寻找和替换在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G中表达的β2微球蛋白。同源/类似/直系同源的保守细胞因子介导的补体抑制或以其他方式免疫调节细胞标志物或表面蛋白，将增强供体-接受者细胞界面的总体免疫耐受性。在某些方面，hCD55可以与本文所公开的任何方面组合敲入。在某些方面，hCD46可以与本文所公开的任何方面组合敲入。
在第三种方法中，本发明利用“寻找和替换”以便表达或过表达特定的配体和其他免疫调节分子，从而以由蜕膜区域中的滋养层和胎盘细胞表现的方式在靠近供体-接受者细胞界面的区域中产生局部的免疫抑制环境。由此，供体细胞将具有诱导T细胞(包括但不限于CD8+T细胞和NK细胞)凋亡的能力，并且对TReg和CD4+T细胞具有致耐受性影响。这些包括但不限于Fas-L、TRAIL、PDL-1(死亡配体)和PDL-2。
在某些方面，本公开包括敲除：SLA-11；SLA-6,7,8；SLA-MIC2；和SLA-DQA；SLA-DQB1；SLA-DQB2，以及敲入：HLA-C；HLA-E；HLA-G；和HLA-DQ。在某些方面，本公开包括敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在某些方面，本公开包括敲除：与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入：HLA-C、HLA-E和HLA-G。在某些方面，本公开包括敲除：与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入：HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。在某些方面，可以调节(例如减少)HLA-C的表达。在某些方面，可以与本文所公开的任何方面组合敲入β2微球蛋白。在某些方面，hCD55可以与本文所公开的任何方面组合敲入。在某些方面，hCD46可以与本文所公开的任何方面组合敲入。在某些方面，本公开包括过表达一种或多种凋亡诱导配体(例如，FasL、TRAIL、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2))以减弱与本文所公开的任何方面组合的T细胞反应。在某些方面，本公开包括与猪表面聚糖表位的单、双或三重敲除组合的前述遗传修饰的任何组合。在某些方面，本公开不涉及敲除编码PERV-A、PERV-B和/或PERV-C的基因。
在某些方面，可以调节(例如减少)HLA-C的表达。在某些方面，可以与本文所公开的任何方面组合敲入β2微球蛋白。在某些方面，hCD55可以与本文所公开的任何方面组合敲入。在某些方面，hCD46可以与本文所公开的任何方面组合敲入。在某些方面，本公开包括过表达一种或多种凋亡诱导配体(例如，FasL、TRAIL、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2))以减弱与本文所公开的任何方面组合的T细胞反应。在某些方面，本公开包括与猪表面聚糖表位的单、双或三重敲除组合的前述遗传修饰的任何组合。
在某些方面，本公开包括敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在某些方面，本公开包括敲除：与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入：HLA-C、HLA-E和HLA-G对。在某些方面，本公开包括敲除：与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入：HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。
在一些实施方案中，这种非转基因工程化猪具有少于10种基因操作，诸如不超过约8种、或不超过约5种基因操作。在一些实施方案中，工程化猪包括少于20种此类基因操作，或者在一些实施方案中，不超过约15种或不超过约10种基因操作。
考虑到在怀孕期间具有母体免疫细胞和胎盘的胎儿滋养层细胞之间相互作用的平行晶状体中的异种移植，本发明人转变和修改了允许母体-胎儿耐受性的机制以制备本公开的低免疫原性异种移植制品。通过对如本文所述的SLA基因进行遗传重新编程、敲除一个或多个表面聚糖、以及任选地引入有限的凋亡诱导蛋白和补体调节蛋白子集，异种移植制品模拟在怀孕期间的胎儿滋养层细胞的许可母体-胎儿耐受性动态。
在某些方面，本公开集中于(断言)不需要在移植手术后移植接受者普遍和有害地使用外源性免疫抑制药物(或延长的免疫抑制方案)以延长挽救生命的移植物的低免疫原性和/或致耐受性细胞、组织和器官的产生。替代地，这种方法的中心原理与现有和先前的教条方法相反；代替接受在供体与接受者之间存在先天和固定的差异，并因此专注于将干预、基因改变和/或伴随的外源性免疫抑制药物用作减少/消除/消极改变接受者自然产生的免疫反应的方法，我们有意地选择逆转基础科学教条其他领域的焦点。代替接受在供体和接受者之间的免疫学不相容，特别是(但不限于)一种或多种主要组织相容性复合物的那些不匹配，我们打算在来源处改变这些催化抗原，从而消除了所有作为在供体和接受者之间的细胞、组织和器官排斥的成因效应因子的沉淀机制。
从而消除了需要繁重的免疫抑制药物/治疗方案水平的限速步骤，我们间接地(但实质上)解决了整个异种移植领域的主要障碍之一。即，自1996年以来(Patience等人,1997)，关于在所有猪细胞中普遍表达的另外的(无害的)内源性逆转录病毒(PERV)的感染能力的担忧，极大地限制了本科学领域的发展。此外，难治性折衷或故意抑制接受者的天然免疫能力(主要通过允许长期器官/移植物存活的必要药物)进一步加剧了关于异种移植治疗学的潜在临床风险的担忧。从那时起，在过去的二十年中，广泛的研究在很大程度上消除了关于PERV的担忧；同时，努力从潜在猪源供体的基因组中消除所有PERV。我们的方法通过解决(并显著减少)器官排斥现象的根本的基本原因的机制而消除了PERV RNA的存在和/或出现，不会给患者造成可信的风险。
重申一下，针对这种未满足的临床需求的前一种/先前的方法恰好遵循了“一刀切”的经典医学教条。替代地，我们大力反对这种局限性的观点，并务实地展示了利用当前技术进步和基本原理来实现显著改善临床结果指标的“患者特异性”解决方案的能力。前者，我们称为“下游”方法-其必须与按顺序解决所有自然免疫过程相抗衡。后者是我们的方法，我们乐观地称为“上游”方法-代表使未完成的科学工作以协调的转化医学工作结束的一种方法。
修饰技术
还将进一步理解的是，对本文提供的源动物基因组的破坏和修饰可以通过几种方法来进行，所述方法包括但不限于通过使用成簇的规律间隔短回文重复序列(“CRISPR”)，其可以用于产生具有专门定制的基因组的动物。参见例如，Niu等人,“Inactivation ofporcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas-9,”Science 357:1303-1307(2017年9月22日)。这样的基因组修饰可以包括但不限于α-(1,3)半乳糖基表位的表达被破坏或被消除、本文所公开的任何遗传或转基因修饰(例如，如在Denner中所公开)、和/或设计成减少源自此类源动物的制品的生物负荷和免疫原性以使免疫排斥最小化的任何其他定制基因组修饰。
最初被称为微生物适应性免疫系统的成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)最近已适应于哺乳动物基因编辑。CRISPR/Cas系统是基于细菌和古细菌中的适应性免疫机制，以通过DNA或RNA干扰防御外来遗传元件的入侵。通过哺乳动物密码子优化，CRISPR/Cas已适应于精确的DNA/RNA靶向，并且在哺乳动物细胞和胚胎中非常高效。用于基因组编辑的最常用和充分表征的CRISPR/Cas系统是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系统；此系统使用Cas9核酸酶和短引导RNA(gRNA)的组合来靶向特异性DNA序列进行切割。与直接位于PAM序列(例如NGG)5'的靶DNA互补的20个核苷酸的gRNA将Cas9指导至靶DNA并介导双链DNA的切割以形成DSB。因此，CRISPR/Cas9可以在任何N20-NGG位点实现基因靶向。
在一些方面，基因组修饰蛋白可以选自RNA引导的成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)(CRISPR/Cas)核酸酶系统、CRISPR/Cas双切口酶系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、包含与核酸酶结构域连接的可编程DNA结合结构域的融合蛋白(即产生双链DNA断裂)及其组合。通过使用此类基因组修饰技术，获得了在体细胞或在胚胎中高修饰率的高比率双链断裂(DSB)，并且例如通过体细胞核移植(SCNT)经修饰的体细胞或将工程化核酸酶直接显微注射到胚胎中产生了大量经遗传修饰的猪。体细胞核移植或克隆涉及筛选携带预期基因改变的体细胞(通常是胎儿成纤维细胞)，以及在克隆过程中对经修饰的细胞进行核移植。通过预先筛选或选择策略，可以将工程化核酸酶轻松应用于体外产生在供体细胞内的NHEJ或HDR诱导的突变，这能够富集携带所需突变的细胞。SCNT的替代方案是涉及在单细胞胚胎中进行直接基因编辑的方法。可以将编辑器的mRNA(用于敲除)或与供体DNA(用于敲入)一起显微注射到受精卵的细胞质或原核中，然后将所述受精卵的细胞质或原核转移到同步的替代物中以产生编辑的动物。与SCNT相比，此程序非常简单。
在其他方面，可以将包含与非核酸酶修饰结构域连接的可编程DNA结合结构域的融合蛋白用于修饰遗传物质。在某些方面，融合蛋白的可编程DNA结合结构域可以是无催化活性的CRISPR/Cas系统、无催化活性的大范围核酸酶、锌指蛋白或转录激活因子样效应物，并且融合蛋白的非核酸酶修饰结构域可以具有乙酰基转移酶活性、脱乙酰化酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性、脱豆肉豆蔻酰化活性、瓜氨酸化活性、解旋酶活性、氨基化活性、脱氨基活性、烷基化活性、脱烷基化活性、氧化活性、转录激活活性或转录阻遏物活性。在特定方面，融合蛋白的非核酸酶修饰结构域具有胞嘧啶脱氨酶活性、组蛋白乙酰转移酶活性、转录激活活性或转录阻遏物活性。
所述方法可以涉及将(a)可编程DNA修饰蛋白或编码所述可编程DNA修饰蛋白的核酸、以及(b)至少一种可编程DNA结合蛋白或编码所述至少一种可编程DNA结合蛋白的核酸引入真核细胞中。所述可编程DNA修饰蛋白靶向于靶染色体序列，并且所述至少一种可编程DNA结合蛋白中的每一种均靶向于所述靶染色体序列近端的位点。所述至少一种可编程DNA结合蛋白与靶染色体序列近端的位点的结合增加了可编程DNA修饰蛋白到靶染色体序列的可及性，从而增加了靶向基因组修饰的效率和/或特异性。
转基因方法
在其他方面，猪源动物包括经修饰以表达人性状的转基因动物。例如，在DennerJ,“Xenotransplantation-Progress and Problems:A Review,”J Transplant TechnolRes 4(2):133(2014)(“Denner”)中公开了此类另外的修饰，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。此类修饰可以包括但不限于hCD46-人膜辅因子蛋白MCP；hCD55-人衰变加速因子DAF；hCD59-人保护素；H-转移酶，竞争α-1,3-半乳糖基转移酶所需的底物；与Ig重链融合的hCTLA4-Ig-人细胞毒性T-鼠淋巴细胞抗原4，作为用于阻断CD28/CTLA4 T细胞共刺激的替代配体；hTM-人血栓调节蛋白，抗凝结，激活蛋白C；hA20肿瘤坏死因子-α-(TNF-α)诱导基因，可以控制AVR；HLA-E/β微球蛋白，保护免受人自然杀伤细胞的细胞毒性；TRAIL-肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体，诱导凋亡；hHO-1(人血红素加氧酶-1)，抗细胞凋亡，细胞保护性，Fas-L-Fas配体，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族，其与其受体结合诱导细胞凋亡；GnT-III-β-1,4-N乙酰葡萄糖氨基转移酶III，催化N聚糖中的平分型GlcNAc结构的形成；shRNA PERV-PERV特异性短发夹RNA，通过RNA干扰和其他修饰抑制PERV表达。此类修饰也可以包括下表1中列出的那些，从Denner复制如下。
表1
在一些实施方案中，这种转基因工程化猪具有少于10种基因操作，诸如不超过约8种、或不超过约5种基因操作。在一些实施方案中，工程化猪包括少于20种此类基因操作，或者在一些实施方案中，不超过约15种或不超过约10种基因操作。
因此，应当理解，可以将具有一系列生物学特性，包括但不限于基因组修饰和/或其他基因工程化特性的多种源动物用于降低由异种移植引起的在人体内的免疫原性和/或免疫排斥(例如，急性排斥、超急性排斥和慢性排斥)。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免血栓性微血管病。在某些方面，本公开可以通过将本公开的生物制品移植到人患者中来用于减少或避免肾小球病。将进一步理解的是，本文列出的源动物的列表不是限制性的，并且本发明涵盖具有单独或组合用于降低免疫原性和/或免疫排斥的一种或多种修饰(基因的或其他方式)的任何其他类型的源动物。
包括PERV的单敲除猪
将进一步理解的是，在一些方面，其基因组缺乏或不表达活性α-(1,3)半乳糖基表位，其基因组包括PERV A、B和C，并且通过本文所述的方法生产的猪产生源自此类源动物的优异生物制品以在异种移植后降低人体内的免疫原性，从而提高增加的移植寿命。此类生产方面包括但不限于制品源自在无指定病原体的设施(包括但不限于如本文所述的设施)中维持和繁殖的无指定病原体的动物；动物和所得的制品不含某些病原体，包括但不限于蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌；制品从收获到异种移植的时间内进行了最低程度的操作；制品是活细胞(例如，活的、有生物活性的)；制品在异种移植后能够在受试者中诱导血管形成；和/或制品的移植不需要伴随免疫抑制剂药物和/或其他免疫抑制剂疗法。
至少两项研究(如本文实施例1中所阐述)支持了本文所述的制品的这种降低的免疫原性，所述至少两项研究表明，与利用未根据本发明生产和/或制备的其基因组缺乏猴子上的活性α-(1,3)半乳糖基表位的猪的先前研究相比，根据本发明生产和制备的从其基因组缺乏包括活性α-(1,3)半乳糖基表位的一种或多种细胞外表面聚糖的猪来源的皮肤移植物在猴子上的表现明显更好。参见例如，Albritton等人Lack of Cross-SensitizationBetween alpha-1,3-Galactosyltransferase Knockout Porcine and Allogeneic SkinGrafts Permits Serial Grafting,Transplantation第97卷，第12期，2014年6月27日(接受者狒狒的Gal-T-K皮肤移植物在12或13天时被完全排斥)；Barone等人,Geneticallymodified porcine split-thickness skin grafts as an alternative to allograftfor provision of temporary wound coverage:preliminary characterization,Burns41(2015)565-574(接受者狒狒的Gal-T-KO皮肤移植物在11天时被完全排斥)；以及Weiner等人,Prolonged survival of Gal-T-KO swine skin on baboons,Xenotransplantation,2010,17(2):147–152(在狒狒上的Gal-T-KO异种分层厚度皮肤移植物在11天时被完全排斥)。此外，令人惊讶地，至少一项研究表明，根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤移植物的表现优于同种异体移植物。参见本文实施例1。尽管本文的工作实施例证明了使用皮肤作为模型器官的本公开的有益结果，但是本领域技术人员已经认识到，导致成功的皮肤异种移植制品的相同因素与其他器官异种移植的成功相关。因此，本领域技术人员认识到异种移植各种类型的细胞、组织和不同器官的能力，其中所收获的异种移植组织显示出在一定时间段内能抵抗接受者身体的排斥。这些因素包括本发明的制品是有活力的、有生物活性的、非最终灭菌的，具有低免疫原性，具有低生物负荷，具有低致病性，诱导血管形成、胶原生长和/或来自移植接受者的其他相互作用，诱导器官或组织附着、器质性结合或接受者的其他临时或永久性接受。如本文所用，短语“最终灭菌的”是指已经在其最终容器中灭菌的制品，而短语“非最终灭菌的”是指尚未在其最终容器中灭菌的制品。最终灭菌通常涉及在高质量环境条件下填充和密封制品容器。在这种类型的环境中对制品进行填充和密封，以使处理中的制品的微生物和微粒含量最小化并帮助确保后续灭菌过程成功进行。然后将在其最终容器中的制品进行灭菌处理，诸如加热或辐照。与最终灭菌过程形成对比，在无菌过程中，首先使药物制品、容器和封闭件(closure)酌情经受单独的灭菌方法，然后将它们合在一起。由于其性质，某些制品在过程的较早阶段或在其整个过程中进行无菌处理。因为没有在其最终容器中对制品进行灭菌的过程，容器是在高无菌性环境中填充和密封的。无菌处理比最终灭菌涉及更多的变量。在无菌组装成最终制品之前，通常使最终制品的单独部分经受各种灭菌过程。例如，可以使玻璃容器经受干热；可以使容器经受UV辐照和/或抗病原体浴；可以使橡胶封闭件经受湿热；并且可以将液体进行过滤。这些制造过程中的每一个都需要验证和控制。每个过程都可能引入错误，其最终可能导致受污染制品的分配。
封闭群体
一般封闭群体
现在参考图1，在一个方面，在外部确保动物安全以考虑作为候选者添加到安置在SAF 100内的一般封闭群体128中，以帮助在单独的隔离区域152中繁殖也安置在SAF 100内的DPF封闭群体102。控制在外部确保安全的动物向SAF的运输，以减少对潜在传染因子的暴露。此类缓解技术包括但不限于在运输期间使用灭菌的HEPA过滤笼子、使用氯己定清洗的运货车、以及不包含其他动物。
首先对候选动物进行检疫，以检查健康状况和是否适合纳入一般封闭群体128中。例如，在一些方面，首先将来自外部的动物安置在SAF内的检疫纳入区域130中，并伴随完整的健康记录(包括但不限于出生日期、疫苗接种、感染、和抗生素史)、纯种系谱和基因测试结果。这些动物在检疫纳入区域130中居住至少七(7)天，直到已评估伴随的记录并采取其他健康筛选措施(包括筛选一些传染因子)。
在一些方面，健康不良、具有可疑的医学状态或由于此类医学问题而无法接受治疗的动物将不被接受到一般封闭群体128中和/或将以其他方式从检疫区域130中淘汰。接受标准的实例包括但不限于：(a)源动物出生时没有任何在畜群中不曾预料并且可能影响动物的健康质量的先天性缺陷；(b)源动物已按年龄接受了所有疫苗接种，且并所述疫苗是杀灭剂；(c)已对源动物一生中发生的任何感染进行了检查并进行了临床干预，并且确定感染和任何治疗(如果适用)均不影响动物的健康质量；(d)已经审查了监督测试的结果，并且已经验证了在过去3个月内对源动物进行了测试(所有源动物在处死时都进行了测试，并且所有测试都必须为阴性)；(e)如果动物以任何需要医学关照的方式受到伤害，则进行了审查并且确认伤害和医学干预(如果适用)的影响对动物的健康没有影响；和/或(f)已执行PERV测试并记录了结果。
在一些方面，通过了此筛选过程和时间表的动物被移出检疫纳入区域130，并进入SAF 100内的一般保持区域132，以加入或创建现有的或新形成的一般封闭群体128。将理解的是，一般保持区域132被保持在封闭群体条件下，所述封闭群体条件基本上类似于在DPF隔离区域152中的DPF封闭群体102中所应用的条件。
将进一步理解的是，除了它们的后代之外，在外部确保安全的候选动物将永远不会成为DPF封闭群体的成员。如本文进一步描述的，来自一般封闭群体128的仔猪将被用于创建和/或繁殖DPF封闭群体。
DPF封闭群体
怀孕母猪和DPF仔猪
在一个方面，从外部或从一般封闭群体128获得怀孕母猪134(或小母猪)生产仔猪以产生和/或添加到DPF封闭群体102畜群中。例如，在一个方面，将母猪134放置在SAF内的母猪检疫区域136中直到分娩(在这一方面，通过剖腹产术)时为止，以便避免使仔猪暴露于潜在的病原体，包括猪巨细胞病毒(pCMV)。当仔猪在自然分娩期间穿过母猪的阴道时，可能发生仔猪中的pCMV传染。仔猪由于其通过如本文所述的剖腹产术分娩，防止了这种传染，并且通过本文所述的方法生产的仔猪不含pCMV。
在剖腹产术手术之前，例如手术的早晨，在无菌环境中根据标准手术室规程在SAF100内准备了手术室138，所述手术室有两侧：用于母猪剖腹产术的A侧140、和接收作为发现于或添加到DPF封闭群体中的候选者的仔猪144的B侧142。
母猪134被带入手术室138中以进行俘虏式栓系安乐死(captive bolteuthanasia)。紧随其后，将母猪134放置于左侧卧位，并用氯己定广泛地准备腹部和躯干，并以无菌方式用布帘覆盖。迅速切开侧腹切口，并分裂腹肌以进入腹膜。在双重夹紧和分开脐带后，将子宫外置化、切开并取出仔猪144。在俘虏式栓系安乐死后立即执行手术程序对于仔猪144的生存至关重要。
在出生时实施对仔猪144的感染控制。将仔猪144放置于无菌盐浴溶液中的温热的1％氯己定(或其他灭菌剂，诸如必妥碘)中，然后转移给仔猪处理者至复苏区域148以进行复苏、复温和管饲第一剂量的初乳。母猪的134屠体已被工作人员用缝线缝合上并按照适当的程序进行处理。
随后在单独的无菌仔猪检疫室150中对仔猪144进行检疫，然后转移到无指定病原体的隔离区域(“DPF隔离区域”)152，以创建或加入DPF封闭群体102。将理解的是，DPF隔离区域152可以具有适合于将DPF封闭群体管理和维持到如本文所述的配种、饲养、分娩、收获和总体管理所需的程度的任何尺寸。
在一个方面，支持DPF封闭群体的DPF隔离区域152是在较大的SAF 100内部的大约500ft2的限制访问的正压屏障隔离套房，具有支持至少9只动物(每只至多20kg)的动物畜牧能力。将理解的是，DPF隔离区域152可以显著大于此，并且根据本文所述的制品和方法，取决于对源动物数量的要求和对制品的需求，可以包括多个区域(包括但不限于多个房间和套房)。
在一些方面，在DPF隔离区域152中在无指定病原体的条件下对仔猪进行跟踪并处理仔猪。例如，在DPF隔离区域152中穿戴个人防护设备(“PPE”)(包括面罩、手套、鞋套和发帽)进行仔猪的处理。动物由干净的人员处理，这些人员没有进入安置其他猪的任何动物房间或设施。为了进行跟踪，仔猪在出生后3天进行耳朵切迹，并在断奶时(通常3-5周)用手工标记的塑料耳标对耳朵进行标记。
将理解的是，在DPF隔离区域152中的DPF封闭群体102中饲养一些仔猪作为异种移植制品的来源，并且使DPF封闭群体102中的一些仔猪成熟并用于繁殖一般封闭群体128。在繁殖一般封闭群体128的情况下，将成熟的动物从DPF隔离区域152中移出并添加到一般封闭群体128中进行配种。由于将DPF隔离区域152控制为DPF，一旦这些或任何其他动物离开DPF隔离区域152，那些动物就永远不会返回到DPF隔离区域152中。
采取预防措施以防止DPF封闭群体102内的任何动物暴露于污染(例如，从DPF封闭群体102外部的动物获得的血液、血液制品或组织)。如果DPF封闭群体102中的任何动物无意中暴露于从DPF封闭群体102外部的动物获得的血液、血液制品或组织，则将那些动物从DPF封闭群体102中移出，并且将永远不会返回到DPF封闭群体102中。所有肠胃外干预均使用无菌技术和无菌设备，并且进行常规程序，诸如疫苗接种、用药物或生物制剂治疗、静脉放血和活组织检查。通过卡访问将DPF隔离区域152仅限制于特殊授权和培训的工作人员。
在本发明的另一个方面，在一些方面，由DPF隔离区域152中的培训过的和白大褂工作人员处理和人工饲养新生仔猪，以确保它们的健康并且使它们被保持为无指定病原体的。
繁殖
能以多种方式繁殖DPF封闭群体102。例如，如本文所述，母猪134可以从外部或一般封闭群体128中获取，进行检疫，并使其仔猪144经由剖腹产术分娩，将所述仔猪进行复苏、消毒、检疫并置于DPF隔离区域152中。可以将新生仔猪保持在26-30℃或80-85℉。在一些方面，使用加热灯使动物保持温暖。新生仔猪最初被安置在SAF中的无菌中型板条箱中，底部配备有无菌毛巾/帷帘。
也能以其他方式繁殖DPF封闭群体102。例如，在一个方面，通过完全发生在DPF隔离区域152内的在DPF封闭群体102中的动物之间的自然交配来繁殖DPF封闭群体102。将理解的是，由于人工授精或不涉及自然交配的其他配种技术的结果，在DPF隔离区域152内的DPF封闭群体102中也可能发生怀孕。
在此类方面中，DPF隔离区域152内的DPF封闭群体102中的怀孕母猪154(或小母猪)携带整个妊娠，并且通过阴道活产来分娩仔猪且剖腹产术是不必要的。重要的是，由在DPF隔离区域152内的自然交配和阴道活产所产生的仔猪是无指定病原体的，包括无pCMV感染。
在阴道活产后，立即将仔猪从母猪上取下，以防止母猪伤害仔猪。然后，在如本文所述的方法中，仔猪从出生后由DPF隔离区域152中的人进行人工饲养。
在DPF封闭群体102或一般封闭群体128中交配的情况下，本文所公开的猪的配种通常是纯合至纯合的配种。在妊娠前两周，然后在整个怀孕期间，向雌性给予激素。此外，与DPF封闭群体102一样，一般封闭群体128也可以通过在一般封闭群体128中的动物之间的自然交配进行繁殖，并且也可以由于人工授精或其他不涉及自然交配的辅助生殖技术(ART)而发生。
已经开发和改进了各种技术，以从遗传优良的动物中获得大量后代，或从不育(或亚不育)动物中获得后代。这些技术包括：人工授精、配子或胚胎的冷冻保存(冷冻)、诱导多发排卵、胚胎移植、体外受精、对精子或胚胎进行性别确定、核移植、克隆等。
将人工授精(AI)用于从遗传优良的雄性中获得后代已有超过200年了。冷冻保存(冷冻)和储存精液的方法的改进使更多的牲畜生产者可使用AI。以与冷冻保存精液相同的方式，胚胎冷冻允许具有高遗传质量的动物得以全球商业化。
多发排卵和胚胎移植：胚胎移植技术的发展允许生产者从遗传优良的雌性获得多个后代。取决于物种，可以通过手术或非手术技术从具有优良遗传价值的雌性(也称为胚胎供体)中回收受精的胚胎。然后将遗传优良的胚胎移植到遗传价值较低的雌性(也称为胚胎接受者)体内。在牛和马中，有效的技术无需手术即可回收受精的胚胎，但是在每个正常生殖周期中仅产生一个或有时两个胚胎。在猪和羊中，必须通过手术技术回收胚胎。为了增加可以从遗传优良的雌性中回收的胚胎数量，用激素方案对胚胎供体进行处理以诱导多发排卵或超排卵。
体外受精：作为从供体动物收集胚胎的一种替代方法，最近已经开发了体外(在实验室中)生产胚胎的方法。所述方法也被称为体外胚胎生产。可以从不育或年老的雌性卵巢中、或从常规的胚胎供体(如上所述)中获得未成熟的卵母细胞(雌性卵)。卵子(卵)收集是使用超声和引导针从卵巢中抽吸未成熟的卵母细胞的一种非手术技术。一旦已经从卵巢中取出未成熟的卵母细胞，就让它们成熟、进行受精并体外培养至多七天，直到它们发育到适合于移植或冷冻的阶段。
自1980年代中期以来，已经开发了将核从卵裂球(来自早期以及推测未分化的分裂期胚胎的细胞)或体细胞(成纤维细胞、皮肤、心脏、神经或其他体细胞)移植到去核的卵母细胞(去除细胞核的未受精的雌性卵细胞)中的技术。这种“核移植”产生了它们本身是其他动物(转基因动物、遗传优良的动物、或生产大量乳或具有一些其他所需性状的动物等)几乎相同的副本的多个动物副本。此过程也被称为克隆。迄今为止，体细胞核移植已用于克隆牛、绵羊、猪、山羊、马、骡子、猫、兔、大鼠和小鼠。
所述技术涉及从待克隆动物的适当组织(成纤维细胞)中培养体细胞。然后将来自培养的体细胞的核显微注射到从相同或近缘物种的另一个个体获得的去核卵母细胞中。通过一个尚不了解的过程，来自体细胞的细胞核被重新编程为适合于指导胚胎正常发育的基因表达模式。在体外进一步培养和发育之后，胚胎被移植到雌性接受者中，并且最终导致活的后代诞生。通过核移植繁殖动物的成功率通常低于10％，并且取决于许多因素，包括物种、接受者卵子的来源、供体核的细胞类型、核移植前对供体细胞的处理以及核移植所使用的技术等。
最常用的ART依赖于受精作为第一步骤。卵和精子的这种结合伴随着来自父系和母系的遗传物质的重组，并且通常被称为“对遗传层面的改组(shuffling the geneticdeck)”。将理解的是，这些配种技术既可以在DPF封闭群体内作为DPF隔离区域152内的配种步骤使用，也可以在一般封闭群体中和/或从外部用作雌性的配种步骤。
在利用ART使一般封闭群体中的雌性和/或来自外部的雌性受精的情况下，从此类雌性出生的仔猪可以是如本文所述的，即，母猪134可以从外部或一般封闭群体128中获取，进行检疫，并通过剖腹产术分娩其仔猪144，并对所述仔猪进行复苏、消毒、检疫、并放置于DPF隔离区域152中。
封闭群体的维护
将理解的是，如本文所用，短语“无指定病原体”可以用于描述动物、动物畜群、从其衍生的动物制品和/或不含一种或多种指定病原体的动物设施。优选地，使用此类指定病原体的定义明确的例行测试，利用确保不存在和/或破坏此类指定病原体的适当标准操作程序(SOP)和畜群畜牧和兽医护理的实践(包括但不限于本文所公开和描述的例程、测试、程序、畜牧和兽医护理)来维持此类“无指定病原体”的动物、动物畜群、由其衍生的动物制品和/或动物设施。将进一步理解的是，如本文所用，术语“不含”、“基本上不含”和类似术语当与“无病原体”结合使用时，意在表示主题病原体不存在、不是活的、无活性或以其他方式无法通过主题病原体的标准或其他测试方法检测到。
指定的病原体可以包括任何数量的病原体，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫和/或朊病毒(和/或与可传播的海绵状脑病(TSE)相关的其他病原体)。指定的病原体可以包括但不限于任何和全部人畜共患病毒和来自以下科的病毒：腺病毒科(adenoviridae)、指环病毒科(anelloviridae)、星状病毒科(astroviridae)、杯状病毒科(calicivirdae)、圆环病毒科(circoviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、细小RNA病毒科(picornaviridae)和呼肠孤病毒科(reoviridae)。
指定的病原体还可以包括但不限于腺病毒、虫媒病毒、动脉炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、杯状病毒、心病毒、圆环病毒2、圆环病毒1、冠状病毒、脑心肌炎病毒、附红细胞体、猪嗜血杆菌、疱疹病毒和疱疹相关病毒、虹膜病毒、嵴病毒、钩端螺菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、支原体、正粘病毒、papovirus、副流感病毒3、副粘病毒、细小病毒、pasavirus-1、瘟病毒、细小双节RNA病毒(PBV)、微小核糖核酸病毒、猪圆环病毒样(po-circo-like)病毒、猪星状病毒、猪bacovirus、猪博卡病毒2、猪博卡病毒4、猪肠病毒9、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪脊髓灰质炎病毒、猪嗜淋巴细胞疱疹病毒(PLHV)、猪粪便相关环状病毒(PoSCV)、posavirus-1、天花病毒、狂犬病相关病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、立克次体、萨佩罗病毒(sapelovirus)、札幌病毒、猪葡萄球菌(staphylococcus hyicus)、中间葡萄球菌(staphylococcus intermedius)、葡萄球菌表皮(staphylococcus epidermidis)、凝固酶阴性葡萄球菌、猪痘病毒、猪流感、捷申病病毒(teschen)、环曲病毒、猪细环病毒2(TTSuV-2)、可传播的胃肠炎病毒、水疱性口炎病毒、和/或任何和/或全部其他病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫和/或朊病毒(和/或与TSE相关的其他病原体)。在一些方面，特别是在猪畜群中，因为未在猪的自然条件下报告TSE，因此未进行TSE的测试。在其他方面，作为本公开的方法的一部分，进行了对TSE的测试。
有可以在动物畜群中测试的大量病原体，并且没有法规指南或标准，也没有该领域中关于应在供体动物中测试哪些特定组的病原体以及哪些特定组的病原体应从供体动物群体中除去以确保安全且有效的异种移植的了解。换句话说，在本公开之前，没有待测试和排除的有限数量的已鉴定的、可预测的病原体。本公开提供了由本发明人鉴定出对于进行安全且有效的异种移植而排除在外至关重要的特定组的病原体，如下表2中所示。
表2
在某些方面，本公开的制品来源于具有低于本公开中讨论的多种或全部病原体的检测水平的抗体滴度水平的动物。在某些方面，测试了移植有本公开的制品的受试者，并发现其具有低于本公开中讨论的多种或全部病原体的检测水平的抗体滴度水平。
在一些方面，本公开包括测试特定组的病原体的方法，所述特定组的病原体由不超过18-35，例如35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18种病原体组成，所述特定组的病原体包括表2中鉴定的每种病原体。在一些方面，本公开包括产生、维持和使用不含所述18-35，例如35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18种病原体的供体动物，所述特定组的病原体包括表2中鉴定的每种病原体。
如本文所述，在DPF封闭群体102内通过阴道活产出生的仔猪没有被pCMV感染，但是仍然连续进行pCMV测试。如本文所述，对猪巨细胞病毒(pCMV)和猪内源性逆转录病毒(PERV)的测试应常规且连续地进行筛选和维持，并且对于DPF封闭群体应常规且连续地进行。在本发明的一些方面，本文所述的源动物仅对PERV A和B呈阳性，而一些对PERV A、B和C呈阳性。在其他方面，源动物不含PERV A、B和/或C(通过利用CRISPR和其他技术)。
关于PERV，应当理解，已知大多数(如果不是全部)猪都对PERV A和B呈阳性。虽然认识到PERV，但是从用猪衍生的组织进行治疗传播PERV的风险预计很小。迄今为止，在所有的猪组织以及在所有品种的猪中有八种PERV mRNA表达，并且对暴露于猪细胞、组织和器官(包括胰岛)的人的临床前和临床异种移植研究均未能证明PERV的传播。参见例如，MorozovVA,Wynyard S,Matsumoto S,Abalovich A,Denner J,Elliott R,“No PERV transmissionduring aclinical trial of pig islet cell transplantation,”Virus Res 2017；227:34-40。万一发生人感染，这种情况不太可能，在普通的临床使用中PERV在体外易受核苷和非核苷逆转录酶抑制剂的影响。参见例如，Wilhelm M,Fishman JA,Pontikis R,AubertinAM,Wilhelm FX,“Susceptibility of recombinant porcine endogenous retrovirusreverse transcriptase to nucleoside and non-nucleoside inhibitors,”Cellular&Molecular Life Sciences 2002；59:2184-90；Schuurman,H.,“Regulatory aspects ofclinical xenotransplantation,”Int.J.Surg.,23,(2015),第312-321页。使用本公开的异种移植制品的实验数据表明，在接受者的器官中未检测到PERV遗传物质，并且猪DNA和细胞没有从异种移植器官迁移到接受者的循环中。
维持DPF封闭群体102以确保动物依然没有指定病原体，并且在SAF 100的所有水平上(即配种、维持、繁殖)应用了适当的动物护理和福祉标准。例如，进行了对病原体和其他生物标志物的连续测试，包括本文鉴定的许多病原体(包括但不限于pCMV和其他病原体)。根据需要收集环境和血液样品，以进行基因分型和病原体测试。由设施兽医评估针对病原体或其他健康担忧而获得的一个或多个测试结果，所述设施兽医可能会建议进行后续测试和观察，并根据需要对设施或设施内的区域(例如，房间、套房或其他区域)进行检疫。应对源动物例行护理过程中使用的任何抗微生物剂进行仔细记录，并仅使用灭活的疫苗。抗微生物剂的实例包括头孢唑林、杆菌肽、新霉素和多粘菌素。
在一些方面，每3个月进行对源动物的例行健康监测和病原体(例如，不定因子)的筛选。获得一般和DPF封闭群体中的每只动物的血清、鼻拭子和粪便样品，并且每3个月提供一次分析测试以检测此类病原体。安乐死后立即通过俘虏式栓系获得用于测试的源动物血清、鼻拭子和粪便样品，并如本文所公开的进行评估，包括以下中的一项或多项：进行无菌测定并确认在所述无菌测定中需氧和厌氧细菌不生长；进行支原体测定并确认在所述支原体测定中支原体集落不生长；进行内毒素测定并确认在内毒素测定中所述生物制品不含内毒素，进行MTT还原测定并确认在所述MTT还原测定中所述制品具有至少50％的细胞生存能力；进行流式细胞术并确认如通过所述流式细胞术确定所述制品不具有半乳糖基-a-1,3-半乳糖表位；进行对18至35种病原体特异的病原体检测测定并确认所述制品不含蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
在一些方面，所有猪都要进行例行健康监测，其包括对所有疾病、医学护理、程序、所施用的药物、疫苗接种、身体检查、所接受的任何治疗、和每天喂食时通过肉眼健康检查进行的表明动物能够站立、自由移动和在临床上看起来正常的一般健康评估和观察、以及与动物的外观、活动和食欲有关的观察进行文档编制，以及在动物畜牧业日志上记录任何缺陷。在一些方面，向动物接种针对猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌(Hemophilus Parasuis)、猪链球菌、多杀巴斯德菌(Pasteurella Multocida)、支气管脓毒症博德特菌和猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix Rhusiopathiae)的疫苗。所有六个月或以上的猪都可以接种针对猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体(Canicola-Grippotyphosa-Hardjo-Icterohaemorrhagiae-Pomona)、流感和细小病毒的疫苗。可以例如每六个月进行一次重复疫苗接种。
在一些方面，健康监测通常将作为清洁和喂养的日常畜牧程序的一部分进行，以使进入猪保持区域(例如，房间、套房或其他区域)的情况最小化。在进入之前，人员必须穿戴个人防护设备(PPE)，并确保其鞋子没有严重污染(例如，可见的灰尘或泥土)。然后，他们将在进入之前穿上一次性鞋套/靴套。与未在无指定病原体设施中安置的任何动物接触的人员如果受到污染，将更换PPE。如果对于动物饲养所而言是外源的或判断有必要，则所有工具(铲子、其他必要的工具)将进行不少于2分钟的氯己定浸泡。去除固体废物和脏的垫层。每两周至少一次用稀释的Quat-PV或漂白剂对动物保持区域进行消毒。
在一些方面，垫层每天使用经过辐照的垫层刨花进行替换。替换量为所移除量的大约相等量。每周至少替换一次所有垫层。动物畜牧业日志中记录了包括健康状态检查、清洁和水位在内的日常活动。工作人员每天收集适当标记的垃圾和生物废物，并进行焚化。
关于仔猪，新生儿由隔离套房中培训过的白大褂工作人员处理和护理。在安置仔猪之前，对所有供给、房间和板条箱进行消毒。无菌帷帘和毛巾用于衬板条箱的底部。室温控制在80-85℉。通过使用加热灯，将动物板条箱维持在85-95℉。在前2星期内，将仔猪维持在板条箱中，此后将仔猪安置在具有辐照的刨花的地板上。每天清洁板条箱，并且每天都去除和补充刨花。最初每隔1至2小时使用饲管向仔猪饲喂新鲜制备的无菌初乳(为猪配制的牛初乳IgG、Sterling Nurs emate ASAP或等效物)，直到仔猪从饲喂器自我进食。在早期几天内，将仔猪每天称重两次，并且每天检查两次健康状况并记录下来。从第14天开始，每天向仔猪饲喂3次奶替代品(Ralco Birthright或等效物)，并进一步补充辐照过的仔猪谷物(无抗生素的蠕变饲料、Blue Seal 813或等效物)。记录每只仔猪在每次饲喂时进食的量。在仔猪出生后的前7天内进行疫苗接种、基因分型、耳朵切迹和尖齿修剪。在一些方面，疫苗使用灭活剂。仔猪在出生后第7天接种针对猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、多杀巴斯德菌、支气管脓毒症博德特菌和猪红斑丹毒丝菌的疫苗，并在28日龄时加强免疫。在一个方面，疫苗是灭活剂。所有六个月或以上的猪都接种针对猪红斑丹毒丝菌、钩端螺旋体(Canicola-Grippotyphosa-Hardjo-Icterohaemorrhagiae-Pomon a)、流感和细小病毒的疫苗。每六个月进行一次重复接种。
将异种移植制品的源动物在由给定程序的管理者采用的标准操作程序管理的特定隔离屏障条件下维持在正压的生物收容机构中，并在受控条件下接受特殊护理以减少不定因子。为了确保旨在用于异种移植用途的源动物的封闭群体的福利，SAF、人员和源动物的看护者应遵守动物畜牧、组织收获和动物处死的程序。在特定的隔离屏障条件下，将源动物安置在正压的生物收容机构中。
在一些方面，食物和垫层被运送到装卸码头、运输并储存在仅内部走廊的工作人员可访问的在清洁笼子清洗区域之外的特定饲料室内。所有的垫层和饲料都通过辐照灭菌，并用双袋包装以确保无菌。特定制造商将用于仔猪和更成熟动物的饲料限定为谷物饲料。其不含有任何牲畜蛋白质。供水通过使用被分配到无菌盘中的设施无菌系统或购买的无菌水来提供。保持对饲料、水和其他消耗品的存储和运送的记录，并根据方案包含制造商、批号和其他相关信息。
在一些方面，维持动物记录以描述提供给源动物持续至少两代的饲料，然后将其用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源。这包括来源、供应商以及所使用饲料类型(包括其内容物)。禁止使用源自动物的饲料。不向源动物提供含有动物蛋白或被在2008年颁布的关于源动物(21CFR 589.2000)、或用于源动物的含有明显药物污染或杀虫剂或除草剂残留物的饲料(21CFR 589.2001)的FDA饲料禁令所禁止的其他牲畜材料的饲料。
在一些方面，以足够的质量提供纯净水，以防止动物不必要地暴露于传染性病原体、药物、杀虫剂、除草剂和肥料。向新生动物提供明确符合畜群资格的初乳。在一些方面，将配制用于猪的牛初乳IgG、Sterling Nursemate ASAP或等效物用于喂养新生动物。
来源于DPF封闭群体的生物制品
生物制品
如本文所述，用于异种移植的生物制品源自根据本发明生产和维持的源动物，包括源自如本文所述的DPF封闭群体102。此类生物制品包括但不限于肝、肾、皮肤、肺、心脏、胰腺、肠、神经和其他器官、细胞和/或组织。
此类生物制品的收获发生在开始于处死源动物直到完成最终制品的生产的单一、连续且设备齐全的隔离生产事件中。通过俘虏式栓系安乐死对动物实施安乐死，如有必要，可以将其在无菌无孔袋中移动到手术室中，在所述手术室中将进行从源动物中收获生物制品的程序。手术团队的所有成员都应穿戴完全无菌的手术设备，例如，穿着无菌衣服以在接收源动物之前维持无指定病原体条件，并且在一些情况下戴上双层手套以使污染最小化，并且对手术区域和工具进行灭菌。将源动物以无菌方式从袋子和容器中取出。手术人员用杀菌剂(例如氯己定)将源动物擦洗例如至少1-10分钟，例如在将要进行手术的整个动物区域上刷洗，定期将氯己定倒在所述区域上以确保覆盖度。用打开的必妥碘刷子擦洗动物的一个或多个手术区域，并在将要进行手术的整个动物区域上用无菌水冲洗例如1-10分钟。对于手术，操作员将按照程序和其他标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体的条件。在处死动物的15小时内从源动物中收获用于异种移植的所有器官、细胞或组织。
生物制品还可以包括但不限于本文公开的那些(例如，在具体的实例中)，以及从源动物中收获的任何和所有其他组织、器官和/或纯化的或基本上纯的细胞和细胞系。在一些方面，用于如本文所述的异种移植的组织包括但不限于蜂窝组织(areolar)、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、cartaginous、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、肉膜状组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(Epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织。在一些方面，用于如本文所述的异种移植的器官包括但不限于皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、软骨、角膜、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫和阴道。
在一些方面，用于如本文所述的异种移植的纯化的或基本上纯的细胞和细胞系包括但不限于血细胞、血液前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、堆积细胞、内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、粒膜细胞、造血细胞、朗格汉斯细胞胰岛、角质形成细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、黑素细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cell)、神经细胞、其他肌肉细胞、胰腺α-1细胞、胰腺α-2细胞、胰腺β细胞、胰腺胰岛素分泌细胞、脂细胞、上皮细胞、主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、星形细胞、嗜碱性粒细胞、骨细胞、骨前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、肝细胞、角质形成细胞、库普弗(Kupffer)细胞、肝星状细胞、淋巴细胞、微血管内皮细胞、单核细胞、神经元干细胞、神经元、嗜中性白细胞、胰岛细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、血小板、原始干细胞、雪旺细胞、平滑肌细胞、甲状腺细胞、肿瘤细胞、脐静脉内皮细胞、肾上腺细胞、抗原呈递细胞、B细胞、膀胱细胞、宫颈细胞、视锥细胞、卵细胞、上皮细胞、生殖细胞、毛细胞、心脏细胞、肾细胞、leydig细胞、叶黄素细胞、巨噬细胞、记忆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、起搏器细胞、肾小管周细胞、垂体细胞、浆细胞、前列腺细胞、红细胞、视网膜细胞、杆状细胞、支持细胞(Sertoli cell)、体细胞、精细胞、脾细胞、T细胞、睾丸细胞、子宫细胞、阴道上皮细胞、白细胞、纤毛细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、子宫内膜细胞、成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、卵泡细胞、杯状细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、粘液细胞、未角质化的上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和鳞状上皮细胞。
器官是组合在一起以在体内执行一种或多种特定功能的一组相关细胞。在生物学上，皮肤是人体最大且生长最快的器官，并且被分类为外皮系统的主要组分，外皮系统是“高级”动物中发现的十种大型器官系统之一。皮肤起着多种关键的作用，包括调节温度、对外界提供动态屏障、以及充当支持庞大的感觉受体网络的导管。皮肤执行对于身体的生存和健康至关重要的多种功能。皮肤愈合以防止创伤后失血，通过散发热量来调节体温，并作为针对寒冷、吸收、分泌、热调节、感官检测和定位、以及屏障保护的一个层。实际上，不仅已经认识到皮肤移植的成功与其他器官的移植有关，而且皮肤移植体似乎比其他器官(例如，免疫特权器官(诸如肝))对排斥更敏感，并且甚至皮肤移植体已经被建议用作“前哨移植物”，即在人接受者中使用皮肤移植物作为同一接受者中对移植的实体器官排斥的早期预测因子。例如，如在AliTransplant Proc.2016年10月；48(8):2565-2570中所报告，在一些肠和多脏器移植接受者中进行腹壁移植的经验提供的证据表明，排斥可能在肠同种异体移植物中出现之前表现在皮肤组分中，从而提供了期间腹壁排斥的治疗可能防止肠排斥的出现的“前导时间”。
此外，美国法典第42章第274节和第301节明确在其人体器官的正式定义中列出了皮肤，即“经修订的《国家器官移植法》(National Organ Transplant Act)第301节所涵盖的‘人体器官’(‘Human organ’)意指人(包括胎儿)的肾、肝、心脏、肺、胰腺、骨髓和其他造血干/祖细胞(不考虑其收集方法)、角膜、眼睛、骨骼、皮肤和肠，包括食管、胃、小和/或大肠、或胃肠道的任何部分。”类似地，《人体器官移植条例》(Human Organ TransplantOrdinance，HOTO)是一项防止器官交易并保护供体和接受者的自决权的国际认可的条例。这项全球立法将皮肤(以及外皮系统的整个部分)正式列为器官，并且更广泛地将器官定义为“由组织的结构化排列组成的人体的任何部分，如果将所述组织完全去除，则无法被身体再生。”接下来，移植(transplant)的正式医学定义是：“从身体的一个部分或从一个个体中去除组织，并且特别是通过手术将其植入或插入另一个身体或个体中。”HOTO将移植定义为“在移植(transplant)手术期间，无论持久性如何，将器官从一个人转移到另一个人”。
关于皮肤，移植物(graft)通常由用于实现临时的浅表伤口覆盖的脱细胞和/或重构的均质真皮薄片组成。此类移植物(graft)不保留原始组织结构，也不保留有代谢活性的原本天然存在的细胞，并且因此不会变成血管化的；未进行毛细管向内生长或血管间的连接。因此，免疫排斥不是关注的事情-皮肤移植物(graft)被移植物下面的完整宿主上皮细胞的生长所“驱逐”而非排斥。因此，尽管术语移植物(graft)可以正确地应用于此类解决方案，但是使移植体(transplant)与移植物(graft)区分开的主要特性是增加的复杂性、组织和包括一种或多种类型的组织的特性。在当前情况下，从根本上将皮肤移植体(transplant)与现有技术中已知的移植物(graft)区分开。例如，皮肤异种移植体(xenotransplant)由在最终经历免疫介导的排斥之前执行与患者原始皮肤相同的功能的活细胞组成。因此，在这种情况下，根据本公开的皮肤异种移植体(skin xenotransplant)是器官移植体(organ transplant)而不是移植物(graft)。
制品特性和治疗用途
在一些方面，本文所描述和公开的异种移植制品是临时的，即它们在异种移植患者中的使用是非永久性的，主要用于治疗急性疾病和损伤，与不是根据本发明生产的制品相比能够被利用更长的时间段。将理解的是，本文所描述和公开的制品的一些方面也可以是永久的或更永久的，其中移植的器官、组织和/或细胞在长得多的时间段内被人接受者接受而没有不良排斥。
在其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品是有活力的活细胞(例如，充满活力的、有生物活性的)制品；不同于由无法完成血管形成过程的最终灭菌的无活力的细胞构成的合成的或其他基于组织的制品。此外，在一些方面，本公开的制品没有被戊二醛或放射治疗灭活或“固定”。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品被最小程度地操作(例如，没有相关细胞、器官或组织的物理改变)，使得此类制品基本上处于其天然状态。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品能够与人接受者进行器质性结合，包括但不限于与血管形成、胶原生长(例如就皮肤而言)和/或来自移植接受者的其他相互作用(诱导移植物附着、器质性结合或接受者的其他临时或永久性接受)相容。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品用于异种移植中，而无需使用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法来实现期望的治疗效果。
在其他方面，本文所描述和公开的一些异种移植制品(例如皮肤)通过冷冻保存来储存、新鲜储存(无冷冻)或通过其他方法储存以保存与本发明一致的此类制品。存储涉及使用保持细胞和组织生存能力的条件和过程。
在一些方面，存储可能涉及在无菌等渗溶液(例如，有或没有抗生素的无菌盐水)的任何组合中将器官、组织或细胞储存在冰上，储存在冷冻保存液体中，冷冻保存在-40℃左右或-80℃左右的温度下，以及本领域已知的其他方法。这样的存储可以发生在主要收容系统和次要收容系统中。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品用于同源用途，即，用执行与供体相同的一种或多种基本功能的对应器官、细胞和/或组织修复、重建、替换或补充接受者的器官、细胞和/或组织(例如，将猪肾用作人肾的移植体，将猪肝用作人肝的移植体，将猪皮肤用作人皮肤的移植体，将猪神经用作人神经的移植体，等等)。
在又其他方面，本文所描述和公开的异种移植制品具有低的生物负荷，使可能用于增加异种移植后制品的生物负荷和人体对制品的免疫排斥的病原体、抗体、遗传标记和其他特性最小化。这可能包括通过PRR TLR检测PAMP并排斥主题异种移植制品的先天免疫系统。
将理解的是，本文所公开和描述的方面可以以任何数量的组合来应用以产生包含由本发明所涵盖的方面的一个或多个特征和/或方面的一系列或不同方面。
将理解的是，根据本发明，存在源自DPF封闭群体的制品有许多治疗应用。例如，此类制品可以用于治疗器官、细胞或组织的急性和/或慢性疾病、病症或对器官、细胞或组织的损伤，以及可以利用本文公开的制品的任何和所有其他疾病。此类治疗和/或疗法可以包括利用此类制品修复、重构、替换或补充(在一些方面是临时的，并且在其他方面是永久的)人接受者的对应器官、细胞和/或组织，所述器官、细胞和/或组织与供体执行一种或多种相同的基本功能。
具体的治疗应用包括但不限于肺移植、肝移植、肾移植、胰腺移植、心脏移植、神经移植和其他完全或部分移植。关于皮肤，治疗应用还包括但不限于对烧伤、糖尿病性溃疡、静脉溃疡、慢性皮肤病况以及其他皮肤疾病、损伤和/或病况(包括但不限于严重且广泛的深度部分厚度和全层厚度损伤、疾病和/或病况)的治疗(参见例如，本文的实施例2)；用于具有包含大于或等于30％的全身表面积的深度真皮或全层烧伤的成年和小儿患者，任选地与分层厚度自体移植物联合使用，或单独用于由于其创伤/烧伤的严重性和程度而不可以选择分层厚度自体移植物的患者；用根据本发明衍生的肝制品治疗肝衰竭、创伤、疾病、损伤和/或病况；治疗周围神经损伤、以及其他神经疾病、损伤和/或病况；以及利用从DPF封闭群体中收获的材料进行的细胞和其他疗法，包括美国专利第7,795,493号(“Phelps”)中公开的治疗用途，包括针对某些病症的细胞疗法和/或输注(如在第30列第1行至第31列第9行所公开的)和治疗某些病症或病理学(如在第31列第10至42行所公开的)，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。
将理解的是，本文的疗法的具体叙述决不限制本文所公开和描述的制品的治疗应用类型，其涵盖以下器官、组织和/或细胞的急性和/或慢性疾病、病症、对以下器官、组织和/或细胞的损伤：皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、脑、脑、软骨、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫、子宫、阴道、蜂窝组织、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、cartaginous、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、肉膜状组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(Epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织；血细胞、血液前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、堆积细胞、内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、粒膜细胞、造血细胞、朗格汉斯细胞胰岛、角质形成细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、黑素细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cell)、神经细胞、其他肌肉细胞、胰腺α-1细胞、胰腺α-2细胞、胰腺β细胞、胰腺胰岛素分泌细胞、脂细胞、上皮细胞、主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、星形细胞、嗜碱性粒细胞、骨细胞、骨前体细胞、心肌细胞、软骨细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、肝细胞、角质形成细胞、库普弗(Kupffer)细胞、肝星状细胞、淋巴细胞、微血管内皮细胞、单核细胞、神经元干细胞、神经元、嗜中性白细胞、胰岛细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、血小板、原始干细胞、雪旺细胞、平滑肌细胞、甲状腺细胞、肿瘤细胞、脐静脉内皮细胞、肾上腺细胞、抗原呈递细胞、B细胞、膀胱细胞、宫颈细胞、视锥细胞、卵细胞、上皮细胞、生殖细胞、毛细胞、心脏细胞、肾细胞、leydig细胞、叶黄素细胞、巨噬细胞、记忆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、起搏器细胞、肾小管周细胞、垂体细胞、浆细胞、前列腺细胞、红细胞、视网膜细胞、杆状细胞、支持细胞(Sertoli cell)、体细胞、精细胞、脾细胞、T细胞、睾丸细胞、子宫细胞、阴道上皮细胞、白细胞、纤毛细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、子宫内膜细胞、成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、卵泡细胞、杯状细胞、角质化上皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、粘液细胞、未角质化的上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和鳞状上皮细胞。此列表绝不意味着限制治疗急性和/或慢性疾病、病症、损伤、器官或组织衰竭、以及可以利用本文公开的制品的任何和所有其他疾病的治疗用途的阵列。
关于烧伤的治疗，包括但不限于例如II度烧伤和III度烧伤，在一些方面，根据本发明衍生的皮肤制品用于治疗具有严重且广泛的深度部分厚度和/或全层厚度烧伤伤口的人患者。此类制品包含在使用前不会离体扩增并且在预期的治疗持续时间内不会从应用部位迁移的最终分化的细胞类型。因此，致瘤性的潜力可忽略不计。
此类制品粘附在伤口床上，并在烧伤后立即提供屏障功能。此类制品具有非最终灭菌的有活力的细胞，允许移植物组织在接受者中的血管形成。在一些方面，表皮保持完全完整，并且真皮组分得以保持，而没有改变各种细胞和组织的结构形态或组织。该生理机制支持移植物材料的延长生存，并提供至少一种临时的屏障功能，与同种异体移植物相比具有相等或更佳的显著的临床影响。在一些方面，如果存在或发展出感染的临床体征，例如疼痛、水肿、红斑、发热、流水、臭味或不明原因的发烧，则直到感染的临床体征在预定的时间段内(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、1周、2周、3周或4周)减轻或消除或者如果受试者的感染测试呈阴性都不应用本公开的制品。在一些方面，清洁伤口，确认其血管形成良好且无渗出。如果还使用了真皮替代物(诸如尸体同种异体移植物)，则在应用制品之前从被移植的同种异体移植物中去除表皮层，而不去除植入的真皮。表皮层可以根据设施的标准操作程序用皮刀或其他器械去除。
通常在临床实践中使用的移植物由用于实现临时的浅表伤口覆盖的脱细胞和/或重构的均质真皮薄片组成。此类常规移植物不保留原始组织结构，也不保留有代谢活性的原本天然存在的细胞，并且因此不会变成血管化的；未进行毛细管向内生长或血管间的连接。相比之下，本文所述的皮肤制品从根本上不同于此类移植物，因为本公开的制品包括与患者原始皮肤执行相同功能的活细胞，即所述制品充当器官移植体。皮肤执行与体内平衡、温度调节、液体交换和感染预防有关的另外的关键作用。没有足够量的皮肤可能会损害执行这些功能的能力，从而导致由于感染和体液损失引起的高死亡率和发病率的发生。皮肤移植体已被可靠地使用，具有防止具有严重创伤的患者出现这些结果的显著的临床益处；而不管移植物是临时的还是永久的。因此，与其他提议的移植体不同，将不需要使用免疫抑制药物。实际上，在其损伤已经表现出一定水平的固有免疫功能的烧伤患者中，此类方案将是禁忌的。因此，本公开的异种移植制品(xenotransplantation product)不应与由形成为片状或网状的重构的均质野生型猪真皮组成的传统“异种移植物(xenograft)”制品(诸如EZ-DermTM或Medi-SkinTM)相混淆。此类猪异种移植物不形成血管，并且主要仅可用于浅表烧伤的临时覆盖。与之形成鲜明对比的是，本公开的异种移植制品含有与源组织相同构型和不变形态的有代谢活性的最低程度操作的细胞。
在一些方面，本公开包括使用异种移植的供体皮肤作为预测来自同一动物供体的其他器官的排斥的测试。使用人供体皮肤进行此类预测性测试的技术先前已经在例如以下文献中进行了描述：Moraes等人,Transplantation.1989；48(6):951-2；Starzl等人,Clinical and Developmental Immunology,第2013卷,文章ID 402980,1-9；Roberto等人,Shackman等人,Lancet.1975；2(7934):521-4，所述文献的公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文。Moraes报告说，交叉匹配程序在预测早期肾移植排斥方面非常准确。Shackman报告说，从活的人预期的肾供体中获取的皮肤移植物的命运与来自同一供体的肾移植的结果密切相关。根据本公开，在一个方面，本公开包括使用人患者中的异种移植皮肤样品以确定在人患者中是否存在排斥从同一动物供体异种移植的其他器官的风险的方法。
在一些方面，本公开的异种移植制品具有满足法规要求的药代动力学和药效动力学特性。此类特性的表征需要一种关于药物吸收、分布、代谢和排泄的经典含义的独特方法。出于考虑药代动力学的目的，异种移植制品的“吸收”可以通过异种移植制品经历的血管形成过程来描述。例如，在手术后不久，皮肤异种移植制品可能以温暖、柔软和粉红色的形式呈现，然而野生型或传统的异种移植物则以未形成血管的“白色移植物”出现。在一些方面，如通过DNA PCR测试证明在移植位点之外的外周血中存在或不存在猪细胞所证实的，移植体的分布限于移植体的部位。
在其他方面，根据本发明生产的生物制品的细胞在异种移植后不会迁移到接受者中，包括迁移到接受者的循环中。这包括PERV或PERV感染的猪细胞不会迁移到接受者中。可以通过许多方式来确认此类细胞不会迁移到接受者中，所述许多方式包括通过DNA-PCR分析外周血单核细胞(PBMC)和来自移植部位的样品以及高度灌注的器官(例如肝、肺、肾和脾)的样品来确定并以其他方式证明在接受者中没有发生猪细胞(DNA)或猪逆转录病毒(RNA)组分迁移到在外周血中。
此外，异种移植制品的生物利用度和作用机理不受大小的影响。异种移植制品的分布限于施用的部位。例如，在皮肤移植体的情况下，最初由创伤或烧伤损伤产生的清创伤口床是施用部位。本公开包括测试以检测来自异种移植制品的细胞在施用部位之外的外周血、伤口床、脾和/或肾中的分布。在某些方面，这样的测试将证明来自异种移植制品的细胞在施用部位之外的外周血、伤口床、脾和/或肾中不存在。这样的测试可以包括DNA PCR测试在从其中获得制品的动物类型中存在的各种细胞标记，例如PERV、猪MHC和其他猪DNA序列。在某些方面，来自异种移植制品的细胞和核酸仍然限于施用部位。
异种移植制品的代谢，传统上定义为活的生物体通常通过专门的酶或酶促系统对药物的代谢分解，可以与上述在没有外源性免疫抑制药物的情况下发生的天然宿主排斥现象相吻合。通过与预期用于未来人使用的相同配制品和相同施用途径，此类异种移植制品在临床上可使用的时间里经历了与同种异体移植物比较物类似的延迟的免疫排斥过程。
以类似的方式，可以对异种移植制品的排泄建模，并通过由于抗体介导的血管损伤引起的移植体坏死缺血、最终引起组织死亡而导致的临床“坍陷”现象来凭经验进行监测。
与当前的护理标准相比，本公开的异种移植制品的已证明的功效以及安全性、可用性、贮存性、保质期和分布提供了显著的优势。
在一些方面，本公开的异种移植制品的“剂量”被表示为每单位移植面积的制品中有活力的细胞的百分比。因此，在一些方面，本公开的异种移植制品可以被认为类似于药物制品中的活性药物成分。
通过避免：(a)免疫或炎性细胞渗入异种移植制品或此类细胞在其他相关区室诸如血液和脑脊髓液中发生改变；(b)异种移植制品的纤维化包封，例如，导致功能受损或异种移植制品的损耗；(c)异种移植制品坏死；(d)移植物抗宿主病(GVHD)；和(e)旨在减少排斥或炎症反应的包封或屏障的体内功能和耐久性，增加了本公开的异种细胞、组织或器官的存活率。
使用FITC-IB4标记和流式细胞术，从仔猪获得血液样品并测试其表型、血细胞表面上α-半乳糖表达的缺乏。在这个发展阶段，所有后代都将在出生时进行基因分型。已经建立了一种PCR测定，以通过使用从耳朵切迹或PBMC分离的DNA确定猪是否具有野生型半乳糖-α1,3半乳糖转移酶基因(Gal-T)，或者对于Gal-T基因敲除(Gal-T-KO)是杂合的还是纯合的。按照Qiagen DNeasy试剂盒说明使用DNeasy试剂盒从PBMC(或皮肤组织)中分离基因组DNA。对基因组DNA和对照模板DNA、野生型Gal-T(+/+)杂合子Gal-T-KO(+/-)和纯合子Gal-T-KO(-/-)进行PCR。
将皮肤移植物的打孔活组织检查物与维持在75-cm2的烧瓶中的培养基(补充有10％胎牛血清和谷氨酰胺、青霉素和链霉素的达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco’smodified Eagle’s medium))中的亚汇合靶细胞、人293(肾上皮)和猪ST-IOWA细胞系共培养。使活组织检查物与靶细胞保持接触5天，其后除去培养基和剩余组织，并根据需要通过传代培养来维持靶细胞共培养物。通过培养上清液中逆转录酶(RT)活性的存在来确定靶细胞的PERV感染。将传播测定维持至少60天，然后才能视为阴性。
进行制品表征以测量安全性、身份、纯度和效力。安全性测试包括细菌和真菌的无菌性、支原体和病毒因子。本公开包括冷冻保存和存档以根据需要进一步测试所有最终的异种移植制品(即，器官的细胞或组织或活组织检查物)的样品，无论是新鲜的还是来自离体培养物。在一些情况下，例如，如果异种移植制品是整个的完整器官，则将相关的替代样品(例如，相邻组织或对侧器官)存档。
关于皮肤，猪皮肤的储存和冷冻保存还没有被充分表征，特别是在生存能力方面，因为大多数猪异种移植物是有意失活的，或者用戊二醛或放射处理“固定的”。这种信息对于支持使用活的猪皮移植物(或猪皮移植体)作为临时且临床上有利的选择是必要的。
在将异种移植制品从源动物中取出后立即进行移植的程序中，诸如整个器官的异种移植，异种移植制品的测试结果可能在其临床使用之前无法获得。在此类情况下，对源动物本身的测试可能是在程序之前可能进行的所有测试。可以根据本公开对从此类异种移植制品或适当的相关生物替代物(例如，相邻组织或对侧器官)中获取的样品进行测试。微生物检查方法可以包括下表3中阐述的方面：
表3
本公开包括使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液或pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液来制备测试悬浮液；为了悬浮巴西曲霉孢子，可以将0.05％的聚山梨醇酯80添加到缓冲液中。本公开包括在2小时内或如果储存在2℃和8℃之间则在24小时内使用悬浮液。作为准备并且然后稀释巴西曲霉或枯草芽孢杆菌的营养细胞的新鲜悬浮液的替代，制备了稳定的孢子悬浮液，并且然后将适量的孢子悬浮液用于测试接种。可以将稳定的孢子悬浮液维持在2°至8°持续有效的时间段。为了验证测试条件，使用所选稀释剂代替测试制剂进行阴性对照。必须没有微生物的生长。如在制品测试中所述，当测试制品时也进行阴性对照。阴性对照失败需要进行调查。可以根据USP 61、USP 63、USP 71、USP 85 EP第2.6.13节非无菌制品的微生物检查(Microbial Examination of Non-sterile Products)(测试特定微生物)来进行微生物检查，每篇所述文献均以全文引用的方式并入本文。
关于猪巨细胞病毒(PCMV)的测试，每季度对源动物进行PCMV筛选。然而，使然后持续饲养在封闭群体中的剖腹产来源的仔猪未感染有PCMV。在本文实施例1的研究过程中进行了对PCMV的分析，并且使用以下PCR方法在打孔活组织检查中未检测到PCMV。这些结果与鼻拭子的PCR结果一致。将实时定量PCR用于PCMV测试。使用Stratagene Mx3005P通过实时PCR定量靶DNA序列。为每个基因靶标产生序列特异性引物和TaqMan探针。每个25uL PCR反应均包括靶DNA、800nM引物、200nM TaqMan探针、20nM Rox参考试剂和1x Brilliant III超快主混合物(Ultra Fast Master Mix)。PCR循环条件如下：在95℃下进行1次循环持续5分钟，然后在95℃下进行50个变性循环持续10秒，以及在60℃下进行退火延伸持续30秒，在每次延伸后收集数据。将克隆到Invitrogen TOPO质粒中的经凝胶提取的扩增子的系列稀释液用作定量标准。检测到的靶DNA的线性动态范围为10至106个拷贝。为了定量PCMV DNA，在TaqMan PCR中一式三份运行300ng异种移植物猪肾DNA。已显示对PCMV DNA聚合酶基因具有特异性的引物和探针与PLHV-1没有交叉反应性。剖腹产来源的猪作为源动物的使用，与所得封闭群体的动物畜牧业以及屏障隔离条件的维持相结合，归因于所述动物不含PCMV。关于皮肤，本发明人注意到，鉴于与同种异体移植物相当的性能，在实施例1中使用单敲除猪(与三重敲除或甚至进一步遗传修饰的猪相反)获得的安全性和功效结果十分令人惊讶。
在一些方面，用于测试异种移植制品的分析程序还可以包括：
a.USP<71>无菌性。酌情将样品转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。对于细菌抑制和真菌抑制，TSB样品掺有<100菌落形成单位(CFU)的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的24小时培养物、以及<100个的巴西曲霉孢子的接种物。FTM样品将掺有<100CFU的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和产孢梭菌的24小时培养物的接种物。如果未观察到生长，则发现所述制品具有细菌抑制和真菌抑制作用，并且未通过USP<71>无菌性测试。
b.需氧和厌氧细菌培养物。酌情将样品转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现微生物生长的迹象，则将判断所述制品符合如USP<71>所述的无菌性测试。
c.支原体测定USP<63>。将新鲜样品添加到100mL支原体Hayflick肉汤中，并在37℃下孵育至多21天。在2-4天、7-10天、14天和21天后对样品进行传代培养。然后将板在37℃下孵育至多14天，并检查支原体集落的存在。如果未检测到任何集落，则发现所述制品符合USP<63>并且不含支原体。
d.内毒素USP<85>。对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(Limulusamoebocyte lysate，LAL)测试的抑制/增强。将在37℃下每个样品用40mL WFI提取样品1小时。然后将样品在LAL动力学发色测试中进行测试，在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。将根据USP<85>进行测定。
e.细胞生存能力的MTT测定。使用针对[3-4,5二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)代谢的生化测定相对于对照组织样品测试了药物制品的代谢活性。将新鲜异种移植制品组织的阳性和阴性对照样品(阳性对照)或异种移植制品组织的热灭活圆盘(阴性对照)或异种移植制品的测试物品放入含有MTT溶液(在DMEM中为0.3mg/mL，0.5mL)的琥珀色微量离心管中。将圆盘用MTT甲臜处理，并在37℃和5％CO2空气的气氛下孵育180±15分钟。通过除去圆盘来终止反应，并且通过在环境温度下孵育≤24小时或在4℃下冷藏≤72小时来提取甲臜。在这段时间期间，样品要避光。提取完成后取等分试样，并测量550nm(参考波长为630nm)下的吸光度，并将其与标准曲线进行比较。
f.细胞外聚糖表位的IB4测定。将使用荧光激活流式细胞术确定细胞上不存在半乳糖基-a-1,3-半乳糖(α-Gal)表位。用荧光色素标记的异凝集素-B4(FITC-I-B4)将全血中的白细胞染色，并与从野生型阳性对照和Gal-T-KO源动物获得的血液进行两次比较。首先，在出生时对所有源动物进行测试。第二，将对从源动物处死时收集的全血进行相同的测试，并且测试基因敲除的稳定性以及α-Gal的阴性表型。异凝集素与来自野生型猪的细胞上的表位结合，但在来自Gal-T-KO猪的细胞上不发生结合。所述测定用于确认在基因工程化的源动物中不存在α-gal表位。自发地重新激活基因以及在处死后重新表达α-Gal部分非常不可能和不合理预期的；如前所证明，其包含只会破坏异种移植制品的功效，从而导致其类似于野生型猪组织并发生超急性排斥。
g.PERV病毒测定。PERV pol定量：使用Stratagene MX300P实时热循环仪(AgilentTechnologies)，在50个循环的PERV聚合酶定量TaqMan PCR中一式三份扩增10uL的RT反应的1:625稀释液。相似地处理10uL的“无RT酶”对照RT反应的1:25稀释液。PCR条件包括终浓度为800nM的PERV pol正向和反向引物以及终浓度为200nM的PERV pol探针。使用Brilliant III超快主混合物(600880Agilent Technologies)，并用ROX报告染料(600880Agilent Technologies)和0.04单位/μL UNG核酸酶(N8080096，Life Technologies)补充至20nM。循环条件包括：在50℃下10分钟进行一次循环，然后在95℃下10分钟进行一次循环以及在95℃下10秒进行50次循环，然后在60℃下30秒，在每个循环结束时收集数据。测量每纳克输入cDNA的PERV pol的绝对拷贝以及猪MHC-I和猪GAPDH核酸的绝对拷贝。测试如本文所述解冻的打孔活组织检查物和洗涤的异种移植制品中的PERV DNA和RNA的存在。
h.组织学和形态学。遵循所描述的制造过程对异种移植制品的样品进行取样以检查细胞形态和组织。在显微镜下通过可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织的正确细胞形态和组织、以及不存在异常细胞浸润群体。
i.释放测定取样方法。一旦产生了所有单位的最终异种移植制品批次，就独立随机地选择单位以用于所需接受标准的生产发布测定中。这些单位将被标记为向各个实验室承包商发布批次，并且将根据所需的cGMP条件进行各种分析测试。
类似地，在验证供人临床使用之前，所有最终异种移植制品都必须符合接受标准以选择供体猪作为材料，包括(i)审查关于限定的纯种系谱的医学记录；(ii)审查关于通过Flowmetrics获得的α-1,3-半乳糖测试结果的医学记录；(iii)审查关于完全疫苗接种历史的医学记录；(iv)审查关于猪一生中进行的监督测试的医学记录；(v)对源动物的不定因子筛选；(vi)审查关于猪一生中的感染的医学记录；和(vi)审查关于动物病史中记录的任何皮肤异常的医学记录。
在生产过程结束时在发布供临床使用之前进行最终异种移植制品控制策略和分析测试。所需的分析测试的结果将通过异种移植制品药物制品分析证书(COA)记录下来，所述分析证书附有与每个批次的异种移植制品药物制品有关的主批次记录。
下表4是对异种移植制品材料进行的测定和一系列测试的结果的列表。
表4
在另一个方面，将理解的是，包括基于源动物开发的不定因子控制策略，包括物种、品系、地理起源、组织类型和建议的适应症。对不定因子进行分析测试，以包括细菌、真菌、支原体和病毒微生物，包括如下：
a.无细菌状态–进行细菌学筛选以确认药物制品不含人关注的潜在生物因子。进行需氧和厌氧筛选两者以确保无菌性。如本文所述将样品解冻，并酌情转移到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或硫代乙醇酸盐液体培养基(FTM)中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现微生物生长的迹象，则将判断所述制品符合无菌性测试。
b.无真菌学(真菌)状态–进行真菌学筛选以确认药物制品不含关注的潜在真菌因子。如本文所述将样品解冻。解冻后，将样品转移到大豆-酪蛋白消化物琼脂中。将容器孵育，以允许潜在的生长。如果未发现真菌生长的迹象，则将根据USP<71>判断所述制品符合无菌性测试。
c.无支原体状态-进行支原体筛选以确认药物制品不含支原体。如本文所述将样品解冻，并且添加至100mL支原体肉汤中并在37℃下孵育至多21天。在2-4天、7-10天、14天和21天后对样品进行传代培养。然后将板在37℃下孵育至多14天，并检查支原体集落的存在。如果未检测到任何集落，则发现所述制品符合USP<63>并且不含支原体。
d.无内毒素状态–进行无内毒素状态以确认药物制品不含关注的内毒素和相关因子。对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(LAL)测试的抑制/增强。如本文所述将样品解冻，并在37℃下每个样品用40mL WFI提取1小时。然后将样品在LAL动力学发色测试中进行测试，在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。将根据USP<85>进行测定。
e.进行的病毒测定–进行病毒测定以确认源动物不含关注的潜在病毒因子，从而确认了内源性病毒(参见下文)。这包括针对特定潜伏性内源性病毒(包括PERV)的共培养和RT-PCR测试。还对动物源进行体内测定，以监测动物健康和无病毒感染，这是批次发布标准的关键方面。由于猪组织中PERV的本土性质，因此这使得有资格作为阳性结果而不排除使用这种组织。然而，已在批次发布中鉴定和表征所述病毒，以提供信息监测异种移植制品的接受者。
f.细胞生存能力测定–进行MTT测定以确认异种移植制品中细胞的生物活性状态。与阳性对照(新鲜、未冷冻保存的)和阴性对照(热变性的)相比，通过线粒体活性的替代标志物提供了生存能力的证据。细胞的活性对于异种移植制品是必需的，以提供预期的临床功能。这是批次发布标准所必需的，并且目前已确定组织生存能力应不低于新鲜组织对照比较物所展示的代谢活性的50％。
g.组织学和形态学-在显微镜下通过对表皮和真皮层的苏木精和曙红(H&E)切片染色的可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织和细胞浸润群体的正确细胞形态和组织。进行此操作以确认在异种移植制品中存在的细胞的适当生理外观和身份。异种移植制品由最低程度操作的猪真皮和表皮组织层构成。这是批次发布标准所必需的。验证了表皮层中以下细胞层(从最表面到最深)的证据：
i.角质层
ii.颗粒层
iii.棘突层
iv.基底层
验证了真皮层中以下细胞结构的证据：
v.血管、脉管系统的证据
vi.神经
vii.各种腺体
viii.毛囊
ix.胶原
经基因工程化的源动物在基因组中不含有任何外来的、引入的DNA；所采用的遗传修饰仅是单个基因的敲除，所述单个基因负责编码引起细胞表面抗原普遍表达的酶。将理解的是，异种移植制品在一个或多个方面不结合转基因技术，诸如CD-46或CD-55转基因构建体。
进行无内毒素状态以确认药物制品不含关注的内毒素和相关因子。确保无内毒素状态的方案如下：对来自同一批次的三个样品测试了鲎试剂(Limulus amoebocytelysate，LAL)测试的抑制/增强。将样品解冻、提取并在LAL动力学发色测试中进行测试，根据USP<85>在有效稀释下标准曲线的范围为5-50EU/mL。
进行MTT测定以确认制品中细胞的生物活性状态。与阳性对照(新鲜、未冷冻保存的)和阴性对照(热变性的)相比，通过线粒体活性的替代标志物提供了生存能力的证据。细胞活性是制品所必需的，以提供预期的临床功能和对于一个方面在50％至100％线粒体活性范围内的生存能力参数。
在显微镜下通过对表皮和真皮层的苏木精和曙红(H&E)切片染色的可见检查进行验证，以确保异种移植制品组织和细胞浸润群体的正确细胞形态和组织。进行此操作以确认在制品中存在的细胞的适当生理外观和身份。
对于皮肤异种移植制品，验证了表皮层中以下细胞层(从最表层到最深)的证据：角质层；颗粒层；棘突层；基底层。验证了真皮层中以下细胞结构的证据：血管、脉管系统的证据；神经；各种腺体；毛囊；胶原。
可以将异种移植制品进一步处理以确保其仍然不含需氧和厌氧的细菌、真菌、病毒和支原体。在无菌条件下，在收获之后立即、在收获后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒内、在10秒至1分钟内、在1分钟至1小时内、在1小时至15小时内、或在15小时至24小时内，使用适用的无菌技术，在药物制品处理套房中的层流通风橱中，例如使用UV辐照或抗微生物剂/抗真菌剂中的一种或多种对异种移植制品进行灭菌。在一个方面，可以将制品放置于抗微生物剂/抗真菌剂浴(“抗病原体浴”)中。抗病原体浴可以包括：一种或多种抗细菌剂，例如氨苄西林、头孢他啶、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢菌素、青霉素、四环素、万古霉素等；一种或多种抗真菌剂，例如两性霉素B、唑类、咪唑类、三唑类、噻唑类、克念菌素、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素、龟裂霉素、烯丙胺、棘球白素等；和/或一种或多种抗病毒剂。抗病原体浴可以包括载体或介质作为稀释剂，例如RPMI-1640培养基。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少2种抗细菌剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少2种抗细菌剂和至少一种抗真菌剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括至少四种剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括不超过4、5、6、7、8、9或10种剂。在一些方面，抗病原体浴可以包括前述的任何组合。
可以使用UV光灭菌对制品进行灭菌。例如，将制品放置在UV灯下一段所需的时间，例如0.5、1、1.5、2、3、4、5、6分钟或更长时间，然后翻转到另一侧，并将相反侧放在UV灯下持续相同或不同的时间段。可以基于特定的生物剂或待灭菌的生物剂的类型来改变将给定样品暴露于UV的时间，例如，如下表8所示。例如，可以使用具有至少100uW/cm2的UV-C强度的UV灯对制品灭菌至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟，并且翻转使得其相反表面暴露于所述UV灯至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟，以获得经UV处理的制品；UV-C剂量为至少100,000uW秒/cm2且至多800,000、700,000、600,000、500,000、400,000、300,000或200,000uW秒/cm2；UV-C剂量为至少200,000uW秒/cm2且至多800,000、700,000、600,000、500,000、400,000、or 300,000uW秒/cm2；具有至少100uW/cm2的UV-C强度的UV灯持续至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟。
制品处理发生在开始于处死源动物直到完成最终制品的生产的单一、连续且设备齐全的隔离生产事件中。通过俘虏式栓系安乐死对动物实施安乐死，如有必要，可以将其在无菌无孔袋中移动到手术室中，在所述手术室中将进行从源动物中收获生物制品的程序。手术团队的所有成员都应穿戴完全无菌的手术设备，例如，穿着无菌衣服以在接收源动物之前维持无指定病原体条件，并且在一些情况下戴上双层手套以使污染最小化，并且对手术区域和工具进行灭菌。将源动物以无菌方式从袋子和容器中取出。手术人员用杀菌剂(例如氯己定)将源动物擦洗例如至少1-10分钟，例如在将要进行手术的整个动物区域上刷洗，定期将氯己定倒在所述区域上以确保覆盖度。用打开的必妥碘刷子擦洗动物的一个或多个手术区域，并在将要进行手术的整个动物区域上用无菌水冲洗例如1-10分钟。
在一个方面，关于皮肤，由根据本发明的源自猪的真皮组织组成的全层厚度皮肤移植物伤口敷料与所培养的表皮自体移植物结合或组合使用，以产生根据本公开的和可以在本公开的方法中使用的制品。在应用表皮自体移植物之前，需要对伤口床进行大量清创术以确保有足够的基底。为了确认伤口床已准备好进行表皮自体移植，应用本文所述的皮肤制品，例如源自本公开动物的生物皮肤制品以确认附着。一旦确认附着，就去除临时的伤口覆盖制品，并且在一些方面，用网状的自体移植物覆盖伤口床，并且将一种或多种培养的表皮自体移植物制品放置在顶部以封闭自体移植物网中的间隙。
清创术可以包括机械清创术、化学清创术、酶促清创术或其组合。机械清创术可以包括外科手术切除，例如去除真皮薄层直至可见健康组织的切向切除，或去除全层的真皮直至下层筋膜的筋膜切除术。切向切除术使较少有活力组织随坏死组织一起被切除，但通常导致更高的失血量，比筋膜切除术具有更大的生理应激因子，并且更可能导致“不完全的”清创术，一些失活的组织保留在原位。在筋膜切除术中，失血量和手术时间减至最少，但通常有大量健康组织随着烧伤组织一起被去除。清创剂可以包括能够通过去除外来物质和死组织来清洁烧伤伤口的剂。许多此类剂是已知的。在酶促清创术中，使用胶原酶或其他蛋白水解酶来分解细胞外基质的蛋白质，从而无需手术就可以清除掉失活的组织，同时优选地使健康组织基本上保持完整。酶促清创术涉及将蛋白水解酶和任选地其他外源酶应用于伤口表面，以分解坏死组织。酶促清创术可能是一个相对缓慢的过程，与其他局部制剂、浸泡和重复敷料相结合需要数周的时间段。可替代地，可以使用多酶制品(例如，从菠萝植物的茎中提取的那些多酶制品，例如在WO 98/053850和WO 2006/0006167中公开的，以及以商品名称出售的制品中所提供的)来实现快速的酶促清创术。酶促清创术的程序通常利用酶，诸如菠萝蛋白酶衍生物、清创酶(debridase)、胶原酶、木瓜蛋白酶衍生物、链激酶、舒替兰酶(sutilains)、纤维蛋白溶酶、脱氧核糖核酸酶、磷虾衍生物、胰蛋白酶或其组合。自溶性清创术依靠增强由于巨噬细胞和内源性蛋白水解活性而在伤口中发生的坏死组织和焦痂从健康组织中的选择性液化、分离和消化的自然过程。这通过使用闭塞性、半闭塞性或潮湿的交互式敷料来实现。酶促清创剂包括富含菠萝蛋白酶的酶制品、其他胶原酶、或能够清除失活的组织或伤口碎片的其他酶制品。NexoBridTM(MediWound Ltd.)是一种富含这种菠萝蛋白酶的制品，专门针对热变性的胶原进行降解，从而导致部分厚度或全层厚度的伤口需要伤口覆盖或敷料制品。此类制品和方法描述于美国专利第8,540,983号；第8,119,124号；第7,128,719号；第7,794,709号；第8,624,077号；和US2009/0010910A1，所述专利中每一篇以引用的方式并入本文。
在一些方面，伤口床可以包括或者可以是慢性伤口或急性伤口。慢性伤口包括但不限于静脉腿溃疡、压力性溃疡和糖尿病性足溃疡。急性伤口包括但不限于烧伤、创伤性损伤、截肢伤口、皮肤移植物供体部位、咬伤、冻疮伤口、皮肤擦伤和手术伤口。
在没有真皮的情况下，使用根据本发明生产的生物制品。从此类制品中去除表皮(例如，在使用VERSAJETTM Hydrosurgery系统在猪上收获真皮之前)，使得仅保留真皮。然后，将主题生物制品放置于患者的皮下组织上，作为本文所述的培养的表皮自体移植物过程的基质。
在一个方面，将根据本公开衍生的肝用于体外灌注作为人患者的临时过滤器，直到患者接受人移植体为止。在DPF隔离区域内的手术区域中，将源动物放置在一般麻醉剂(氯胺酮、甲苯噻嗪、安氟醚)下或通过俘虏式栓系实施安乐死。然后在无指定病原体条件下对源动物进行肝切除术。可以将源自源动物的肝制品包装起来并按照人供体肝的现行惯例运输到程序的地点。可以例如通过用动脉套管经皮将套管插入人患者的颈内静脉进行静脉回流、以及用动脉套管经皮将套管插入患者的股静脉进行静脉流出来执行利用肝过滤制品的程序。将这些套管连接到旁路回路，旁路回路装有其中并入的离心泵、热交换器、充氧器和辊式泵。将该回路用晶体预处理并运行一段时间(例如10-30分钟)，然后将根据本公开的动物的肝以稳定的流速(例如600-1000ml/min)掺入，维持在偶尔补充有温的溶液(例如30-40℃)的晶体浴中。
将理解的是，在猪至人异种移植的上下文中，每个人接受者将具有该个体独特的主要组织相容性复合物(MHC)(I类、II类和/或III类)，并且将不匹配供体猪的MHC。因此，将理解的是，当将供体猪移植物引入接受者时，猪MHC分子它们本身充当抗原，引起来自接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。
人白细胞抗原(HLA)基因在人群体中显示出难以置信的序列多样性。例如，仅HLA-B基因就有>4,000个已知的等位基因。据信，HLA基因中的遗传多样性(其中不同等位基因具有呈递不同抗原的不同效率)是进化赋予针对人所暴露的各种不同病原体的更好的群体水平抗性的结果。这种遗传多样性在异种移植期间也呈现出问题，其中接受者的免疫反应是决定植入结果和移植后存活的最重要因素。
根据本发明的一个方面，向供体猪提供了被生物工程化以表达一组特定的已知人HLA分子的基因组。例如在IPD-IMGT/HLA数据库(可获自ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)和international ImMunoGeneTics information (可获自imgt.org)中可获得此类HLA序列。例如，HLA-A1、B8，DR17是白种人中最常见的HLA单倍型，频率为5％。因此，可以使用已知的MHC/HLA序列信息结合本文提供的公开内容来执行所公开的方法。
在一些方面，鉴定出接受者的人白细胞抗原(HLA)基因和MHC(I类、II类和/或III类)并对其进行作图。将理解的是，能以本领域已知的任何方式来确定人接受者的HLA/MHC序列。例如，HLA/MHC基因通常用靶向测序方法(长读段测序或长插入短读段测序)进行分型。常规上，已经以2位数分辨率(例如，A*01)确定了HLA类型，其近似于血清抗原分组。最近，已经将序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)方法用于以4位数分辨率(例如，A*01:01)进行HLA分型，这可以区分氨基酸差异。当前，与其他常规方法相比，用于HLA分型的靶向DNA测序是最流行的HLA分型方法。由于基于序列的方法直接确定编码区域和非编码区域，因此其可以实现分别以6位数分辨率(例如A*01:01:01)和8位数分辨率(例如A*01:01:01:01)进行HLA分型。从临床角度来看，以最高分辨率进行HLA分型期望将现有HLA等位基因与新等位基因或无效等位基因区分开。此类测序技术描述于例如Elsner HA,Blasczyk R:(2004)Immunogenetics of HLA null alleles:implications for blood stem celltransplantation.Tissue antigens.64(6):687-695；Erlich RL等人(2011)Next-generation sequencing for HLA typing of class I loci.BMC genomics.12:42-10.1186/1471-2164-12-42；Szolek A等人(2014)OptiType:Precision HLA typing fromnext-generation sequencing data.Bioinformatics 30:3310–3316；Nariai N等人(2015)HLA-VBSeq:Accurate HLA typing at full resolution from whole-genomesequencing data.BMC Genomics 16:S7；Dilthey AT等人(2016)High-accuracy HLA typeinference from whole-genome sequencing data using population referencegraphs.PLoS Comput Biol12:e1005151；Xie C.等人(2017)Fast and accurate HLAtyping from short-read next-generation sequence data with xHLA 114(30)8059-8064中，将所述文献中的每一篇以全文引用的方式并入本文。
已知的人HLA/MHC或单个接受者的测序的HLA/MHC序列可以用作模板来修饰猪白细胞抗原(SLA)/MHC序列以与已知的人HLA/MHC序列或人接受者的HLA/MHC序列匹配，例如具有90％、95％、98％、99％或100％的序列同源性。在鉴定待使用的已知人接受者HLA/MHC序列或对人接受者进行基因测序以获得HLA/MHC序列后，可以根据所需的HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行生物学重新编程。例如，向本公开的猪施用几种靶向引导RNA(gRNA)序列，以用人接受者的模板HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。
将CRISPR-Cas9用于介导猪细胞中特定天然基因座上整个MHC等位基因的快速且无痕的交换。使用具有两种gRNA的Cas9多重靶向来引入MHC等位基因侧翼的单链断裂或双链断裂，从而使得能够用模板HLA/MHC序列(以单链或双链DNA模板提供)替换。在某些方面，将CRISPR/Cas9组分注射入猪卵母细胞、卵子、合子或胚细胞中，然后转移到寄养母亲体内。
在某些方面，本公开包括无SLA和表达HLA的生物学重新编程猪的胚胎发生和活产。在某些方面，本公开包括对无SLA和表达HLA的生物学重新编程的猪进行配种，以产生无SLA和表达HLA的后代。在某些方面，通过猪合子的胞质内显微注射将CRISPR/Cas9组分注射到猪合子中。在某些方面，在对CRISPR/Cas9遗传修饰的猪进行选择性配种之前，将CRISPR/Cas9组分注射到猪中。在某些方面，在从猪收获细胞、组织、合子和/或器官之前，将CRISPR/Cas9组分注射到供体猪中。在某些方面，CRISPR/Cas9组分包括用于受控基因编辑的所有必需组分，所述受控基因编辑包括利用控制性gRNA分子的自灭活，如美国专利第9,834,791号(Zhang)所述，所述专利以全文引用的方式并入本文。
可以利用已知的基因组编辑技术进行遗传修饰，所述基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑以及成簇的规则间隔回文重复序列Cas9(CRISPR-Cas9)。这些可编程核酸酶能够实现DNA双链断裂(DSB)的靶向产生，这促进了细胞修复机制的上调，从而导致非同源末端连接(NHEJ)或同源指导的修复(HDR)的易错过程，后者可以用于整合外源供体DNA模板。CRISPR-Cas9也可以用于去除细胞中的病毒感染。例如，能以在以下文献中所描述的方式进行经由CRISPR-Cas9的遗传修饰：Kelton,W.等人,“Reprogramming MHC specificity by CRISPR-Cas9-assisted cassette exchange,”Nature,Scientific Reports,7:45775(2017)(“Kelton”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，本公开包括使用CRISPR-Cas9重新编程以介导整个等位基因(例如MHC、HLA、SLA等)的快速且无痕的交换。
在一个方面，对接受者的HLA/MHC基因进行测序，并根据接受者的HLA/MHC基因制备模板HLA/MHC序列。在另一个方面，来自WHO数据库的已知人HLA/MHC基因型可以用于本公开的猪的遗传重新编程。例如，使用聚合酶链式反应制备CRISPR-Cas9质粒，并将接受者的HLA/MHC序列作为模板克隆到质粒中。鉴定猪细胞中SLA/MHC基因座上的CRISPR切割位点，并将靶向切割位点的gRNA序列克隆到一种或多种CRISPR-Cas9质粒中。然后将CRISPR-Cas9质粒施用于猪细胞中，并在猪细胞的MHC基因座处进行CRIPSR/Cas9切割。
猪细胞中的SLA/MHC基因座被与已知的人HLA/MHC序列或接受者的测序HLA/MHC基因匹配的一个或多个模板HLA/MHC序列替换。在执行SLA/MHC重新编程步骤之后对猪细胞进行测序，以便确定是否已成功重新编程猪细胞中的HLA/MHC序列。来自HLA/MHC序列重新编程的猪的一种或多种细胞、组织和/或器官被移植到人接受者中。
在某些方面，在将HLA/MHC序列重新编程的猪用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源之前，使它们繁殖至少一代或至少两代。在某些方面，CRISPR/Cas9组分也可以用于灭活负责PERV活性的基因，例如pol基因，从而同时从猪供体中完全消除PERV。
出于修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC的目的，已对人和猪组织相容性复合物的比较基因组组织进行作图。例如，这种SLA到HLA作图可以在以下文献中找到：Lunney,J.,“Molecular genetics of the swine major histocompatibility complex,the SLAcomplex,”Developmental and Comparative Immunology 33:362-374(2009)(“Lunney”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，鉴于本公开并使用Lunney等人的作图作为参考工具，本领域普通技术人员有效且高效地对猪细胞进行遗传重新编程。
修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC使得与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同或几乎相同的来自猪细胞的特定MHC分子表达。在一个方面，本公开涉及对仅限于猪基因组的特定SLA区域的特定部分进行修饰以在猪中保持有效的免疫特性，同时当生物制品被移植到人接受者中时是低免疫原性的，使得可以减少或避免免疫抑制剂的使用。与本公开的方面形成对比，现有技术的异种移植研究需要使用免疫抑制剂来抵抗排斥。在一个方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。在一个方面，猪基因组被重新编程以敲除SLA-11；SLA-6,7,8；SLA-MIC2；和SLA-DQA；SLA-DQB1；SLA-DQB2，以及敲入HLA-C；HLA-E；HLA-G；和HLA-DQ。在某些方面，降低在重新编程的猪基因组中的HLA-C表达。通过对猪细胞进行重新编程以使其对人的免疫系统不可见，这种重新编程由此可以最小化甚至消除免疫反应，所述免疫反应基于供体猪细胞原本表达的猪MHC分子原本发生。
因此，将理解的是，这方面(即，将SLA/MHC重新编程以表达专门选择的人MHC等位基因)当应用于用于异种移植目的的猪细胞、组织和器官时与来自缺乏这种重新编程的野生型猪或以其他方式遗传修饰的猪(例如转基因猪或具有非特定或不同遗传修饰的猪)的细胞、组织和器官相比将减少排斥。
将进一步理解的是，结合供体猪细胞中的α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的消除(例如，“单敲除”、“双重敲除”或“三重敲除”)，使供体猪细胞、组织和器官表达具体如本文所述的已知的人MHC基因型或接受者的MHC呈现出与缺乏本公开的特定SLA/MHC重新编程的三重敲除猪相比其细胞将具有降低的免疫排斥的一种猪。
根据本公开的冷冻保存和储存包括制备根据本公开的生物制品、放置于容器中、向容器中添加冷冻介质并密封。例如，将15％的二甲亚砜(DMSO)冷冻保护介质与胎儿猪血清(FPS)或供体血清(如果没有FPS)以1:1的比率组合，过滤(0.45微米)，并在使用前冷却至4℃。随后将容器以每分钟1℃的速率在控制速率的相冷冻机(phase freezer)中冷冻至-40℃，然后迅速冷却至-80℃的温度。DMSO在冷冻过程中会替换细胞内液体。以基于冷冻小瓶的最大内部体积(10ml)比异种移植制品的体积小约40-80％或50-70％的量使用冷冻保护介质(例如CryoStor)。为了解冻用于手术用途的冷冻保存的生物制品，将密封的小瓶放置于约37℃水浴中持续大约0.5至2分钟，此时打开容器并使用无菌技术将所述制品取出。随后，制品在温和搅拌下例如在盐水中经历三次一分钟连续洗涤，以稀释并系统地除去周围的残留DMSO并防止细胞生存能力丧失。然后可以通过外科手术使用制品。
将理解的是，可以使用材料、容器和过程进行处理、储存、运输和/或以其他方式处理异种移植制品，以确保保存无菌性并防止对其造成损害。在一些方面，可以使用无菌的非粘性材料来保护异种移植制品，例如，以支撑异种移植制品并防止所述制品粘附在表面上和/或防止异种移植制品在操作、存储或运输期间的自粘。异种移植制品的意外粘附可能破坏异种移植制品的完整性，并可能降低其治疗可行性。包含无菌非粘性材料提供了保护和/或物理支持，并防止粘附。在一些方面，无菌的非粘性材料没有生物或化学活性，并且不直接影响异种移植制品本身的代谢活性或功效。
通过以下非限制性条目列表进一步描述本公开的各方面：
1.一种生产适合用于异种移植到人接受者中的生物制品的方法，所述方法包括：
生产非野生型生物工程化猪，其中所述猪是通过自然配种和自然分娩生产的，其中所述猪具有生物工程化基因组，使得其不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位，并且其中所述猪不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，
根据减少生物负荷的程序饲养所述猪并维持所述猪，所述程序包括将所述猪维持在封闭畜群中，其中已确认所述封闭畜群中的所有其他动物不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，其中所述猪被隔离免于与在所述封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触，
从所述猪中收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪实施安乐死并从所述猪中无菌地去除所述生物制品，
在收获的15小时内对所述生物制品进行处理，包括灭菌，并将所述生物制品储存在无菌容器中，
其中所述生物制品不含有一种或多种细胞外表面聚糖，其中所述制品不含蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种和毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，并且其中所述制品是有生物活性的并且包含在异种移植后能够形成血管的活的细胞和组织，
其中所述制品的细胞线粒体活性如通过MTT测定测量为大于50％；
其中如与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品当移植到人异种移植接受者中时具有较低的免疫原性，
其中如与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品当移植到人异种移植接受者中时具有较低的抗原性，并且
其中所述制品在没有向人异种移植接受者施用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法的情况下抵抗人异种移植接受者的排斥。
2.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述处理包括在收获的15小时内进行紫外线(UV)灭菌。
3.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中将所述制品平放在无菌表面上，并暴露于具有至少100uW/cm2的UV-C强度的UV灯至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟，并且翻转使得其相反表面暴露于所述UV灯至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟以获得经UV处理的制品。
4.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中将所述制品平放在无菌表面上，并暴露于至少100,000uW秒/cm2且至多800,000、700,000、600,000、500,000、400,000、300,000或200,000uW秒/cm2的UV-C剂量。
5.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中将所述制品平放在无菌表面上，并暴露于至少200,000uW秒/cm2且至多800,000、700,000、600,000、500,000、400,000或300,000uW秒/cm2的UV-C剂量。
6.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括将所述经UV处理的制品放置于预先灭菌的容器中，并且随后将所述容器的所有表面暴露于具有至少100uW/cm2的UV-C强度的UV灯下至少2分钟且至多15、12、10、8、6、5、4、3或2.5分钟，将所述无菌容器的先前灭菌的盖子的所有表面暴露于所述UV灯下至少2分钟，并且随后将所述盖子固定在所述无菌容器上。
7.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述处理步骤还包括以下中的至少一项：将所述生物制品放入含有一种或多种抗生素的抗微生物溶液中，诸如将所述生物制品放入含有一种或多种抗生素诸如氨苄西林/头孢他啶/万古霉素/两性霉素B的抗微生物溶液中；进行流式细胞术以确定细胞外表面聚糖表位的消除；使用冷冻保护介质包装进行冷冻保存。
8.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述存储步骤还包括冷冻保存所述制品，其中所述冷冻保存步骤包括控制速率的冷冻技术，所述控制速率的冷冻技术从约4℃开始且每分钟降低约1℃直到-40℃，随后在5分钟内使温度降低至约-80℃。
9.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述异种移植制品被确认不含一种或多种细胞外表面聚糖表位。
10.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物体通过剖腹产术(C-section)分娩。
11.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括向所述生物体施用一种或多种抗微生物剂和一种或多种疫苗。
12.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述一种或多种疫苗是灭活疫苗。
13.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括向所述生物体饲喂无菌水或纯净水以及不含有动物蛋白或基于牲畜的材料的基于谷类的饲料。
14.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括对所述生物体的垫层、笼子和饲料进行辐照灭菌。
15.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述减少生物负荷的程序还包括对所述封闭畜群进行空气过滤，化学灭菌用于安置或运输所述生物体的笼子和车辆，将所述生物体在氯己定中浸浴，将所述生物体在无菌盐水中浸浴，将所述生物体在抗真菌溶液中浸浴；或者组合条目1-15中任一条目所述的方法，所述方法还包括在所述饲养步骤之前对所述生物体筛选可检测水平的立克次体、支原体、可传播的海绵状脑病(TSE)和寄生虫。
16.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括以与所述生物体相同的方式饲养多个另外的生物体，并对所述另外的生物体进行定期的尸检、组织学和病理学检查以确认所述封闭畜仍然不含病原体和寄生虫。
17.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在所述收获步骤之前对所述生物体检疫至少两周，并对所述生物体筛选可检测水平的病原体。
18.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述检疫步骤还包括对所述生物体进行身体检查以及选自全血细胞计数、外周血涂片和针对寄生虫的粪便检查中的一项或多项测试。
19.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述收获步骤期间对所述生物体实施安乐死，并且所述方法还包括进行包括总体的尸检、组织病理学和微生物学的评估。
20.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在尸检时从所述生物体的脾、肝、骨髓、中枢神经系统和肺中的至少一种收集组织样品并将其冷冻保存。
21.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在所述收获步骤期间从所述生物体收集血浆和/或脑脊髓液。
22.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括测量所述生物制品中的细胞生存能力和选自由所述生物制品分泌或产生的细胞因子、激素和神经递质的生物活性分子中的至少一种。
23.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括将所述制品切割成所需的尺寸；将所述切割制品在抗病原体浴中浸浴；并且在将保存所述切割和浸浴的制品的温度下储存所述切割和浸浴的制品。
24.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括将所述制品施加到与所述制品具有至少相同的尺寸的支架上，将所述制品和所述支架卷起，将所述卷起的制品和支架放入无菌容器中，并且将所述容器储存在约10℃至约-80℃之间的温度下。
25.一种用于临床异种移植的生物制品，其来源于根据本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法生产的非野生型生物工程化猪，
其中来自所述猪的细胞已被遗传修饰，使得其表达已知人序列或所述生物制品的人接受者的主要组织相容性复合物。
26.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中所述基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
27.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中所述基因组还包含破坏的β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶基因。
28.如本文-28所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中所述基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
29.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括一个或多个内源性猪白细胞抗原等位基因与一个或多个人白细胞抗原等位基因的无痕交换。
30.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括来自已知人序列的对应人白细胞抗原核苷酸区域对在一个或多个内源性猪白细胞抗原中的长度为60-70个核苷酸的替换。
31.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中所述一个或多个同种型是DQ和DR。
32.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中来自所述猪的所述细胞已在I类HLA、MHCII、B细胞Fc受体、糖蛋白半乳糖基转移酶1,3(GGTA1)、NOD样受体家族含CARD结构域的蛋白5(NLRC5)和免疫球蛋白G(IgG)中的一个或多个处进行遗传重新编程。
33.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中与来自所述非遗传修饰的对应猪的细胞相比，来自所述经遗传修饰的猪的细胞当与人外周血单核细胞(PBMC)共培养时诱导较低的细胞因子白介素6(IL-6)的产生和较低的CD8+ T细胞免疫反应，如通过体外混合的淋巴细胞反应测定所测量的。
34.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的生物制品，其中所述经遗传修饰的猪还包含在人中不表达的内源基因的降低的蛋白质表达和在人中表达的基因的增加的蛋白质表达。
35.一种组合制品，其包含来自人受试者的表皮自体移植物制品和如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品。
36.一种制备用于临床异种移植到人中的生物制品的方法，所述方法包括选择已知的人主要组织相容性复合物基因序列或对人接受者的主要组织相容性复合物基因进行测序；遗传修饰猪的细胞以将所述猪的主要组织相容性复合物基因序列的一部分替换成所述已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分，从而使得所述猪的细胞表达所述已知的人主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分；从表达所述已知的人主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分的所述猪中分离出一种或多种细胞、组织和/或器官，其中所述分离的细胞、组织和/或器官是所述生物制品。
37.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述遗传修饰步骤包括制备模板主要组织相容性复合物序列，制备CRISPR-Cas9质粒，将模板主要组织相容性复合物序列克隆到所述质粒中，确定在所述猪细胞中的所述主要组织相容性复合物基因座处的CRISPR切割位点，将gRNA序列克隆到一个或多个CRISPR-Cas9质粒中，将CRISPR-Cas9质粒施用到猪的细胞中，在所述猪细胞的所述主要组织相容性复合物基因座处进行CRIPSR/Cas9切割，将所述猪细胞中的所述主要组织相容性复合物基因座替换成与所述已知的人主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分相匹配的一个或多个模板主要组织相容性复合物序列。
38.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在进行所述主要组织相容性复合物替换步骤之后对所述猪的细胞进行测序，并将所述猪的主要组织相容性复合物基因的序列与所述已知的人序列或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因进行比较，并且如果所述猪细胞中的所述主要组织相容性复合物序列已被成功替换，则从表达所述已知人序列或所述人接受者的主要组织相容性复合物的猪中分离出一种或多种细胞、组织和/或器官以制备所述生物制品。
39.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括将来自所述主要组织相容性复合物序列替换的猪的所述生物制品移植到所述人接受者中。
40.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括将主要组织相容性复合物序列替换的猪配种至少一代以获得后代猪，并且然后从表达所述已知的人序列或所述人接受者的主要组织相容性复合物的所述后代猪中分离出一种或多种细胞、组织和/或器官，其中所述分离的细胞、组织和/或器官是所述生物制品。
41.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述猪的基因组包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
42.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述猪的基因组包含破坏的β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶基因。
43.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
44.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括一个或多个内源性猪白细胞抗原等位基因与一个或多个人白细胞抗原等位基因的无痕交换。
45.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括来自已知人序列的对应人白细胞抗原核苷酸区域对在一个或多个内源性猪白细胞抗原中的长度为60-70个核苷酸的替换。
46.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述已知人序列的所述人白细胞抗原核苷酸区域是DQ和DR中的一者或多者，优选DQβ和DRβ中的一者或多者。
47.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述猪的所述细胞已在I类HLA、MHCII、B细胞Fc受体、糖蛋白半乳糖基转移酶1,3(GGTA1)、NOD样受体家族含CARD结构域的蛋白5(NLRC5)和免疫球蛋白G(IgG)中的一个或多个处进行遗传重新编程。
48.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中与来自所述非遗传修饰的对应猪的细胞相比，来自所述经遗传修饰的猪的细胞当与人外周血单核细胞(PBMC)共培养时诱导较低的细胞因子白介素6(IL-6)的产生和较低的CD8+ T细胞免疫反应，如通过体外混合的淋巴细胞反应测定所测量的。
49.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述经遗传修饰的猪还包含在人中不表达的内源基因的降低的蛋白质表达和在人中表达的基因的增加的蛋白质表达。
50.一种遗传重新编程的猪，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组具有一种或多种破坏的表面聚糖，例如α-1,3半乳糖基转移酶基因，并且被遗传修饰使得其表达从所述遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官的已知人序列或人接受者的主要组织相容性复合物的一部分，并且任选地根据本文所公开的任一条目或条目组合被进一步修饰。
51.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中所述遗传重新编程的猪的基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
52.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中所述遗传重新编程的猪的基因组还包含破坏的β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶基因。
53.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其包含具有至少两个SLA基因缺失和来自HLA基因的对应部分的至少两个HLA基因插入的核基因组，其中所述HLA基因来自所述已知人序列或所述人接受者、来自给定人口群体的共有序列、或来自文库序列。
54.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中所述基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
55.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括一个或多个内源性猪白细胞抗原等位基因与一个或多个人白细胞抗原等位基因的无痕交换。
56.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括来自已知人序列的对应人白细胞抗原核苷酸区域对在一个或多个内源性猪白细胞抗原中的长度为60-70个核苷酸的替换。
57.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中来自所述已知人序列的所述人白细胞抗原核苷酸区域是DQ和DR中的一者或多者，优选DQβ和DRβ中的一者或多者。
58.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的经遗传重新编程的猪，其中来自所述猪的所述细胞已在I类HLA、MHCII、B细胞Fc受体、糖蛋白半乳糖基转移酶1,3(GGTA1)、NOD样受体家族含CARD结构域的蛋白5(NLRC5)和免疫球蛋白G(IgG)中的一个或多个处进行遗传重新编程。
59.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中与来自所述非遗传修饰的对应猪的细胞相比，来自所述经遗传修饰的猪的细胞当与人外周血单核细胞(PBMC)共培养时诱导较低的细胞因子白介素6(IL-6)的产生和较低的CD8+ T细胞免疫反应，如通过体外混合的淋巴细胞反应测定所测量的。
60.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的遗传重新编程的猪，其中所述经遗传修饰的猪还包含在人中不表达的内源基因的降低的蛋白质表达和在人中表达的基因的增加的蛋白质表达。
61.一种制备遗传重新编程的猪的方法，所述遗传重新编程的猪包含如下核基因组，所述核基因组具有一种或多种破坏的表面聚糖例如α-1,3半乳糖基转移酶基因并且被遗传修饰使得其表达从所述遗传重新编程的猪中分离的细胞、组织和/或器官的已知的人序列或人接受者的主要组织相容性复合物，所述方法包括选择已知的人主要组织相容性复合物序列或对所述人接受者的主要组织相容性复合物基因进行测序，获得包含具有至少一个破坏的猪表面聚糖基因的核基因组的猪，遗传修饰所述猪的细胞以将所述猪的主要组织相容性复合物基因的部分替换成所述已知的人主要组织相容性复合物基因的对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因的对应部分，使得所述猪的细胞表达所述人接受者的主要组织相容性复合物的部分。
62.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述遗传重新编程的猪的基因组还包含编码β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶的破坏的基因。
63.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述遗传重新编程的猪包含具有至少两个SLA基因缺失和至少两个HLA基因插入的核基因组，其中所述HLA基因来自所述人接受者、来自给定人口群体的共有序列、或来自文库序列。
64.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
65.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述遗传重新编程的猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括一个或多个内源性猪白细胞抗原等位基因与一个或多个人白细胞抗原等位基因的无痕交换。
66.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述遗传重新编程的猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括来自已知人序列的对应人白细胞抗原核苷酸区域对在一个或多个内源性猪白细胞抗原核苷酸区域中的长度为60-70个核苷酸的替换。
67.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述已知人序列的所述人白细胞抗原核苷酸区域是DQ和DR中的一者或多者，优选DQβ和DRβ中的一者或多者。
68.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述猪的所述细胞已在I类HLA、MHCII、B细胞Fc受体、糖蛋白半乳糖基转移酶1,3(GGTA1)、NOD样受体家族含CARD结构域的蛋白5(NLRC5)和免疫球蛋白G(IgG)中的一个或多个处进行遗传重新编程。
69.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中与来自所述非遗传修饰的对应猪的细胞相比，来自所述经遗传修饰的猪的细胞当与人外周血单核细胞(PBMC)共培养时诱导较低的细胞因子白介素6(IL-6)的产生和较低的CD8+ T细胞免疫反应，如通过体外混合的淋巴细胞反应测定所测量的。
70.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述经遗传修饰的猪还包含在人中不表达的内源基因的降低的蛋白质表达和在人中表达的基因的增加的蛋白质表达。
71.一种延迟、减少或防止人接受者中对异种移植组织的排斥、分离或不良反应的方法，所述方法包括选择已知的人主要组织相容性复合物基因序列或对所述人接受者的主要组织相容性复合物基因进行测序；获得包含具有破坏的α-1,3半乳糖基转移酶基因的核基因组的猪；遗传修饰所述猪的细胞以将所述猪的主要组织相容性复合物基因的一部分替换成所述已知的人主要组织相容性复合物基因序列的对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的对应部分，使得所述猪的细胞表达所述已知的人主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分；从表达所述已知的人主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分或所述人接受者的主要组织相容性复合物基因序列的所述对应部分的所述遗传重新编程的猪中分离出细胞、组织和/或器官；以及将来自所述遗传重新编程的猪的所述分离的细胞、组织和/或器官移植到所述人接受者中。
72.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述遗传重新编程的猪的基因组还包含破坏的β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶基因。
73.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
74.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括一个或多个内源性猪白细胞抗原等位基因与一个或多个人白细胞抗原等位基因的无痕交换。
75.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述猪的所述细胞具有如下基因组，所述基因组包括来自已知人序列的对应人白细胞抗原核苷酸区域对在一个或多个内源性猪白细胞抗原中的长度为60-70个核苷酸的替换。
76.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述已知人序列的所述人白细胞抗原核苷酸区域是DQ和DR中的一者或多者，优选DQβ和DRβ中的一者或多者。
77.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中来自所述猪的所述细胞已在I类HLA、MHCII、B细胞Fc受体、糖蛋白半乳糖基转移酶1,3(GGTA1)、NOD样受体家族含CARD结构域的蛋白5(NLRC5)和免疫球蛋白G(IgG)中的一个或多个处进行遗传重新编程。
78.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中与来自所述非遗传修饰的对应猪的细胞相比，来自所述经遗传修饰的猪的细胞当与人外周血单核细胞(PBMC)共培养时诱导较低的细胞因子白介素6(IL-6)的产生和较低的CD8+T细胞免疫反应，如通过体外混合的淋巴细胞反应测定所测量的。
79.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述经遗传修饰的猪还包含在人中不表达的内源基因的降低的蛋白质表达和在人中表达的基因的增加的蛋白质表达。
80.一种来源于非野生型生物工程化的非人生物体的用于临床异种移植的生物制品，
其中所述生物制品从其来源的所述生物体通过自然配种和/或辅助生殖技术产生，并且
其中所述生物体具有生物工程化的基因组，使得其不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位，并且
其中所述生物体不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，
其中所述生物体不是转基因的，
其中所述制品不含有一种或多种细胞外表面聚糖，
其中所述制品不含：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、伪狂犬病、弓形虫、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，
其中尚未对所述制品进行最终灭菌，
其中与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品具有较低的免疫原性，
其中如与从由常规Gal-T敲除猪、由常规三重敲除猪、由转基因猪、由野生型动物制成的异种移植制品、和/或同种异体移植物获得的生物制品相比，所述制品当移植到人异种移植接受者中时具有较低的抗原性，并且
其中所述制品是有生物活性的，并包含在异种移植之后能够形成血管的活细胞和组织。
81.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述制品在没有向人异种移植接受者施用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法的情况下抵抗所述移植接受者的排斥。
82.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述制品包括器官或组织。
83.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述器官包括肝、肺、肾或皮肤。
84.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述组织包括神经。
85.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述器官在所述异种移植之后能够在所述患者的移植区域中形成血管。
86.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述皮肤在所述异种移植之后能够在所述患者的移植区域中促进胶原产生。
87.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述生物体具有如下基因组，所述基因组具有至少一个进一步破坏的基因，所述至少一个进一步破坏的基因选自编码以下的基因：胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)、β1-4N-乙酰半乳糖氨基转移酶、猪白细胞抗原、α-1,2-岩藻糖基转移酶、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原、肿瘤坏死因子α相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、Fas配体(Fas L)、CD55、CD59和CD46。
88.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述生物体具有如下基因组，所述基因组具有至少一个另外的修饰以表达选自以下的至少一种蛋白质：人白细胞抗原MHC I型；MHC II型；hCD46-人膜辅因子蛋白(MCP)；与Ig重链融合的hCTLA4-Ig-人细胞毒性T-鼠淋巴细胞抗原4；hCD55-人衰变加速因子(DAF)；hCD59-人保护素；H-转移酶；hTM-人血栓调节蛋白；hA20肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导基因；HLA-E/β微球蛋白；人血红素加氧酶1(hHO-1)。
89.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述制品是有生物活性的，并且包含在-40℃或以下的温度下冷冻保存至少一年之后能够形成血管的活细胞和组织。
90.如本文所公开的任一条目或条目组合所述的制品，其中所述制品不含以下中的至少两种：蛔虫属种、隐孢子虫属、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、弓形虫、猪甲型流感病毒、支气管脓毒症博德特菌、葡萄球菌属、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、腺病毒、虫媒病毒、牛病毒性腹泻病毒、杯状病毒、心病毒、圆环病毒2、圆环病毒1、脑心肌炎病毒、附红细胞体、猪嗜血杆菌、疱疹病毒和疱疹相关病毒、虹膜病毒、嵴病毒、钩端螺菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、支原体、正粘病毒、papovirus、副流感病毒3、副粘病毒、细小病毒、pasavirus-1、瘟病毒、细小双节RNA病毒(PBV)、微小核糖核酸病毒、猪圆环病毒样病毒、猪星状病毒、猪bacovirus、猪博卡病毒2、猪博卡病毒4、猪肠病毒9、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪脊髓灰质炎病毒、猪嗜淋巴细胞疱疹病毒(PLHV)、猪粪便相关环状病毒(PoSCV)、posavirus-1、天花病毒、狂犬病相关病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、立克次体、萨佩罗病毒、札幌病毒、猪葡萄球菌、猪痘病毒、捷申病病毒、环曲病毒、猪细环病毒2(TTSuV-2)、可传播的胃肠炎病毒、水疱性口炎病毒、和朊病毒。
91.一种生产第二代非野生型生物工程化仔猪的方法，所述方法包括：
通过剖腹产术从怀孕的母猪分娩非野生型生物工程化仔猪，其中所述母猪通过自然配种和/或辅助生殖技术生产，并且
将所述分娩的仔猪保持在隔离的封闭畜群中，其中在所述隔离的封闭畜群中的所有其他猪均被确认不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，并且其中所述仔猪不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒；
将所述仔猪饲养在所述隔离的封闭畜群中；
在性成熟时使所述仔猪与也维持在所述隔离的封闭畜群中且不含所述病原体的另一只猪交配；并且
分娩由所述交配产生的新仔猪，其中所述新仔猪是也不含所述病原体的第二代非野生型生物工程化仔猪。
92.一种猪，所述猪通过条目91或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法生产。
93.如条目92或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括从所述新仔猪收获生物制品。
94.如条目93或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述制品包括器官或组织。
95.如条目94或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述器官包括肝、肺、肾或皮肤。
96.如条目95或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述组织包括神经。
97.如条目92或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述非野生型生物工程化仔猪具有如下基因组，所述基因组具有破坏的α-1,3半乳糖基转移酶基因。
98.如条目92和94-98中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述第二代非野生型生物工程化仔猪具有如下基因组，所述基因组具有至少一个进一步破坏的基因，所述至少一个进一步破坏的基因选自编码以下的基因：胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)、β1-4N-乙酰半乳糖氨基转移酶、猪白细胞抗原、α-1,2-岩藻糖基转移酶、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原、肿瘤坏死因子α相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、Fas配体(Fas L)、CD55、CD59和CD46。
99.如条目92和94-99中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述第二代非野生型生物工程化仔猪具有如下基因组，所述基因组具有至少一个另外的修饰以表达选自以下的至少一种蛋白质：人白细胞抗原MHC I型；MHC II型；hCD46-人膜辅因子蛋白(MCP)；与Ig重链融合的hCTLA4-Ig-人细胞毒性T-鼠淋巴细胞抗原4；hCD55-人衰变加速因子(DAF)；hCD59-人保护素；H-转移酶；hTM-人血栓调节蛋白；hA20肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导基因；HLA-E/β微球蛋白；人血红素加氧酶1(hHO-1)。
100.如条目92和94-100中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在每个所述分娩步骤之后，将所述非野生型生物工程化仔猪和所述第二代非野生型生物工程化仔猪中的每一者放置于温热的灭菌剂溶液浴中。
101.如条目92和94-101中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中将所述非野生型生物工程化仔猪和所述第二代非野生型生物工程化仔猪维持在封闭畜群中使得所述非野生型生物工程化仔猪、所述第二代非野生型生物工程化仔猪和人护理人员被检疫免于与所述封闭畜群之外的任何猪和猪安置设施接触。
102.如条目92和94-102中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括向所述非野生型生物工程化仔猪和所述第二代非野生型生物工程化仔猪施用一种或多种抗微生物剂和一种或多种疫苗。
103.如条目92和94-103中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括：对所述非野生型生物工程化仔猪和所述第二代非野生型生物工程化仔猪的垫层和饲料进行辐照灭菌。
104.如条目92和94-104中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括所述非野生型生物工程化仔猪和所述第二代非野生型生物工程化仔猪具有无菌水或纯净水以及不含有动物蛋白或基于牲畜的材料的基于基于谷类的饲料。
105.一种治疗已经遭受需要皮肤移植物的损伤的人受试者的方法，所述方法包括将来自第二代非野生型生物工程化仔猪的皮肤移植物移植到所述受试者中，其中所述第二代非野生型生物工程化仔猪通过条目92或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法来生产，其中所述皮肤移植物不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，其中未向所述受试者施用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法。
106.如条目106或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在检测到所述皮肤移植物的一种或多种临床排斥体征之后，监测所述皮肤移植物的临床排斥体征，去除所述皮肤移植物并将其替换成同种异体皮肤移植物或自体皮肤移植物。
107.如条目107或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述一种或多种临床排斥体征选自：缺乏或丧失血管形成；坍陷；白色；与正常皮肤相比颜色较深或变苍白；与正常皮肤相比温度更低；肉芽形成；痂皮或结痂形成；出脓；以及柔韧性丧失或降低。
108.如条目106-108中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述损伤是部分厚度伤口或全层厚度伤口。
109.如条目106-108中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述损伤包括烧伤；撕脱皮肤；糖尿病性伤口和/或静脉淤滞性溃疡。
110.一种治疗需要功能性肝的受试者的方法，所述方法包括：获得来源于根据条目92和94-105中任一条目制备的仔猪或根据条目37-50中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合制备的猪的肝，在所述受试者和所述肝之间产生体外回路，使得来自所述受试者的血液能够流过所述肝并流回所述受试者；并允许血液经由体外回路从所述受试者流过所述肝并流回所述受试者。
111.一种用于临床异种移植的未分化细胞，其来源于根据条目92和94-105中任一条目制备的仔猪或根据条目37-50中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合制备的猪，其中所述细胞能够在再生疗法中使用以产生器官或生物组织。
112.一种将制品异种移植到人患者中的方法，所述方法包括：
获得条目1所述的生物制品；并且
将所述制品移植到人接受者中，其中在所述移植后，所述制品表现出临床益处。
113.如条目113或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述制品包括器官或组织。
114.如条目114或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述器官包括肝、肺、肾或皮肤。
115.如条目115或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述组织包括神经。
116.如条目113-116中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述移植步骤在不存在免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法的情况下进行。
117.如条目115或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述器官是皮肤，并且所述方法还包括在所述移植步骤之前清创移植部位。
118.如条目115或条目118或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述异种移植之后，所述皮肤在所述患者的移植区域中形成血管。
119.如条目115和118-119中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述皮肤在所述异种移植后在所述患者中的移植区域中产生胶原。
120.如条目113-120中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述临床益处与同种异体移植物制品相比得以增强，其中与所述同种异体移植物制品相比的临床益处是以下中的一项或多项：移植物脱位减少；移植物附着增加；与周围组织水平上的肉芽形成；少于20％的过度肉芽形成；血肿少于伤口大小的20％；以及纤维蛋白沉积少于伤口大小的20％；与同种异体移植物相比细菌感染减少；止血增加；诱导转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)中的至少一种的表达；增加人成纤维细胞、人表皮角质形成细胞、人内皮细胞和人多能干细胞中的至少一种的吸引力和/或增殖；抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8和MMP-9中的至少一种；治疗、减少或抑制高血糖症、神经病、血管病变、感染、纤维蛋白袖(fibrin cuff)和/或静脉高血压中的至少一种；蜂窝组织炎减少；红斑减少；水肿减少；感觉过敏减少；硬结减少；压痛减少；瘙痒减少；脓肿减少；中毒性休克综合征的发生率降低；产生毒素1的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的定殖减少；脓毒症的发生率降低；以及大肠杆菌(E.coli)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)种、普罗威登斯菌属(Providencia)种、肠杆菌科(enterobacteriaceae)和白色念珠菌(C.albicans)的定殖减少。
121.如条目113-121中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物制品从其来源的所述生物体是通过自然配种和/或辅助生殖技术产生的。
122.如条目113-122中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述非人生物体被遗传修饰以破坏选自编码以下的基因的至少一种进一步破坏的基因：胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)、β1-4N-乙酰半乳糖氨基转移酶、猪白细胞抗原、α-1,2-岩藻糖基转移酶、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原、肿瘤坏死因子α相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、Fas配体(Fas L)、CD55、CD59和CD46。
123.如条目113-123中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述非人生物体具有如下基因组，所述基因组具有至少一个另外的修饰以表达选自以下的至少一种蛋白质：人白细胞抗原MHC I型；MHC II型；hCD46-人膜辅因子蛋白(MCP)；与Ig重链融合的hCTLA4-Ig-人细胞毒性T-鼠淋巴细胞抗原4；hCD55-人衰变加速因子(DAF)；hCD59-人保护素；H-转移酶；hTM-人血栓调节蛋白；hA20肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导基因；HLA-E/β微球蛋白；人血红素加氧酶1(hHO-1)。
124.如条目113-124中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述临床益处包括形成闭塞性纤维蛋白密封，减少或防止在移植部位或愈合部位的感染，增加或保留在所述移植部位或所述愈合部位的流体，增加或保留在所述移植部位或所述愈合部位的电解质，增加或保留在所述移植部位或所述愈合部位的温度体内平衡，减少在所述移植部位或所述愈合部位的瘢痕形成，减少或消除脓毒症，减少或消除蛋白质损失，恢复身体功能，或其组合。
125.如条目113-125中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在没有向所述人接受者施用免疫抑制剂药物或其他免疫抑制剂疗法的情况下，所述移植制品对所述人接受者的排斥具有抗性。
126.如条目113-126中任一条目或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括执行脚趾血压读数、脉搏体积记录、经皮氧气测量和皮肤灌注压力测量中的一者或多者，或者还包括在所述移植步骤之后，用压缩疗法、真空辅助闭合(VAC)、卸载、负压、高压氧气疗法或它们的组合来治疗所述人接受者。
127.一种生产用于异种移植到人接受者中的生物制品的方法，所述生物制品包括在异种移植后形成血管的活细胞和组织，
所述方法包括：
A)生产非野生型生物工程化猪，其中所述猪具有生物工程化基因组，使得其不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位，
B)确认所述猪不含至少以下人畜共患病原体：
(i)粪便物质中的蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫和弓形虫；
(ii)通过抗体滴度确定的钩端螺旋体属(Leptospira)种、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病、可传播的胃肠炎病毒(TGE)/猪呼吸道冠状病毒、和弓形虫(Toxoplasma Gondii)；
(iii)猪流感；
(iv)通过细菌培养确定的以下细菌病原体：支气管脓毒症博德特菌、凝固酶阳性葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、牲畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(LA MRSA)、亮毛杜鹃和毛癣菌属种；
(v)猪巨细胞病毒；和
(vi)猪布鲁氏菌；
C)根据减少生物负荷的程序来维持所述猪，所述程序包括将所述猪维持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他动物均不含所述人畜共患病原体，其中所述猪被隔离免于与在所述隔离的封闭畜群之外的任何非人动物和动物安置设施接触；
D)从所述猪中收获生物制品，其中所述收获包括对所述猪实施安乐死并从所述猪中无菌地去除所述生物制品；
E)在收获后使用不会如由3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定所测定将细胞生存能力降低至小于50％细胞生存能力的灭菌过程对所述生物制品进行处理，包括灭菌；并且
F)在保存细胞生存能力的存储条件下将所述生物制品储存在无菌容器中。
128.如条目127或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法不包括对所述生物制品进行最终灭菌，其中所述生物制品不含蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
129.如条目127或条目128或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在步骤F)之前，所述方法还包括通过以下步骤测试所述处理过的生物制品：
a.进行无菌测定并确认需氧和厌氧细菌在所述无菌测定中不生长，
b.进行支原体测定并确认支原体集落在所述支原体测定中不生长，
c.进行内毒素测定并确认所述生物制品在所述内毒素测定中不含内毒素，
d.进行MTT还原测定，并确认所述制品在所述MTT还原测定中具有至少50％的细胞生存能力，
e.进行流式细胞术，并确认所述制品如通过所述流式细胞术确定的不具有半乳糖基-a-1,3-半乳糖表位，
f.进行对18至35种病原体具有特异性的病原体检测测定，并确认所述制品不含蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
130.如条目127-129中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物制品不含两种或更多种类型的细胞外表面聚糖表位，如通过流式细胞术所确认的。
131.如条目127-130中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物制品不含α-1,3-半乳糖基转移酶表位和N-羟乙酰神经氨酸表位，如通过流式细胞术所确认的。
132.如条目127-131中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物制品不含α-1,3-半乳糖基转移酶表位、N-羟乙酰神经氨酸表位和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶表位，如通过流式细胞术所确认的。
133.如条目127-132中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述猪通过亲本猪的自然交配生产，所述亲本猪也维持在所述隔离的封闭畜群中并且不含以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，并且其中所述猪通过阴道活产分娩。
134.如条目127-133中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述阴道活产后，所述猪由一个或多个人来人工饲养。
135.如条目127-134中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括以与所述猪相同的方式饲养多头另外的猪，并对所述另外的猪进行定期的尸检、组织学和病理学检查以确认所述封闭畜群仍然不含蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
136.如条目127-135中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括向所述猪饲喂无菌或纯净水以及不含有动物蛋白或基于牲畜的材料的基于谷类的饲料，以及对所述猪的垫层、笼子和饲料进行辐照灭菌。
137.如条目127-136中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在所述收获步骤之后进行包括总体的尸检、组织病理学和微生物学的评估，并在尸检时收集和冷冻保存来自所述猪的脾、肝、骨髓、中枢神经系统和肺中的至少一种的组织样品。
138.如条目127-137中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物工程化基因组还包含破坏的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因。
139.如条目127-138中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物工程化基因组还包含破坏的β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶基因。
140.如条目127-139中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物工程化基因组还包含一个或多个内源性猪白细胞抗原等位基因与一个或多个人白细胞抗原等位基因的无痕交换。
141.如条目127-140中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物工程化基因组还包含对应人白细胞抗原核苷酸区域对在一个或多个内源性猪白细胞抗原中的长度为50-70个核苷酸的替换。
142.如条目127-141中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述对应的人白细胞抗原核苷酸区域是DQβ与HLA-E、HLA-G或HLA-E和HLA-G两者的组合。
143.如条目127-142中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物工程化的基因组已在I类人白细胞抗原(HLA)、主要组织相容性复合物(MHC)II、B细胞Fc受体、糖蛋白半乳糖基转移酶1,3(GGTA1)、NOD样受体家族含CARD结构域的蛋白5(NLRC5)和免疫球蛋白G(IgG)中的一个或多个处进行遗传重新编程。
144.如条目127-143中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中与来自所述非遗传修饰的对应猪的细胞相比，所述生物制品当与人外周血单核细胞(PBMC)共培养时诱导降低的细胞因子白介素6(IL-6)的产生和较低的CD8+T细胞免疫反应，如通过体外混合淋巴细胞反应测定所测量的。
145.如条目127-144中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述生物工程化基因组包含具有猪白细胞抗原(SLA)缺失和HLA插入的核基因组，其中所述HLA基因来自所述人接受者，来自给定人口群体的共有序列或来自文库序列。
146.如条目127-145中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括通过以下方式来生物重新编程所述猪的基因组：制备模板主要组织相容性复合物序列，制备CRISPR-Cas9质粒，将模板主要组织相容性复合物序列克隆到所述质粒中，确定在所述猪细胞中的所述主要组织相容性复合物基因座处的CRISPR切割位点，将gRNA序列克隆到一个或多个CRISPR-Cas9质粒中，将CRISPR-Cas9质粒施用到所述猪的细胞中，在所述猪细胞的所述主要组织相容性复合物基因座处进行CRIPSR/Cas9切割，将所述猪细胞中的所述主要组织相容性复合物基因座替换成来自人模板主要组织相容性复合物序列的一个或多个模板主要组织相容性复合物序列。
147.如条目127-146中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，所述方法还包括在步骤A)之前，
a.从所述封闭畜群外的附有健康记录、纯种系谱和基因测试结果的多于一头猪中获得候选猪群，并将来自所述封闭畜群外的多于一头猪安置在检疫纳入区域中持续至少7天，并且其中在候选猪群中的猪是非野生型生物工程化猪，所述非野生型生物工程化猪具有生物工程化基因组使得它们不表达一种或多种细胞外表面聚糖表位，
b.筛选来自所述封闭畜群外的所述多于一头猪的感染情况，以鉴定应从所述候选猪群中去除的任何猪，
c.从所述候选猪群中去除任何已鉴定的猪，以形成经过筛选的候选猪群，
d.将所述经过筛选的候选猪群移到保持的保持区域中，其中所述猪被隔离免于与所述保持区域外的任何非人动物和动物安置设施接触，
e.在所述保持区域中将所述经过筛选的候选猪进行交配，
f.通过剖腹产术从怀孕的母猪分娩非野生型生物工程化仔猪，其中所述母猪通过自然配种和/或辅助生殖技术生产，并且
g.将所述分娩的仔猪保持在隔离的封闭畜群中，其中已确认在所述隔离的封闭畜群中的所有其他猪均不含至少以下病原体：巨细胞病毒、动脉炎病毒和冠状病毒，并且其中所述仔猪不含至少以下病原体：蛔虫属种、隐孢子虫属种、棘球属、粪类圆线虫、弓形虫、猪布鲁氏菌、钩端螺旋体属种、猪肺炎支原体、猪生殖和呼吸综合征病毒、伪狂犬病、葡萄球菌属种、亮毛杜鹃属种、毛癣菌属种、猪流感、猪巨细胞病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、支气管脓毒症博德特菌和家畜相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，
并且然后执行条目127所述的步骤A)。
148.如条目127-147中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述仔猪具有基因组，所述基因组包含破坏的：(i)α-1,3半乳糖基转移酶基因；(ii)胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因；(iii)β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶基因；(i)和(ii)；(i)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)。
149.如条目127-148中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述灭菌过程不包括对所述生物制品进行最终灭菌，并且其中所述灭菌过程包括将所述收获的生物制品暴露于UV-C辐照和将所述收获的生物制品在抗病原体浴中浸浴中的至少一者。
150.一种将制品异种移植到异种移植接受者中的方法，所述方法包括：
获得通过任何前述条目所述的方法生产的生物制品；
将所述生物制品移植到异种移植接受者中；
监测所述接受者的以下至少一项：
a.所述生物制品的血管形成；
b.对所述生物制品的排斥；
c.免疫原性生物标志物的增加；并且
其中在所述移植后，所述生物制品在所述异种移植接受者中表现出临床益处。
151.如条目150或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述移植步骤在不存在免疫抑制剂的情况下进行。
152.如条目150或条目151或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中所述临床益处与同种异体移植物制品相比得以增强，其中与所述同种异体移植物制品相比的所述临床益处为以下中的一项或多项：移植物脱位减少；移植物附着增加；与周围组织水平上的肉芽形成；少于20％的过度肉芽形成；血肿少于伤口大小的20％；以及纤维蛋白沉积少于伤口大小的20％；与同种异体移植物相比细菌感染减少；止血增加；诱导转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)中的至少一种的表达；增加人成纤维细胞、人表皮角质形成细胞、人内皮细胞和人多能干细胞中的至少一种的吸引力和/或增殖；抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8和MMP-9中的至少一种；治疗、减少或抑制高血糖症、神经病、血管病变、感染、纤维蛋白阻塞和/或静脉高血压中的至少一种；蜂窝组织炎减少；红斑减少；水肿减少；感觉过敏减少；硬结减少；压痛减少；瘙痒减少；脓肿减少；中毒性休克综合征的发生率降低；产生毒素1的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的定殖减少；脓毒症的发生率降低；以及大肠杆菌(E.coli)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)种、普罗威登斯菌属(Providencia)种、肠杆菌科(enterobacteriaceae)和白色念珠菌(C.albicans)的定殖减少。
153.如条目150-152中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述移植步骤之后，所述异种移植接受者具有1,000至20,000μg/ml的血清IgM和IgG水平。
154.如条目150-153中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述移植步骤之后，所述异种移植接受者具有1,000至5,000μg/ml的血清IgM水平。
155.如条目150-154中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述移植步骤之后，所述异种移植接受者具有8,000至15,000μg/ml的血清IgG水平。
156.如条目150-155中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述移植步骤之后，所述异种移植接受者具有低于在移植之前测量的血清IgM和IgG水平或比在移植之前测量的血清IgM和IgG水平高小于10％的血清IgM和IgG水平。
157.如条目150-156中任一条目或组合或本文所公开的任一条目或条目组合所述的方法，其中在所述移植步骤之后，所述异种移植接受者具有比在移植之前测量的所述异种移植接受者的血清IgM水平低20％至50％的血清IgM水平。
158.如任何前述条目所述的方法或制品，其中所述制品具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的线粒体活性。
159.如任何前述条目所述的方法或制品，其中所述制品在3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原测定中具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的细胞生存能力。
160.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码糖表面聚糖和MHC I的基因被敲除。
161.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC II类DP、DQ和DRα的基因被敲除。
162.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC II类DP、DQ和DRα的基因被敲除，并且DRβ被替换成人DRβ基因序列。
163.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC II类DQ、DR和DPα的基因被敲除。
164.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC II类DQ、DR和DPβ的基因被敲除，并且DPα被替换成人DPβ基因序列。
165.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC II类DR、DP和DQα的基因被敲除。
166.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC II类DR、DP和DQα的基因被敲除，并且DQβ被替换成人DQβ基因序列。
167.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，并且编码MHC II类DQα和DQβ的基因被敲除，并且DRα和DRβ被替换成人DRα和DRβ基因序列。
168.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，并且编码MHC II类DRα和DRβ的基因被敲除，并且DQα和DQβ被替换成人DQα和DQβ基因序列。
169.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，编码HLA-A的基因被敲入，并且编码MHC II类DQα和DQβ的基因被敲除，并且DRα和DRβ被替换成人DRα和DRβ基因序列。
170.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，编码HLA-A的基因被敲入，并且编码MHC II类DRα和DRβ的基因被敲除，并且DQα和DQβ被替换成人DQα和DQβ基因序列。
171.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，编码HLA-B的基因被敲入，并且编码MHC II类DQα和DQβ的基因被敲除，并且DRα和DRβ被替换成人DRα和DRβ基因序列。
172.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，编码HLA-B的基因被敲入，并且编码MHC II类DRα和DRβ的基因被敲除，并且DQα和DQβ被替换成人DQα和DQβ基因序列。
173.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，编码HLA-A和HLA-B的基因被敲入，并且编码MHC II类DQα和DQβ的基因被敲除，并且DRα和DRβ被替换成人DRα和DRβ基因序列。
174.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，编码HLA-A和HLA-B的基因被敲入，并且编码MHC II类DRα和DRβ的基因被敲除，并且DQα和DQβ被替换成人DQα和DQβ基因序列。
175.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，并且编码HLA-A的基因被敲入。
176.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，并且编码HLA-B的基因被敲入。
177.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，并且编码HLA-C的基因被敲入。
178.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体动物例如猪具有经修饰的基因组，使得编码MHC I类的基因被敲除，编码HLA-A、HLA-B和HLA-C的基因被敲入，并且编码MHC II类DRα和DRβ的基因被替换成人DRα和DRβ基因序列，并且MHC II类DQα和DQβ被替换成人DQα和DQβ基因序列。
179.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体猪具有经修饰的基因组以敲除：与HLA-A、HLA-B、HLA-C和DR对应的猪基因，以及敲入：HLA-C；HLA-E；和HLA-G。
180.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体猪具有经修饰的基因组以敲除：与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入：HLA-C、HLA-E、HLA-G。
181.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述供体猪具有经修饰的基因组以敲除：与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入：HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。
182.如任何前述项目所述的方法、制品或猪，其中所述供体猪具有经修饰的基因组以敲除：SLA-11；SLA-6,7,8；SLA-MIC2；和SLA-DQA；SLA-DQB1；SLA-DQB2，以及敲入：HLA-C；HLA-E；HLA-G；和HLA-DQ。
183.如任何前述条目所述的方法、制品或猪，其中所述重新编程使用以下各项进行：RNA引导的成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)(CRISPR/Cas)核酸酶系统、CRISPR/Cas双切口酶系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、包含与核酸酶结构域连接的可编程DNA结合结构域的融合蛋白(即，产生双链DNA断裂)及其组合。
184.如任何前述条目所述的方法或制品，其中所述生物制品具有抗原性谱和免疫原性谱，使得其在没有向所述人接受者施用免疫抑制剂药物的情况下抵抗所述人接受者的免疫系统的排斥。
在下面的实施例中进一步详细地描述了本发明，提供所述实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1
DPF封闭群体皮肤移植物(猴子研究)
已经发现，根据本发明生产的来源于DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤移植物表现出比来源于α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪、但不是来源于DPF封闭群体猪的皮肤移植物显著更长的排斥时间。
在猴子上评估α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪(不是来源于DPF封闭群体)的排斥时间的许多先前研究表明，排斥时间在11-13天的范围内。参见例如，Albritton等人Lack of Cross-Sensitization Between alpha-1,3-Galactosyltransferase KnockoutPorcine and Allogeneic Skin Grafts Permits Serial Grafting,Transplantation第97卷，第12期，2014年6月27日(接受者狒狒的Gal-T-KO皮肤移植物在12或13天时被完全排斥)；Barone等人,Genetically modified porcine split-thickness skin grafts as analternative to allograft for provision of temporary wound coverage:preliminary characterization,Burns 41(2015)565-574(接受者狒狒的Gal-T-KO皮肤移植物在11天时被完全排斥)；以及Weiner等人,Prolonged survival of Gal-T-KO swineskin on baboons,Xenotransplantation,2010,17(2):147–152(狒狒的Gal-T-KO异种分层厚度皮肤移植物在11天时被完全排斥)。
在非临床研究中已经表明，本发明与其同种异体移植物比较物相比具有同等且令人惊讶地好的表现，而没有质量不一致、不靠性和可获得性有限的固有缺点。也就是说，令人惊讶地，至少第1号研究表明，根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤移植物的表现优于同种异体移植物。
申请人的两项最新研究(下文列出的第1号研究和第2号研究)证明，根据本发明生产的源自DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤移植物在研究2中在猴子上表现出显著更高的排斥时间，超过30天。本实施例中经基因工程化的源动物在基因组中不含有任何外来的、引入的DNA；所采用的遗传修饰仅是单个基因的敲除，所述单个基因负责编码引起细胞表面抗原普遍表达的酶。该实施例中的异种移植制品不结合转基因技术，诸如CD-46或CD-55转基因构建体。
第1号研究
这项研究评估了全层厚度皮肤病变实验模型中在食蟹猴(Macaca fascicularis)中将DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪异种移植制品材料与同种异体移植物相比作为在自体移植物放置之前的临时伤口移植物。
主要终点包括筛选在移植物和接受者中的猪内源性逆转录病毒(PERV)，以及评估异种移植制品和同种异体移植物排斥以及它们对最终自体移植物成活的潜在影响。次要终点包括尸检时收集的肾、脾、肝、肺移植物和伤口床组织的微生物学和组织病理学分析。
这项研究中招募了四(4)只食蟹猴。在第0天，在每只动物的背侧区域上产生测量大约为2-3cm x 2-3cm的四(4)个全层厚度伤口床。
最初，在第0天，用异种皮肤(异种移植制品)、分层厚度Gal-T转基因猪异种移植制品材料或同种异体皮肤(同种异体移植物)(分层厚度同种异体移植物材料)治疗伤口。
在研究的第15天，移除异种移植制品和同种异体移植物，并替换成分层厚度自体皮肤移植物(自体移植物)，此后动物存活到研究的第22天(垂死牺牲动物1001和1004除外)。
用异种移植制品或同种异体移植物治疗并在第12或15天移除(图9A)并存活直至第22天(图9B)的食蟹猴模型中全层厚度伤口床的显微镜评估表明，没有证据表明异种移植制品或同种异体移植物中任何一种引起急性组织排斥，当与同种异体移植物检品相比时用异种移植制品检品的总体性能相当至稍微更好，并且在用异种移植制品或同种异体移植物检品预处理后自体移植物的性能一般至良好。异种移植制品的显著存活时间促使进行了后续研究(第2号研究)。
第2号研究
这项研究的目的是评估DPF封闭群体、α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪异种移植制品材料在食蟹猴(macaca fascicularis)中的安全性和免疫原性。
主要终点包括在移植物放置之前和之后筛选猪内源性逆转录病毒(PERV)，以及评估异种移植制品的排斥。
这项研究中招募了四(4)只食蟹猴。在第0天在每只动物的背侧区域上产生两(2)个9cm2全层厚度伤口床。
用由真皮和表皮组织层组成的分层厚度Gal-T-敲除猪异种移植物材料治疗伤口。
在一些方面，根据本公开可以使用转基因动物。图8显示了在非人灵长类动物接受者中用作治疗全层厚度伤口缺损的临时伤口闭合的猪分层厚度皮肤移植物的纵向进展。左：POD-0，在伤口部位2处的异种移植物。右：POD-30，在伤口部位2处的相同异种移植物。图10显示了以下的POD-30组织学图像：顶部、中心：H&E，伤口部位的低倍图像描绘了完整的上皮覆盖。虚线圈住的是残留的异种移植物组织。底部，左侧：H&E，大插入框的高倍图像。虚线的右下方是异种移植物的真皮组分，其中异种移植物的真皮基质用空心箭头表示。虚线的左侧是宿主真皮(黑色箭头)和宿主真皮基质。存在轻度炎症，并将其解释为对异种移植物检品的反应。底部，右侧：H&E，小插入框的高倍图像。虚线粗略地表明了异种移植物检品(虚线下方)和新的胶原组织(虚线上方)之间的连接，图像顶端是完整上皮。观察到响应于异种移植物的轻度炎症(空心箭头)。
图11A绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgMELISA(μg/mL)。图11B绘制了研究过程期间所有四名受试者(2001、2002、2101、2102)的总血清IgG ELISA(μg/mL)。在一些方面，移植有本公开的制品的受试者将具有各自小于20,000μg/ml的血清IgM和IgG水平。在一些方面，移植有本公开的制品的受试者将具有比在移植之前测量的血清IgM和IgG水平高了低于或小于10％、5％、3％或1％的血清IgM和/或IgG水平。在一些方面，所要求保护的方法可以证明免疫反应发生率为移植有本公开的制品的受试者的小于5％、3％或1％。
图12A绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的可溶性CD40L的全身浓度。图12B绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的TGF-α的全身浓度。图12C绘制了在POD-0、POD-7、POD-14、POD-21和POD-30下通过Luminex 23-plex测量的IL-12/23(p40)的全身浓度。
在30或31天时将动物处死，对于睾丸和附睾，将伤口部位收集并固定在10％的中性缓冲福尔马林(NBF)或改良的戴维森氏溶液(Davidson’s Solution)中。应当注意，尽管由于研究设计并且出于比较目的而将动物在30或31天处死，但是本公开的异种移植制品能够抵抗比本实施例中使用的研究时间更长的排斥时间。
用异种移植物治疗并在第30或31天处死的食蟹猴模型中的全层厚度伤口床的显微镜评估表明，宿主和异种移植组织能够很好地填补伤口缺损。
通过专门的(猪特异性)聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶PCR(RT-PCR)测试样品，在指定的术后间隔分别进行猪内源性逆转录病毒(PERV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的筛选。评估猪异种移植物、接受者的裂解的PBMC、接受者的伤口床、以及尸检时来自接受者的高灌注器官中的猪细胞迁移的存在。所有测试均用DNA和RNA以及测定性能的内部对照一式三份进行。对肾、脾、肝、肺、异种移植物、同种异体移植物、尸检时收集的伤口床组织进行微生物学(细菌、真菌、病毒)测定和组织病理学分析，并进行外周血分析以测试异种移植物相关的免疫原性生物标志物。对以下样品进行DNA PCR来测试在用本公开的制品治疗的食蟹猴模型的PBMC中的猪细胞迁移：(A.)(3)个全层厚度(异种移植物)伤口床，(B)(3)个全层厚度(同种异体移植物)伤口床；(C)(2)个脾样品；(D)(2)个肾样品。没有证据表明细胞向宿主的全身性迁移或人畜共患传播。如用猪MHC对照所确认，PERV的存在归因于伤口床中残留的猪细胞。我们的结果表明，猪DNA和细胞没有从移植物迁移到移植物接受者的循环中，同样，PERV或感染PERV的猪细胞也没有迁移通过伤口床。
下表5显示了对猪细胞迁移和传播的分析：
表5
表5的关键：
阴性(-)＝阴性
阳性(+)＝阳性
*＝由于不相关的、研究设计相关的后勤或保存问题而无法进行的测试或不可接受的样品
阳性(+)A对NHP 1004(PERV阳性)的伤口床进行了共培养研究，以确定在移植物与接受者(宿主)之间的界面上存在的检测到的病毒是否可能感染获准的人细胞。
在培养23天之后，异种移植物和接受者伤口床细胞与用于PERV感染和复制的获准的人细胞进行共培养未证明在靶细胞(HEK293)中有效的感染。
实施例2
以下实施例提供了从根据本发明生产的无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪中收获和处理皮肤的过程的描述，所述皮肤将用作用于人移植的异种皮肤制品。在一些这些方面中，异种移植制品由分层厚度移植物组成，所述分层厚度移植物由含有来源于专门的基因工程化的无指定病原体(DPF)源动物(α1,3半乳糖基转移酶敲除[Gal-T-KO]小型猪)的活的非最终灭菌的猪细胞的真皮和表皮组织层组成。
本实施例中经基因工程化的源动物在基因组中不含有任何外来的、引入的DNA；所采用的遗传修饰仅是单个基因的敲除，所述单个基因负责编码引起细胞表面抗原普遍表达的酶。该实施例中的异种移植制品不结合转基因技术，诸如CD-46或CD-55转基因构建体。
本文公开的过程和技术仅是示例，并且不限制本发明的范围。将完全理解的是，虽然本实施例针对异种移植皮肤制品，但以下工艺中的几个步骤以及整个方法的各个方面都可以应用于其他器官或组织，包括但不限于肾、肺、肝、胰腺、神经、心脏、肠和其他器官或组织。将进一步理解的是，可以关于皮肤以外的其他器官或组织的收获和处理，对本实施例中公开的工艺和方法进行修改(包括增加或省略一个或多个工艺或方法步骤)。这种理解部分基于以下事实：其他器官和组织将具有不同的物理特性，并且因此，在某些实际方式中，此类其他器官或组织的收获和处理步骤将与本实施例不同(例如，肾、心脏、肝、肺或其他整个器官将不被切成一定尺寸并包装在由尼龙网支撑的冷冻小瓶中)。然而，将进一步理解，可以利用本领域已知的方法进行如应用于每个这种器官或组织的一个或多个工艺或方法步骤的增加或省略(例如，收获的肾、心脏、肝、肺或其他整个器官在一些方面将如本文所述被置于抗病原体浴中或暴露于UV光下以在收获后去除病原体，并被置于一个或多个封闭系统中)。例如，此类一个或多个封闭系统可以包括但不限于第一封闭系统(例如，利用惰性材料进行初始封闭以包围器官，从而防止器官与靠近所述器官的其他材料接触或粘附)和/或第二封闭系统(例如，含有所述器官和第一封闭系统(如果使用了第一封闭系统)的无菌且安全的外部容器)。此类一个或多个封闭系统内的此类器官被配置成作为整个器官被运输到临床部位，在温度、无菌性和其他条件下被储存、保护和运输，以维持如本文所述在临床部位进行移植的无菌性和细胞生存能力。
动物准备
皮肤制品处理发生在开始于处死源动物直到完成最终制品的生产的单一、连续且设备齐全的隔离生产事件中。
接收了源自DPF封闭群体的异种皮肤移植物，最近在DPF隔离区域的另一部分通过俘虏式栓系安乐死对猪实施安乐死。源动物被包含在无菌的无孔袋中，所述袋被包含在塑料容器中，所述塑料容器被地送到DPF隔离区域中并放置在手术室中，在所述手术室中将进行从源动物中收集皮肤的程序。手术团队的所有成员都应穿戴完全无菌的手术设备，例如，穿着无菌衣服以在接收源动物之前维持无指定病原体条件，并且在一些情况下戴上双层手套以最小化污染。
在净化之前(例如，在用二氧化氯气体处理之前的24小时)以及在程序之前，为操作区域准备从源动物收获皮肤所需的材料。在操作之前，对切皮刀(Dermatome)(电子皮肤收获设备，例如Exsurco的Amalgatome)电源和延长线进行灭菌并将其放置在操作区域中。在二氧化氯气体处理期间不在房间中的任何材料(因此是非无菌的)将在进入房间之前用70％乙醇或异丙醇喷雾。
将源动物以无菌方式从袋和容器中移出，例如，人使用灭菌的手套和/或灭菌装置从袋和容器中提起源动物以帮助提起并使污染最小化。手术人员用氯己定将源动物擦洗至少2分钟，在将要进行手术的整个动物区域上刷洗，定期将氯己定倒在所述区域上以确保覆盖度。
将源动物的右侧腹和背部朝手术台放置，使左侧腹和背部暴露。暴露的表面被擦洗至最明显的手术边界，并被用毛巾夹固定的无菌帷帘束缚。然后，用打开的必妥碘刷子擦洗源动物，并在将要进行手术的整个动物区域上用无菌水冲洗大约2分钟。
这种氯己定和必妥碘的混合物将在源动物上放置大约2分钟，然后工作人员(穿着无菌衣服以维持无指定病原体条件)将用无菌水和无菌纱布冲洗并干燥源动物。去除源动物的毛发，以免影响膜或引入会降解细胞的其他元素。在死后立即在无指定病原体环境中使用灭菌的电推剪和/或直剃刀进行脱毛，并使用氯己定泡沫清洁刀片。工作人员将使用电推剪和/或直剃刀(在无菌浴中润滑)去除手术部位上剩余的所有毛发，注意不要刺穿皮肤。通过将源动物转到左侧腹上可以重复此程序(从擦洗到剃毛)，以便暴露右侧。将源动物用无菌水冲洗，并用无菌毛巾干燥，并用70％乙醇喷雾。外科医生将目视检查源动物，以确保擦洗的适当覆盖。在无菌擦洗和最终剃毛之后，源动物已准备好进行皮肤收获。
皮肤收获
操作员将按照程序和其他标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体条件。在处死动物的15小时内从源动物中收获用于异种移植的所有组织。
在一个方面，将源动物侧放在手术台上。在这方面，利用切皮刀圆形刀片(例如和SD)进行收获。当工作人员将动物固定到位时，外科医生确定最合适的宽度(例如1、2、3或4英寸)，并使用圆形切皮刀以选定的厚度(例如，0.50mm、0.55mm、0.62mm)去除分层厚度皮肤移植物条。
作为进一步的实例，取决于所讨论的治疗需要，皮肤移植物的厚度可以在0.01mm至4mm的范围内。还应理解的是，在一些方面，也可以利用本领域已知的替代性收获和移植程序来利用收获全层厚度移植物。移植物尺寸可以在1cm2至1000cm2(或大约1ft2)的范围内。将理解的是，取决于应用和所利用的收获技术以及源动物的尺寸，更大的移植物尺寸也是可能的。将理解的是，对于所有方面，也可以利用其他深度，这取决于用于治疗和/或其他目的的手头任务的应用和需求。
在另一个方面，皮肤收获涉及首先通过外科手术从动物上去除皮瓣，然后将皮瓣的真皮侧朝下放置在收获板上(例如，由金属、塑料或其他适当的材料制成的实心板)，所述收获板设置在手术台上。在这方面，将无菌的衬垫材料添加到皮瓣的下方和收获板的顶部，以适当地提供适当的切皮刀装置功能。然后用钢夹将皮瓣牢固地固定在收获板上。将弯曲的毛巾夹用于与夹相对的皮瓣侧面上，直到皮肤结实且绷紧为止。外科医生将在切皮刀上选择最适当的厚度，并根据收获条件进行调整。外科医生将在固定的皮瓣上使用切皮刀，沿着切皮刀前进方向提供辅助维持张力。第二辅助还可以为皮瓣张力提供帮助，并可以使用鼠齿钳拉出从切皮刀中出来的移植物。
将移植物修剪成所需的尺寸。举例来说，尺寸可以是：5cm x 5cm，总表面积为25cm2，且均匀厚度为大约0.55mm；5cm x 15cm，总表面积为75cm2，且均匀厚度为大约0.55mm；8cm x 7.5cm，总表面积为60cm2，且均匀厚度为大约0.55mm；8cm x 15cm，总表面积为120cm2，且均匀厚度为大约0.55mm。将进一步理解的是，可以根据患者的需要产生可定制的尺寸(即，宽度、厚度和长度)，包括可以收获更大的皮肤片用于异种移植程序。
异种移植制品被进一步处理成不含需氧和厌氧细菌、真菌和支原体。在无菌条件下，在收获之后立即、在收获后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10秒内、在10秒至1分钟内、在1分钟至1小时内、在1小时至15小时内、或在15小时至24小时内，使用适用的无菌技术，在药物制品处理套房中的层流通风橱中，将异种移植制品放置于抗微生物剂/抗真菌剂浴(“抗病原体浴”)中。对于皮肤制品，这可能会在将皮肤制品修剪成适当的剂量大小和形状(例如，修剪成正方形、矩形或其他所需尺寸的形状)后发生。
抗病原体浴包括放置在无菌容器中的氨苄青霉素、头孢他啶、万古霉素、两性霉素B，并且异种移植制品按下表6中概述的进行稀释，并按下表7中概述的添加到RPMI-1640培养基中。在一个方面，在添加上述物品之前，从瓶中取出约10mL的培养基。
表6
表7
将理解的是，尽管本实施例针对异种移植皮肤制品，但是也可以将其他器官(包括但不限于肾、肺、心脏、肝、胰腺和其他器官)在根据本发明的抗病原体浴中浸浴。执行药物和其他化学品的组合的量以及暴露于这种抗病原体浴的持续时间以使此类暴露对细胞生存能力和线粒体活性的影响最小化，以实现所需的抗病原体结果并根据本发明对异种移植制品进行最低程度的操作。
作为通过抗病原体浴去除病原体的替代或补充，通过利用紫外光的工艺和系统使制品无指定病原体。在这方面，操作员按照机构标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体条件。操作员戴上针对紫外光和激光的护眼安全眼镜。
将紫外激光灯安装在层流通风橱中。灯的四个角中的每个角都放置在两个彼此叠置的容器盖子上，即，使用四对盖子来支撑灯，或者能够将灯放置在通风橱工作表面上方的临时或固定位置的其他支撑物品。从灯泡(总共2个灯泡管)到通风橱底部的距离为大约1.5英寸。通风橱的整个内部都喷有酒精，例如乙醇或异丙醇。打开灯，并且操作员根据灯的规格、灯泡数量以及灯泡与异种移植制品之间的距离，计算所需暴露的时间。
操作员将两个浴(一个氯己定和一个酒精)倒入两个单独的碗中，并将所述两个碗放在通风橱下。
将一包新的灭菌冷冻小瓶放置在通风橱下。拧开冷冻小瓶盖并将其放入氯己定浴中。然后将每个冷冻小瓶(不带盖)倒置，并将开口端投入氯己定浴中，每次一分钟，然后直立放置以风干。此后，利用无菌纱布用氯己定和酒精擦拭每个冷冻小瓶的外部。从氯己定浴中取出冷冻小瓶盖，并放在无菌纱布上。将每个小瓶的开口端分别投入酒精浴中1分钟，然后静置风干。
将最近从手术室的收获/获得阶段获得的异种移植制品经由进入层流通风橱的单向入口转移到制品处理室中。在转移给操作员之前，用70％乙醇擦掉进入无菌区域的任何物质。操作员将可以使用层流通风橱中的所有必需材料：异种移植制品(在无菌容器中)、冷冻小瓶、10mL注射器和针头、相冷冻机保持架以及预先剪切尼龙网。一次只能处理一种尺寸的制品，以确保对最终小瓶的适当控制。根据无菌、洁净技术，操作员就座在层流通风橱旁。
当使用UV光杀菌时，将制品放置在UV灯下持续所需的时间段，例如2分钟或更长时间，然后翻转到另一侧，并将相反侧放置在UV灯下持续相同的时间段，例如2分钟或更长时间。基于特定的生物剂或待灭菌的生物剂的类型来改变将给定样品暴露于UV的时间段，例如，如下表8所示。
表8
*使用125uW/cm2的UV-C强度
关于其他完整器官，制品产量将通常取决于给定源动物可以具有每个这种完整器官的数量(例如，一个肝、两个肺、两个肾、一个心脏、一个胰腺等)。
还将理解的是，尽管本实施例针对异种移植皮肤制品，但是其他器官(包括但不限于肾、心脏、肺、肝、胰腺和其他器官)可以暴露于紫外光下并使其不含根据本发明的指定病原体。执行UV暴露剂量、强度和暴露于这种紫外光的持续时间以使此类暴露对细胞生存能力和线粒体活性的影响最小化，以实现所需的抗病原体结果并根据本发明对异种移植制品进行最低程度的操作。
制造工艺
一般而言
通过持续的制造事件，源动物被处理成无菌异种移植制品。与源动物有关的制品的制造涉及几个条目，包括但不限于：
a.源动物的照料和畜牧养殖(包括，如本文所述，提供某些疫苗接种、仔细维持和分析纯种系谱记录、进行适当的动物畜牧养殖、以及将动物维持在隔离屏障条件下)；
b.制品制造(包括，如本文所述，从安乐死到收获，将源动物处理成主题制品)；
c.源动物的分析测试(包括，如本文所述，筛选不定因子，包括寄生虫学、细菌学和病毒学测定)；
d.源动物的分析测试(包括，如本文所述，确认源动物是α-1,3-半乳糖转移酶敲除或具有给定应用所需的其他特征)；和
e.源动物的分析测试(包括，如本文所述，内源病毒(PERV)的病毒测定)。
所得制品的制造和发布测试中也涉及几个条目，包括但不限于：
a.制品制造(包括，如本文所述，处理药物制品、储存药物制品和发布药物制品)；
b.药物制品的分析测试(包括，如本文所述，生存能力测试(例如通过MTT测定))，
c.无菌性测试(包括，如本文所述，需氧细菌培养、厌氧细菌培养、真菌培养、支原体测定、内毒素测试，USP<71>))，
d.不定因子测试(包括，如本文所述，用于例如内源性病毒(PERV)的PCR测定)；和
e.药物制品的分析测试(包括，如本文所述，组织学)。
对于皮肤，每只动物的制品产量的量可根据每只动物的尺寸而变化。举例来说，一些动物可以产生3,000与6,000cm2之间的制品。在一个方面，以连续过程从单一源动物收获单批次的皮肤制品。表9中提供了异种移植制品的批次说明，并且表10中提供了异种移植制品的批次配方。
表9
批次大小
表10
批次配方
先前的批次测试是在良好实验室规范(“GLP”)条件下执行的，以确保始终维持过程无菌性。在材料发布和临床使用之前确定最终制品的无菌性的保证。在验证用于人临床用途之前，所有异种移植制品都将满足某些接受标准，包括如本文所述。最终的药物制品控制策略和分析测试是在制造过程结束时在发布用于临床用途之前进行的。所需的分析测试结果将通过药物制品分析证书(COA)记录下来，所述分析证书附有与每个批次的异种移植制品有关的主批次记录。
通过获得肺、肝、脾、脊髓、脑、肾和皮肤的组织样品来生成和维护源动物样品档案。针对源动物组织收集这些组织以进行测试、存档和存储用于进行将来可能的测试。源动物组织和体液的存档样品应酌情储存在负(-)70摄氏度或更低的温度下用于保存样品。在其他方面，可以将固定的样品维持在室温下。在获得活细胞、组织或器官时，应从源动物中收集适当的组织样品以进行福尔马林固定和石蜡包埋并进行冷冻保存。冷冻保存应至少有十个0.5cc等分试样的柠檬酸或EDTA抗凝血浆；五个等分试样的有活力的白细胞(1x107/等分试样，用于随后分离核酸和蛋白质或用作共培养或其他组织培养测定的有活力的细胞来源)。
收获后的制品处理
先前收获且最低程度操作的异种移植皮肤制品(此处的皮肤完整性是具有标准细胞形态和组织的最低程度操作的真皮和表皮组织层)进入正压高于手术套房(被命名为10,000级(IS0-7)制品处理室)正压的单独的相邻房间。
手术室将按照操作准备程序进行设置，并且操作人员将穿着特卫强(Tyvex)套装，以进行通风橱工作。如果需要，助手也将穿着特卫强套装。用无菌技术完成换衣和穿衣。如果需要，手套和袖子用酒精喷雾。预先通过气态二氧化氯灭菌工艺进行灭菌的ABSL-2层流通风橱将用酒精(例如70％的乙醇)进行喷雾，并且将开始层流排气。利用无菌技术，先前通过高压釜灭菌的手术器械、冷冻小瓶、冷冻盘、烧瓶、注射器、针头、附加容器和所有处理设备将被放置在层流通风橱内。在转移给操作员之前，将外部包装用酒精喷雾。
如本文所述，在操作之前，应将尼龙网移植物衬背切成针对剂量水平的适当尺寸的正方形，密封在可高压灭菌的小袋中，并通过蒸汽灭菌。然后将小袋的外部用70％乙醇灭菌，并且放入通风橱中。10mL冷冻小瓶的外部包装将用70％乙醇消毒，并放入通风橱中。无菌的高压灭菌的手术器械包装应用70％乙醇喷雾并且转移给操作员。
应将无菌注射器和针头用70％乙醇喷雾并且转移给操作员。最近从猪供体中收获的移植物组织将被转移到通风橱中。在转移给操作员之前，用70％乙醇擦掉进入无菌区域的任何物质。操作员将可以使用通风橱中的所有必需材料：移植物(在无菌容器中)、冷冻小瓶、10mL注射器和针头、相冷冻机保持架以及剪切尼龙网。根据无菌、洁净技术，操作员应就座在通风橱旁。
参考图2，将提前对每个冷冻小瓶灭菌和标记，以减少冷冻保存之前的处理时间和材料对DMSO的不必要暴露。将含有每种异种移植制品的盆和在室温下RPMI 1640组织培养基以及抗生素(例如，抗病原体浴)放置在层流通风橱下。制品已在抗病原体浴中浸浴不少于30分钟，以对异种移植制品进行灭菌。
在一个方面，当使用UV光灭菌时，如上所述，使用UV灯对冷冻小瓶进行灭菌。在将制品插入每个小瓶中之后，将每个新的盖子放在每个新的瓶上并牢固地拧紧。将每个小瓶放置在灯下，并定期滚动，以使小瓶外部均匀地暴露于光。将小瓶放置在玻璃罐中，所述玻璃罐的内部先前已灭菌并且外部已由操作员使用酒精和氯己定进行灭菌(包括螺纹和盖)。用酒精擦拭小瓶，然后将其放入玻璃罐中。玻璃罐的外部在通风橱外面用酒精浸湿。在通风橱下，操作员将玻璃罐盖子浸浴，并且将罐的开口端投入酒精中，并用酒精(和任选的氯己定)擦拭罐的外部，包括罐的螺纹。利用纱布用酒精擦拭小瓶，并将其用器械将其放入每个玻璃罐中。然后固定玻璃罐的盖子，并且将罐交给助手。在所有这些过程中，助手会频繁并定期用酒精对操作员的手套和手臂进行喷雾。
在本实施例中，异种移植皮肤制品(其已在外科手术套房中用无菌剪刀剪切成一定形状并用10刃解剖刀修整)将用无菌不锈钢直尺重新测量，以验证是否满足技术规格和尺寸。视觉检查异种移植皮肤制品，以确保不存在裂痕、撕裂、可观察到的缺陷或厚度过大或不足。
在层流通风橱下，操作员将使用镊子从抗病原体浴中取出单个异种移植皮肤制品，并将其放在先前剪切成适合冷冻小瓶的一片尼龙网上，定位于尼龙网的中心，真皮侧与网接触(例如，真皮面朝下)，每个制品花费1分钟(应理解该时间可能更短或更长，并且每个制品至多5分钟)。将理解的是，无菌尼龙网包装组分尤其用于支撑异种移植制品并防止异种移植制品在卷起时自粘。
将进一步理解的是，无菌尼龙网包装组分可以具有允许将异种移植制品放置在无菌尼龙网包装组分上并适合位于无菌尼龙网包装组分的二维表面积(即长度和宽度，不包括厚度)内的任何尺寸(例如，异种移植制品的二维面积尺寸将小于无菌尼龙网包装组分的二维面积尺寸)。
将进一步理解的是，将根据异种移植制品尺寸和剂量来确定无菌尼龙网包装组分的尺寸。例如，无菌尼龙网包装组分为8cm x 7.5cm(60cm2)，以适合5cm x 5cm的异种移植皮肤制品(25cm2)(7.5克)，当将其放入冷冻小瓶中时使用7ml冷冻保护介质。甚至将进一步理解的是，无菌尼龙网包装组分的尺寸为8cm x 22.5cm(180cm2)，以适合5cm x 15cm的异种移植皮肤制品(75cm2)(22.5克)，当放在冷冻小瓶中时使用5ml冷冻保护介质。
包装期间异种移植皮肤制品的表皮或真皮区域的意外粘附可能会破坏异种移植皮肤制品的完整性并可能降低其治疗可行性。包含无菌尼龙网包装组分旨在提供内部物理支撑并防止自粘。无菌尼龙网包装组分没有生物或化学活性，并且不会直接影响异种移植皮肤制品本身的代谢活性或功效。
在许多实验过程期间，包括本文实施例1中描述的猴子研究，从未观察到使用这种无菌尼龙网包装组分会产生与异种移植制品的不利的、不希望的反应，或者降解和污染最终的异种移植制品，从而对接受者造成不良的反应或后果。移植程序中不使用无菌的尼龙网包装组分。在冷冻保存和解冻后，并且在使用异种移植制品之前，将其丢弃。因此，对于给定的应用，仔细选择了特定的材料和相关的规格。Medifab 100微米尼龙网(零件号03-100/32-Medifab)是根据cGMP标准制造的，并且被选中是因为其物理特性和经过认证的对人临床使用的可接受性。
然后，在层流通风橱下，操作员将紧紧卷起异种移植制品和尼龙网包装组分的该组合，并将该组合放置在冷冻小瓶(例如10ml小瓶)中，每个制品花费1分钟(应理解该时间可能更短或更长，并且每个制品至多5分钟)。在这方面，将网材料卷起以确保圆柱体的垂直高度为8cm，并均匀地适合在10ml冷冻小瓶内(例如，10cm长度和17mm直径)，并且一旦完成后就可以用螺纹密封盖进行固定。网材料被定向成使得保护性网材料位于异种移植制品的外部，并且一旦卷起完成，就没有暴露或可见的异种移植材料，并且其被完全包装在保护性插件中。无菌尼龙网包装组分的固有拉伸和材料特性是均匀的，并且材料的无弹性或刚度使其膨胀以填充冷冻小瓶的体积。因此，无论初始的“卷密度”如何，材料都将均匀地松散并因此被标准化。
然后，操作员将在层流通风橱下使用无菌注射器吸取足够的无菌冷冻保护介质(例如，5-7ml的含5％二甲亚砜(DMSO)的介质(Cryostor CS5,BioLife Solutions))以填充冷冻小瓶直到皮肤制品卷完全浸没为止，确保异种移植皮肤材料、网衬背和冷冻保护介质的组合与10ml填充线齐平，每个制品花费1分钟(应理解该时间可能更短或更长，并且每个制品至多5分钟)。
在层流通风橱下，操作员将用螺纹盖密封冷冻小瓶。内容物的身份和标签信息由操作员确认。在制品处理之前，将标签预先填入并应用到包含制品的冷冻小瓶外部。
将理解的是，本文所述的异种移植制品和包装组分的制备可以呈治疗剂量的形式。例如，异种移植药物制品由以下组成：
a.异种移植分层厚度皮肤药物物质
b.一级容器封闭系统，其包括
i.主要包装组分：无菌透明的聚丙烯10ml冷冻小瓶，带螺纹密封盖
ii.无菌尼龙网包装组分
iii.冷冻保护介质包装组分
异种移植制品的指定剂量为每cm2 300mg活的有代谢活性的猪异种移植药物物质，恒定厚度为0.55mm。示例性配制品包括：
c.剂量强度1：25cm2分层厚度皮肤移植物，均匀厚度为0.55mm，重量为大约7.5克。
d.剂量强度2：75cm2分层厚度皮肤移植物，均匀厚度为0.55mm，重量为大约22.5克。
示例性异种移植药物制品主要包装组分为带有螺纹密封盖的无菌透明的聚丙烯10ml冷冻小瓶。例如，Simport Cryovial,T310(10-ml)是由Simport Scientific制造的。该制品由不含BPA、不含重金属和不含LATEX的医疗级树脂构成，并符合USP VI级限制。
在异种移植药物制品制造过程期间使用了尼龙网包装组分。将准备好的异种移植药物制品放在无菌尼龙网包装组分(例如，Medifab 100微米尼龙网)上，该组分已预先修整为以下尺寸：
a.剂量强度1：宽度7.5cm，高度8cm；总面积60cm2
b.剂量强度2：宽度22.5cm，高度8cm；总面积180cm2
在药物制造过程期间还使用了冷冻保护介质包装组分。冷冻保存之前，将异种移植药物制品浸入以下体积的冷冻保护介质包装组分中：
a.剂量强度1：7ml的Cryostor CS5(含有5％DMSO)。
b.剂量强度2：5ml的Cryostor CS5(含有5％DMSO)。
为了确保冷冻保护介质的饱和度，在层流通风橱(ISO-5，FED STD 209E Class100条件)下，将指示量的CryoStor CS5介质(按剂量强度)通过10ml注射器应用到处于垂直位置的冷冻小瓶(诸如图30中所示的冷冻小瓶类型)中。冷冻介质填充空隙空间，并且重力确保填充过程从垂直定向的冷冻小瓶的底部开始直至顶点处的填充线。添加体积直至其达到制造商标定的10ml填充线为止。以这种方式填充小瓶也有助于去除气泡。一旦完成后，用螺纹盖密封。对饱和度和填充度进行视觉和物理验证，以确保异种移植制品的内容物不能在内部移位。
冷冻保存
将制品材料放在如上所述的包含冷冻小瓶和制品的适当冷冻机架中，并放入经过认证的Q-A控制速率相冷冻机中。使用经过认证的Q-A控制速率相冷冻机，通过一种标准化的控制速率冷冻过程将整个制品冷冻保存：
a.从4℃开始，内部腔室和样品温度探头将以每分钟1℃的速率降低，直至达到-40℃的温度为止。
b.一旦以控制的速率达到-40℃的温度，控制速率的冷冻机样品温度探头应从-40℃迅速降低至-80℃。
c.然后将材料转移到GLP认证的-80℃冷冻机中直至使用。
从室温到-80℃，每个批次时间花费40分钟(应理解时间可能更短或更长，并且至多2小时)。在一些方面，可以使用渗透性冷冻保护剂(诸如DMSO)来保护形态和组织结构，并保持与新鲜皮肤相当的代谢活性水平。在一些方面，可替代地或另外地，冷冻保存可以包括甘油、庆大霉素、制霉菌素、L-谷氨酰胺和其他处理溶液中的一种或多种。在一些方面，不使用β-内酰胺抗生素。
包含冷冻保护介质包装组分旨在支持在异种移植制品所需的冻融循环期间的细胞存活。在包装期间未包括异种移植制品的冷冻保护介质包装组分可能会破坏异种移植制品的完整性或阻碍冷冻保存过程，并可能将异种移植制品的生存能力降低至可接受标准以下。在不包含冷冻保护介质的情况下冷冻保存异种移植制品导致对异种移植制品中包含的生物活性细胞的破坏。在冷冻过程期间发生冰晶的快速形成以及细胞膜和线粒体细胞器屏障的破坏，并且二甲亚砜成分起到交换细胞内液的作用。因此，冷冻保护介质减少了此类冰晶的形成以及总细胞体积的快速破坏性增加，这将负面地影响细胞生存能力并因此影响药物制品的功效。
在许多实验过程期间，包括本文实施例1中的猴子研究，从未观察到使用这种冷冻保护介质包装组分会产生与异种移植制品的不利的、不希望的反应，或者降解和污染最终的异种移植制品，从而对接受者造成不良的反应或后果。因此，选择特定的材料和相关的规格以满足意图用于人临床用途的异种移植制品所必需的适当标准。这包括鉴定一种具有最低亚临床水平的DMSO的冷冻保护介质，所述冷冻保护介质可以令人满意地发挥作用而无需在配制品中包含另外的异种移植材料(猪血清)。在移植程序中不使用冷冻保护介质包装组分。在解冻后，并且在使用异种移植用于治疗用途(包括作为药物制品)之前，将其丢弃。CryoStor CS5是根据cGMP标准制造的，并且被选中是因为其经过认证的对人临床使用的可接受性。
运输到临床站点
应将制品运输到临床站点，以将异种移植皮肤制品材料维持在-80℃的存储条件下。一个示例性运送容器是具有广泛的以下规格的EXP-6标准干蒸气运输机：
·动态保持时间10天
·保持温度-150℃或更低
·核心技术干蒸气液氮
·标本室直径2.8英寸(71mm)
·深度11.5英寸(292mm)
·干重9.7磅/4.4kg
·装料重量18.3磅/8.3kg
·国内尺寸21.07磅/9.56kg
·国际尺寸24.87磅/11.28kg
·外箱12英寸x12英寸x22英寸
·(305x305x559mm)
运输过程的各方面也在图29中示出，包括但不限于：(1)冷冻保存仓库；(2)在冷冻保存仓库中时在如本文所述的冷冻小瓶和介质中的异种移植制品；(3)将冷冻小瓶放在干蒸气运输容器(或二级封闭系统)中；(4)通过快递员运输容器和小瓶；(5)在递送地点对异种移植制品进行控制和监测(在负(-)150摄氏度或更低的条件下可以持续至少10天)；(6)从容器/二级封闭系统中取出如本文所述的冷冻小瓶和介质中的异种移植制品；(7)将在如本文所述的冷冻小瓶和介质中的异种移植制品置于冷冻机中的-80℃下储存的位置。
临床站点准备
在一个方面，药物制品作为冷冻保存的异种移植制品到达临床站点。在使用之前，异种移植制品必须在37℃的水浴中解冻，从小瓶中取出，并在室温下于一系列3个无菌的0.9％盐水浴中洗涤。
对于解冻过程，使用了无菌设备和无菌技术：
a.在三个500mL无菌手术碗中各准备200mL生理盐水。
b.将未打开的冷冻小瓶与皮肤制品一起置于温度约25℃的水浴中。在一些实施方案中，温度为约37℃。
c.在所述水浴中，轻轻旋转大约5分钟或直到组织在冷冻小瓶内移动，注意尽可能地最小化异种移植皮肤制品组织悬浮于解冻的DMSO中的不必要的暴露时间。
d.打开冷冻小瓶并使用无菌镊子快速去除组织和网，以转移到一碗生理盐水中。
e.使用无菌镊子，确保组织完全浸没在盐水中15秒，通过轻轻旋转来搅动以使覆盖最大化。下面的支撑网材料应与皮肤异种移植皮肤制品材料分开。如有必要，使用第二对无菌镊子分开。网可以留在碗中，也可以丢弃。
f.使用无菌镊子，将皮肤转移到第二碗洗涤液中。完全浸没并轻轻旋转15秒；这是连续稀释或“冲洗”。
g.重复前一步，使用无菌镊子将皮肤转移到第三次洗涤的生理盐水中。完全浸没并轻轻旋转约15秒。
h.冲洗过程的整个持续时间应在60秒内完成以使制品悬浮于解冻的DMSO中的不必要的暴露时间最小化，以便使制品功效最大化。
i.现在将组织解冻，冲洗并准备好应用。保留在生理盐水中直至使用，在约25℃下不超过2小时。
完成完整的解冻和冲洗过程之后，异种移植制品就准备好放置在伤口部位。一旦解冻后用盐水连续洗涤提供了足够的稀释溶剂，以除去残留的冷冻保护剂(5％DMSO溶液，CryoStor CS5)，并将细胞内液水平恢复至正常的体内平衡状态。含有亚临床水平的DMSO的冷冻保护介质的这种稀释和使用确保了解冻后残留在异种移植皮肤制品材料上的任何最少的残留DMSO都将是不明显的，并且极不可能具有临床意义。该过程还确保保留最大量的代谢活性细胞，并且从而使异种移植制品的功效最大化。
解冻的实例。以下是异种移植制品的解冻程序的一个实例。解冻可以在操作员戴着无菌手套的情况下在生物安全柜中发生，如下所述：(i)在三个500mL手术碗中各准备200mL生理盐水；(ii)通过将其用氯己定擦拭干净、然后用70％乙醇喷洒来制备水浴；(iii)在乙醇干燥之后，在水浴中添加无菌水溶液，并加热至37℃+/-2℃；(iv)将异种移植药物制品装在双层袋中，保留不打开并置于37℃水浴中；(v)轻轻旋转大约5分钟或直到组织在冷冻小瓶内移动；(vi)尽可能地使组织在解冻的DMSO中花费的时间最少；(vii)用乙醇喷洒外袋并从外袋中取出小瓶，并用70％乙醇喷洒异种移植药物制品冷冻小瓶，然后将其放入生物安全柜中；(viii)拧开冷冻小瓶，并用镊子快速去除组织和网，以转移到一碗生理盐水中；(ix)使用镊子确保组织完全浸入盐水中60秒，通过轻轻旋转搅动以使覆盖最大化；(x)网应与皮肤分开，必要时使用第二对镊子分开；(xi)网可以保留在碗中，也可以丢弃；(xii)使用镊子将皮肤转移到第二碗洗涤液中；(xiii)完全浸没并轻轻旋转60秒；(xiv)使用镊子将皮肤转移到第三碗洗涤液中，并且完全浸没并轻轻旋转60秒。现在将组织解冻，并准备好应用。用无菌盆中的无菌盐水使其保持湿润。
滚动惰性尼龙网衬背和异种移植皮肤制品的过程会导致异种移植制品的均匀“卷密度”。根据给定应用的预先准备的尺寸，将所有网材料切割成均一的尺寸，并从同一材料批次中获得，从而为特定批次中制造的所有皮肤制品单元提供均一的材料特性。
尼龙网插入物的固有拉伸和材料特性是均匀的，并且材料的无弹性或刚度导致其膨胀以填充一级容器封闭系统(冷冻小瓶)的体积。因此，无论初始的“卷密度”如何，材料都将均匀地松散并因此被标准化。
在ABSL-2层流通风橱内，在Class 100、ISO5条件下将指示量的CryoStor CS5介质(按剂量强度)通过10ml注射器应用到处于垂直位置的冷冻小瓶中。
冷冻介质填充空隙空间，并且重力确保填充过程从垂直定向的冷冻小瓶的底部开始直至顶点处的填充线。添加体积直至其达到制造商标定的10ml填充线为止。以这种方式填充小瓶也有助于去除气泡。
一旦完成后，用螺纹盖密封。通过摇动皮肤制品对饱和度和填充度进行视觉和物理保证，从而确保内容物不能在内部移位。冷冻小管的各方面也在图30中示出，其中各方面尤其可以包括10ml体积、17mm x 84mm的尺寸、便于取下盖的纵条纹、硅胶垫圈、由相同聚丙烯材料制成的具有相同膨胀系数的确保在所有温度下密封的盖和管、1和1/4匝螺纹设计、厚壁、较大的白色标记区域、以及允许轻松清空内容物的圆底。
二级封闭系统的各方面在图31中示出，其中各方面尤其可以包括特卫强–1073B医疗级结构、5英寸宽度x12”高度、容纳15条(came)或2个冷冻小瓶箱的存储能力、保持-150摄氏度或更低的温度、利用干蒸气液氮、在正常运输条件下IATA额定动态保持时间10天、标本室直径2.8英寸(71mm)、标本室深度11.5英寸(292mm)、干重9.7磅/4.4kg、装料重量18.3磅/8.3kg、国内尺寸重量为21.07磅/9.56kg、国际尺寸重量为24.87磅/11.28kg、外箱尺寸为12英寸x12英寸x22英寸。
由于处理仅涉及制品的最小机械操作，并且在此封闭过程中不会引入其他化学或生物剂，因此预计不会在制品中存在任何另外的杂质或外部杂质。如本文所述进行将源动物用于制品制造过程所需的验收标准测试，并通过药物制品COA进行记录。如本文所述评估最终制品的病毒不定因子。
就保质期而言，如所述的异种移植制品的连续存储在-80℃下连续储存时支持长达至少7年(在一个实施方案中为6个月的保质期)的保质期长期稳定性(细胞生存能力)。异种移植制品连续冷冻保存的保质期为至少7年。表11显示了将测试异种移植制品的稳定性时间点。
表11
稳定性研究时间点
A＝初始制品发布测试
B＝异种移植制品的稳定性测试
根据一个方面，在以下表12中是可以在分析和释放证书中使用的条目。
表12
测试结果
实施例3
真皮表皮组合制品
以下实施例提供了根据本发明生产的用于人移植的源自无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤制品。本文所公开的制品、工艺和技术仅是实例，并且不限制本发明的范围。
一些用于治疗烧伤和其他疾病的皮肤移植制品利用培养的表皮自体移植物(参见例如，由Vericel Corporation生产的在商标名称下的制品)。此类表皮自体移植物可以用于有烧伤(包括严重烧伤)的患者，并且由于所述材料源自患者自己的皮肤，因此导致对移植的表皮材料的排斥减少或没有。
然而，此类制品仅限于表皮，并且不包括皮肤的真皮部分。参考图3，将理解的是，真皮(其通常占皮肤厚度的95％)执行与表皮(其是通常占皮肤厚度的5％的皮肤外面部分)显著不同的功能。
由于仅表皮自体移植物缺乏执行真皮关键功能的能力，因此此类制品与有活力的真皮组合使用。在一些损伤中，伤口床包括患者自身真皮的剩余部分，这是在将培养的表皮自体移植物移植到患者身上的程序中使用的理想真皮。然而，在一些情况下，烧伤更为严重，并且患者自身的真皮不再存在或不再有活力。在那些情形中，需要不同的真皮，因为仅表皮自体移植物将是不够的。
在一个方面，将由源自根据本发明的无指定病原体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的真皮组织组成的全层厚度皮肤移植物伤口敷料与培养的表皮自体移植物结合或组合使用。利用该组合的一种治疗过程如下。
具有严重烧伤伤口的患者在受伤后48-72小时内被送往手术室。在对患者进行护理后尽可能快地进行活组织检查，并根据用于产生培养的表皮自体移植物的已知程序分离表皮皮肤细胞并使其单独生长(参见例如，由Vericel Corporation生产的商标名称为的制品)。
根据患者身体的损伤的多少，从健康区域获取表皮自体移植物以治疗烧伤区域和/或随后产生用于移植过程的表皮自体移植物网。
用本文所述的皮肤制品(例如，根据本发明生产的源自无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤制品)治疗严重烧伤区域。此类治疗包括临时伤口覆盖，直到利用足够的自体移植物长期治疗患者。
在应用表皮自体移植物之前，需要对伤口床进行大量清创术以确保有足够的基底。为了确认伤口床已准备好进行表皮自体移植，应用本文所述的皮肤制品(例如，根据本发明生产的源自无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤制品)以确认附着。一旦确认附着，就去除临时的伤口覆盖制品，并且在一些方面，用网状的自体移植物覆盖伤口床，并且将一种或多种培养的表皮自体移植物制品放置在顶部以封闭自体移植物网中的间隙。
清创术可以包括机械清创术、化学清创术、酶促清创术或其组合。机械清创术可以包括外科手术切除，例如去除真皮薄层直至可见健康组织的切向切除，或去除全层的真皮直至下层筋膜的筋膜切除术。切向切除术使较少有活力组织随坏死组织一起被切除，但通常导致更高的失血量，比筋膜切除术具有更大的生理应激因子，并且更可能导致“不完全的”清创术，一些失活的组织保留在原位。在筋膜切除术中，失血量和手术时间减至最少，但通常有大量健康组织随着烧伤组织一起被去除。清创剂可以包括能够通过去除外来物质和死组织来清洁烧伤伤口的剂。许多此类剂是已知的。在酶促清创术中，使用胶原酶或其他蛋白水解酶来分解细胞外基质的蛋白质，从而无需手术就可以清除掉失活的组织，同时优选地使健康组织基本上保持完整。酶促清创术涉及将蛋白水解酶和任选地其他外源酶应用于伤口表面，以分解坏死组织。酶促清创术可能是一个相对缓慢的过程，与其他局部制剂、浸泡和重复敷料相结合需要数周的时间段。可替代地，可以使用多酶制品(例如，从菠萝植物的茎中提取的那些多酶制品，例如在WO 98/053850和WO 2006/0006167中公开的，以及以商品名称出售的制品中所提供的)来实现快速的酶促清创术。酶促清创术的程序通常利用酶，诸如菠萝蛋白酶衍生物、清创酶、胶原酶、木瓜蛋白酶衍生物、链激酶、舒替兰酶、纤维蛋白溶酶、脱氧核糖核酸酶、磷虾衍生物、胰蛋白酶或其组合。自溶性清创术依靠增强由于巨噬细胞和内源性蛋白水解活性而在伤口中发生的坏死组织和焦痂从健康组织中的选择性液化、分离和消化的自然过程。这通过使用闭塞性、半闭塞性或潮湿的交互式敷料来实现。酶促清创剂包括富含菠萝蛋白酶的酶制品、其他胶原酶、或能够清除失活的组织或伤口碎片的其他酶制品。NexoBridTM(MediWound Ltd.)是一种富含这种菠萝蛋白酶的制品，专门针对热变性的胶原进行降解，从而导致部分厚度或全层厚度的伤口需要伤口覆盖或敷料制品。此类制品和方法描述于美国专利第8,540,983号；第8,119,124号；第7,128,719号；第7,794,709号；第8,624,077号；和US2009/0010910A1，所述专利中每一篇以引用的方式并入本文。
在一些方面，伤口床可以包括或者可以是慢性伤口或急性伤口。慢性伤口包括但不限于静脉腿溃疡、压力性溃疡和糖尿病性足溃疡。急性伤口包括但不限于烧伤、创伤性损伤、截肢伤口、皮肤移植物供体部位、咬伤、冻疮伤口、皮肤擦伤和手术伤口。
在没有真皮的情况下，使用根据本发明生产的源自无指定病原体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的皮肤制品。从此类制品中去除表皮(例如，在使用VERSAJETTMHydrosurgery系统在猪上收获真皮之前)，使得仅保留真皮。然后，将主题猪真皮放置于患者的皮下组织上，作为本文所述的培养的表皮自体移植物过程的底物。
实施例4
DPF异种肝过滤器
使用转基因猪肝作为人体内的体外过滤器公开于Levy等人,“Liverallotransplantation after extracorporeal hepatic support with transgenic(hCD55/hCD59)porcine livers:Clinical results and lack of pig-to-humantransmission of the porcine endogenous retrovirus,”Transplantation,69(2):272-280(2000)(“Levy”)，将所述文献的全部内容通过引用并入本文。
在该研究中，提出了遗传修饰的转基因猪肝的全器官体外灌注，以维持等待人肝移植来治疗暴发性肝衰竭的患者。据报告，所使用的猪肝对于人CD55(衰变加速因子)和人CD59是转基因的，然而，这些肝不能抑制[α]-gal抗体的显著增加。
根据本发明，在一个方面，将源自根据本发明的DPF封闭群体的α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的肝用于体外灌注作为用于人患者的临时过滤器，直到患者接受人移植体为止。将理解的是，也可以利用具有另外的遗传修饰的猪，包括对表1和本文其他地方列出的任何数量的性状进行遗传重新编程的猪。
在一个方面，如图4所示，体外回路利用充氧器(例如，Minimax 中空纤维充氧器)、泵(例如，带有BP50Pediatric Bio 离心泵的Bio-Medicus型号540)和保温器(Bio-Medicus型号370BioCalTM温度控制器)。该回路还利用滚子泵(例如，Sarns型号7000；Sarns,Ann Arbor,MI)来补充回到患者的重力不足。用桥和夹子来将灌注的肝和患者分开。
在DPF隔离区域内的手术区域中，将源动物放置在一般麻醉剂(氯胺酮、甲苯噻嗪、安氟醚)下或通过俘虏式栓系实施安乐死。然后在无指定病原体条件下对源动物进行肝切除术。
在用作体外过滤器之前，可以以本领域已知的任何方式来保存肝，包括但不限于如Levy中所公开的(例如，“4℃乳酸化林格氏/白蛋白溶液，以及将套管插入门静脉(28FResearch Medical，型号SPC-641-28)和下腔静脉(36F Research Medical，型号SPC-641-36)中”)。
总胆管可以通过任何方式插管，包括但不限于Levy中所述(例如，“使用静脉内延长管(Extension Set 30，Abbott Hospitals,Inc.,Chicago,IL)以允许随后定量胆汁产生。”)
可以将源自源动物的肝制品包装起来并按照人供体肝的现行惯例运输到程序的地点。
可以例如通过用12F儿科动脉套管(例如，Medtronic DLP,Grand Rapids,MI)经皮将套管插入人患者的颈内静脉进行静脉回流、以及用19F股动脉套管(例如，MedtronicBio-Medicus,Eden Prairie,MN)经皮将套管插入患者的股静脉进行静脉流出来执行利用肝过滤制品的程序。将这些插管连接到旁路回路，所述旁路回路具有掺入其中的离心泵(例如，Bio-Medicus)、热交换器(Medtronic Bio-Medicus)、充氧器(例如，MedtronicCardiopulmonary,Anaheim,CA)和滚子泵(例如，Sarns)。
该回路用晶体预处理并运行一段时间(例如20分钟)，然后将DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪肝以800ml/min的稳定流速掺入，保持在临时补充有温溶液的晶体浴中。
上述本发明的各方面旨在仅是示例性的；对于本领域技术人员而言，许多变化和修改将是显而易见的。所有此类变化和修改都旨在落入任何所附权利要求所限定的本发明的范围内。
实施例5
在本实施例中，早产猪胎儿和新生仔猪作为DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的后代出生，如根据本发明在本文中所示和所述的。
此类早产猪胎儿和新生仔猪被用作异种移植疗法的细胞、组织和器官的来源，包括但不限于再生或直接移植疗法。将理解的是，此类细胞、组织和器官可以新鲜使用或在根据本发明的冷冻保存之后使用(例如，在-80℃范围内的冷冻保存)。
在一个方面，从此类早产猪胎儿中收获间充质细胞、多能细胞、干细胞和/或其他未分化的细胞，并将其用于如本文所述的再生疗法和其他疗法，然而此类未分化的细胞可以高比例发现于猪胎儿以及新生仔猪中。由于这些细胞在妊娠早期来源于胎儿，因此它们的分化程度较低且更具有灵活性，这为再生疗法提供了更大的潜力。此外，由于这些细胞可能源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪，如本文所示和所述的，所以它们不具有导致被人免疫系统排斥的恼人的免疫原性、致病性和/或其他恼人因子，并且所述细胞将在人接受者内持续存在并分化，从而利用这些遗传和细胞构建模块恢复了模型组织的生长功能。
举例来说，可以通过本领域已知的再生细胞疗法方法(例如，通过利用生物支架)利用此类细胞产生用于异种移植的一系列器官和/或组织，包括但不限于：皮肤、肾、肝、脑、肾上腺、肛门、膀胱、血液、血管、骨骼、脑、脑、软骨、耳朵、食管、眼睛、腺、牙龈、毛发、心脏、下丘脑、肠、大肠、韧带、嘴唇、肺、淋巴、淋巴结和淋巴管、乳腺、嘴、指甲、鼻、卵巢、输卵管、胰腺、阴茎、咽、垂体、幽门、直肠、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、脊髓、脾、胃、肾上荚膜、牙齿、腱、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、输尿管、尿道、子宫、子宫和阴道、蜂窝组织、血液、腺样体、骨骼、棕色脂肪、网状骨质组织、cartaginous、软骨、海绵状组织、软骨样组织、嗜铬组织、结缔组织、肉膜状组织、弹性组织、上皮(epithelial)组织、上皮(epithelium)组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒状组织、肠相关的淋巴样组织、Haller的血管组织、硬的造血组织、不分化组织、间质组织、包埋组织、岛组织、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多房性脂肪组织、肌肉组织、髓样组织、鼻软组织、肾源组织、神经组织、结节组织、骨组织、成骨性组织、类骨质组织、根尖周组织、网状(reticular)组织、网状(retiform)组织、橡胶组织、骨骼肌组织、平滑肌组织和皮下组织。
因此，基于其与成年猪相比的特征，可以将早产猪胎儿和新生仔猪用作根据本发明的组织、细胞和器官的来源。
实施例6
猪皮与人皮肤享有基本的特性，并且代表了用于临时覆盖严重烧伤的人尸体皮肤移植物的潜在替代品。在一项使用MHC匹配和不匹配的MHC II类皮肤移植体模型的研究中，检查了对猪移植物进行长期冷冻保存对移植物生存能力、移植物摄取和屏障功能的影响。
使用甲臜-MTT评估细胞生存能力，并通过移植到猪接受者上评估移植物的生物学特性。为了补充体内临床评估、组织学和形态学分析，进行了一系列MTT还原测定以评价在冷冻保存和长期存储后猪移植物的残余生存能力。线粒体将MTT还原为甲臜代谢产物，其可以观察为紫色。利用此现象，对通过分光光度计测量的光密度值变化的分析或根据标准曲线对产生的甲臜的量进行内推可以提供实验样品与阳性和阴性对照之间的细胞生存能力的差异评估。基于MHC匹配，有2个群组，每个群组2只动物(总计，N＝4)，并且每只猪接受4个移植物：一个自体移植物和三个具有相同MHC谱的同种异体移植物。临床评估了移植物的移植物摄取、附着和移植物排斥时间。还通过班夫(Banff)分级量表在组织学上评估排斥。
在保持所有其他因素恒定的情况下仅基于存储持续时间，对其他等效材料之间进行直接比较产生出有意义的差异存活时间。在以相同方式保存的储存15分钟与7年时间的等效移植物之间进行并行的体内评估。临床总体评估和照片以及独立的组织学评估确定相对于冷冻状态下的时间长度是否存在移植物存活的任何明显差异。串联起来，通过MTT还原测定定量的对移植物生存能力的单独体外评估表征了冷冻保存后细胞的代谢活性和各种存储条件。此外，使用标准组织学(H&E)染色进行的独立组织形态学分析提供了关于这些过程是否在结构水平上引起移植物材料的可观察到的变化的证据。这项研究有利地使用了已经储存的在这样的时间内不间断的材料、以及相关的手术记录和标准化的制度方案。此外，关于所采用的冷冻保存和解冻方案、试剂和方法，比较组之间的处理方法和方案被标准化并相同地应用。结合起来，这允许对存储的持续时间进行单独的并行的评估，并且减轻了对结果进行建模或外推或者以其他方式使用规范的预测方法的需要。此外，在该同种异体皮肤移植模型中使用MHC匹配的和II类不匹配的供体-接受者对作为内部对照，既可确认七年前获得的组织的身份，又可证实手术记录和文献的准确性。此外，同种异体移植物表现出的等效行为也证明，没有由于存储的持续时间改变移植物的抗原性。
没有技术故障；所有移植物都粘附在各自的伤口床上并重新形成血管。在群组1(MHC匹配的供体-接受者对)中，所有移植物均保持附着状态，并在手术后(POD)第12天表现出一致的健康状态(图5A)，但在POD-14时观察到坏死、进行性红斑和附着丧失的迹象(图5B)。对群组1中的6个移植物的临床评估显示在POD-14至18时排斥。在群组2中，MHC II类不匹配的同种异体移植物表现与到POD-4时的自体移植物相当。然而，到POD-8时，所有同种异体移植物均表现出轻度红斑，与排斥一致，并被POD-10时认为完全排斥。在新鲜的、最近保存的和长期保存的皮肤移植物之间的持续时间、附着质量或细胞生存能力方面，没有观察到统计学上显著的差异。从统计学上讲，冷冻保存的材料比死的材料更有活力，并且这一发现在体内是凭经验证明的，因为所有7年的移植物均表现出对伤口床的附着和延长的存活力。非活的同种异体移植物未表现出这种存活力。在不限制本发明的情况下，将理解的是，本发明的冷冻保存的时间段可以例如包括长达约7年的任何时间长度。
材料和方法：
该研究是根据IACUC批准的协议(2005N000279，修订版69)在移植科学中心(Center for Transplantation Sciences)进行的，并且符合美国农业部(USDA)的《动物福利法》(Animal Welfare Act)(9CFR第1、2和3部分)、《实验动物的护理和使用指南》(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)以及所有州、地方法律和法规。研究方案、手术程序和动物护理指南由IACUC常设委员会独立审查和监控。
本实验中总共招募了八只猪，并且全部都是Sachs-NIH近交小型猪群体的成员。在手术时，所有猪的总体重在10与20-kg之间，并且年龄在2与4个月之间。在本实验期间的任何时间都未施用免疫抑制方案。将动物24074和24075指定为群组1，并且它们代表MHC匹配的供体-接受者对。将动物24043和24070指定为群组2，并且它们代表MHC II类不匹配的供体-接受者对。单独地，对于体外MTT系列分析，另外有五只野生型哥廷根小型猪为阳性和阴性对照提供了组织。
猪供体用I.M.2mg/kg的telazol(盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮，Zoetis Inc.,Kalamazoo,MI)麻醉，并送至手术室进行气管插管。使用2％的异氟烷和氧气维持麻醉。手术前用醋酸氯己定(NolvasanR Surgical Scrub,Fort Dodge Animal Health,Fort Dodge,IA)和10％聚维酮碘(Betadine Solution,Purdue Products,L.P.,Stamford,CT)对皮肤表面进行消毒。然后给动物披上帷帘，使背部的右侧暴露在外。使用深度设置为0.056-cm(0.022英寸)的空气驱动的Zimmer切皮刀(Medfix Solution,Inc.,Tucson,AZ)从每只动物的肩胛骨与最下肋骨的下缘之间收获测量为大约25cm2(表面积)的分层厚度皮肤移植物。
收获皮肤移植物后，意图用于冷冻保存的移植物和储存有限持续时间的移植物经历了标准化的制度方案，并在解冻前在-80℃下维持15分钟。长期冷冻保存的移植物已在-80℃下连续储存了超过7年的时段。将先前尺寸为大约25cm2的所有移植物放置在无菌尼龙网衬背上以进行结构支撑，并卷起以放置在层流通风橱下的螺纹密封冷冻小瓶中。一旦准备好所有移植物，就将大约5mL的冷冻介质添加到小瓶中并密封。该方案要求冷冻介质通过将15％二甲亚砜(DMSO)冷冻保护介质(Lonza BioWhittaker)与胎儿猪血清(FPS)或供体血清(如果没有FPS)以1:1的比率组合、过滤(0.45微米)并在使用前冷却至4℃来制备。随后将小瓶以每分钟1℃的速率在控制速率的相冷冻机中冷冻至-40℃，然后迅速冷却至-80℃的温度，在此温度下对照组中的经历有限的存储时间的那些检品保持15分钟，或者在暴露于延长的冷冻保存时间的测试组中的那些实验移植物的情况下保持超过7年的时段。DMSO在冷冻过程中会替换细胞内液体。以基于冷冻小瓶的最大内部体积(10ml)比异种移植制品的体积小约40-80％或50-70％的量使用冷冻保护介质(例如CryoStor)。
为了解冻用于外科手术用途的移植物，将密封的小瓶置于37℃水浴中大约1分钟，在这时将小瓶打开，并使用无菌技术取出冷冻的移植物。随后，将移植物在生理盐水中伴随轻轻搅动进行3次1分钟系列洗涤，以便稀释并系统地去除周围的残余DMSO，并防止细胞生存能力丧失。然后在25℃的生理盐水中将移植物带到手术区进行移植。
连续进行了两个单独但相同的手术事件。整个手术计划包括总共四只(n＝4)供体-接受者猪，两个实验群组(群组1和群组2)中的每一个使用两只动物，并如先前所述根据SLA配置进行有意配对。总共移植了四个技术对照和十二个(n＝12)实验移植物，并且随后进行了观察。
每只动物都沿动物的右背部以线性(从尾部到头颅)方向接受四个深度部分缺损，分别从1到4排列。在收获最初的分层厚度移植物之后，用切皮刀通过另外的途径通过外科手术引入了深度部分伤口缺损。所得的伤口床是均匀的、没有可见的碎屑，并且显示出独立的点状出血。这些缺损被打断，而不是用切皮刀以单一连续途径来完成。替代地，在总体尺寸、深度和解剖位置方面，小心地创建了四个分离的但等效的伤口。
在解冻后，但在移植前，使用15号(尺寸)刀片对所有分层厚度皮肤移植物进行开窗术，以防止血清肿或血肿形成。将移植物检品独立地放置于准备好的伤口床上，并使用简单、不匀称的3-0尼龙缝线将其均匀缝合在适当的位置，并以移植物至伤口床的方式进行应用。每个移植物引入大约16个固定点，并在移植物周围均匀分布，所得的结位于伤口边缘，而不是移植物制品上。该技术确保存在最小但足够的残余张力，并使残余张力均匀，这对于最佳的移植物至伤口的附着、血肿的最小化和最佳的移植物存活力是必需的。
在伤口部位1(最尾部)放置了一个分层厚度自体移植物，用作技术对照。在伤口床创建期间收获该自体移植物检品，随后与所有实验移植物同时进行相同的冻融过程，并在相同的冷冻保存状态下保持与对于有限持续时间鉴定的对照移植物相同的持续时间(在-80℃下保持15分钟)。在伤口部位2，将来自其相应群组配对配偶的分层厚度同种异体移植物缝合在适当的位置。该移植物代表检品暴露于冷冻保存有限的持续时间(在-80℃下持续15分钟)。在伤口部位3，来自野生型供体的分层厚度同种异体移植物，其代表具有与在冷冻保存状态下经历了“延长的”存储(在-80℃下超过7年)的伤口部位2的那些移植物相同的SLA匹配的分层厚度移植物。在伤口部位4(最头颅端)处，来自基因工程化敲除供体的分层厚度同种异体移植物，代表了具有与在冷冻保存状态(-80℃)下也经历了“延长”暴露超过7年的源自基因工程化供体动物的在伤口部位2处的那些移植物相同的SLA匹配的分层厚度移植物。
将覆盖的压力敷料(由Xeroform凡士林纱布(Medtronic)、TelfaTM非粘性敷料(Covidien,Minneapolis,MN)组成和无菌纱布)保持在适当的位置，并用多个重叠的TegadermTM(3M,St.Paul,MN)片干燥。然后接受者穿上棉外套，以减少对移植物的干扰。在POD-2时除去移植物敷料，并且此后每天更换。术后总随访时间为20天。监测动物的疼痛迹象，包括发音、呼吸急促、食欲不振以及态度、行为和活动性的变化。应用芬太尼透皮贴剂用于术后镇痛。所有缝线均在POD-7时除去。
为了验证该测定方法并建立对于分层厚度皮肤猪皮的检品特定的边界条件，对新鲜样品(n＝5、5)和热变性样品(n＝5、5)进行了两个独立的测定系列。新鲜样品上产生的(几何)平均甲臜分别为0.221±0.022-mg/mL和0.300±0.035-mg/mL。相比之下，热变性样品上产生的(几何)平均甲臜分别为0.094±0.020-mg/mL和0.105±0.009-mg/mL。这些差异在两种情况下均具有统计学显著性(p<0.05)。
所有四个猪接受者耐受外科手术，并且完全康复而没有事故。全部十六个(n＝16)移植物重新形成血管，没有技术并发症的迹象，并且一致地表现出对下面伤口床的附着(即“良好摄取”)。在术后观察期过程中，没有因机械干扰而丢失移植物，也没有表现出任何伤口感染的临床迹象。在伤口部位1的所有四个(n＝4)自体移植物均永久愈合，并且在研究终点与周围组织没有区别，从而用作皮肤移植、冷冻保存和解冻技术的技术对照。
在群组1中，所有六个(n＝6)同种异体移植物均表现出对下面伤口床的等效附着，并在术后(POD)第2天和第4天一致地表现出与血管形成和灌注一致的临床体征。然而，值得注意的是已经冷冻保存延长的持续时间的同种异体移植物所表现出的颜色的反差(丧失)。与在伤口部位2处的自体移植物和同种异体移植物相比，所有这四个移植物均显得更苍白。在这两个动物中到POD-6时这种外观在所有移植物中都被完全消除了。到POD-8时所有六个(n＝6)同种异体移植物均表现出浅表表皮的轻度脱落，但是在POD-12时进行检查时移植物仍保持有活力、附着并以其他方式看起来健康。在动物24074中，伤口部位2和3处的移植物到POD-14时显示出坏死、进行性红斑和附着丧失的初始迹象，并呈现出增加的免疫介导的排斥的迹象，直到在POD-18时最终排斥为止。然而，伤口部位4(最头颅端)处的同种异体移植物没有类似地持续；替代地在POD-14时该移植物变得显著更黑并表现出完全坏死的迹象，并在临床上被评估为此时完全被排斥。值得注意的是，从在POD-12时有生存能力到POD-14时完全撕裂，移植物4的迅速损失与在伤口部位2和伤口部位3处相异且截然不同。对于动物24075上的移植物，所有移植物在POD-14时均被排斥。
在群组2中，动物呈现与群组1中的那些相似(到POD-4时)，并且彼此等效。总体而言，在群组1中，临床体征的进展与轻度不匹配的移植物相当，但步伐加快。经历了延长冷冻保存的移植物在POD-2和POD-4时比未经历冷冻保存的移植物显得更苍白，并且所有移植物到POD-6时均显示出灌注和血管形成的证据增加。到POD-8时，动物24043中的所有三个同种异体移植物均显示出明显的排斥迹象，并被视为完全排斥。到POD-10时，在动物24070中，所有三个同种异体移植物均显示出明显的排斥迹象，并被视为完全排斥。然而，所有同种异体移植物以相同的比率的存活，而与遗传学或存储时间长度无关。
对于经历有限或延长的冷冻保存持续时间的移植物，在伤口部位2和3处100％的同种异体移植物比较物(n＝4个中的4)在移植物存活的持续时间的临床评估方面是相同的。伤口部位2和4的比较是一致的(n＝3)，例外是动物24074在伤口部位4的同种异体移植物，其存活直到POD-14(n＝1)，被确定为在其相似物前四天在临床上被排斥。
总体而言，组织学评估与临床评估密切相关。手术后，所有移植物(包括自体移植物)在POD-2和POD-4时的初步观察期间均表现出急性炎症的早期迹象，其后来随着时间的推移而消退。与群组1中的那些相比，群组2中的所有同种异体移植物均一致地表现出加速的向免疫介导排斥的进展。
最终，群组1中的所有六个(n＝6)同种异体移植物和群组2中的动物24043的三个同种异体移植物(n＝3)独立地表现出与独立的总体临床评估毗连的组织学和显微镜排斥迹象。唯一的例外是在动物24070上植入的三个同种异体移植物，其中每个移植物在POD-10时获得4的班夫得分(共4分)，但直到POD-12时才被正式认为排斥，这比在POD-10时指定的对应临床名称晚了一个评估期(2天)。
对于经历有限或延长的冷冻保存持续时间的移植物，在伤口部位2和3处100％的同种异体移植物比较物(n＝4个中的4)在移植物存活的持续时间的组织学评估方面是相同的。伤口部位2和4的比较是一致的(n＝3)，例外是动物24074在伤口部位4的同种异体移植物，其在手术后14天存活(n＝1)，被确定为在其对应物前四天在组织学上被排斥。
如在任一种测试场合中应用的，MTT或中性红色染色技术都被认为进行组织学和显微镜评估无效，然而标准的苏木精和曙红染色证明了可观察到的热变性标本的组织破坏。
总体而言，使用具有随机截距的线性混合效应模型，在伤口部位3处的移植物的平均存活在比伤口部位2处的同种异体移植物的平均存活少了0.00天(95％CI：-1.10天，1.10天)。在伤口部位4处的移植物的平均存活比在伤口部位2处的同种异体移植物的平均存活少2.00天(95％CI：1.10天，3.10天)。组织学评估发现比总体评估的移植物平均多0.5天的存活，但是这在统计学上没有区别(p＝0.28)。八个实验移植物中的七个与它们的比较物表现相当。体内实验表明，经历短期存储与长期存储的移植物之间无统计学差异。除了在动物24074上在伤口部位4处的移植物被评估为比其比较物早四天被完全排斥外，移植物性能和存活力在两组之间没有区别。
如以前的出版物所述，在早期吸入和血管形成期间，冷冻保存的移植物显得明显更苍白。对于所有动物的伤口部位3和4处的移植物，这种对比都十分明显。最终，移植物完全消退，并以等效的程度附着在下面的伤口床上。
在三种独立的评估方法中，一致地证明了所表现的生存能力。MTT测定的统计学分析表明，在冷冻保存的标本和新鲜标本之间没有显著差异(图6A)，但是在新鲜标本和冷冻保存的标本与热变性标本之间观察到显著差异(图6B)。这在广义上表明，从统计学上讲，冷冻保存的材料比死的材料更有活力。该结果在体内结果中得到了证实，在所述体内结果中，所有7年移植物均表现出对伤口床的附着和延长的存活力，非活的移植物则不会表现出这种结果。
关于MTT还原测定，在标本与标本之间以及在群组与群组之间，由此类测定产生的绝对值之间存在相当大的变异性。实际上，甲臜产生的绝对值事实上比非冷冻保存的样品获得的那些更高；冷冻不可能增强细胞活性。
可以将猪皮冷冻保存多年，例如1、3、5、7年或更长时间，并保留细胞生存能力，并且遗传修饰Gal-T-KO当与使用相同的程序处理和储存的野生型猪皮相比时不会影响代谢稳定性。
此外，在该同种异体皮肤移植模型中使用MHC匹配的和II类不匹配的供体-接受者对作为内部对照以比较长期冷冻保存(7年)对同种异体皮肤移植物存活的影响。在长期冷冻保存后的细胞生存能力数据受到体内皮肤存活的支持。这也证明了移植物的遗传差异(野生型与Gal-T-KO)不影响移植物的存活。
假设是移植物摄取和总体存活与存储持续时间的长度成反比。换句话说，预期移植物被冷冻的时间越长，其存活并模仿保存较短持续时间的比较移植物的可能性越小。令人惊讶地，这些研究揭示，在本公开的情况下，可以将猪组织冷冻保存显著的时间(7年)，并保持足够的细胞生存能力。此外，当与经过相同处理的野生型皮肤相比时，遗传修饰(Gal-T-KO)不影响代谢活性。最后，结果证实了MTT还原测定能够可靠地提供一种准确、有用的诊断方法，并且适用于评估猪皮移植物的生存能力。
这项研究的有希望的结果表明，将猪皮冷冻保存和储存后勤相关的持续时间可能是可行的，并且我们的发现与当前的行业实践以及美国组织库协会(AmericanAssociation for Tissue Banks)针对人体尸体组织建立的多年“保质期”指南一致。
此外，这些数据表明，公开了保存和储存具有足够生存能力的猪异种移植制品的可扩展的、临床上有用的方法，并且可以有效地储存和分配活的猪异种移植制品。
实施例7
将理解的是，在猪至人异种移植的上下文中，每个人接受者将具有该个体独特的主要组织相容性复合物(MHC)(I类、II类和/或III类)，并且将不匹配供体猪的MHC。因此，将理解的是，当将供体猪移植物引入接受者时，猪MHC分子它们本身充当抗原，引起来自接受者的免疫反应，从而导致移植排斥。
人白细胞抗原(HLA)基因在人群体中显示出难以置信的序列多样性。例如，仅HLA-B基因就有>4,000个已知的等位基因。据信，HLA基因中的遗传多样性(其中不同等位基因具有呈递不同抗原的不同效率)是进化赋予针对人所暴露的各种不同病原体的更好的群体水平抗性的结果。这种遗传多样性在异种移植期间也呈现出问题，其中接受者的免疫反应是决定植入结果和移植后存活的最重要因素。
根据本发明的一个方面，向供体猪提供了被生物工程化以表达一组特定的已知人HLA分子的基因组。例如在IPD-IMGT/HLA数据库(可获自ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)和international ImMunoGeneTics information (可获自imgt.org)中可获得此类HLA序列。例如，HLA-A1、B8，DR17是白种人中最常见的HLA单倍型，频率为5％。因此，可以使用已知的MHC/HLA序列信息结合本文提供的公开内容来执行所公开的方法。
在一些方面，鉴定出接受者的人白细胞抗原(HLA)基因和MHC(I类、II类和/或III类)并对其进行作图。将理解的是，能以本领域已知的任何方式来确定人接受者的HLA/MHC序列。例如，HLA/MHC基因通常用靶向测序方法(长读段测序或长插入短读段测序)进行分型。常规上，已经以2位数分辨率(例如，A*01)确定了HLA类型，其近似于血清抗原分组。最近，已经将序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)方法用于以4位数分辨率(例如，A*01:01)进行HLA分型，这可以区分氨基酸差异。当前，与其他常规方法相比，用于HLA分型的靶向DNA测序是最流行的HLA分型方法。由于基于序列的方法直接确定编码区域和非编码区域，因此其可以实现分别以6位数分辨率(例如A*01:01:01)和8位数分辨率(例如A*01:01:01:01)进行HLA分型。从临床角度来看，以最高分辨率进行HLA分型期望将现有HLA等位基因与新等位基因或无效等位基因区分开。此类测序技术描述于例如Elsner HA,Blasczyk R:(2004)Immunogenetics of HLA null alleles:implications for blood stem celltransplantation.Tissue antigens.64(6):687-695；Erlich RL等人(2011)Next-generation sequencing for HLA typing of class I loci.BMC genomics.12:42-10.1186/1471-2164-12-42；Szolek A等人(2014)OptiType:Precision HLA typing fromnext-generation sequencing data.Bioinformatics 30:3310–3316；Nariai N等人(2015)HLA-VBSeq:Accurate HLA typing at full resolution from whole-genomesequencing data.BMC Genomics 16:S7；Dilthey AT等人(2016)High-accuracy HLA typeinference from whole-genome sequencing data using population referencegraphs.PLoS Comput Biol12:e1005151；Xie C.等人(2017)Fast and accurate HLAtyping from short-read next-generation sequence data with xHLA 114(30)8059-8064中，将所述文献中的每一篇以全文引用的方式并入本文。
已知的人HLA/MHC或单个接受者的测序的HLA/MHC序列可以用作模板来修饰猪白细胞抗原(SLA)/MHC序列以与已知的人HLA/MHC序列或人接受者的HLA/MHC序列匹配，例如具有90％、95％、98％、99％或100％的序列同源性。在鉴定待使用的已知人接受者HLA/MHC序列或对人接受者进行基因测序以获得HLA/MHC序列后，可以根据所需的HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行生物学重新编程。例如，向本公开的猪施用几种靶向引导RNA(gRNA)序列，以用人接受者的模板HLA/MHC序列对猪细胞中的SLA/MHC序列进行重新编程。
将CRISPR-Cas9用于介导猪细胞中特定天然基因座上整个MHC等位基因的快速且无痕的交换。使用具有两种gRNA的Cas9多重靶向来引入MHC等位基因侧翼的单链断裂或双链断裂，从而使得能够用模板HLA/MHC序列(以单链或双链DNA模板提供)替换。在某些方面，将CRISPR/Cas9组分注射入猪卵母细胞、卵子、合子或胚细胞中，然后转移到寄养母亲体内。
在某些方面，本公开包括无SLA和表达HLA的生物学重新编程猪的胚胎发生和活产。在某些方面，本公开包括对无SLA和表达HLA的生物学重新编程的猪进行配种，以产生无SLA和表达HLA的后代。在某些方面，通过猪合子的胞质内显微注射将CRISPR/Cas9组分注射到猪合子中。在某些方面，在对CRISPR/Cas9遗传修饰的猪进行选择性配种之前，将CRISPR/Cas9组分注射到猪中。在某些方面，在从猪收获细胞、组织、合子和/或器官之前，将CRISPR/Cas9组分注射到供体猪中。在某些方面，CRISPR/Cas9组分包括用于受控基因编辑的所有必需组分，所述受控基因编辑包括利用控制性gRNA分子的自灭活，如美国专利第9,834,791号(Zhang)所述，所述专利以全文引用的方式并入本文。
可以利用已知的基因组编辑技术进行遗传修饰，所述基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、腺相关病毒(AAV)介导的基因编辑以及成簇的规则间隔回文重复序列Cas9(CRISPR-Cas9)。这些可编程核酸酶能够实现DNA双链断裂(DSB)的靶向产生，这促进了细胞修复机制的上调，从而导致非同源末端连接(NHEJ)或同源指导的修复(HDR)的易错过程，后者可以用于整合外源供体DNA模板。CRISPR-Cas9也可以用于去除细胞中的病毒感染。例如，能以在以下文献中所描述的方式进行经由CRISPR-Cas9的遗传修饰：Kelton,W.等人,“Reprogramming MHC specificity by CRISPR-Cas9-assisted cassette exchange,”Nature,Scientific Reports,7:45775(2017)(“Kelton”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，本公开包括使用CRISPR-Cas9重新编程以介导整个等位基因(例如MHC、HLA、SLA等)的快速且无痕的交换。
在一个方面，对接受者的HLA/MHC基因进行测序，并根据接受者的HLA/MHC基因制备模板HLA/MHC序列。在另一个方面，来自WHO数据库的已知人HLA/MHC基因型可以用于本公开的猪的遗传重新编程。例如，使用聚合酶链式反应制备CRISPR-Cas9质粒，并将接受者的HLA/MHC序列作为模板克隆到质粒中。鉴定猪细胞中SLA/MHC基因座上的CRISPR切割位点，并将靶向切割位点的gRNA序列克隆到一种或多种CRISPR-Cas9质粒中。然后将CRISPR-Cas9质粒施用于猪细胞中，并在猪细胞的MHC基因座处进行CRIPSR/Cas9切割。
猪细胞中的SLA/MHC基因座被与已知的人HLA/MHC序列或接受者的测序HLA/MHC基因匹配的一个或多个模板HLA/MHC序列替换。在执行SLA/MHC重新编程步骤之后对猪细胞进行测序，以便确定是否已成功重新编程猪细胞中的HLA/MHC序列。来自HLA/MHC序列重新编程的猪的一种或多种细胞、组织和/或器官被移植到人接受者中。
在某些方面，在将HLA/MHC序列重新编程的猪用作在异种移植中使用的活组织、器官和/或细胞的来源之前，使它们繁殖至少一代或至少两代。在某些方面，CRISPR/Cas9组分也可以用于灭活负责PERV活性的基因，例如pol基因，从而同时从猪供体中完全消除PERV。
出于修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC的目的，已对人和猪组织相容性复合物的比较基因组组织进行作图。例如，这种SLA到HLA作图可以在以下文献中找到：Lunney,J.,“Molecular genetics of the swine major histocompatibility complex,the SLAcomplex,”Developmental and Comparative Immunology 33:362-374(2009)(“Lunney”)，所述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。因此，鉴于本公开并使用Lunney等人的作图作为参考工具，本领域普通技术人员有效且高效地对猪细胞进行遗传重新编程。
修饰供体SLA/MHC以匹配接受者HLA/MHC使得与已知人基因型或特定人接受者的MHC分子相同或几乎相同的来自猪细胞的特定MHC分子表达。在一个方面，本公开涉及对仅限于猪基因组的特定SLA区域的特定部分进行修饰以在猪中保持有效的免疫特性，同时当生物制品被移植到人接受者中时是低免疫原性的，使得可以减少或避免免疫抑制剂的使用。与本公开的方面形成对比，现有技术的异种移植研究需要使用免疫抑制剂来抵抗排斥。在一个方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G。在一些方面，猪基因组被重新编程以敲除与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-F、DQ和DR对应的猪基因，以及敲入HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-F和DQ。在一个方面，猪基因组被重新编程以敲除SLA-11；SLA-6,7,8；SLA-MIC2；和SLA-DQA；SLA-DQB1；SLA-DQB2，以及敲入HLA-C；HLA-E；HLA-G；和HLA-DQ。在某些方面，降低在重新编程的猪基因组中的HLA-C表达。通过对猪细胞进行重新编程以使其对人的免疫系统不可见，这种重新编程由此可以最小化甚至消除免疫反应，所述免疫反应基于供体猪细胞原本表达的猪MHC分子原本发生。
因此，将理解的是，这方面(即，将SLA/MHC重新编程以表达专门选择的人MHC等位基因)当应用于用于异种移植目的的猪细胞、组织和器官时与来自缺乏这种重新编程的野生型猪或以其他方式遗传修饰的猪(例如转基因猪或具有非特定或不同遗传修饰的猪)的细胞、组织和器官相比将减少排斥。
将进一步理解的是，结合供体猪细胞中的α-1,3-半乳糖基转移酶、Neu5Gc和β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(B4GALNT2)的消除(例如，“单敲除”、“双重敲除”或“三重敲除”)，使供体猪细胞、组织和器官表达具体如本文所述的已知的人MHC基因型或接受者的MHC呈现出与缺乏本公开的特定SLA/MHC重新编程的三重敲除猪相比其细胞将具有降低的免疫排斥的一种猪。
实施例8
制备并测试猪细胞中的各种细胞标志物组合，以制备人患者身体所接受的生物学上重新编程的猪细胞用于各种用途。对于这些测试，使用可从(3D4/21)获得的猪主动脉内皮细胞(PAEC)和/或转化的猪巨噬细胞细胞系。待测试的细胞样品包括以下这些：
1.PAEC野生型；
2.PAEC II类SLA DQ敲除(KO)；
3.PAEC II类SLA DQ KO+HLA DQ敲入(KI)；
4.PAEC II类SL DR敲除(KO)；
5.PAEC II类SLA DR KO+HLA Dr敲入(KI)；
6.PAEC II类SLA DP敲除(KO)；和
7.PAEC II类SLA DP KO+HLA DP敲入(KI)。
或者对于3D4/21细胞：
1)敲除表面糖聚糖(GGTA1、CMAH和B4GALNT2)
2)敲除所有MHC I
3)试验1
a.敲除DP、DQ和DRα
b.将DRβ替换成其人等效物
4)试验2
a.敲除DQ、DR和DPα
b.将DPβ替换成其人等效物
5)试验1
a.敲除DR、DP和DQα
b.将DQβ替换成其人等效物
仅敲除和敲除加敲入细胞集合是通过设计和合成靶基因的引导RNA产生的。每个引导RNA由两种组分构成：CRISPR RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)。这些组分可以连接形成称为单引导RNA(sgRNA)的连续分子，或者退火形成两片式引导(cr:tracrRNA)。
可以将CRISPR组分(gRNA和Cas9)以DNA、RNA或核糖核蛋白(RNP)复合物形式传递至细胞中。DNA形式涉及将gRNA和Cas9序列克隆到质粒中，然后将所述质粒引入细胞中。如果需要永久表达gRNA和/或Cas9，则可以使用慢病毒将DNA插入宿主细胞的基因组中。可以酶促地(通过体外转录)或合成地产生引导RNA。合成的RNA通常比IVT衍生的RNA更纯，并且可以进行化学修饰以抵抗降解。Cas9也可以作为RNA递送。核糖核蛋白(RNP)形式由gRNA和Cas9蛋白组成。将RNP预先复合在一起，并且然后引入细胞中。这种形式易于使用，并且已被证明在许多细胞类型中都非常有效。
在设计并产生引导RNA之后，通过几种可能的转染方法之一将CRISPR组分引入细胞中，所述可能的转染方法诸如脂质转染、电穿孔、核转染或显微注射。在将引导RNA和Cas9引入细胞培养物中之后，它们在一些细胞内的靶位点处产生DSB。然后，NHEJ途径修复断裂，从而可能在该过程中插入或缺失核苷酸(插入缺失)。由于NHEJ可能不同地修复每条染色体上的靶位点，因此每个细胞可能具有不同的插入缺失集、或插入缺失和未编辑序列的组合。
对于敲入细胞，使用例如同源定向修复(HDR)通过插入基因组材料将所需序列敲入细胞基因组中。为了优化II类分子的表达，将细胞在猪干扰素γ(IFN-γ)中孵育72小时以刺激表达。然后使用靶标特异性抗体通过流式细胞术测量表达。流式细胞术可以包括抗HLA-C、HLA-E、HLA-G或其他HLA抗体，或泛抗HLA I类或II类抗体。根据本公开，证实了敲入后的细胞表面HLA表达。
可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定以确定抗HLA抗体是否识别来自本公开的生物制品的细胞。可以使用通过添加含有先前表征的抗HLA抗体(或对照血清)的特定人血清制备的测定板。将经IFN-γ处理的供体细胞重悬并添加至测定板中，与补体来源(例如兔血清)一起孵育。在室温下孵育至少1小时之后，添加吖啶橙/溴化乙锭溶液。通过以下方式确定细胞毒性百分比：对在荧光显微镜下可视化的死细胞和活细胞计数，减去在不存在抗HLA抗体的情况下获得的自发裂解值，并用量表评分。
对于3D4/21细胞：
当敲除表面糖聚糖时，获得了不表达糖部分的细胞系，因此在人血清中不存在天然的预先形成的抗体的结合。这是使用流式细胞术和人血清以及标记的山羊抗人IgG或IgM抗体；或者针对糖的特异性抗体来检测的。结果是没有抗体与最终细胞系的结合。阳性对照是没有遗传修饰的原始细胞系(WT)。此外，分子分析证明了那些基因的变化。
在使用CRISPR技术敲除SLA I类分子的表达时，所得的细胞系缺乏上述糖部分以及SLA I类表达。通过流式细胞术和分子基因进行分析以证明没有表面表达和在基因水平上进行的变化。使用与人PBMC和受辐照的细胞系的混合淋巴细胞反应(MLR)评估细胞反应性。与WT细胞系相比，存在T细胞增殖(主要是CD8+T细胞)的减少。
通过仅敲除异二聚体的α基因来进行SLA II类分子DR和DQ的表达。因为没有猪DP，所以所得的细胞系缺乏任何MHC分子的表达。在分子水平、细胞表面表达以及与人PBMC的体外反应性上进行分析。存在针对所得细胞系的反应性的显著向下调节。
人II类DRβ基因被敲入。进行了类似的分析，但也将使用具有相同DRβ的人供体。由于α分子的高度同源性，猪DRα预期与人DRβ结合并在细胞表面上表达，具有相同DR的供体预期不发生反应。在一些方面，DR的人α基因和β基因二者都被敲入。对敲入的DPβ和DQβ基因进行了类似的试验。
对于PAEC：
为了测试细胞反应性，将PAEC与猪IFN-γ一起孵育72小时，然后将人CD4+T细胞添加到PAEC中并培养7天。读数是激活/增值的形式，这取决于可用的资源。
可能的观察结果是：
1.未刺激的WT PAEC：无反应
2.刺激的PAEC：阳性反应
3.刺激的II类SLA DQ KO：无反应
4.刺激的II类SLA DQ KO+HLA DQ KI：与#2相比无反应或减少的反应。
为了观察对DQ的特异性反应，在培养物中不存在人抗原呈递细胞(APC)，使得细胞反应不是由APC呈递的猪抗原的结果。
在确认研究结果后，繁殖遗传重新编程的猪，以便繁殖几个猪群体，每个群体都具有从上述测定中确定的所需人细胞修饰中的一种。研究猪在完全生长后的细胞活性，以确定所述猪是否表达所需的性状以避免异种移植后对猪细胞和组织的排斥。此后，繁殖具有超过一种所需人细胞修饰的进一步遗传重新编程的猪，以获得表达在异种移植后将不被人患者身体排斥的细胞和组织的猪。
可以在与医疗制品相关的各种文档中描述任何上述方案或其类似变体。此文档可以包括但不限于方案、统计分析计划、研究人员手册、临床指南、药物指南、风险评估和调解程序、处方信息以及可能与药物制品相关的其他文档。特别预期的是，这样的文档可以与细胞、组织、试剂、装置和/或遗传物质一起作为试剂盒物理包装，这可能是有益的或者由监管机构提出。
实施例9
制品处理
一般而言
根据以下程序处理本公开的异种移植制品。
人员
操作员按照制度标准穿着无菌衣服，以维持无指定病原体条件。操作员戴上针对紫外光和激光的护眼安全眼镜。
层流通风橱的准备和制品处理
在层流通风橱中设置了紫外激光灯(型号#)。灯的四个角中的每个角都放置在两个彼此叠置的容器盖子上，即，使用四对盖子来支撑灯。从灯泡(总共2个灯泡管)到通风橱底部的距离为大约1.5英寸。通风橱的整个内部都喷有酒精，例如乙醇或异丙醇。打开灯，并且操作员根据灯的规格、灯泡数量以及灯泡与异种移植制品之间的距离，计算所需暴露的时间。
操作员将两个浴(一个氯己定和一个酒精)倒入两个单独的碗中，并将所述两个碗放在通风橱下。
将一包新的灭菌小瓶放置在通风橱下。拧开小瓶盖并将其放入氯己定浴中。然后将每个小瓶(不带盖)倒置，并将开口端投入氯己定浴中，每次一分钟，然后直立放置以风干。此后，利用无菌纱布用氯己定和酒精擦拭每个小瓶的外部。从氯己定浴中取出小瓶盖，并放在无菌纱布上。将每个小瓶的开口端分别投入酒精浴中1分钟，然后静置风干。
将具有根据实施例2制备的网衬背的异种移植制品“#46制品”(5x15cm)从其原始小瓶中取出，并且操作员将原始小瓶置于空碗中。操作员将#46制品置于打开的消毒器械包装的纸面上。操作员展开#46制品并将其放置在灯下持续2分钟，然后将其翻转到另一侧，取下网衬背，并且将其相反侧放在灯下持续2分钟，同时仍在同一张纸上。基于特定的生物剂或待灭菌的生物剂的类型可以改变将给定样品暴露于UV光的时间，例如，如下表13所示：
表13
*使用125uW/cm2的UV-C强度
然后取出“#46制品，并切成两半。用手将每半部分卷起并放在如上所述进行灭菌的新小瓶中。将每个新的盖放在每个新的小瓶上，并牢固地拧紧。将每个小瓶放置在灯下，并定期滚动以使小瓶的外部均匀地暴露于光。将小瓶放置在玻璃罐中，所述玻璃罐的内部先前已灭菌并且外部已由操作员使用酒精和氯己定进行灭菌(包括螺纹和盖)。
对以下异种移植制品进行类似的处理，不同之处在于代替在进入灯下之前放置在无菌纸上，不将网从制品上取下并将制品皮肤侧朝上放置在灯下持续2分钟，然后将制品折叠起来使得每个制品的底部部分的第一半面向灯2分钟，然后将每个制品的第二半折叠起来使得每个制品的底部的另一半面向灯2分钟。一些制品被切成较小的部分并暴露在光下，一些制品持续长于2分钟，但从不少于2分钟。
使制品#40(5x15cm)、#63(10x15cm)、#69(10x15cm)和#25经过上述过程，并且将制品#69和#25仅使用器械卷起，操作员未直接处理那些制品。与#46一样，在操作员将盖牢固地拧紧在每个小瓶上之后，将每个小瓶放置在灯下并滚动以均匀暴露于灯发出的光。随后将小瓶从灯下移开，并在放入玻璃罐中之前用酒精擦拭。
利用四个玻璃罐来储存每组小瓶。在交给操作员之前，助手通过喷瓶用酒精将玻璃罐的外部浸透。助手通过握住每个罐的底部并在通风橱外面交给操作员来将玻璃罐交给操作员。在从助手那里接收到玻璃罐后，操作员在通风橱下浸浴玻璃罐盖子，并将罐的开口端投入酒精中并用酒精擦拭罐的外部，包括罐的螺纹。
利用纱布用酒精擦拭小瓶，并将其用器械将其放入每个玻璃罐中。然后固定玻璃罐的盖子，并且将罐交给助手。在所有这些过程中，助手会频繁并定期用酒精喷雾操作员的手套和手臂。
此后，在程序结束时将制品放入相冷冻机中。
实施例10
进行了一项临床试验以评估用于覆盖严重且广泛的深度部分厚度和全层厚度烧伤伤口的异种移植皮肤的安全性和耐受性。
主要终点包括评估当在自体移植物放置之前作为严重且广泛的深度部分厚度或全层厚度烧伤伤口的临时覆盖应用时的28天之后本公开的异种移植皮肤制品的安全性和耐受性。安全性终点包括不良事件的发生率和严重程度；身体检查的变化；生命体征的变化；心电图的变化；血液学、血清化学、尿液分析的变化；接受者外周血中存在的猪内源性逆转录病毒(PERV)RNA的发生率(如通过RT-PCR测定所证明的)；以及局部感染的发生率和严重性。PERV测试包括针对PERV DNA序列对受试者PBMC进行PCR、针对PERV RNA对受试者PBMC进行RT-PCR、以及对PERV特异性抗体的血清学分析。
次要终点包括：1)当在自体移植物放置之前作为严重且广泛的深度部分厚度或全层厚度烧伤伤口的临时覆盖应用时的本公开的异种移植皮肤制品的长期安全性和耐受性；2)评估由本公开的异种移植皮肤制品提供的临时屏障功能的持续时间；3)表征在用本公开的异种移植皮肤制品治疗的部位处的局部伤口感染的发生率；4)评估去除本公开的异种移植皮肤制品的容易性和方法；5)从伤口清创术后初始移植物放置的时间到有效屏障功能丧失的时间，通过植入本公开的异种移植皮肤制品，表征和描述提供给所述受试者的临时屏障功能的进展和质量，所述有效屏障功能丧失起因于：通过移植物-宿主免疫反应(如通过临床伤口评估量表确定的)的移植物排斥的时间；机械干扰或破坏(剪切力或血肿)；或按照研究者的指示，有意将其去除以与受试者的总体临床过程一致。
进一步的目标包括：探索如与用人尸体同种异体移植物治疗的相似伤口部位相比在用本公开的异种移植皮肤制品治疗的部位处在自体移植物放置后最终伤口闭合的发生率并表征其质量；探索如与用人尸体同种异体移植物治疗的类似伤口部位相比在用本公开的异种移植皮肤制品治疗的部位处的肥大性疤痕形成的发生率和质量，以及探索如与用人尸体同种异体移植物治疗的相似伤口部位相比在用本公开的异种移植皮肤制品治疗的部位处的疤痕形成的严重性。使用改良的温哥华疤痕量表(modified Vancouver ScarScale，mVSS)评估疤痕形成的发生率和严重性。下表14中显示了mVSS：
表14
图例：0＝最佳；12＝最差
将本公开的异种移植皮肤制品包装在具有带螺纹的密封盖的透明塑料的、带外螺纹的聚丙烯小瓶中，储存在制品真皮侧的卷起的无菌尼龙网衬背上，所述背衬用于在处理和运输过程中支撑和保护制品。将每个制品单独浸入具有5％二甲亚砜(DMSO)的无菌冷冻保护介质中。此过程中不包括或使用源动物血清。内容物通过控制速率的相冷冻机冷冻保存，并储存在-80℃下直至使用。
将制品放置在烧伤伤口上，并通过缝合或闭合固定在适当的位置。制品保留在原位直到不再为伤口床提供有效的屏障功能，这起因于以下原因之一：通过移植物-宿主免疫反应的制品排斥的时间(如通过临床伤口评估量表确定的)；机械干扰或破坏(剪切力或血肿)；或与受试者的总体临床过程一致的有意去除。使用整个研究期间各时间点收集的血液样品通过被动和主动筛选程序(包括进行免疫原性测试)对受试者进行监测。免疫原性监测包括测定血清总IgG和IgM水平、人抗猪抗体、以及确定是否正在发生细胞介导的免疫反应的测定。
临床伤口评估量表在图32中示出。血液学测试包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)(差异(％和绝对值))、血红蛋白、血细胞比容、血小板、凝血酶原时间(PT)/国际归一化比率(INR)。血清化学测试包括ALT、白蛋白、碱性磷酸酶淀粉酶、脂肪酶、AST、总胆红素直接胆红素总蛋白肌酐、血尿素氮肌酸激酶、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、钾、钠、葡萄糖、氯化物、碳酸氢盐、钙。尿液分析测试包括pH、比重、蛋白质、葡萄糖、血液、亚硝酸盐。
基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到0、1或2级的移植物脱位。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到3、4或5级的移植物附着。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到3或4级的肉芽组织。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到0、1或2级的过度肉芽形成。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到0、1或2级的血肿。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到0、1或2级的纤维蛋白沉积。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到正常或粉色血管分布。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到正常、混合型或色素沉着不足。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到正常或坚固的柔韧性。基于非人灵长类动物的结果，预期将观察到平的或<2mm的疤痕高度。
实施例11
将根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的异种肾移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少十四个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
实施例12
将根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的异种肺移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少30天的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少3个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少6个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少12个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
实施例13
将根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的异种肝移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60天的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少3个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少6个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少12个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
实施例14
将根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的异种心脏移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少20个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
实施例15
将根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的异种神经组织移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少75天的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少3个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少6个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少12个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
实施例16
将根据本发明生产的源自DPF封闭群体α-1,3-半乳糖基转移酶[Gal-T]敲除猪的异种胰腺移植到非人灵长类动物和人中。预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少20个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少24个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少36个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少48个月的存活。在一些方面，预期在非人灵长类动物和人中的每一者中都观察到至少60个月的存活。
虽然已经参考某些说明性方面(包括特征的各种组合和子组合)相当详细地描述和示出了本公开的主题，但是本领域技术人员将容易理解涵盖在本公开的范围内的其他方面及其变化和修改。此外，对这些方面、组合和子组合的描述并非旨在传达所要求保护的主题需要除了明确叙述于权利要求中的那些之外的特征或特征的组合。因此，本公开的范围旨在包括所附权利要求的精神和范围内的所有修改和变型。
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