阅读说明：本技术 干细胞的保存 (Preservation of Stem cells ) 是由 P·圣祖德洛 I·卡拉什琴斯卡 于 2020-01-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及干细胞保存领域,特别地涉及包含分子量为约35000Da的聚乙二醇(PEG)的水溶液作为用于保存干细胞的细胞外试剂的用途。(The present invention relates to the field of stem cell preservation, in particular to the use of an aqueous solution comprising polyethylene glycol (PEG) having a molecular weight of about 35000Da as an extracellular agent for the preservation of stem cells.)

具体实施方式

本主题发明是基于其发明人的观察而开发的，所述观察是包含具有限定的分子量的聚乙二醇(PEG)的水溶液允许有效保存干细胞，同时保持它们的活力。

在根据本主题发明的用途中，使用分子量约为35000Da(35kDA)的PEG(也称为PEG35)。根据本发明使用的PEG可以通过任何已知方法获得，其中优选地，所述PEG可以由具有较低分子量的PEG分子合成。在本发明的其他优选实施方式中，可以通过现有技术中已知的任何已知技术来纯化PEG。在本发明的特别优选实施方式中，可以使用可商购的PEG。

根据本发明，PEG优选地以约0.01mmol/l至约5mmol/l的浓度使用，例如以0.02mmol/l、0.03mmol/l、0.04mmol/l、0.05mmol/l、0.06mmol/l、0.07mmol/l、0.08mmol/l、0.09mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l、0.8mmol/l、0.9mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l、3.0mmol/l、3.5mmol/l、4.0mmol/l、4.5mmol/l和5mmol/l的浓度使用。在本发明的特别优选实施方式中，PEG浓度低于1mmol/l并且最优选地为约0.03mmol/l。

根据本主题发明，所使用的水溶液被用作细胞外试剂，即其中钠离子(Na⁺)大于钾离子(K⁺)浓度的试剂。这种类型的试剂通过减少细胞内冰的形成来防止细胞在储存过程中死亡。

在本发明的优选实施方式中，所述溶液含有至少约30mmol/l浓度的Na⁺离子以及至少约10mmol/l浓度的K⁺离子。在本发明的最优选实施方式中，所述溶液含有约125mmol/l浓度的Na⁺离子以及约25mmol/l浓度的K⁺离子。

优选地，以氢氧化钠(NaOH)的形式引入钠离子，而以磷酸二氢钾(KH₂PO₄)的形式引入钾离子。

在本发明的特别优选实施方式中，除了上述组分(即PEG、钠离子和钾离子)外，所述溶液可以含有在细胞储存配制品领域中使用的其他组分，即包含不可渗透阴离子的试剂、来自糖类(the group of sugars)的化合物、膜稳定剂/缓冲溶液和能量源。

在本发明的特别优选实施方式中，提及的溶液包含：

其中

所述溶液的pH在约6,5至约8的范围内，以及

所述溶液的渗透压在约290mOsm/kg至约320mOsm/kg的范围内。

不可渗透细胞膜的阴离子(其作用是防止低温引起的细胞肿胀)是乳糖酸或其盐。

棉子糖的功能是另外的渗透支持。在本发明的优选实施方式中，使用棉子糖五水合物(棉子糖·5H₂O)。

膜稳定剂是硫酸镁，优选地硫酸镁七水合物(MgSO₄·7H₂O)，其起作用以稳定细胞膜的电化学平衡，这决定Na⁺离子、K⁺离子、磷离子和Ca²⁺离子的适当转运。

KH₂PO₄是缓冲系统，其作用是维持溶液的pH，从而提供酸/碱平衡。另外地，它还向溶液提供钾离子。

谷胱甘肽和别嘌呤醇是对抗自由基形成和作用的试剂。

腺苷是ATP前体的来源，作为能量源。

用于制备根据本发明使用的溶液的水是药学上可接受的注射用水。

在本发明的最优选实施方式中，提及的溶液包含：

以及

其量足以获得pH约7.4的NaOH、以及

注射用水，

其中所述溶液具有300mOsm/kg的渗透压并且包含约125mmol/l的Na⁺离子。

当根据本主题发明的用途旨在用于冷冻保存时，需要添加冷冻保护剂。冷冻保护剂可以是冷冻保存配制品中使用的这种类型的任何组分，其中优选地是二甲亚砜(DMSO)。优选地，基于溶液的总体积，二甲亚砜(DMSO)以约5体积％至约20体积％的浓度使用，最优选地以约10体积％的浓度使用。

根据本发明使用的溶液不含有单独添加的钙离子或作为包括在所提及的溶液的组成中的化合物的组分而添加的钙离子。用于制备根据本发明使用的溶液的注射用水也不含有所述离子。

根据本发明，上文和下文中使用的术语“约”应理解为与给定值的+/-5％的偏差，反映了在制造本发明组合物的过程中，例如在测量溶液的组分期间可能出现的不精确。

实施例

实施例1

用于干细胞保存的溶液

在与干细胞保存有关的实验中，使用了具有以下组成的配制品StoreProtectPlus(制造商：Carnamedica)：

以及

其量足以获得pH约7.4的NaOH、

注射用水，

实施例1的溶液表现出约300mOsm/kg的渗透压，并且包含浓度约为120mmol/l的钠离子(Na⁺)以及浓度约为25mmol/l的钾离子(K+)。

实施例2

用于干细胞冷冻保存的溶液

在与干细胞冷冻保存相关的实验中，使用来自实施例1的配制品，所述配制品另外地包含相对于溶液的总体积的10体积％的二甲亚砜(DMSO)。

实施例3

干细胞的短期保存

从9个供体中分离的间充质脂肪源性干细胞(ADSC)被分成测试组，并储存长达120h。使用以下实验组：(a)NaCl溶液(0.9％)，(b)含葡萄糖的NaCl溶液(0.9％)，(c)林格氏溶液(Ringer’s solution)(费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi))，(d)勃脉力(Plasmalyte)配制品(巴克斯特公司(Baxter))(每1000ml溶液包含：5.26g的氯化钠、0.37g的氯化钾、0.3g的氯化镁(6H₂O)、3.68g的乙酸钠(3H₂O)、5.02g的葡萄糖酸钠，并且包含：140mmol/l的钠离子、5mmol/l的钾离子、1.5mmol/l的镁离子、98mmol/l的氯离子、27mmol/l的乙酸根离子(CH₃COO^-)、23mmol/l的葡萄糖酸根离子(C₆H₁₁O₇ ^-)，其中溶液的理论渗透压为294mOsm/l，pH为约7.4(从6.5-8.0))，(e)HypoThermosol FRS配制品(HTS，生物生命溶液公司(BioLife Solutions))(包含/：Trolox、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、H₂PO₄ ^-、HEPES、乳糖酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱甘肽)以及(e)如实施例1中限定的溶液。短期保存(最长120小时)在4℃的温度下进行，其中在(d)组和(e)组的情况下还在室温下进行。在实验过程中，在选定的时间点观察细胞活力和有活力细胞的数目。

出于计数的目的，用碘化丙啶标记细胞，并用自动细胞计数器(NanoEntec)计数。

图1示出了实验组(a)、(b)、(d)和(e)获得的活力测量结果，而图2示出了：对于测试组(d)和(e)，作为保存时间函数的有活力细胞的数目。

图1所示的结果证实，在实施例1的溶液的情况下获得了最高的干细胞活力(120小时后高于90％)。在实施例1的溶液的情况下，从实验开始120小时后，有活力细胞的数目也是最高的(图2)。

实施例4

干细胞的冷冻保存

在第二个实验中，测试了实施例2中限定的配制品在干细胞冷冻保存中的可用性。在这个实验中，使用了与实施例1中相同类型的干细胞。将经认证的配制品Stem-CellBanker(Zenoaq)用作参考配制品。实验在-196℃的温度下进行了7天。

在解冻细胞后，进行活力测量(以与实施例1中相同的方式)，并将细胞转移到储存溶液(HypoThermosol FRS(HTS，生物生命溶液公司)(参考配制品)和实施例1的溶液)中，以评估储存条件的变化是否对细胞活力产生负面影响。

在所述保存期间，在选定的时间点(12小时、24小时、48小时、72小时)观察细胞活力。

图3示出了冷冻储存后干细胞活力测量的结果。所述测量结果证实实施例2的配制品提供了冷冻状态下干细胞的有效保存。

图4示出了对于HypoThermosol FRS配制品和实施例1的溶液，解冻后在选定的时间点的干细胞活力测量的结果。图4所示的结果清楚地示出了：实施例1的溶液表现出比所使用的参考配制品更好的特性。