具体实施方式

本文提供了用于稳健TCRα/β+细胞耗竭的改善方法以及使用所公开的方法制备的细胞群，所述方法可以最小化接受同种异体CAR T细胞疗法的患者的GVHD风险。在一方面，本公开提供了增加TCR+耗竭效率以显著减少TCR-细胞群中的残余TCR+细胞水平而的方法。

如本文所使用的，术语“一个/一种(a/an)”用于意指一个或多个/一种或多种。例如，提及“一个细胞”或“一种抗体”是指“一个或多个细胞”或“一种或多种抗体”。

如本文所使用的，术语“TCR耗竭的”当用于引用使用本公开提供的方法生成的细胞群时意指与从供体收集的细胞群相比所包括的表达内源性TCRα/β异二聚体的细胞较少的细胞群。例如，TCR耗竭的细胞(TCRα/β耗竭的细胞)群可以包括10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的表达内源性TCRα/β复合物的细胞。

如本文所使用的，术语“TCR+”和“TCR”当用于引用细胞或细胞群(包含使用本公开提供的方法生成的群)时是指表达至少内源性TCRα/β异二聚体的细胞，尽管CD3复合物的一个或多个组成部分可以表达在细胞表面上或者不表达在细胞表面上。

如本文所使用的，术语“TCR-”当用于引用细胞或细胞群(包含使用本公开提供的方法生成的群)时是指缺乏至少TCRα/β异二聚体的细胞，尽管CD3复合物的一个或多个组成部分可以表达在细胞表面上或者不表达在细胞表面上。

如本文所使用的，可互换使用的术语“抗TCR抗体”和“抗TCR”是指仅结合并识别人TCRα链的抗体，仅结合并识别人TCRβ链的抗体，或者结合并识别人TCRα/β异二聚体的抗体。抗TCR抗体可以是鼠、人或人源化抗体。

如本文所使用的，可互换使用的术语“抗CD3抗体”和“抗CD3”是指结合并识别并结合人CD3γ链、人CD3δ链、CD3ζ链、CD3ε链或包括正常人ε/ε/ζ/ζ/γ/δCD3复合物的两个或更多个组成部分的人CD3复合物的抗体。抗CD3抗体可以是鼠、人或人源化抗体。

术语“患者”和“受试者”可互换使用并且包含人和非人动物受试者以及患有正式诊断病症的受试者、没有正式辨别的病症的受试者、接受医疗护理的受试者、有罹患病症的风险的受试者等。

术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包含治疗性治疗、预防性治疗和在其中降低受试者罹患病症的风险或其它风险因素的应用。治疗不需要完全治愈病症并且涵盖减轻症状或潜在风险因素的实施例。术语“预防”并不要求100％消除事件发生的可能性。相反，所述“预防”表示在化合物或方法存在的情况下，事件发生的可能性已经降低。

经工程化的基于TCR-细胞的同种异体CAR-T产物例证了用于生成下一代CAR-T疗法的策略。然而，如移植物抗宿主疾病(GvHD)风险和宿主抗移植物疾病(HvGD)等潜在免疫反应代表了同种异体CAR-T细胞疗法的重要安全性或有效性问题之一。GvHD由供体衍生的T细胞引起，所述供体衍生的T细胞通过T细胞αβ受体(TCRαβ)识别HLA错配并具有攻击患者组织的潜力。GVHD和HvGD可能是严重的，甚至是致命的，即使在HLA匹配的供体环境中也是如此，因为轻微的错配仍然会引起免疫反应。

如CliniMACS 和TCR试剂盒等用于去除TCR+细胞(TCRαβ+细胞耗竭)的现行方法仅采用抗TCR抗体，以使用抗TCR抗体将TCR+细胞(TCRαβ+细胞)与TCR-细胞(TCRαβ-细胞)分离，并且在最终药物产品中可以达到99％或更高TCR-细胞纯度(参见例如Radestad等人，(2014)《免疫学研究杂志(J Immunol Res)》，2014：578741卷)。然而，TCR-最终药物产品中出现的小于1％的残余TCR+细胞水平可能仍然带来与同种异体CAR-T细胞疗法相关联的GvHD风险，特别是在高剂量水平下。

本公开提供了用于产生耗竭了表达内源性TCR的免疫细胞的经工程化的免疫细胞群的方法，所公开的方法包括：用抗TCR抗体和抗CD3抗体标记免疫细胞群；以及从所述经工程化的免疫细胞群中分离出抗TCR抗体标记的免疫细胞和抗CD3抗体标记的免疫细胞。

本公开还提供了一种从免疫细胞群中耗竭表达内源性TCR的细胞的方法，所公开的方法包括：用抗TCR抗体和抗CD3抗体标记所述免疫细胞群；将抗TCR抗体标记的免疫细胞和抗CD3抗体标记的免疫细胞与未标记的免疫细胞分离；以及收集所述未标记的免疫细胞，从而获得耗竭了表达内源性TCR的细胞的免疫细胞群。所述方法还可以适用于包括用抗TCR抗体和一种或多种针对除CD3之外的任何其它所关注靶标的抗体(例如，MHC1、MHC2、CD52或PD1)标记的免疫细胞群。

在一方面，本公开提供了耗竭TCRαβ+细胞的方法，所述方法包括使免疫细胞群与TCR抗体和CD3抗体接触。所述方法还可以适用于包括用抗TCR抗体和一种或多种针对除CD3之外的任何其它所关注靶标的抗体(例如，MHC1、MHC2、CD52或PD1)标记的免疫细胞群。

本公开提供了用于产生耗竭了表达内源性TCR的免疫细胞的经工程化的免疫细胞群的方法，所公开的方法包括：用抗TCR抗体和抗CD52抗体标记免疫细胞群；以及从所述经工程化的免疫细胞群中分离出抗TCR抗体标记的免疫细胞和抗CD52抗体标记的免疫细胞。

本公开还提供了一种从免疫细胞群中耗竭表达内源性TCR的细胞的方法，所公开的方法包括：用抗TCR抗体和抗CD52抗体标记所述免疫细胞群；将抗TCR抗体标记的免疫细胞和抗CD52抗体标记的免疫细胞与未标记的免疫细胞分离；以及收集所述未标记的免疫细胞，从而获得耗竭了表达内源性TCR的细胞的免疫细胞群。

在另一方面，本公开提供了一种耗竭TCRαβ+细胞的方法，所述方法包括使免疫细胞群与抗TCR抗体和CD52抗体接触。在实例中证明的这些方法的有效性是出乎意料的，因为在人类细胞中，CD52和TCR在物理上并不相互关联，并且虽然不希望受任何理论的束缚，但应理解CD52和TCR在生物学上没有直接关系。因此，在本公开的另一方面，所公开的方法可以包括使用抗TCR抗体和针对通常不与TCR相关的所关注靶标的另一种抗体。

在又另一方面，本公开提供了一种耗竭TCRαβ+细胞的方法，所述方法包括使免疫细胞群与抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体接触。

本文所述的方法将抗TCR抗体和抗CD3抗体一起用于TCRαβ+细胞耗竭，这对于生成经工程化的基于TCRαβ-细胞的同种异体CAR T产物特别有用。在本公开之前，将经工程化的T细胞(不是未经修饰的T细胞产物)临床规模耗竭到99.9％-99.99％TCR-细胞纯度水平以留下0.1％-0.01％TCR+细胞残余是极其困难的并且代表了同种异体疗法开发的挑战。本公开提供了一种用于这个问题的解决方案。

达到这种低水平残余TCR+细胞(例如，在耗竭后第1天测量的0.1％-0.01％范围内的TCR细胞)代表了经工程化的同种异体CAR T产物(例如，TCRα/β-CAR T细胞)的重大进步并通过降低GvHD可能性给患者提供了提高的临床益处。

降低GvHD(和HvGD)风险以及增强抗肿瘤效力的有效方法对于制造有效、安全和纯的经工程化的同种异体免疫细胞(例如，表达靶向癌症抗原的CAR的同种异体CAR-T细胞)可能特别有用。在一些实施例中，本公开提供了用于产生降低GvHD和/或HvGD的风险或防止GvHD和/或HvGD的进展的同种异体CAR-T细胞和产品的方法。在一些实施例中，经工程化的同种异体CAR-T细胞具有针对实体瘤或血液癌的增强的抗肿瘤活性。在一些实施例中，CAR-T细胞包括经修饰以降低或消除内源性TCR、CD52、MHC1、MHC2或PD1基因表达中的一种或多种的表达的细胞群。因此，在一些实施例中，CAR-T细胞包括耗竭了TCR+、CD52+、MHC1+、MHC2+和/或PD1+细胞的群。

本文提供了从经工程化的免疫细胞群中耗竭表达内源性表达的TCR、CD3、CD52、MHC1、MHC2或PD1中的一种或多种的细胞(例如，TCR+、CD3+、CD52+、MHC1+、MHC2+和/或PD1+细胞)群的方法，以及包括用于所述方法的抗体试剂的试剂盒。

T细胞受体信号传导

T细胞受体复合物(如本文所述为TCR)是T细胞表面上的抗原受体分子，负责识别由MHC分子呈递给T细胞从而可能导致T细胞激活和对抗原的免疫反应的抗原。人类T细胞受体是由两条跨膜异二聚糖蛋白链，即各自具有两个通过二硫键连接的结构域的α链和β链(也有少量γδ链)，组成的异二聚体。由于TCR的胞质尾区较短，因此当其与肽-MHC复合物结合时不能直接进行信号传导。相反，TCR与一组统称为CD3的信号传导分子相关，当TCR与肽-MHC复合物结合时，所述信号传导分子会传输细胞内信号。

CD3由一个γ分子和δ分子以及两个ε分子构成，所述分子在其胞外结构域中均与免疫球蛋白结构域具有一些有限的序列同源性。这些分子具有小的胞质结构域和带负电残基的跨膜结构域。在膜中，这些带负电残基与TCR跨膜区中的带正电残基形成盐桥。TCR-CD3受体复合物由形成通过二硫键连接的二聚体的两种其它不变蛋白ζ和η完成。因此，在T细胞表面处，TCR-CD3复合物表达为与具有细胞内ζζ同二聚体或ζη异二聚体的CD3γε和CD3δε二聚体相关联的αβ(或γδ)异二聚体。

在不希望受理论束缚的情况下，一些研究人员认为，如果TCR表达被破坏，则CD3表面表达也可能被废除。然而，如本文所述，出乎意料地发现残余CD3表面表达仍可以指示残余TCR+细胞并且可以通过使用抗CD3抗体与抗TCR抗体的组合来提高TCR+耗竭效率。

分选和耗竭免疫细胞的方法

如本文所述，在一方面，本公开提供了一种从免疫细胞群中耗竭表达内源性TCRα/β二聚体的细胞的方法，所述方法包括：用抗TCR抗体和抗CD3抗体标记所述细胞群(所述标记可以依次或在单个操作中同时进行)；将抗TCR和抗CD3标记的细胞与未标记的细胞分离，从而获得耗竭了表达内源性TCR的细胞的细胞群。

最初，将经修饰以使内源性TCRα或TCRβ基因有缺陷的经工程化的免疫细胞暴露于TCR耗竭试剂中。在一些实施例中，TCR耗竭试剂包括靶向TCRα多肽、TCRβ多肽或在免疫细胞表面上内源性表达的TCRα/β异二聚体的抗体。如本文所描述的，与仅用抗TCR抗体执行的耗竭相比，使用抗TCR抗体与抗CD3抗体(和/或任选地，抗CD52抗体)抗体的组合进行的TCR耗竭出乎意料地增加了TCR+耗竭效率。

抗TCR抗体、抗CD3抗体或抗CD52抗体(或针对TCR耗竭操作所关注的靶标的任何其它抗体)可以与生物素缀合，以促进使用直接或者间接与磁耗竭试剂(如磁耗竭药剂，如磁微珠(通常但不一定直径为约50nm的纳米颗粒)或任何其它表面(如琼脂糖珠、声波颗粒、塑料孔板、玻璃孔板、陶瓷孔板、柱、细胞培养袋或膜))缀合的二级抗体(例如，抗生物素抗体)进一步标记和/或分离。当使用磁微珠时，所述微珠促进了TCR+细胞与TCR-细胞的分离；当与磁柱接触时，TCR+细胞可以保留在所述柱上，而未标记的TCR-细胞穿过而到达收集袋。当暴露于声波时，声波颗粒可以促进TCR+与TCR-细胞的分离。虽然在所公开的方法的上下文中提供了抗生物素抗体，但可以采用其它生物素结合配偶体如链霉亲和素、亲和素和其它识别生物素的蛋白质来代替本文提供的所有方法中的抗生物素抗体。

在一些实施例中，提供的细胞可以任选地针对其它细胞表面标志物进行分选。例如，免疫细胞群的子集可以包括表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞，所述抗原特异性CAR本身包括一个或多个对一种或多种单克隆抗体具有特异性的表位(例如，示例性模拟表位序列；参见例如WO2016/120216，所述文献以引用方式并入本文)。所述方法包括：使免疫细胞群与对表位具有特异性的单克隆抗体接触；以及选择与单克隆抗体结合的免疫细胞以获得富集表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞的细胞群。

在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与荧光团缀合。在此实施例中，选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过荧光激活细胞分选(FACS)来完成。

在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与磁颗粒缀合。在此实施例中，选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过磁激活细胞分选(MACS)来完成。

在一些实施例中，在用于分选表达CAR的免疫细胞的方法中使用的单克隆抗体选自阿仑单抗(alemtuzumab)、替依莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫单抗(tositumomab)、阿昔单抗(abciximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、西妥昔单抗(cetuximab)、英夫利昔单抗(infliximab)、利妥昔单抗(rituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、达克珠单抗(daclizumab)、依库丽单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、贝利木单抗(belimumab)、康纳单抗(canakinumab)、狄诺塞麦(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、易普利姆玛(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕妥珠单抗(panitumumab)、QBEND-10和/或尤克特单抗(ustekinumab)。在一些实施例中，所述mAb是利妥昔单抗。在另一个实施例中，所述mAb是QBEND-10。

流式细胞术可以用于对细胞群中的特定细胞类型进行定量。一般来说，流式细胞术是一种用于主要通过光学手段对细胞的组分或结构特征进行定量的方法。由于可以通过定量结构特征来区分不同的细胞类型，因此流式细胞术和细胞分选可以用于对混合物中不同表型的细胞进行计数和分选。

流式细胞术分析涉及两个主要步骤：1)用一种或多种可检测标志物标记所选细胞类型，以及2)确定经标记的细胞相对于群中细胞的总数的数量。在一些实施例中，标记细胞类型的方法包含将经标记的抗体与由特定细胞类型表达的标志物结合。抗体可以直接用荧光化合物标记或使用例如识别第一抗体的荧光标记的第二抗体间接标记。

在所公开方法的一些实施例中，可以使用磁激活细胞分选(MACS)实现从TCR-细胞中分选或分离任选地表达CAR的TCR+细胞。磁激活细胞分选(MACS)是一种用于通过使用超顺磁纳米颗粒和柱、根据各种细胞群的表面抗原(CD分子)来分离各种细胞群的方法。MACS可以用于获得非常纯的细胞群。单细胞悬浮液中的细胞可以用微珠磁性地标记。将样品施加到由铁磁材料构成的柱，所述铁磁材料覆盖有不会破坏细胞的涂层，从而允许快速且温和地分离细胞。未标记的细胞通过柱，而经磁性标记的细胞保留在柱内。流出液(flow-through)可以作为未标记的细胞级分收集。在洗涤步骤后，将柱从分离器中取出，并且经磁性标记的细胞从柱中洗脱。

可以在Basu S等人(2010)中找到用于纯化特定细胞群(如T细胞)的详细方案。(Basu S，Campbell HM，Dittel BN，Ray A.《通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化特定细胞群(Purification of specific cell population by fluorescence activated cellsorting)》，《可视化实验期刊(J.Vis.Exp.)》(41)：1546)。

在所公开的方法的一些实施例中，可以使用声波分离代替基于磁性的分离方法来实现从TCR-细胞中分选或分离任选地表达CAR的TCR+细胞。虽然不希望受理论束缚，但应理解声波分离依赖于三维驻波来分离混合物的组分。在所公开的方法的上下文中，可以将如抗TCR抗体、抗CD52抗体或抗CD3抗体等抗体缀合到表面，如声波颗粒。声波颗粒可以是珠。在实施例中，将细胞暴露于带有抗TCR抗体、抗CD52抗体或抗CD3抗体中的一种或多种的声波颗粒，从而将声波颗粒与表达所关注靶标的任何细胞相关联。然后将细胞放置于声室中并暴露于声波。鉴于珠相关细胞和未用抗体-珠颗粒标记的细胞的不同性质，声波将经标记的细胞和未标记的细胞分离，在经标记的细胞(例如，TCR+或CD52+细胞)远离经标记的细胞转移时可以收集所述未标记的细胞。

免疫细胞

适用于本文所述的TCR+细胞耗竭方法的细胞包含免疫细胞。

在体外操纵或基因修饰(例如，如本文所描述的)之前，在本文所述方法中使用的细胞(例如，免疫细胞)可以从受试者获得。细胞可以从多个非限制性基于受试者的来源获得，包含外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的T细胞系。在一些实施例中，细胞可以源自健康供体或诊断为患有癌症的患者。在一些实施例中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

在实施例中，免疫细胞获自最终将接受经工程化的免疫细胞(即，自体疗法)的受试者。在实施例中，免疫细胞获自供体，所述供体是与将接受经工程化的免疫细胞(即，同种异体疗法)的受试者不同的个体。

细胞可以通过单采术从个体的循环血液中获得。单采术产物通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在某些实施例中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆级分并将所述细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理。

PBMC可以直接用于基因修饰以使用本文所述的方法产生经工程化的免疫细胞(如CAR或TCR)。在某些实施例中，在分离PBMC之后，可以任选地进一步分离T淋巴细胞以产生仅包括T细胞的群，并且可以在基因修饰和/或扩增之前或之后将细胞毒性和辅助T淋巴细胞进一步分选为原初、记忆和效应T细胞亚群。

在某些实施例中，T细胞可以通过例如使用通过梯度的离心裂解红细胞并耗竭单核细胞来从PBMC分离。T细胞的特异性亚群如CD28+、CD3+、CD4+、CD8+、CD25+、CD62L+、CD5+、CD45RA-、CCR7+、CD95+、IL2Rβ+和CD45RO+T细胞可以进一步通过本领域已知的阳性选择技术或阴性选择技术分离。例如，可以通过针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。供本文使用的一种方法是通过使用单克隆抗体的混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或细胞选择，所述单克隆抗体针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。流式细胞术和细胞分选也可以用于分离所关注的细胞群以供本公开中使用。

在一些实施例中，在应用本文提供的耗竭方法之前或之后，T细胞群富集CD8+细胞。

在一些实施例中，在应用本文提供的耗竭方法之前或之后，T细胞群富集CD4+细胞。

在一些实施例中，通过鉴定与这些类型细胞中的每一种相关的细胞表面抗原，群或CD4+和/或CD8+细胞可以进一步分选为原初细胞、干细胞记忆细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和效应细胞。在一些实施例中，原初T细胞的表型标志物的表达包含CD45RA+、CD95-、IL2Rβ-、CCR7+和CD62L+。在一些实施例中，干细胞记忆T细胞的表型标志物的表达包含CD45RA+、CD95+、IL2Rβ+、CCR7+和CD62L+。在一些实施例中，中枢记忆T细胞的表型标志物的表达包含CD45RO+、CD95+、IL2Rβ+、CCR7+和CD62L+。在一些实施例中，效应记忆T细胞的表型标志物的表达包含CD45RO+、CD95+、IL2Rβ+、CCR7-和CD62L-。在一些实施例中，T效应细胞的表型标志物的表达包含CD45RA+、CD95+、IL2Rβ+、CCR7-和CD62L-。因此，通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，CD4+和/或CD8+T辅助细胞可以分选为原初细胞、干细胞记忆细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和T效应细胞。在具体实施例中，所公开的方法可以用于增强T细胞的这些子集中的一个或多个子集的耗竭。

应理解，PBMC可以进一步包含其它细胞毒性淋巴细胞，如NK细胞或NK T细胞。可以将携带如本文公开的嵌合受体的编码序列的表达载体引入到人类供体T细胞、NK细胞或NKT细胞的群中。标准程序可以用于表达CAR的T细胞的冷冻保存，所述冷冻保存用于储存和/或制备以用于人类受试者。在一个实施例中，T细胞的体外转导、培养和/或扩增是在不存在非人动物衍生的产物(如小牛血清和胎牛血清)的情况下进行的。在各个实施例中，冷冻保存介质可以包括例如CS2、CS5或CS10或包括DMSO的其它介质或不包括DMSO的介质。

经工程化的免疫细胞

本文所述的TCR+细胞耗竭方法在制造用于治疗癌症的免疫细胞疗法(包含包括经工程化的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)的疗法)中可能特别有用。

经工程化的免疫细胞可以是同种异体的或自体的，并且所公开的方法可以应用于自体或同种异体疗法。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞(或其群)是或者包括T细胞(例如，炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、NK细胞、NK-T细胞、TCR表达细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞或巨噬细胞。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞或其组合组成的组。在一些示例性实施例中，经工程化的免疫细胞是T细胞。T细胞还可以是γ/δT细胞。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞可以源自例如但不限于干细胞。干细胞可以是成年干细胞、非人类胚胎干细胞，更具体地非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、全能干细胞或造血干细胞。干细胞可以是CD34+或CD34-。

在一些实施例中，所述细胞是从外周血获得或制备的。在一些实施例中，所述细胞是从外周血单核细胞(PBMC)获得或制备的。在一些实施例中，所述细胞是从骨髓获得或制备的。在一些实施例中，所述细胞是人类细胞。在一些实施例中，使用选自由病毒(慢病毒或γ逆转录病毒)转导、电穿孔、声孔效应、生物射弹(例如基因枪)、脂质转染、聚合物转染、纳米颗粒或聚合复合物组成的组的方法通过核酸载体转染或转导细胞。在一些实施例中，所述细胞是从非T细胞重新编程的T细胞。在一些实施例中，所述细胞是从T细胞重新编程的T细胞。

结合药剂(包含抗体和其片段)

在实施例中，所公开的方法包括使用抗体或抗原结合药剂(例如，包括抗原结合结构域或包括抗体或其片段)。如下所讨论的，在各个实施例中，经工程化的免疫细胞还可以包括结合药剂。

如本文中使用的，术语“抗体”是指包含足以赋予特定靶抗原特异性结合的规范免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，天然产生的完整抗体是包括彼此缔合成通常被称为“Y形”结构的两个相同的重链多肽(各自约50kD)和两个相同的轻链多肽(各自约25kD)的大致150kD的四聚体药剂。每个重链包括至少四个结构域(各自长约110个氨基酸)-氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的尖端处)，之后是三个恒定结构域：CHI、CH2和羧基末端CH3(位于Y茎的基部处)。被称为“开关”的短区连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2结构域和CH3结构域连接到抗体的其余部分。这个铰链区中的两个二硫键将完整抗体中的两个重链多肽彼此连接。每个轻链包括两个结构域-氨基末端可变(VL)结构域，之后是羧基末端恒定(CL)结构域。本领域技术人员非常熟悉抗体结构和序列元件，识别所提供序列中的“可变”和“恒定”区，并理解此类结构域之间的“边界”的定义可能具有一定灵活性，使得相同抗体链序列的不同呈现可以指示例如相对于所述相同抗体链序列的不同呈现转移一个或几个残基的位置处的此类边界。

完整抗体四聚体包括两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接，两个其它二硫键将重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并且四聚体形成。天然产生的抗体通常在CH2结构域上也被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有表征为由在压缩的反平行β桶中彼此压紧的两个β片层(例如，3链、4链或5链片层)形成的“免疫球蛋白折叠”的结构。每个可变结构域含有被称为“互补决定区”的三个高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构框架的β片层，并且将来自重链和轻链两者的CDR环区一起置于三维空间中，使得其形成位于Y结构的尖端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区与互补系统的元件结合并且还与效应细胞上的受体结合，所述效应细胞包含例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域已知的，可以通过糖基化或其它修饰来调节Fc受体的Fc区的亲和力和/或其它结合属性。在一些实施例中，根据本发明产生和/或利用的抗体包含糖基化Fc结构域，包含具有经修饰的或经工程化的此糖基化的Fc结构域。

出于本公开的目的，在某些实施例中，包含如在天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以被称为和/或被用作“抗体”，无论此多肽是天然产生的(例如，通过生物体与抗原反应产生的)还是通过重组工程化、化学合成或其它人工系统或方法产生的。在一些实施例中，抗体是多克隆的；在一些实施例中，抗体是单克隆的。在一些实施例中，抗体具有带小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体特性的恒定区序列。在一些实施例中，如本领域中已知的，抗体序列元件是人源化的、灵长化的、嵌合的等。

此外，如本文所使用的，术语“抗体”可以指用于在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的本领域已知的或开发的构建体或形式中的任一种。例如，在一些实施例中，本公开的方法中利用的抗体呈选自但不限于以下的形式：完整IgA抗体、IgG抗体、IgE抗体或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，等)；如Fab片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fd片段和分离的CDR或其集合等抗体片段；单链可变片段(scFV)；多肽-Fc融合体；单结构域抗体(例如，如IgNAR或其片段等鲨鱼单结构域抗体)；骆驼科抗体(在本文中也称为纳米抗体或VHH)；鲨鱼抗体、掩蔽抗体(例如，)；小模块化免疫药物(SMIPs^TM)；单链双抗体或串联双抗体VHH；微抗体；锚蛋白重复蛋白或DART；TCR样抗体； 微量蛋白；和在一些实施例中，抗体可能缺乏在天然产生时其将会具有的共价修饰(例如，多糖的附接)。在一些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如，多糖的附接)、有效载荷(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)或其它侧基(例如，聚乙二醇等)。

如本文所使用的，术语“抗体药剂”通常是指与特定抗原特异性结合的药剂。在一些实施例中，所述术语涵盖包含足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体药剂包含但不限于单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施例中，抗体药剂可以包含一种或多种带小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特性的恒定区序列。在一些实施例中，抗体药剂可以包含一种或多种本领域已知的人源化、灵长化、嵌合等的序列元件。在许多实施例中，术语“抗体药剂”用于指用于在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的本领域已知的或开发的构建体或形式中的一种或多种。例如，根据本发明利用的抗体药剂呈选自但不限于以下的形式：完整IgA抗体、IgG抗体、IgE抗体或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，等)；如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fd片段和分离的CDR或其集合等抗体片段；单链Fv；多肽-Fc融合体；单结构域抗体(例如，如IgNAR或其片段等鲨鱼单结构域抗体)；骆驼科(cameloid)抗体；掩蔽抗体(例如，)；小模块化免疫药物(SMIPs^TM)；单链双抗体或串联双抗体VHH；微抗体；锚蛋白重复蛋白或DART；TCR样抗体； 微量蛋白；和

用于执行本公开的方法的抗体或抗体药剂可以是单链的或双链的。在一些实施例中，抗体或抗原结合分子是单链的。在某些实施例中，抗原结合分子选自由以下组成的组：scFv、Fab、Fab′、Fv、F(ab′)₂、dAb和其任何组合。

抗体和抗体药剂包含抗体片段。抗体片段包括完整抗体的一部分，如完整抗体的抗原结合区或可变区等。抗体片段包含但不限于Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)₂、Fv、双抗体、线性抗体、由抗体片段抗体和scFv片段形成的多特异性和其它片段。抗体还包含但不限于多克隆、单克隆、嵌合的dAb(结构域抗体)、单链、Fab、Fa、F(ab′)₂片段和scFv。抗体可以是完整抗体或免疫球蛋白或抗体片段。抗体片段可以通过各种技术制备，包含但不限于本领域已知的完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或噬菌体)产生。

在一些实施例中，抗体或抗体药剂可以是嵌合抗体(参见例如美国专利第4,816,567号；和Morrison等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》81：6851-6855(1984))。嵌合抗体可以是其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种的抗体。在一个实例中，嵌合抗体可以包括非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴子的可变区)和人恒定区。在另外的实例中，嵌合抗体可以是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包含其抗原结合片段。

在一些实施例中，嵌合抗体可以是人源化抗体(参见例如Almagro和Fransson，《生物科学前沿(Front.Biosci.)》，13：1619-1633(2008)；Riechmann等人，《自然(Nature)》332：323-329(1988)；Queen等人，《美国国家科学院院刊》86：10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人，《方法(Methods)》，36：25-34(2005)；Padlan，《分子免疫学(Mol.Immunol)》，28：489-498(1991)；Dall′Acqua等人，《方法》，36：43-60(2005)；Osbourn等人，《方法》，36：61-68(2005)；以及Klimka等人，《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》83：252-260(2000))。人源化抗体是包括来自非人高变区的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括至少一个，并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的框架区(FR)对应于人抗体的那些。人源化抗体可以任选地包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。

在一些实施例中，本文提供的抗体或抗体药剂是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体(参见例如van Dijk和van de Winkel，《药理学新见(Curr.Opin.Pharmacol)》，5：368-74(2001)；和Lonberg，《免疫学新观点(Curr.Opin.Immunol)》，20：450-459(2008))。人抗体可以是具有与由人或人细胞产生的或衍生自利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的人抗体。人抗体的此定义明确排除了包括非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域公知的方法制备人抗体。

嵌合抗原受体(CAR)

如本文所描述的，所公开的方法可以用于从免疫细胞群中耗竭TCR+细胞。免疫细胞可以是CAR+细胞并且经工程化以用于如同种异体疗法等治疗应用。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞包括包含细胞外抗原结合结构域的CAR。如本文所使用的，嵌合抗原受体(CAR)包括特异性识别靶抗原(例如，癌细胞上的靶抗原；癌抗原)的蛋白质。当与靶抗原结合时，CAR可以激活免疫细胞以攻击并破坏带有所述抗原的细胞(例如癌细胞)。CAR还可以整合包括全部或一部分蛋白质(如4-1BB、CD28或OX 40)和/或信号传导结构域(如CD3ζ)的共刺激结构域，以便增加其效力。参见Krause等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，第188卷，第4期，1998(619-626)；Finney等人，《免疫学杂志(Journal of Immunology)》，1998，161：2791-2797，Song等人，《血液(Blood)》119：696-706(2012)；Kalos等人，《科学转化医学期刊(Sci.Transl.Med.)》3：95(2011)；Porter等人，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》365：725-33(2011)，以及Gross等人，《药理学和毒理学年鉴(Rev.Pharmacol.Toxicol.)》56：59-83(2016)；美国专利第7,741,465号和第6,319,494号。

本文所述的嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域、任选地将胞外结构域连接到跨膜结构域的铰链结构域和胞内结构域，其中胞外结构域包括特异性结合到靶标的抗原结合结构域。

在一些实施例中，抗原特异性CAR进一步包括安全开关和/或单克隆抗体特异性表位。在一些实施例中，抗原选择性CAR包括前导肽或信号肽。

CAR抗原结合结构域

如以上所讨论的，本文所述的CAR包括抗原结合结构域。如本文所使用的，“抗原结合结构域”是指结合指定靶抗原的任何多肽。在一些实施例中，抗原结合结构域是scFv。在一些实施例中，抗原结合结构域与肿瘤细胞上的抗原结合。在一些实施例中，抗原结合结构域与涉及过度增殖性疾病(例如，非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin′s Lymphoma)、多发性骨髓瘤或其它实体癌或血液癌)的细胞上的抗原结合。所公开的方法可以用于耗竭也是CAR+细胞的TCR+细胞，从而提供CAR+/TCR-细胞群。

在一些实施例中，CAR的抗原结合结构域包括本文所述的可变重链、可变轻链和/或一个或多个CDR。在一些实施例中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包括轻链CDR CDR1、CDR2和CDR3，以及重链CDR CDR1、CDR2和CDR3。

当抗原结合结构域与一个靶标的结合比其与第二靶标的结合更紧密时，所述抗原结合结构域被称为是“选择性的”。

CAR的抗原结合结构域选择性地靶向癌症抗原。在一些实施例中，癌症抗原选自EGFRvIII、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKGD2D、CS1、CD44v6、ROR1、紧密连接蛋白(Claudin)-18.2、Muc17、FAPα、Ly6G6D、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25、CD19、BCMA、FLT3、CD70、DLL3、CD52或CD34。在一些实施例中，CAR包括靶向EGFRvIII、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKGD2D、CS1、CD44v6、ROR1、紧密连接蛋白-18.2、Muc17、FAPα、Ly6G6D、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25、CD19、BCMA、FLT3、CD70、DLL3、CD52或CD34的抗原结合结构域。

在一些实施例中，癌症抗原选自由以下组成的组：碳酸酐酶IX(CAIX)、癌胚抗原(CEA)、CDS、CD7、CDIO、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如细胞表面抗原)、上皮糖蛋白(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2，3，4、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白细胞介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2)、κ轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、LI细胞粘附分子(LICAM)、黑色素瘤抗原家族A，1(MAGE-AI)、粘蛋白16(Muc-16)、粘蛋白1(Muc-1)、间皮素(MSLN)、NKG2D配体、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胎抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)和威尔姆斯肿瘤蛋白(Wilms tumor protein)(WT-1)。

在其它实施例中，本公开涉及编码本文所述的抗原结合结构域中的任一抗原结合结构域的分离的多核苷酸。在一些实施例中，本公开涉及编码CAR的分离的多核苷酸。本文还提供包括所述多核苷酸的载体及其制备方法。

在一些实施例中，可以形成通过实践本公开的方法而产生的细胞群的组分的CAR免疫细胞(例如，CAR-T细胞)包括编码安全开关多肽的多核苷酸，例如RQR8。参见例如WO2013153391A，所述文献以全文引用的方式特此并入。在包括所述多核苷酸的CAR免疫细胞(例如，CAR-T细胞)中，安全开关多肽可以在CAR免疫细胞(例如，CAR-T细胞)的表面处表达。

CAR铰链结构域

本公开的CAR的细胞外结构域可以包括“铰链”结构域(或铰链区)。所述术语通常是指起到将CAR中的跨膜结构域连接到CAR中的细胞外抗原结合结构域的作用的任何多肽。具体地，铰链结构域可以用于为细胞外抗原结合结构域提供更大的灵活性和可及性。

铰链结构域可以包括多达300个氨基酸——在一些实施例中，10到100个氨基酸，或者在一些实施例中，25到50个氨基酸。铰链结构域可以源自天然存在的分子的全部或部分，如源自CD8、CD4、CD28、4-1BB或IgG(具体地，IgG的铰链区；应理解，铰链区可以含有免疫球蛋白家族成员的一些或全部，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM或其片段)的细胞外区的全部或部分，或源自抗体重链恒定区的全部或部分。可替代地，铰链结构域可以是对应于天然存在序列的合成序列，或者可以是完全合成的铰链序列。在一些实施例中，所述铰链结构域是人CD8α链的一部分(例如NP_001139345.1)。在另一个特定实施例中，所述铰链和跨膜结构域包括人CD8α链的一部分。在一些实施例中，本文所述的CAR的铰链结构域包括CD8α、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα的子序列，具体地CD8α、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα中的任一个的铰链区。在一些实施例中，铰链结构域包括人CD8α铰链、人IgG1铰链、人IgG4、人PD-1或人FcγRIIIα铰链。在一些实施例中，本文公开的CAR包括scFv、CD8α人铰链和跨膜结构域、CD3ξ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。

CAR跨膜结构域

本文提供的CAR被设计成具有与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。所述跨膜结构域可以类似地与CAR的细胞内结构域融合。在一些实例中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。在一些实施例中，短接头可以在CAR的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域中的任何或一些结构域之间形成连接。

跨膜区可以是合成的(非天然存在的)或可以衍生自以下(包括以下或对应于以下的片段)：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导T细胞共刺激因子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1，CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。

在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域是CD8α跨膜结构域。

在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。

CAR细胞内结构域

CAR的细胞内(胞质)结构域可以提供包括CAR的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种功能的激活。例如，T细胞的效应子功能可以指溶细胞活性或辅助活性，包含细胞因子的分泌。

应当理解，合适的(例如，激活的)细胞内结构域包含但不限于衍生自以下的信号传导结构域(包括以下或对应于以下中的全部或以下的片段)：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导T细胞共刺激因子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1，CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。

在一些实施例中，CAR的细胞内/胞质结构域可以被设计成包括单独的或与在CAR的上下文中有用的任何其它期望细胞内结构域组合的41BB/CD137结构域。NCBI参考序列：NP_001552.2中描述了41BB/CD137的完整天然氨基酸序列。NCBI参考序列：NM_001561.5中描述了完整天然41BB/CD137核酸序列。

在一些实施例中，CAR的细胞内/胞质结构域可以被设计成包括单独的或与在本公开的CAR的上下文中有用的任何其它期望细胞内结构域组合的CD28结构域。NCBI参考序列：NP_006130.1中描述了CD28的完整天然氨基酸序列。NCBI参考序列：NM_006139.1中描述了完整天然CD28核酸序列。

在一些实施例中，CAR的细胞内/胞质结构域可以被设计成包括单独的或与在CAR的上下文中有用的任何其它期望细胞内结构域组合的CD3ζ结构域的全部或片段。

在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的结构域。在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包括选自由41BB的片段(GenBank：AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)组成的组中的共刺激分子的一部分。

包括CAR的经工程化的免疫细胞

本文提供了表达CAR的经工程化的免疫细胞(例如，CAR-T细胞或CAR+细胞)和经工程化的免疫细胞群，所述经工程化的免疫细胞和经工程化的免疫细胞群耗竭了具有表达内源性TCR的细胞。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞包括CAR T细胞，每个CAR T细胞包括细胞外抗原结合结构域并且已经减少或消除了内源性TCR的表达。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞群包括CAR T细胞群，每个CAR T细胞包括两个或更多个不同的细胞外抗原结合结构域并且已经减少或消除了内源性TCR的表达。在一些实施例中，免疫细胞包括CAR群，每个CAR T细胞包括相同的细胞外抗原结合结构域并且已经减少或消除了内源性TCR的表达。

经工程化的免疫细胞可以是同种异体的或自体的。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞或经工程化的免疫细胞群是T细胞(例如，炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、NK细胞、NK-T细胞、TCR表达细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞或B细胞，并且表达CAR。在一些实施例中，T细胞可以源自由以下组成的组：CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或包括CD4+和CD8+T细胞的组合的群。

在一些实施例中，使用所公开的方法产生的经工程化的免疫细胞或经工程化的免疫细胞群可以源自例如但不限于干细胞。干细胞可以是成年干细胞、非人类胚胎干细胞，更具体地非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

在一些实施例中，使用所公开的方法产生的经工程化的免疫细胞或免疫细胞群是从外周血获得或制备的。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞是从外周血单核细胞(PBMC)获得或制备的。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞是从骨髓获得或制备的。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞是从脐带血获得或制备的。在一些实施例中，所述细胞是人类细胞。在一些实施例中，所述细胞使用选自由电穿孔、声孔效应、生物射弹(例如，基因枪)、脂质转染、聚合物转染、纳米颗粒、病毒转染(例如，逆转录酶病毒、慢病毒、AAV)或聚合复合物组成的组中的方法通过核酸载体来转染或转导。

在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞包括的干细胞记忆细胞和中枢记忆细胞的百分比大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达本公开的抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞包括的干细胞记忆细胞和中枢记忆细胞的百分比为约10％到约100％、约10％到约90％、约10％到约80％、约10％到约70％、约10％到约60％、约10％到约50％、约10％到约40％、约10％到约30％、约10％到约20％、约15％到约100％、约15％到约90％、约15％到约80％、约15％到约70％、约15％到约60％、约15％到约50％、约15％到约40％、约15％到约30％、约20％到约100％、约20％到约90％、约20％到约80％、约20％到约70％、约20％到约60％、约20％到约50％、约20％到约40％、约20％到约30％、约30％到约100％、约30％到约90％、约30％到约80％、约30％到约70％、约30％到约60％、约30％到约50％、约30％到约40％、约40％到约100％、约40％到约90％、约40％到约80％、约40％到约70％、约40％到约60％、约40％到约50％、约50％到约100％、约50％到约90％、约50％到约80％、约50％到约70％、约50％到约60％、约60％到约100％、约60％到约90％、约60％到约80％、约60％到约70％、约70％到约90％、约70％到约80％、约80％到约100％、约80％到约90％、约90％到约100％、约25％到约50％、约75％到约100％或约50％到约75％。

在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞包括的干细胞记忆细胞和中枢记忆细胞的百分比大于10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞包括的干细胞记忆细胞和中枢记忆细胞的百分比为约10％到约60％、约10％到约50％、约10％到约40％、约15％到约50％、约15％到约40％、约20％到约60％或约20％到约70％。

在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞富集T_CM细胞和/或T_SCM细胞，使得经工程化的免疫细胞包括至少约60％、65％、70％、75％或80％的组合的T_CM细胞和T_SCM细胞。在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞富集T_CM细胞和/或T_SCM细胞，使得经工程化的免疫细胞包括至少约70％的组合的T_CM细胞和T_SCM细胞。在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞富集T_CM细胞和/或T_SCM细胞，使得经工程化的免疫细胞包括至少约75％的组合的T_CM细胞和/或T_SCM细胞。

在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达本公开的抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞富集T_CM细胞和/或T_SCM细胞，使得经工程化的免疫细胞包括至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的T_SCM细胞。在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达本公开的抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞富集T_CM细胞和/或T_SCM细胞，使得经工程化的免疫细胞包括至少约30％、35％、40％或45％的T_SCM细胞。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞是表达CAR的炎性T淋巴细胞。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞是表达CAR的细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞是表达CAR的调节性T淋巴细胞。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞是表达CAR的辅助T淋巴细胞。

在一些实施例中，根据本公开的经工程化的免疫细胞可以包括一种或多种被破坏或失活的基因。在一些实施例中，靶抗原(例如，EGFRvIII、Flt3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKGD2D、CS1、CD44v6、ROR1、紧密连接蛋白-18.2、Muc17、FAPα、Ly6G6D、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25、CD19、BCMA、FLT3、CD70、DLL3或CD34、CD70)基因可以被敲除以引入靶向相同抗原的CAR(例如，EGFRvIII、Flt3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKGD2D、CS1、CD44v6、ROR1、紧密连接蛋白-18.2、Muc17、FAPα、Ly6G6D、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25、CD19、BCMA、FLT3、CD70、DLL3或CD34、CD70 CAR)以避免诱导CAR激活。如本文所描述的，在一些实施例中，根据本公开的经工程化的免疫细胞包括一个被破坏或失活的基因和/或表达CAR或多链CAR，所述基因选自由以下组成的组：MHC1(β2M)、MHC2(CIITA)、EGFRvIH、Flt3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKGD2D、CS1、CD44v6、ROR1、紧密连接蛋白-18.2、Muc17、FAPα、LV6G6D、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25、CD19、BCMA、FLT3、CD70、DLL3或CD34、CD70、TCRα和TCRβ。在一些实施例中，细胞包括多链CAR。在一些实施例中，分离的细胞包括两个被破坏或失活的基因和/或表达CAR或多链CAR，所述基因选自由以下组成的组：CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、PD-1和TCRα、PD-1和TCRβ、MHC-1和TCRα、MHC-1和TCRβ、MHC2和TCRα、MHC2和TCRβ。

在一些实施例中，所述方法包括通过将能够通过选择性DNA切割选择性地使基因失活的核酸内切酶引入到细胞中来破坏一个或多个基因或使一个或多个基因失活。在一些实施例中，核酸内切酶可以是例如锌指核酸酶(ZFN)、megaTAL核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALE-核酸酶或)或CRISPR(例如Cas9或Cas12)核酸内切酶。

在一些实施例中，通过破坏内源性TCRα基因和/或TCRβ基因或使内源性TCRα基因和/或TCRβ基因失活，使TCR+细胞或其群在细胞中失去功能。本公开的耗竭方法对于在使TRCα基因失活之后从细胞群中去除任何剩余TCR+T细胞特别有用。使用本文公开的方法产生的经工程化的免疫细胞可以用于通过预防或减少宿主抗移植物(HvGD)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)来治疗有需要的患者；因此，在本公开的范围内是一种通过预防或减少宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)来治疗有需要的患者的方法，所述方法包括通过向所述患者施用有效量的包括被破坏或失活的TCRα和/或TCRβ基因的经工程化的免疫细胞来治疗所述患者。

本公开提供了提高缺乏内源性TCR表达或具有降低的内源性TCR表达的经工程化的免疫细胞群的纯度的方法。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞包括少于1.0％的TCR+细胞、少于0.9％的TCR+细胞、少于0.8％的TCR+细胞、少于0.7％的TCR+细胞、少于0.6％的TCR+细胞、少于0.5％的TCR+细胞、少于0.4％的TCR+细胞、少于0.3％的TCR+细胞、少于0.2％的TCR+细胞或少于0.1％的TCR+细胞。此群可以是所公开方法的产物。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞群包括少于0.1％的TCR+细胞。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞包括少于0.09％的TCR+细胞、少于0.08％的TCR+细胞、少于0.07％的TCR+细胞、少于0.06％的TCR+细胞、少于0.05％的TCR+细胞、少于0.04％的TCR+细胞、少于0.03％的TCR+细胞、少于0.02％的TCR+细胞、少于0.01％的TCR+细胞。此群可以是所公开方法的产物。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞群包括介于约0.01％-0.001％之间的TCR+细胞。此群可以是所公开方法的产物。

本公开还提供了包括本文所述的CAR中的任何CAR的经工程化的免疫细胞，并且其特征还在于一个或多个内源性基因的表达减少或消除。在一些实施例中，可以将CAR通过质粒载体作为转基因引入到免疫细胞中。在一些实施例中，质粒载体还可以含有例如选择标志物，所述选择标志物用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞。

经TCR工程化的免疫细胞和经TCR工程化的免疫细胞群(包含CAR T细胞)的制造

本文提供了从免疫细胞群(包含经工程化的免疫细胞，如CAR+细胞)中耗竭表达内源性TCR的细胞的方法。如本文所描述的，用抗TCR抗体和抗CD3抗体标记细胞群、将抗TCR和抗CD3标记的细胞与未标记的细胞分离并收集未标记的细胞有助于获得耗竭了表达内源性TCR的细胞的细胞群。在各个实施例中，分离通常可以使用磁珠、声波颗粒、膜(所有这些都可以与由经标记的细胞识别的部分缀合)、FACS和其它已知的分离方法来实现。使用此方法产生的细胞也形成本公开的一个方面。

本文提供了从免疫细胞群(包含经工程化的免疫细胞，如CAR+细胞)中耗竭表达内源性TCR的细胞的方法。如本文所描述的，用抗TCR抗体和抗CD52抗体标记细胞群、将抗TCR和抗CD52标记的细胞与未标记的细胞分离并收集未标记的细胞有助于获得耗竭了表达内源性TCR的细胞的细胞群。在各个实施例中，分离通常可以使用磁珠、声波颗粒、膜(所有这些都可以与由经标记的细胞识别的部分缀合)、FACS和其它已知的分离方法来实现。使用此方法产生的细胞也形成本公开的一个方面。

本文还提供了从免疫细胞群(包含经工程化的免疫细胞，如CAR+细胞)中耗竭表达内源性TCR的细胞的方法。如本文所描述的，用抗TCR抗体和抗CD3抗体以及抗CD52抗体标记细胞群、将抗TCR、抗CD3标记和抗CD52标记的细胞与未标记的细胞分离并收集未标记的细胞有助于获得耗竭了表达内源性TCR的细胞的细胞群。在各个实施例中，分离通常可以使用磁珠、声波颗粒、膜(所有这些都可以与由经标记的细胞识别的部分缀合)、FACS和其它已知的分离方法来实现。使用此方法产生的细胞也形成本公开的一个方面。

在本文所述的经工程化的免疫细胞的体外操纵或基因修饰之前，可以从受试者获得所述细胞。表达CAR的细胞群可以源自如本文所述的同种异体或自体过程，并且可以耗竭了如本文所述的内源性TCR。

分离的免疫细胞的基因修饰

如本文所描述的，如T细胞等免疫细胞可以在进行本文提供的方法之前使用已知方法进行基因修饰，或者免疫细胞可以在进行基因修饰之前在体外激活和扩增(或在iPSC或祖细胞的情况下分化)。在一些实施例中，对免疫细胞进行基因修饰以减少或消除内源性TCR(TRAC)、MHC1(β2M)、MHC2、PD1和/或CD52的表达。在一些实施例中，可以减少或消除两种或更多种内源性蛋白质的表达。例如，可以减少或消除TRAC和CD52的表达。在另一个实例中，可以减少或消除TRAC和由经转导的CAR靶向的蛋白质的表达。在一些实施例中，使用基因编辑技术(例如，CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(ZFN)、MegaTAL、大范围核酸酶)对细胞进行基因修饰以减少或消除一种或多种内源性蛋白质(例如，TCRα、MHC1、MHC2、PD1、CD52)的表达。在另一个实施例中，如T细胞等免疫细胞用本文所描述的嵌合抗原受体进行基因修饰(例如，用包括编码CAR的一个或多个核苷酸序列的病毒载体转导或者通过使用非病毒手段转导)并且然后在体外激活和/或扩增。

用于制造本公开的构建体和经工程化的免疫细胞的某些方法在PCT申请WO2015/120096(PCT/US15/14520)中描述，所述PCT申请的内容以全文引用的方式特此并入。

在一个实施例中，本公开提供了一种储存表达CAR的经基因工程化的细胞的方法。这涉及冷冻保存免疫细胞，使得所述细胞在解冻后仍是有活力的。表达CAR的免疫细胞的一部分可以通过本领域已知的方法进行冷冻保存，以提供此类细胞的永久来源，用于未来治疗患有恶性肿瘤的患者。当需要时，可以将冷冻保存的转化免疫细胞解冻，使所述转化免疫细胞生长和扩增，以获得更多此类细胞。如实例和附图所证实的，使用本文提供的耗竭方法产生的细胞群可以冷冻保存，并且稍后解冻用于治疗应用。

同种异体CAR T细胞

用于制造同种异体CAR T疗法或AlloCARs^TM的过程涉及从健康供体中收获健康的、精选的、筛选的和测试的T细胞。接下来，T细胞被工程化以表达CAR，所述CAR识别在血液或实体肿瘤中表达的某些细胞表面蛋白(例如，靶抗原，如EGFRvIII、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKGD2D、CS1、CD44v6、ROR1、紧密连接蛋白-18.2、Muc17、FAPα、Ly6G6D、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25、CD19、BCMA、FLT3、CD70、DLL3、CD52或CD34)。同种异体T细胞使用基因编辑工具(如锌指、CRISPR或其它基因编辑技术)进行基因编辑，以便在给予不同于供体的患者时降低移植物抗宿主疾病(GvHD)的风险并防止同种异体排斥(HvGD)。

可以减少或消除内源性T细胞受体基因(例如，TCRα、TCRβ)的表达以便避免GvHD。也可以减少或消除内源性MHCl(β2M)、MHC2和/或PD1的表达，以便避免HvGD，从而防止宿主免疫细胞将移植细胞上的MHC1和MHC2识别为外来抗原。也可以减少或消除内源性表达CD52(分化簇52)基因，以便使CAR T产物对抗CD52抗体治疗具有抗性。因此，抗CD52抗体治疗淋巴细胞耗竭可以用于抑制宿主免疫系统，从而允许CAR T保持植入状态以实现其全部治疗效果。如本文所描述的，至少出于以上例证的目的，用于同种异体疗法的经工程化的免疫细胞或其群可以包括多次敲除。

在一些实施例中，可以减少或消除编码程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的基因(也称为CD279)的内源性表达，以便增强抗肿瘤效力。

白体CAR T细胞

自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法涉及收集患者自身的细胞(例如，白细胞，包含T细胞)并对T细胞进行基因工程化以表达CAR，所述CAR识别在一种或多种特异性癌细胞的细胞表面上表达的靶抗原并杀死癌细胞。然后将经工程化的细胞冷冻保存并随后施用于患者。

药物组合物和疗法

包括使用所公开的方法制备的细胞群的药物组合物可以用于治疗患有癌症的患者。使用本文提供的方法产生的群中的经工程化的细胞的期望治疗量通常为至少2个细胞(例如，至少1个CD8+中枢记忆T细胞或至少1个CD4+辅助T细胞子集或者CD8+和CD4+细胞中的每个细胞之一)，或者更典型地大于10²个细胞，并且高达10⁶个，高达并包含10⁸或10⁹个细胞，并且可以超过10¹⁰个细胞。细胞的数量将取决于组合物的预期用途以及其中包含的细胞类型。因此，所期望细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个或10¹²个细胞的多次输注中。在使用本公开的方法产生的细胞群的一些应用中，特别是因为所有输注的细胞将被重定向到特定的靶抗原，所以可以施用范围在10⁶/千克(每患者10⁶到10¹¹个)的较低数目的细胞。可以以这些范围内的剂量多次施用CAR治疗。对于接受疗法的患者，所述细胞可以是自体的、同种异体的或异源的。

如本文所描述的，经工程化的免疫细胞群可以耗竭了表达内源性TCR的细胞(例如，细胞是TCR-和/或包括残余水平的TCR+细胞)。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞包括少于1.0％的TCR+细胞、少于0.9％的TCR+细胞、少于0.8％的TCR+细胞、少于0.7％的TCR+细胞、少于0.6％的TCR+细胞、少于0.5％的TCR+细胞、少于0.4％的TCR+细胞、少于0.3％的TCR+细胞、少于0.2％的TCR+细胞或少于0.1％的TCR+细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述TCR+细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞群包括少于0.09％的TCR+细胞、少于0.08％的TCR+细胞、少于0.07％的TCR+细胞、少于0.06％的TCR+细胞、少于0.05％的TCR+细胞、少于0.04％的TCR+细胞、少于0.03％的TCR+细胞、少于0.02％的TCR+细胞、少于0.01％的TCR+细胞。具有上述TCR+细胞水平的细胞群可使用本文公开的方法实现。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞群包括介于约0.01％-0.001％之间的TCR+细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述TCR+细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，经工程化的免疫细胞群包括不可检测水平的TCR+细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述TCR+细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞群包括大于99％的TCR-细胞、大于99.9％的TCR-细胞、大于99.91％的TCR-细胞、大于99.92％的TCR-细胞、大于99.93％的TCR-细胞、大于99.94％的TCR-细胞、大于99.95％的TCR-细胞、大于99.96％的TCR-细胞、大于99.97％的TCR-细胞或大于99.98％的TCR-细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述TCR-细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞群包括介于约99.99％-99.999％之间的TCR-细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述这些TCR-细胞水平的细胞群。

使用本公开的方法产生的TCR耗竭的CAR表达性细胞群可以单独施用，或者与其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合施用。本公开的药物组合物可以包括CAR表达性TCR-细胞群，如本文所述的经工程化的T细胞。本公开的组合物优选地被调配成用于输注或静脉内施用。

治疗方法

本公开提供了用于治疗或预防患者的疾病(例如，癌症)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包括CAR的经工程化的免疫细胞群(例如，不是从所述患者而是从健康供体获得的细胞)，其中所述经工程化的免疫细胞群耗竭了表达内源性TCR的细胞(例如，细胞是TCR-和/或包括残余水平的TCR+细胞)。

在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞群包括少于1.0％的TCR+细胞、少于0.9％的TCR+细胞、少于0.8％的TCR+细胞、少于0.7％的TCR+细胞、少于0.6％的TCR+细胞、少于0.5％的TCR+细胞、少于0.4％的TCR+细胞、少于0.3％的TCR+细胞、少于0.2％的TCR+细胞或少于0.1％的TCR+细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述TCR+细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞群包括少于0.09％的TCR+细胞、少于0.08％的TCR+细胞、少于0.07％的TCR+细胞、少于0.06％的TCR+细胞、少于0.05％的TCR+细胞、少于0.04％的TCR+细胞、少于0.03％的TCR+细胞、少于0.02％的TCR+细胞、少于0.01％的TCR+细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述TCR+细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞群包括介于约0.01％-0.001％之间的TCR+细胞。在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞包括不可检测水平的TCR+细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述这些TCR+细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞群包括大于99％的TCR-细胞、大于99.9％的TCR-细胞、大于99.91％的TCR-细胞、大于99.92％的TCR-细胞、大于99.93％的TCR-细胞、大于99.94％的TCR-细胞、大于99.95％的TCR-细胞、大于99.96％的TCR-细胞、大于99.97％的TCR-细胞或大于99.98％的TCR-细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述这些TCR+细胞水平的细胞群。

在一些实施例中，所述经工程化的免疫细胞群包括介于约99.99％-99.999％之间的TCR-细胞。使用本文公开的方法可实现具有上述这些TCR+细胞水平的细胞群。

本文提供了用于治疗包含癌症的疾病或病症的方法。所述方法降低了患者在用同种异体疗法治疗时将面临GvHD的可能性。在一些实施例中，本公开涉及向有需要的受试者施用有效量的使用本公开的方法制备的TCR耗竭的经工程化的免疫细胞群。在一些实施例中，T细胞介导的免疫反应针对表达癌症抗原的一个或多个靶细胞。在一些实施例中，TCR耗竭的经工程化的免疫细胞群包括表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。在一些实施例中，所述靶细胞是实体或血液肿瘤细胞。在一些方面，本公开包括一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的使用本文所述的方法制备的TCR耗竭的经工程化的免疫细胞群。在一些方面，本公开包括一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的使用本文提供的方法制备的TCR耗竭的经工程化的免疫细胞群，其中TCR耗竭的免疫细胞群包括如本文所述的至少一种嵌合抗原受体和/或分离的抗原结合结构域。在一些实施例中，使用本公开的方法制备的TCR耗竭的含CAR的免疫细胞群可以用于治疗血液恶性肿瘤或实体瘤。

在一些实施例中，使用本公开的方法制备的TCR耗竭的含CAR的免疫细胞群可以用于治疗小细胞肺癌、黑色素瘤、低级别神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、甲状腺髓样癌、良性肿瘤、胰腺、膀胱和前列腺中的弥散性神经内分泌肿瘤、睾丸癌和具有神经内分泌特征的肺腺癌。在一些实施例中，使用本公开的方法制备的TCR耗竭的含CAR的免疫细胞(例如CAR-T细胞)群用于治疗实体瘤癌症。在一些实施例中，使用本公开的方法制备的TCR耗竭的含CAR的免疫细胞(例如CAR-T细胞)群用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌(RCC)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤(MM)或急性髓系白血病(AML)。

还提供了用于减小受试者的肿瘤大小的方法，所述方法包括向所述受试者施用使用本公开的方法制备的TCR耗竭的经工程化的细胞群，其中所述细胞包括嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括与所述肿瘤上的抗原结合的抗原结合结构域。

在一些实施例中，所述受试者患有实体瘤或血液恶性肿瘤，如淋巴瘤或白血病(血液癌)。在一些实施例中，将使用本公开的方法制备的TCR耗竭的经工程化的细胞群递送到肿瘤床。在一些实施例中，所述癌症存在于受试者的骨髓中，并且使用本公开的方法制备的细胞群被递送到所述骨髓中。在一些实施例中，所述癌症存在于患者的免疫细胞或血细胞中，并且使用本公开的方法制备的细胞群被递送到所述免疫细胞或血细胞中。在一些实施例中，所述经工程化的细胞是自体免疫细胞，例如自体T细胞。在一些实施例中，所述经工程化的细胞是同种异体免疫细胞，例如同种异体T细胞，所公开的方法的使用将特别有益于所述同种异体免疫细胞。

治疗剂(例如使用本公开的方法产生的TCR耗竭的经工程化的CAR T细胞群)的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时，保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退的任何量，所述疾病消退通过疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加或预防因疾病折磨引起的损害或残疾来证实。治疗剂促进疾病消退的能力可以使用熟练的技术人员已知的多种方法，如在临床试验期间的人类受试者中、在可预测人类中的功效的动物模型系统中或通过在体外测定中测定药剂的活性来评价。

组合物中的TCR耗竭的经工程化的细胞的期望治疗量包括至少2个细胞(例如，至少一个CD8+中枢记忆T细胞或至少一个CD4+辅助T细胞子集或至少2个CD4+细胞或至少2个CD8+细胞)，或者更典型地大于10²个细胞，并且高达10⁶个，高达并包含10⁸或10⁹个细胞，并且可以超过10¹⁰个细胞。细胞的数量将取决于组合物的预期用途以及其中包含的细胞类型。应注意，本文提供的方法可以用于产生仅包括CD4+细胞、仅包括CD8+细胞或包括CD4+和CD8+细胞两者的TCR耗竭的经工程化的免疫细胞群。因此，所期望细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常10⁸个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个或10¹²个细胞的多次输注中。在本公开的一些方面，特别是因为所有输注的细胞将被重定向到特定的靶抗原，所以可以施用范围在10⁶/千克(每患者10⁶到10¹¹个)的较低数目的细胞。可以以这些范围内的剂量多次施用CAR治疗。对于接受疗法的患者，所述细胞可以是自体的、同种异体的或异源的。

在一些实施例中，使用本公开的方法制备的TCR耗竭的CAR T细胞的治疗有效量为约1×10⁵个细胞/kg、约2×10⁵个细胞/kg、约3×10⁵个细胞/kg、约4×10⁵个细胞/kg、约5×10⁵个细胞/kg、约6×10⁵个细胞/kg、约7×10⁵个细胞/kg、约8×10⁵个细胞/kg、约9×10⁵个细胞/kg、约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg或约9×10⁷个细胞/kg。

在一些实施例中，CAR+/TCR-T细胞的靶剂量在1×10⁶个细胞/kg到2×10⁸个细胞/kg的范围内，例如2×10⁶个细胞/kg。应当理解，高于和低于此范围的剂量可能适用于某些受试者，并且适当的剂量水平可以由医疗保健提供者根据需要确定。另外，可以根据本公开提供多剂量的细胞。

在一些实施例中，在施用于患者施用时，使用本公开的方法制备的在其细胞表面处表达本文所述的抗原特异性CAR中的任一种抗原特异性CAR的TCR耗竭的经工程化的免疫细胞群可以减少、杀伤或裂解患者的内源性抗原表达性细胞。在一个实施例中，表达本文所述的抗原特异性CAR中的任一种抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞减少或裂解抗原表达性内源性细胞或表达抗原的细胞系的细胞的百分比为至少约或大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一个实施例中，表达抗原特异性CAR的经工程化的免疫细胞减少或裂解抗原表达性内源性细胞或表达抗原的细胞系的细胞的百分比为约5％到约95％、约10％到约95％、约10％到约90％、约10％到约80％、约10％到约70％、约10％到约60％、约10％到约50％、约10％到约40％、约20％到约90％、约20％到约80％、约20％到约70％、约20％到约60％、约20％到约50％、约25％到约75％或约25％到约60％。在一个实施例中，内源性抗原表达性细胞是内源性抗原表达性骨髓细胞。

多种另外的治疗剂可以与本文所述的组合物结合使用。例如，可能有用的另外的治疗剂包含PD-1抑制剂，如纳武单抗(nivolumab)派姆单抗(pembrolizumab)派姆单抗、匹利珠单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)；这些化合物可以在施用使用本文提供的方法制备的TCR耗竭的经工程化的免疫细胞群之前、同时或之后施用。

在一些实施例中，可以在被设计成预防或治疗细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性的治疗方案(如抗IL6抗体)之前、同时或之后施用包括使用本文提供的方法制备的TCR耗竭的CAR表达性免疫细胞群的组合物。

在某些实施例中，可以将包括使用本文提供的方法制备的TCR耗竭的含CAR的免疫细胞群的组合物与细胞因子联合施用于受试者。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包含生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体产生素(LH)；肝生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳素；副中肾管抑制物质；小鼠促性腺激素关连肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞产生素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、IL-21，一种肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它包含LIF和试剂盒配体(KL)的多肽因子。如本文所使用的，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。

试剂盒和制品

本公开提供包括TCR耗竭试剂的试剂盒，所述TCR耗竭试剂包括抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体中的一种或多种。所述试剂盒可以用于本文提供的耗竭方法中。

在一个实施例中，本文提供的试剂盒包括抗TCR抗体和抗CD3抗体。在所述试剂盒中，抗TCR抗体和/或抗CD3抗体中的一种或二种可以任选地与生物素缀合。在具体实施例中，抗TCR抗体和抗CD3抗体均与生物素缀合。

在一个实施例中，本文提供的试剂盒包括抗TCR抗体和抗CD52抗体。在所述试剂盒中，抗TCR抗体和/或抗CD52抗体中的一种或二种可以任选地与生物素缀合。在具体实施例中，抗TCR抗体和抗CD52抗体均与生物素缀合。

在一个实施例中，本文提供的试剂盒包括抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体。在所述试剂盒中，抗TCR抗体和/或抗CD3抗体和/或抗CD52抗体中的一种或全部可以任选地与生物素缀合。在具体实施例中，抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体均与生物素缀合。

在另一方面，本文提供的试剂盒可以进一步包括与磁性纳米基质微珠、细胞大小的珠或其它支持物(如膜、声波颗粒或珠、塑料板或柱)缀合的抗生物素抗体。抗生物素抗体可以以缀合形式提供或任选地作为裸抗体连同有助于将抗体附着到磁性纳米基质微珠、细胞大小的珠或其它支持物的材料一起提供。

在具体实施例中，本文提供的试剂盒包括抗TCR抗体和抗CD3抗体。在所述试剂盒中，抗TCR抗体和/或抗CD3抗体中的一种或两种可以任选地直接与磁珠、膜、声波颗粒、塑料板或柱缀合。

在具体实施例中，本文提供的试剂盒包括抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体。在所述试剂盒中，抗TCR抗体和/或抗CD3抗体和/或抗CD52抗体中的一种或两种可以任选地直接与磁珠、膜、声波颗粒、塑料板或柱缀合。

应注意的是，虽然抗生物素抗体的使用形成了本文公开的方法的一个实施例，但也可以采用捕获生物素标记的部分的其它手段。例如，可以使用链霉亲和素、亲和素和其它生物素结合部分来代替所公开的方法中的抗生物素抗体。

本公开还提供包括本文所述的治疗组合物和试剂盒中的任何治疗组合物和试剂盒的制品。制品的实例包含含有治疗剂(例如，使用本文公开的方法制备的TCR耗竭的细胞群，所述TCR耗竭的细胞群可以进一步包括CAR)的容器(例如密封的小瓶)。

实例

如以下实例所示，所公开的组合抗体方法使TCR+细胞耗竭效率显著提高，这与单独的TCR抗体相比，出乎意料地将残余TCR+％水平从0.1％-1％减少到0.1％-0.01％(耗竭后第1天测量的)。这些实例证明了所公开的耗竭方法相对于用于耗竭TCR+细胞的当前方法提供了显著优点。这些优点可以以降低患者表现出GvHD的可能性的形式为接受同种异体疗法的患者提供益处。

实例1.抗TCR抗体和抗CD3抗体的组合增加TCR+细胞耗竭效率

使用经CAR工程化的免疫细胞，通过针对TRAC和CD52基因的的电穿孔敲除内源性TCR和CD52基因表达。然后将TCR和CD52敲除的细胞暴露于TCR耗竭试剂。如表1所示，使细胞与单独或与抗CD3抗体或抗CD52抗体组合的缀合到生物素的一级抗TCR抗体接触。

接下来，将与磁微珠(直径约50nm的纳米颗粒)缀合的二级抗生物素抗体进一步添加到一级抗体标记的细胞中，以便通过一级抗TCR生物素部分将磁微珠与任何残余TCR+细胞结合。然后使用CliniMACS 仪器将标记的细胞施加到磁柱上。TCR+细胞被保留在磁柱内部，而未标记的TCR-细胞穿过而到达产物收集袋。TCR+细胞随后从柱中释放到废物袋中。使用本公开提供的各种耗竭方法探索TCR+细胞耗竭效率，并且在使用抗TCRα抗体、抗TCRβ抗体和/或抗CD3抗体耗竭后不同天监测存在于TCR-细胞群级分中的残余TCR+细胞。图1提供了在不同单元操作情形的情况下同种异体CART制造过程的示意图。

表1.抗体条件的实验设计

表2.抗体信息

如图2A所示，使用各种不同耗竭方法的经耗竭的TCR-产物群中存在的TCR+细胞的百分比基本上小于1％或更少。图2A示出了与使用低1×TCR抗体浓度的对照耗竭方法相比，在耗竭方法中一起使用抗TCR抗体和抗CD3抗体时，在耗竭后第2天检测到TCR+细胞频率出乎意料地降低了204倍；当细胞用抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体处理时，也观察到了同等的降低。图2A还示出，使用抗TCR抗体和抗CD52抗体以及使用3×抗TCR抗体浓度的有效性低于抗TCR抗体和抗CD3抗体的组合，其中3×TCR抗体处理示出6.2倍的降低，并且抗TCR抗体和抗CD52抗体的组合示出2.7倍的降低。有趣的是，图2A证明了使用抗CD52抗体和抗TCR抗体的耗竭比单独使用抗TCR抗体更有效。此结果令人惊讶，因为如本文所述，CD52与TCR或TCR复合物没有生物学关联，并且因此出乎意料的是，采用这两种抗体的耗竭方法比仅使用抗TCR抗体更有效地耗竭TCR+细胞。图2A中示出的结果还证明，出乎意料的是，与使用较低浓度的抗TCR抗体与抗CD3抗体组合相比，简单地增加抗TCR抗体的浓度不会产生明显更好的结果。

在耗竭后第9天还研究了经耗竭的群，并且结果在图2B中示出。图2B示出了在耗竭方法中使用抗TCR抗体和抗CD3抗体时，TCR+细胞频率降低了8倍；当细胞用抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体处理时，也观察到了同等的降低。图2B还示出，使用抗TCR抗体和抗CD52抗体以及使用3×抗TCR抗体浓度的有效性低于抗TCR抗体和抗CD3抗体的组合，其中3×TCR抗体处理示出5倍的降低，并且抗TCR和抗CD52的组合示出2倍的降低。这些结果证明与使用较低浓度的抗TCR抗体与抗CD3抗体组合相比，简单地增加抗TCR抗体的浓度不会产生明显更好的结果。

图3A的FACS绘图可视化了与单独的或与抗CD3抗体和/或抗CD52抗体组合的抗TCR抗体或者增加(3×)浓度的抗TCR抗体相比，当使用抗TCR抗体和抗CD3抗体进行耗竭方法时存在的TCR+细胞最少。数据是在耗竭后第0天和第1天获取的并且与耗竭前细胞样品进行比较。结果进一步证明，在研究的天数内，与使用较低浓度的抗TCR抗体与抗CD3抗体组合相比，简单地增加抗TCR抗体的浓度不会产生明显更好的结果。

图3B的数字柱形图示出，与使用低1×TCR抗体浓度的对照耗竭方法相比，当在耗竭方法中使用抗TCR抗体和抗CD3抗体时，在耗竭后第0天和第1天的TCR+细胞频率降低了151倍和23-32倍；当细胞用抗TCR抗体、抗CD3抗体和抗CD52抗体处理时，也观察到了70倍的同等降低。应注意的是，当前的TCR耗竭操作仅采用标准的1×TCR抗体浓度，这是所公开方法之间的不同点并且被理解为当前的技术状态。图3B还示出，使用抗TCR抗体和抗CD52抗体以及使用3×抗TCR抗体浓度的有效性低于抗TCR抗体和抗CD3抗体的组合，其中3×TCR抗体处理示出19倍和7倍的降低，并且抗TCR和抗CD52的组合示出2.7倍和1.6倍的降低。这些结果进一步证明，在研究的天数内，与使用较低浓度的抗TCR抗体与抗CD3抗体组合相比，简单地增加抗TCR抗体的浓度不会产生明显更好的结果。

图4是耗竭后第0天和第1天采集的数据的FACS绘图，并且进一步证明，与单独使用高(3×)浓度或低(1×)浓度的抗TCR抗体以及使用抗TCR抗体与抗CD52抗体的组合相比，抗TCR抗体和抗CD3抗体的组合提供了更高水平的TCR耗竭。耗竭后的残余TCR+细胞通过抗TCR、抗CD3单染色或抗TCR/CD3双染色进行可视化，并且对于TCR+、CD3+或CD3+/TCR+，所述细胞预期为阳性染色。染色为CD3+/TCR-的小细胞群反映出剩余TCRγδT细胞存在于经耗竭的TCR-细胞群中，因为TCRγδT细胞预期通过抗CD3抗体被去除。

实例2.耗竭后培养

此实例证明经耗竭的免疫细胞群在耗竭后培养期间保持相同的低残余TCR+水平。在耗竭后第1天，将经耗竭的细胞冷冻，并且稍后解冻用于耗竭后培养。在冷冻之前和解冻之后立即检测TCR和CD3表达水平。如图5A-5E所示，由于冷冻-解冻循环，TCR频率和CD3频率均无显著差异；图5A使用抗TCR、抗CD3单染色或抗TCR/CD3双染色通过FACS绘图描绘了在冷冻前和解冻后TCR+、CD3+、CD3+/TCR-和CD3+/TCR+细胞的频率，图5B以数字方式描绘了使用抗TCR抗体在冷冻前和解冻后TCR+细胞的频率，图5C以数字方式描绘了使用抗CD3抗体在冷冻前和解冻后CD3+细胞的频率，图5D以数字方式描绘了使用抗TCR/CD3抗体在冷冻前和解冻后CD3+/TCR-细胞的频率，并且图5E以数字方式描绘了使用抗TCR/CD3抗体在冷冻前和解冻后CD3+/TCR+细胞的频率。

为了确定经耗竭的TCR-细胞群中的残余TCR+细胞频率是否会随着培养时间的增加而增加，将经耗竭的细胞在耗竭后培养10天。通过在整个培养过程期间每2-3天使用抗TCR(图6)和抗CD3(图7)抗体单染色或抗TCR/CD3(图8)抗体双染色检测TCR和CD3细胞频率。具体地，图6、7和8的FACS绘图描绘了对于所有耗竭方法，在耗竭后培养期间TCR+、CD3+或CD3+/TCR+细胞频率逐渐增加的趋势，随后在大约5到7天达到峰值，与单独用低浓度或高浓度的抗TCR抗体或用抗TCR抗体与抗CD52抗体的组合处理的培养物相比，随着时间的推移，使用抗TCR抗体、抗CD3抗体和/或抗CD52抗体的组合耗竭的培养物维持相同的较低TCR+或CD3+细胞频率。

接下来，图9A、9B、9C和9D的柱形图以数字形式描绘了在耗竭后培养期间TCR+、CD3+、CD3+/TCR-或CD3+/TCR+频率。

另外，还在耗竭后培养时间段期间监测细胞生长状态，包含每次传代时的活细胞密度(图10A)、活力(图10B)、细胞直径(图10C)和总扩增倍数(图10D)。总体而言，对于所有研究的耗竭方法都观察到了相当的细胞生长特性。

还研究了使用本文公开的抗体的不同组合来耗竭CD52的效率。具体地，将单独的或与其它抗体组合的抗CD52抗体用于CD52耗竭，并且还研究了用于TCR+细胞耗竭的抗TCR抗体和/或抗CD3抗体对CD52+细胞去除的影响。图11A的FACS绘图示出了耗竭后第0天和第1天耗竭后的残余CD52+细胞频率。图11B的柱形图以数字方式示出了残余CD52+细胞频率。最后，图12的FACS绘图示出了在10天的耗竭后培养期间的残余CD52+细胞频率。

总之，来自实例2的数据证明使用抗TCR抗体和抗CD3抗体两者增强了TCR+细胞耗竭效率。与单独使用抗TCR抗体相比，除使用抗TCR抗体外还使用抗CD3抗体更广泛地去除了CD3+/TCR+细胞。这种耗竭机制提供了改善的TCR+细胞耗竭效率并且对于治疗性同种异体应用来说可以是显著的优点。耗竭后的细胞在耗竭后培养期间针对所有条件都显示出相似的生长，从而表明耗竭方法不影响细胞活力和生长。