实施方式2为一种包括树脂毒素(RTX)的组合物，其用于治疗适应不良性疼痛的方法中，所述方法包括向需要治疗适应不良性疼痛的受试者外周神经周施用RTX。

实施方式3为根据实施方式1或2所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法包括施用0.1μg至100μg剂量的RTX。实施方式4为根据实施方式3所述的方法或供使用的组合物，其中RTX的所述剂量在0.1-1μg、1-2μg、2-5μg、5-10μg、10-20μg、20-30μg、30-40μg、40-50μg、50-60μg、60-70μg、70-80μg、80-90μg或90-100μg的范围内。

实施方式5为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至单一部位。实施方式6为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至多个部位。

实施方式7为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至坐骨神经。实施方式8为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至隐神经。实施方式9为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至股神经。实施方式10为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至桡神经。实施方式11为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至尺神经。实施方式12为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至正中神经。实施方式13为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至肌皮神经。实施方式14为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至指掌侧神经。

实施方式15为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自一个或多个手指的感官输入。实施方式16为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自脚或手的感官输入。实施方式17为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自前肢的感官输入。实施方式18为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自肢体的感官输入。实施方式19为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自关节的感官输入。

实施方式20为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是被截肢者。实施方式21为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中神经周施用靶向截肢部位下游的一个或多个神经纤维。实施方式22为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者罹患幻肢痛或残端痛。实施方式23为根据实施方式20至22中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中神经周施用靶向截肢部位下游的至少两个、三个、四个或五个神经纤维。

实施方式24为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者在神经末梢处具有异常神经生长。实施方式25为根据实施方式24所述的方法或供使用的组合物，其中神经周施用靶向在外周末梢处具有异常生长的神经下游的一个或多个神经纤维。实施方式26为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中神经周施用靶向神经瘤下游的一个或多个神经纤维。

实施方式27为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法包括施用包含所述RTX和药学上可接受的载体的药物制剂。实施方式28为根据实施方式27所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括水。实施方式29为根据实施方式27或28所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括聚山梨醇酯80。实施方式30为根据实施方式27至29中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括聚乙二醇。实施方式31为根据实施方式27至30中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括糖或糖醇。实施方式32为根据实施方式31所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括甘露醇。实施方式33为根据实施方式31或32所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括右旋糖。实施方式34为根据实施方式27至33中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括药学上可接受的缓冲剂。实施方式35为根据实施方式34所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲剂。实施方式36为根据实施方式27至35中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述药物制剂的pH在6至7.6的范围内。实施方式37为根据实施方式36所述的方法或供使用的组合物，其中所述药物制剂的pH在6至6.4、6.3至6.7、6.4至6.8、6.8至7.2、7至7.4或7.2至7.6的范围内。实施方式38为根据实施方式36所述的方法或供使用的组合物，其中所述药物制剂的pH为6.5或7.2。实施方式39为根据实施方式27至38中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括药学上可接受的盐。实施方式40为根据实施方式39所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的盐是NaCl。实施方式41为根据实施方式27至40中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述药物制剂中RTX的浓度在0.02-0.1μg/ml或0.1至300μg/ml的范围内。实施方式42为根据实施方式41所述的方法或供使用的组合物，其中所述药物制剂中RTX的浓度在0.02-0.1μg/ml、0.1-1μg/ml、1-5μg/ml、5-10μg/ml、10-20μg/ml、20-50μg/ml、50-100μg/ml、100-150μg/ml、150-200μg/ml、200-250μg/ml或250-300μg/ml的范围内。实施方式43为根据实施方式41或42所述的方法或供使用的组合物，其中所述药物制剂中RTX的浓度在150至250μg/ml的范围内，或为约200μg/ml。实施方式43.1为根据实施方式41或42所述的方法或供使用的组合物，其中所述药物制剂中RTX的浓度在0.1-200μg/ml的范围内，任选地其中所述药物制剂中RTX的浓度在0.1-50μg/ml的范围内。实施方式43.2为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述RTX以0.05-10ml的注射体积施用，任选地其中所述注射体积在0.05-0.2ml、0.2-0.5ml、0.5-1ml、1-2ml、2-5ml或5-10ml的范围内。

实施方式44为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是哺乳动物。实施方式45为根据实施方式44所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是猫。实施方式46为根据实施方式44所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是狗。实施方式47为根据实施方式44所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是马或猪。实施方式48为根据实施方式44所述的方法或供使用的组合物，其中所述哺乳动物是反刍动物。实施方式49为根据实施方式48所述的方法或供使用的组合物，其中所述反刍动物是牛、绵羊或山羊。实施方式50为根据实施方式44至49中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述哺乳动物是家养哺乳动物。

实施方式51为根据实施方式44所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是人类。

实施方式52为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述治疗减少所述适应不良性疼痛的局部和中枢影响。实施方式53为根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者在治疗之前具有适应不良性疼痛的一种或多种行为症状，并且所述治疗减少或消除所述一种或多种行为症状。

II.

具体实施方式

现在将详细参考本发明的某些实施方式，其实施例在附图中示出。虽然本发明将结合示出的实施方式进行描述，但应理解，它们并不意图将本发明限制于那些实施方式。相反，本发明旨在覆盖可以包含在由所附权利要求书限定的本发明内的所有替代方案、修改和等同物。

在详细描述本教示内容之前，应理解本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为这些可以变化。应注意，除非上下文另有明确指示，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包含多个提及物。因此，举例来说，提及“结合物”包含多个结合物并且提及“细胞”包含多个细胞等。

数值范围包含界定所述范围的数值。考虑到有效数字和与测量相关的误差，已测量值和可测量值应被理解为近似值。此外，“包括(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”和“包含(include/includes/including)”的使用并不打算是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教示内容的限制。

除非在以上说明书中具体指出，否则在说明书中叙述“包括”各种组分的实施方式也被设想为“由所叙述组分组成”或“基本上由所叙述组分组成”；在说明书中叙述“由各种组分组成”的实施方式也被设想为“包括”所叙述组分或“基本上由所叙述组分组成”；并且在说明书中叙述“基本上由各种组分组成”的实施方式也被设想为“由所叙述组分组成”或“包括”所叙述组分(此互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。

本文所使用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为以任何方式限制所希望的主题。在通过引用并入的任何文献与本说明书中所定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各种实施方式来描述本教示内容，但是并不打算将本教示内容限制于此类实施方式。相反，如本领域的技术人员应了解，本教示内容涵盖各种替代方案、修改和等同物。

A.定义

如本文所用的“外周神经周施用”或简单地“神经周施用”是对于外周神经末梢与细胞体之间的神经纤维的施用。举例来说，神经周施用涵盖在外周神经末梢和神经细胞体之间足够接近神经纤维的地方注射药剂，使药剂接触神经纤维。

“适应不良性疼痛”是指与实际组织损伤不成比例的疼痛，这种疼痛在组织已愈合后和/或在不存在组织损伤的情况下仍然存在，因此所述疼痛本身就是一个问题，与任何潜在的当前疼痛源(如损伤)无关。适应不良性疼痛不同于神经性疼痛，其由影响感觉神经元的损伤或疾病引起。

关于神经周施用部位所使用的“下游”是指远离神经末梢的沿着轴突的部位，使得神经末梢本身不被所施用的药剂接触。

“反刍动物”是具有瘤胃的哺乳动物。反刍动物的实施例包含(但不限于)牛、绵羊、羚羊、鹿和长颈鹿。

如本文中所使用的术语“或其一组合”和“或其组合”是指在所述术语之前所列出的术语的任何和所有排列以及组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包含以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定上下文中顺序是重要的，则还包含BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续这个实施例，明确地包含含有一个或多个项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟练的业内人士将了解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语的数量的限制。

除非上下文另有要求，否则“或”以包含性含义使用，即等同于“和/或”。

B.示例性方法和供使用的组合物

本文提供治疗适应不良性疼痛的方法，其包括向需要治疗适应不良性疼痛的受试者外周神经周施用树脂毒素(RTX)。还提供包括RTX的组合物，其用于治疗适应不良性疼痛的方法中，所述方法包括向需要治疗适应不良性疼痛的受试者外周神经周施用RTX。本公开部分地基于以下认识：尽管文献(例如，在Subedi等人和Borkum，同前文献中)中陈述背根神经节和中枢神经系统在适应不良性疼痛(包含其来源)中起相当大的作用，但外周神经周施用RTX可提供适应不良性疼痛的显著缓解。不希望受任何特定理论所束缚，外周神经周施用RTX可中断传入感受伤害性神经元所携带的信号达到足够的程度和足够的持续时间，以提供不仅是局部而且是中枢的神经影响，从而长期减少或控制适应不良性疼痛，而无需直接治疗背根神经节或中枢神经系统，这与适应不良性疼痛涉及中枢神经系统敏感化这一不大可能通过外周治疗解决的持久性问题的观点相反。因此，通过如本文所公开的神经周途径施用RTX以治疗适应不良性疼痛，可以提供从文献中无法预测到的益处，如允许有效地缓解疼痛，而无需治疗背根神经节或中枢神经系统或全身治疗及其伴随的风险，和/或相对于靶向感受伤害性神经末梢(例如，关节腔、皮肤或肌肉中)的治疗，剂量和/或频率减少。

1.受试者

本文所描述的组合物和方法适用于RTX有效，例如能够结合和激活TrpV1或其同源物，并且需要治疗适应不良性疼痛的任何受试者。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人类。在一些实施方式中，哺乳动物是猫。在一些实施方式中，哺乳动物是狗。在一些实施方式中，哺乳动物是反刍动物。在一些实施方式中，哺乳动物是马、牛、猪、绵羊或山羊。

在一些实施方式中，受试者是被截肢者。在一些实施方式中，受试者罹患幻肢痛。举例来说，幻肢痛可发生在被截除的手指、手、前臂、臂、脚趾、脚、腿或其部分(例如，对于腿来说，在膝部上方或下方)的部位处。在一些实施方式中，受试者罹患残端痛。举例来说，幻肢痛可在截肢术之后在残余肢的末端发生，例如被截除的手指、手、前臂、臂、脚趾、脚、腿或其部分(例如，对于腿来说，在膝部上方或下方)的末端处。可具有幻肢痛或残端痛的受试者的另一实施例为除爪动物，例如猫。在一些实施方式中，受试者在神经末梢处具有异常神经生长。举例来说，神经末梢处的异常生长可为神经瘤。

在一些实施方式中，受试者在治疗之前具有适应不良性疼痛的一种或多种行为症状，并且所述治疗减少或消除所述一种或多种行为症状。举例来说，在家养动物中，适应不良性疼痛的行为症状包含行为问题，如被操控时的攻击性，或减弱的寻求注意力(不寻求抚摸)，以及在猫中，排泄行为问题(例如，在猫砂盆外部排尿或排粪，在猫砂盆中不挖掘和掩埋排泄物)。

2.施用部位

RTX可以神经周施用至一个或多于一个部位，这取决于造成适应不良性疼痛的神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至单一部位。

在一些实施方式中，RTX经神经周施用至股神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至坐骨神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至隐神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至桡神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至尺神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至正中神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至肌皮神经。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至指掌侧神经。坐骨神经从下背延伸到腿(在四足动物的情况下为后腿)。隐神经是股神经的最大皮支，并且位于小腿(在四足动物的情况下为下后肢)中。股神经位于腿部的上部大腿(在四足动物的情况下为上后肢)中。桡神经位于上臂(在四足动物的情况下为上前肢)中。尺神经位于前臂和手(在四足动物的情况下为前肢)中。正中神经位于上臂(在四足动物的情况下为前肢)中。肌皮神经位于臂(在四足动物的情况下为前肢)中并且在肱骨中间从正中神经分支出来。指掌侧神经位于手(在四足动物的情况下处于前肢末节)中。

在一些实施方式中，RTX经神经周施用至多个部位。举例来说，治疗坐骨神经和隐神经将阻断腿疼痛，治疗尺神经和指掌侧神经将阻断手疼痛，并且治疗桡神经和正中神经将阻断上臂疼痛。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自一个或多个手指的感官输入。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自脚或手的感官输入。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自前肢(例如前臂或小腿)的感官输入。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自肢体(例如臂或腿)的感官输入。在一些实施方式中，RTX经神经周施用至多个部位，所述多个部位共同对应于来自关节的感官输入。在一些实施方式中，多个部位包含神经的多个分支(例如尺神经的背侧支和掌支)。

在一些实施方式中，(RTX)通过注射施用。可以例如使用1cc注射器或更一般来说，大小适合于剂量体积的注射器来进行注射。

3.剂量

在一些实施方式中，RTX以0.1-100μg的剂量施用。在一些实施方式中，RTX的剂量在0.1-0.5μg、0.5-1μg、1-2μg、2-5μg、5-10μg、10-20μg、20-30μg、30-40μg、40-50μg、50-60μg、60-70μg、70-80μg、80-90μg或90-100μg的范围内。举例来说，例如在除爪的猫中，2.5μg的总剂量可经神经周施用至一个或两个前肢。在一些实施方式中，在人类中，施用至多25μg(例如，5-10μg、10-15μg、15-20μg或20-25μg；或约5、10、15、20或25μg)的剂量。在一些实施方式中，使用2、3或4点神经阻断技术，其中总剂量在上文所列的任一范围内，如0.5-1μg、1-2μg、2-5μg、5-10μg、10-15μg、15-20μg或20-25μg的总剂量。

可以取决于施用部位与神经纤维的接近度调节剂量和体积。举例来说，在超声波或神经刺激物用以确认施用部位极接近神经的情况下，可使用较低剂量和体积。或者，可使用较大体积(如，3-5ml)来实现神经阻断(如肩胛骨神经或坐骨神经阻断)以确保与合乎期望的神经接触。值得注意的是，RTX对TRPV1受体具有特异性并且因此不影响非目标神经，如不具有足够的对RTX敏感的TRPV1受体的运动神经元。

4.制剂

RTX制剂的多个实施例在文献中可获得。参见例如Ueda等人(2008)《心血管药理学杂志(J.ofCardiovasc.Pharmacol.)》51:513-520和US 2015/0190509 A1。可使用用于肠胃外施用(例如注射)的RTX的任何合适制剂。

在一些实施方式中，将可以在上文所论述的剂量下的RTX与药学上可接受的载体一起施用。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括水。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括聚山梨醇酯80。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括聚乙二醇。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括糖或糖醇。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括甘露醇。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括右旋糖。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括药学上可接受的缓冲剂。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲剂。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括药学上可接受的盐。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括NaCl。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括有机溶剂，如乙醇或DMSO，例如作为少数或残余组分用作助剂帮助溶解RTX，随后稀释于主要的水性组合物中。

制剂中RTX的浓度可以是用于递送预期剂量的任何合适的值。在一些实施方式中，药物制剂中RTX的浓度在0.1至300μg/ml的范围内。在一些实施方式中，药物制剂中RTX的浓度在0.1-1μg/ml、1-5μg/ml、5-10μg/ml、10-20μg/ml、10-30μg/ml、20-30μg/ml、20-50μg/ml、50-100μg/ml、100-150μg/ml、150-200μg/ml、200-250μg/ml或250-300μg/ml的范围内。在一些实施方式中，药物制剂中RTX的浓度在150至250μg/ml的范围内或为200μg/ml。在一些实施方式中，药物制剂中RTX的浓度在0.1至200μg/ml，如0.1至50μg/mL或50至200μg/mL的范围内，或为约0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、5、10、20、25、50、100或200μg/mL。

制剂可具有适用于神经周施用的任何pH值。在一些实施方式中，包括RTX和药学上可接受的载体的药物制剂的pH值在6至7.6的范围内。在一些实施方式中，包括RTX和药学上可接受的载体的药物制剂的pH值在6至6.4、6.3至6.7、6.4至6.8、6.8至7.2、7至7.4或7.2至7.6的范围内。在一些实施方式中，包括RTX和药学上可接受的载体的药物制剂的pH值为6.5或7.2。

在一些实施方式中，制剂包括聚山梨醇酯80和右旋糖。在一些实施方式中，聚山梨醇酯80的浓度为2-4％w/v，和/或右旋糖的浓度为4-6％w/v。在一些实施方式中，聚山梨醇酯80的浓度为3％w/v，和/或右旋糖的浓度为5％w/v。在一些实施方式中，在任何前述制剂中，RTX的浓度可以是10-30μg/ml，如10μg/ml或25μg/ml。在一些实施方式中，制剂还包括磷酸盐缓冲剂，例如在表1中关于磷酸盐缓冲剂所示的浓度和pH值。在一些实施方式中，制剂还包括NaCl，例如在表1中关于NaCl所示的浓度。当两者都存在时，磷酸盐缓冲剂和NaCl可以(但不一定)以关于单个制剂所示的浓度和磷酸盐缓冲剂pH值的组合存在。

RTX的示例性制剂示于下表中。

表1.示例性RTX溶液制剂

在一些实施方式中，将表1中所示的制剂中RTX的浓度调节到本文所公开的RTX浓度或浓度范围中的任一个。举例来说，在一些实施方式中，将表1中所示的制剂中RTX的浓度调节到10-50μg/ml。作为另一实施例，在一些实施方式中，将表1中所示的制剂中RTX的浓度调节到10-30μg/ml。作为另一实施例，在一些实施方式中，将表1中所示的制剂中RTX的浓度调节到20-30μg/ml。作为另一实施例，在一些实施方式中，将表1中所示的制剂中RTX的浓度调节到25μg/ml。在一些实施方式中，将表1中所示的制剂中RTX的浓度调节到0.1至100μg/ml、或0.1至50μg/ml(如0.1至25μg/ml、25至50μg/ml)或50至100μg/ml范围内，或约0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、5、10、20、25、50或100μg/ml的浓度。

表1中的制剂可以根据以下示例性方法制备，所述示例性方法提供用于制剂3和5，但本领域的技术人员可使其适用于其它制剂。制剂3可通过如下方式制得：制备30mM，pH7.2磷酸盐缓冲剂。接着将1.43％w/v聚山梨醇酯80和0.86％w/v NaCl混合以形成水性组分。将20mg RTX添加到量瓶中的100mL水性组分中。接着添加30mLPEG 300并且对溶液进行超声处理以溶解固体。添加水性组分达到约80％体积，且接着将其超声处理以混合。应注意，RTX有时最初会在水溶液与PEG的界面处沉淀，但会在超声处理时回流至溶液中。将烧瓶中的全部混合物用水性组分稀释至体积，且将此通过倒置法加以混合。将全部制剂通过0.2μm聚四氟乙烯(PTFE)过滤器过滤。

制剂5可通过如下方式制得：制备30mM，pH 7.2磷酸盐缓冲剂。接着，将3.0％w/v聚山梨醇酯80、0.8％w/v右旋糖和0.54％w/v NaCl混合在一起以形成水性组分。将20mg RTX添加到量瓶中的100mL水性组分中。添加水性组分达到约80％体积，且接着将其超声波处理以溶解所有固体。(或者，可将RTX最初溶解于小体积的乙醇或DMSO中，且可接着将此溶液添加到水性组分中。)将烧瓶中的全部混合物用水性组分稀释至体积，且将此通过倒置法加以混合。将全部制剂通过0.2μm PTFE过滤器过滤。

根据制剂11的制剂是使用200μg RTX、20mg聚山梨醇酯80(使用市售的聚山梨醇酯80)；5.4mg氯化钠、50mg右旋糖以及30mM水性磷酸盐缓冲剂、水(WFI)(达到1mL)制备的。

在一些实施方式中，药物制剂呈单位剂型。以此类形式，将制剂再分为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是经包装的制剂，所述包装含有如在小瓶、安瓿或预装载注射器中的离散量的制剂。此外，单位剂型可以是例如溶液或用于复水的冻干组合物。

关于配制和施用技术的其它细节可见于Gennaro,A.,编,《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第18版.(1990)(马克出版公司(MackPublishing Co.),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.))中。

III.实施例

A.针对在猫中进行神经周施用试验的研究设计

如本文中所描述，RTX的局部区域施用将用于患有难治性局部适应不良性疼痛的猫群体，以评估耐受性、安全性和镇痛效果，如表2中所示。

在即将使用之前，通过将0.1mL:(2.5μg)RTX稀释于0.9mL无菌生理食盐水中，来将5μg/猫或2.5μg/前肢的每个剂量配制于1cc胰岛素注射器中，以用于注射。对于治疗，将总共1.0mL(2.5μg)以神经阻断形式注射，对于每个前肢，同等分布在4个注射部位上(0.25ml/注射部位)。

所述研究的纳入标准包含以下：猫在除爪手术后有局部前肢疼痛的记录；猫所经历的疼痛对标准疼痛处理是难治的，或者饲主选择寻求不同于常规治疗的疼痛处理；饲主表示他或她的猫由于难治性疼痛而经历生存质量的显著下降，饲主报告与慢性适应不良性疼痛状态相关的行为问题，如排泄行为问题(在猫砂盆外部排尿或排粪，在猫砂盆中不挖掘和掩埋排泄物)，被操控时的攻击性，或减弱的寻求注意力(不寻求抚摸)，和/或由于与难治性疼痛相关的临床症状而考虑对其猫进行安乐死(即，疼痛和行动能力不利地影响生存质量)；常用于治疗疼痛的药物(即使是出于另一原因开出的处方，例如皮质类固醇)是可接受的，其条件是在加入本研究前这些药物已经施用了至少2周，并且预期在未来3周内不会改变方案；以及在治疗当天前至少90天进行了除爪手术。猫还必须具有至少12个月的年龄、至少2kg的体重，并且不参与另一研究或未由于主要神经疾病而具有障碍。

如果猫展现以下排除标准中的任一项，那么将从所述研究中排除所述猫：猫怀孕或处于哺乳期；猫在研究过程期间需要可能干扰研究目标的药物或补充剂；或在治疗之前第7天或第0天，研究者对疼痛严重程度的评定按10点量表计小于5。

通过将0.25mLRTX各自注射至1)桡神经浅支、2)尺神经背侧支、3)正中神经和尺神经掌侧支浅支和4)尺神经掌侧支深支中来进行四点神经阻断。每个前肢的神经阻断都是按照已公布的猫前足局部阻断技术进行的(Enomoto等人(2016)《猫医学与外科杂志(J.Feline Med.Surg.)》18:838-845)。为了阻断桡神经浅支(RSbr nn)，将肢体安置为背面朝上并且腕部呈180°伸展。将一根25G×5/8英寸的针从在前臂腕关节水平处的肢体中心的点皮下(SC)插入。针与肢体长轴成10-20°角，斜面朝上，皮下推进约10mm。一旦针尖距离副头静脉和头静脉的汇合点3-5mm，就进行注射(0.25mL)。为了阻断尺神经背侧支(UDbr n)，将肢体安置为侧面朝上。点定位于与副腕骨(ACb)横向且在与副腕骨相同的水平处，安置于ACb和尺骨茎突(SpU)之间。将一根25G×5/8英寸的针从远端到近端皮下插入，使针尖位于ACb和SpU之间形成的沟槽的中点，并且接着进行注射(0.25mL)。为了阻断正中神经(M n)和尺神经掌侧支浅支(UPbrS n)，将肢体安置为掌面朝上。将一根25G×5/8英寸的针在腕垫的远端边界和其横向约5mm处皮下插入，垂直于掌骨长轴，斜面朝上。将针皮下插入，直至所述点位于从肢体外侧面到内侧面的距离的三分之二处。在此点处注入三分之二的注射液体积，且在抽出针时注射剩余体积(0.25mL)。对皮下的注射量施加温和的按摩，持续5秒。为了阻断尺神经掌侧支深支(UPbrDp n)，将肢体安置为掌面朝上。使一根25G×5/8英寸的针几乎垂直于ACb，在中侧方向上插入，使得针接触ACb中点的中间掌面，斜面朝上。接着将针重定向背侧并且在ACb的内侧上推进2-3mm，直至穿过屈肌支持带，并且接着进行注射(0.25mL)。

在第3天、第7天和第14天，使用用于定性评定的饲主录像(跳跃、操纵肢体)对注射RTX的有效性进行评定，并且也将使用猫科动物肌肉骨骼疼痛指数(FMPI)和客户特定结果测量(CSOM)评估猫。

对于CSOM，饲主被要求使用1-5的标度对以下三个属性进行评分：(Q1)伸展远端肢体、“揉捏”；伸展，(Q2)奔跑；以及(Q3)从床和窗户往下跳跃，其中1＝无问题，2＝轻度困难，3＝中度，4＝严重困难，以及5＝办不到。

对于FMPI，使用0-4的标度针对命名为Q1-Q17的17个属性对猫进行评分，其中0＝完全不能，1＝勉强或非常努力，2＝比正常情况适度稍差，3＝接近正常以及4＝正常。FMPI总分是每个问题的评分的总和。总评分越高指示障碍越小，其中可能的范围为(0-68)。对于分析，可使用总评分或可能百分比。Q1-Q17如下：走路(Q1)、奔跑(Q2)、往上跳(Q3)、跳到直至厨房柜台的高度(Q4)、往下跳(Q5)、爬上楼梯(Q6)、下楼梯(Q7)、玩/追赶玩具(Q8)、与其它宠物玩耍和互动(Q9)、从抵靠的位置站起来(Q10)、躺下或坐下(Q11)、伸展(Q12)、梳毛(Q13)、与饲主互动(Q14)、被触摸或操控(Q15)、吃饭(Q16)以及使用猫砂盆(Q17)。

注射RTX的安全性是通过比较筛选时进行的全血细胞计数(CBC)和血生化检查的结果与第14天获得的结果来评估的。还监测猫的不良事件。

B.神经周施用至罹患适应不良性疼痛的除爪猫

在单只患有适应不良性疼痛的除爪猫中，评估了RTX施用的耐受性、安全性和镇痛效果。猫接受总计1.0mL(2.5μg)以神经阻断形式注射的RTX，如上文实施例A中所描述，对于每个前肢，同等分布在4个注射部位上(0.25ml/注射部位)。在RTX施用期间未观察到并发症。RTX的注射一般为良好耐受的。注意到注射后一小时有气喘和分泌唾液的不良事件，而这两个事件在两小时内消退。猫在注射后12小时还呈现了自限性食欲下降。没有观察到类似过敏反应的迹象，并且注射区域中也不存在水肿或疼痛的迹象。

在筛选当天，所述猫呈现的CSOM总分为8和Q1-Q3为轻度到中度困难。在用RTX注射后第14天，CSOM评分为6，其中猫在Q1-Q3情况下有轻度困难。延伸远端肢体、揉捏、伸展和奔跑都显示出此猫有改善。还在第7天和第14天评估CSOM，其均显示相对于第3天的改善，如表3中所示。

表3.在单次注射RTX之后CSOM评分的差异

没有斜体的单元格指示基线或无变化，并且具有斜体数字的单元格指示改善。未观察到评分的恶化。

RTX注射前及后与除爪指相关疼痛相关的体检结果的概述呈现于表4中。

表4.体检发现的概述

使用猫科动物肌肉骨骼疼痛指数(FMPI)评估单次注射RTX至猫中的镇痛效果(表5)。FMPI总分是每个问题的评分的总和。总评分越高指示障碍越小，其中可能的范围为(0-68)。对于分析，可使用总评分或可能百分比。在筛选当天和第0天，所述猫的FMPI评分为47。在注射RTX后第14天，所述猫的FMPI评分为57，指示有改善。通过取得所述猫的总评分且除以总可能点(即，应答问题的数目乘以4)来进行可能百分比的计算。因此，可能百分比＝(Q1-17评分的总和)/(应答问题的数目*4)。

表5.在单次注射RTX之后FMPI评分的差异

具有白色背景且无斜体的单元格指示基线或无变化，具有斜体的单元格指示改善，且填充黑色的单元格指示评分恶化。

此外，所述猫在治疗之前已经显示排泄行为问题、被操控时的攻击性和减弱的寻求注意力。每个这些与慢性适应不良性疼痛状态相关的行为问题在神经周施用RTX后被逆转，即使所述猫在这种治疗之前被认为已疼痛多年。这些结果证明，减少外周信号传递足以逆转中枢对适应不良性疼痛的感知，甚至在可能具有与适应不良性疼痛有关的中枢神经系统中持续长期可塑性变化的受试者中也是如此。

因此，如由CSOM和FMPI评分的改善所示，此猫中RTX的施用是安全且有效的。效果持续至少14天。

C.对于神经周树脂毒素针对除爪猫中严重慢性远端肢体疼痛的研究

猫中的慢性远端肢体疼痛对其生存质量(QoL)是不利的。此研究的目的是评估在具有慢性远端胸肢疼痛迹象的除爪猫中使用RTX作为唯一神经周疼痛处理治疗方法。

在手术或创伤性截肢术期间，神经和周围组织中出现大量创伤。此神经损伤使得神经末梢发芽，致使末端变得过度兴奋，这因局部发炎而延续并恶化。

来自罹患截肢后疼痛综合征的人类和猫科动物患者的科学证据表明，这种多因素病况的发展与局部神经瘤的形成和随后外周和中枢神经通路的改变密切相关(Hanyu-Deutmeyer AA和Dulebohn SC.StatPearls[互联网].Treasure Island(FL):StatPearls出版；2018年1月-2018年4月17日)。猫科动物与人类患者在病理生理学和临床表现上的相似性，使猫科动物除爪后疼痛综合症转变为极佳的转化医学工具，加深了我们对人类的疼痛性适应不良性疾病的理解，如残肢疼痛和复杂区域疼痛综合症(CRPS)。

由于在截爪术后出现严重并发症而罹患严重双侧慢性疼痛(超过90天)的猫被纳入本研究(一项探索性、开放标签、多中心的临床试验)中。十三个(13)病例针对初始疼痛和降低的生存质量(QoL)而被治疗。接着，在全身麻醉(苯海拉明(diphenhydramine)、丁基原啡因(buprenorphine)、右美托咪啶(dexmedetomidine)、氯胺酮和异氟醚的组合)下施用双侧神经周远端肢体注射(环形阻断技术)。按照已公布的猫前足神经阻断技术(Enomoto等人,2016)，RTX的总剂量同等分布在1)桡神经浅支、2)尺神经背侧支、3)正中神经和尺神经掌侧支浅支和4)尺神经掌侧支深支附近。将总共2.5ug(在第1组中，每只前肢1.25ug/1mL，n＝7)和5ug(在第2组中，每只前肢2.5ug/1mL，n＝6)的RTX治疗作为一次性治疗剂注射。第2组包含上文实施例B中提供具体结果的猫。使用客户特定结果测量猫科动物(CSOMf)、猫科动物肌肉骨骼疼痛指数(FMPI)、注射后两次体检以及注射后第3、7、14和28天的录像来实现接下来28天的对QoL和疼痛的监测。

在两组(第1组71.4％；第2组100％)中，动物经历与麻醉恢复期间的治疗相关的自限性反应。最常见的不良事件(AE)为气喘(第1组为57.1％；第2组为83.3％)、发声(第1组为57.1％；第2组为83.3％)和唾液分泌过多(第1组为71.4％；第2组为50％)，且这些事件在治疗后4小时内消退。

当按呈现和消退的当天分析时，在两组中，超过85％的AE在施用的同一天呈现并消退(第1组＝86.6％[26/30]；第2组＝95.4％[21/22])。

在28天的监测周期内，CSOMf和FMPI评分显示出明显的改善。

在两组中，饲主都报告了自然行为(即社交、揉捏和身体活动的改善)和病理学采用行为(即对饲主和同屋中其它宠物的攻击性，不当排尿和排粪)的明显变化，这被视为指示QoL改善。在一些情况下，这些行为上的改善使得被放弃的患者能够被收养并重新安置到新的家庭。正式监测周期为28天，但在一些情况下，非正式地报告了持续若干月(超过6个月)的改善。据报告，有至少两只猫的改善持续了数月，包含行为举止的改善和负面行为的减少，并减少或消除了对每日全身性药物治疗的需求。

因此，本研究提供了证据，证明用于慢性疼痛处理的RTX神经周注射可以有效地治疗患有不利影响生存质量的远端胸肢疼痛的猫，并且此外，所描述剂量的神经周RTX在这些猫中耐受良好。

D.树脂毒素作为神经阻断注射剂在具有14天恢复期的大鼠中的单次剂量研究

本研究是针对当RTX作为神经阻断注射剂以单次剂量供给大鼠时，确定施用RTX的安全性。

研究设计如下：

表6

实验设计-主要研究和恢复研究

^a注射用0.9％氯化钠，USP。

^b30mg/mL吐温80，1.38mg/mL磷酸二氢钠单水合物，2.84mg/mL无水磷酸氢二钠，50.0mg/mL右旋糖单水合物，5.4mg/mL氯化钠，1mL无菌水。

^c25μg/mL树脂毒素。

^d200μg/mL树脂毒素。

表7

实验设计-毒理动力学研究

^a注射用0.9％氯化钠，USP。

^b30mg/mL吐温80，1.38mg/mL磷酸二氢钠单水合物，2.84mg/mL无水磷酸氢二钠，50.0mg/mL右旋糖单水合物，5.4mg/mL氯化钠，1mL无菌水。

^c25μg/mL树脂毒素。

^d200μg/mL树脂毒素。

以神经阻断注射剂形式以0.625、2.5和10μg的水平施用树脂毒素在大鼠中耐受良好。无观察不良效应水平(NOAEL)被视为10μg。

119只雄性和119只雌性Crl:CD(SD)史泊格多利大鼠获自北卡罗来纳州罗利(Raleigh,NC)的查尔斯河实验室弗利公司(Charles River Laboratories)。所述动物为10周龄并且在给药开始时称重在212与482g之间。

将雄性动物和雌性动物以随机方式用层别法分别分配到各组，以达到相似的组别平均体重。

在给药开始之前，被视为不适合用于研究的经分配动物被替换为获自同一批次并在相同的环境条件下维持的备用动物。

神经阻断注射剂量提供至右大腿中。将动物暂时约束用于剂量施用。经由异氟醚吸入给动物服镇静剂用于剂量施用。每只动物的给药当天指定为第1天。对在研究中死亡的恢复期研究动物进行尸检，并保留指定组织。在尸检前冷藏动物以使自溶降到最低。

出于人道原因，对恢复期研究动物进行安乐死。动物经受尸检在尸检之前冷藏动物以使自溶降到最低。

存活直至在第2天预定安乐死的主要研究和恢复期动物都已被记录了最终体重；收集样品用于临床病理评估；并通过异氟醚吸入之后进行放血对动物进行安乐死。存活直至预定安乐死的毒理动力学动物通过二氧化碳吸入来进行安乐死。

主要研究和恢复期动物经受了完整的尸检。经委员会认证的兽医学病理学家可供用于预定尸检。

所有的统计测试都在5％的显著性水平下进行。使用双侧测试进行所有成对比较。

以下列出所关注的成对比较：

分析排除了观察结果小于3个的任何组。

列文氏检验(Levene's test)用于评估组别方差的同质性。

如果列文氏检验不显著，则使用总体单因素方差分析F检验来比较各组，或者如果显著，则使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)。如果发现总体F检验或克鲁斯卡尔-沃利斯检验是显著的，则分别使用邓尼特氏(Dunnett's)或邓恩氏(Dunn's)检验进行成对比较。使用邓尼特氏检验(相当于Nevis 2012表中的t检验)或邓恩氏检验(相当于Nevis 2012表中的威尔科克森秩和检验(Wilcoxon Rank-Sum test))比较具有两组的数据集。

结果

使用验证过的方法来测定对照和测试制剂中的RTX浓度。在第1组和第2组(媒剂)的任一个样品中中均未检测到RTX。第3组到第5组中的平均浓度在其理论浓度的93.6％到117％范围内。

不存在与测试物相关的非计划性死亡或大体的观察结果。

在10μg下，雄性在第1天到第2天，雌性在第1天到第14天的平均体重增加有与树脂毒素(RTX)相关的统计学上显著的降低，这对应于与对照相比的平均体重降低。

在第2至第7天，在2.5μg下，仅雌性的食物消耗量在统计学上显著减少，而在10μg下，仅雄性的食物消耗量在统计学上显著减少。

在某些白血球数目、血小板计数、纤维蛋白、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶、总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率、磷、比重和甘油三酯以及几个其它参数方面注意到各种统计学上显著的差异；然而，这些差异不被视为是不利的，或由于以下1个或多个原因不被视为与媒剂或测试物相关：绝对差异极小；变化缺乏明确的剂量-反应关系；不存在相关的微观发现；绝对差异极小；和/或变化缺乏明确的剂量-反应关系。此外，除了仅在雌性中，在10μg下,嗜中性白血球有统计学上显著的增加，并在恢复期后仍保持增加外，所述差异一般都在恢复期期间消退。

在临床化学参数方面没有与树脂毒素(RTX)相关的不良变化。

在最终安乐死或恢复期的动物中未注意到测试物相关的大体发现。所观察到的大体发现被视为偶然的，具有在这种品系和年龄的大鼠中通常所观察到的性质，和/或在对照和经处理的动物中具有类似发生率，并且因此被视为与RTX的施用无关。

在被施用10μg RTX的两种性别中观察到统计学上显著较低的绝对和相对脾脏重量。这在显微镜下与白髓的淋巴细胞性极小降低相关。被施用10μg RTX的两种性别中的较低绝对和相对胸腺重量在显微镜下与淋巴细胞性的极小至轻度降低相关。未注意到其它与测试物相关的器官重量变化。在最终安乐死时所注意到的与测试物相关的器官重量变化，在恢复期结束时(第15天)未观察到。

存在经分离器官的重量值与其各自的对照有统计学上的差异。然而，不存在模式、趋势或相关数据表明这些值是毒理学相关的。因此，所观察到的器官重量差异被视为偶然的和/或与体重变化相关，并且与RTX的施用无关。

发生了两起与测试物施用无关的非计划性死亡，包含一只服用2.5μg RTX(测试物1)的恢复期研究雌性动物在第2天被发现死亡以及一只被施用对照物2的恢复期研究雌性动物在第13天被安乐死。被施用测试物1的动物的死亡归因于吸入相关的异物/肺部炎症，而被施用对照物2的动物的死亡可能不能通过大体或微观评估来解释，并且可能也不能排除垂死情况与对照物2的关系。

总之，以0、0.625、2.5或10μg的剂量以单次剂量形式对大鼠进行RTX的神经阻断注射未导致与测试物相关的死亡、器官重量差异或大体观察结果。在≥2.5μg RTX时，乳腺出现了非不良的微观变化(单细胞坏死)，并且在10μg RTX时，骨骼肌出现了微观变化(肌纤维变性/坏死)，所有这些在14天的恢复期后完全恢复。在施用部位处注意到与对照物2相关的微观变化(混合性细胞发炎，伴有或不伴有肌纤维变性/坏死)。所有这些发现在14天的恢复期后完全恢复。