一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用
阅读说明：本技术 一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用 (Application of artemisia annua extract in stimulating broomrape seed germination ) 是由 赵娜娜 于 2020-11-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用,包括如下步骤：椒蒿提取物的提取：椒蒿晒干剪碎后,浸泡,浓缩后再用溶剂提取,再浓缩得到椒蒿提取物；列当种子的表面消毒；预培养：在培养皿内铺上定性滤纸和玻璃纤维滤纸,将消毒过的列当种子均匀地撒在玻璃纤维滤纸片上,密封,恒温暗培养；列当种子发芽实验：椒蒿提取物加甲醇稀释后,将滤纸片浸湿,放置干燥,在培养皿中铺上定性滤纸并浸湿。将干燥后的滤纸片放在定性滤纸上,挑选预培养后的列当种子,密封,恒温黑暗培养。椒蒿提取物能高效刺激列当种子提前萌发,因种子未能及时找到寄主并进行吸附生活,从而造成列当“自杀萌发”,可有效用于列当寄生杂草的生物防治工作。(The invention discloses an application of artemisia annua extract in stimulating broomrape seed germination, which comprises the following steps: extracting artemisia annua extract: sun drying and cutting Artemisia annua, soaking, concentrating, extracting with solvent, and concentrating to obtain Artemisia annua extract; sterilizing the surface of broomrape seeds; pre-culturing: spreading qualitative filter paper and glass fiber filter paper in a culture dish, uniformly scattering the sterilized broomrape seeds on the glass fiber filter paper, sealing, and performing constant-temperature dark culture; broomrape seed germination experiment: diluting Artemisia annua extract with methanol, soaking filter paper sheet, drying, spreading qualitative filter paper in culture dish, and soaking. And (3) placing the dried filter paper sheet on qualitative filter paper, selecting the broomrape seeds after pre-culture, sealing, and culturing at constant temperature in the dark. The artemisia annua extract can efficiently stimulate the broomrape seeds to germinate in advance, and the broomrape seeds cannot find hosts in time and live in an adsorption manner, so that the broomrape is subjected to suicide and germination, and the artemisia annua extract can be effectively used for biological control of parasitic broomrape weeds.)
技术领域
本发明涉及一种促进种子发芽的方法，具体是一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用，属于农业技术领域。
背景技术
列当是列当科列当属的一类全寄生植物，常寄生于植物的根部，列当根形成吸器侵入寄主根内，会吸取寄主植物体内养分和水分，阻碍植物的生长，使寄主植物的产量下降，尤其是对葫芦科、茄科、菊科、伞形科、十字花科植物的生长影响较大。列当种子细而小，结实量惊人，在土壤中最长可存活十年。广泛分布于亚州西部、地中海地区以及非洲东部等地区。在我国列当属植物大约有23种，主要分布在东北、西北、华北地区。
危害农作物的列当主要有向日葵列当、小列当、列当、弯管列当等。新疆分布最广泛、危害最为严重的是瓜列当和向日葵列当。瓜列当主要寄生在瓜类、番茄上，尤其以新疆的南疆、东疆地区发生最为普遍，寄生率一般在30％-40％，最高可达100％，严重影响寄主植物的正常生长，例如会导致甜瓜植株萎蔫，它的产量、品质、含糖量都会降低。据报道，1994年新疆甜瓜和西瓜因列当寄生，造成20％-70％的产量损失。
列当种子需要在刺激物质的作用下才能萌发，第一个刺激物质独脚金醇是从杂草独脚金的非寄主植物棉花的根系分泌物中分离出来的。目前为止，研究发现共有3类植物次生代谢产物能够刺激列当种子萌发，包括脱水高粱内酯、倍半萜内酯和独脚金内酯。列当寄主植物可以分泌刺激物质诱导种子萌发，部分非寄生植物也能分泌类似刺激物质诱导种子萌发，但列当不能成功寄生，最终导致种子死亡，这类非寄主植物被称为诱捕作物。寄主植物分泌的次生代谢物质在土壤中不稳定，有必要在非寄主植物中找到类似发芽刺激物质，但由于不是所有植物都能刺激寄生杂草种子萌发,所以找到合适的植物材料是问题的关键所在。
椒蒿是一种野生植物，可食用，可作牲畜饲料，可入药。椒蒿具有杀虫抑菌作用，但其化感活性，目前还未见报道。本实验室主要探索该植物对列当的种子萌发刺激作用，为列当土壤种子库的消减提供诱捕作物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用，所述应用包括如下步骤：
(1)椒蒿提取物的提取：椒蒿晒干剪碎后，依次用乙醇和水浸泡，旋转蒸发器浓缩后得到乙醇浸提物，再用溶剂提取乙醇浸提物，旋转蒸发器浓缩得到椒蒿提取物，2-6℃下保存备用；
(2)列当种子的表面消毒：选取适量的列当种子装入离心管中，再加入适量2.1wt％的次氯酸钠，振动摇匀，静置至沉淀；去除混合液，在离心管中继续加入蒸馏水冲洗2-4次；再加入酒精，振动摇匀，静置至沉淀；去除上层液体，剩余列当种子继续用蒸馏水冲洗2-4次后，倒在吸水纸上，晾干备用；
(3)预培养：在培养皿内铺上双层定性滤纸，加蒸馏水浸湿，在定性滤纸上放入多片玻璃纤维滤纸，将消毒过的列当种子均匀地撒在玻璃纤维滤纸片上，盖上培养皿，封口膜密封培养皿，置于25℃的恒温培养箱中暗培养4天；
(4)列当种子发芽实验：称取71.4mg椒蒿提取物于离心管中，加入甲醇溶液稀释，打孔器将玻璃纤维滤纸打成直径为8mm的滤纸片，稀释后的椒蒿提取物将滤纸片浸湿，放置干燥，最后在培养皿中铺上双层定性滤纸，加入蒸馏水浸湿至不滴漏以保持培养皿内湿润。将干燥后的玻璃纤维滤纸片放在定性滤纸上，在显微镜下挑选饱满、大小一致的步骤(3)预培养后的列当种子，每个滤纸片上放25-30粒种子，盖上培养皿，用Parafilm封口膜密封，置于25℃的恒温培养箱中黑暗培养8天，观察列当种子的发芽情况。
步骤(1)中，椒蒿晒干剪碎后，依次用体积分数为95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和水各浸泡48小时。
步骤(1)中，所述溶剂为正己烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种。
步骤(1)中，得到的椒蒿提取物，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中备用。
步骤(2)中，列当种子的表面消毒，具体步骤为：选取适量的列当种子装入5mL的离心管中，用移液枪向离心管中加入适量2.1wt％的次氯酸钠，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；用移液枪吸出混合液，在离心管中继续加入蒸馏水冲洗3次；再加入75％的酒精，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；移液枪吸去上层液体，剩余列当种子继续用蒸馏水冲洗3次后，倒在吸水纸上，晾干备用。
步骤(4)中，将椒蒿提取物分别稀释成浓度为7.14×104g/mL、3.57×103g/mL、178.5g/mL、8.93g/mL、0.45g/mL和0.022g/mL于六个离心管中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
椒蒿提取物能高效刺激列当种子提前萌发，因种子未能及时找到寄主并进行吸附生活，从而造成列当“自杀萌发”，因此可有效用于列当寄生杂草的生物防治工作，且此方法即不污染环境，同时杂草也不会产生抗药性等特点，应用前景十分广阔，具有显著的社会效益和经济效益。
氯仿中椒蒿提取物在浓度为0.022g/mL时，列当种子发芽率可高达99.2％，甚至高于与参比对照独角金内酯GR24的发芽率(89.20％)，该植物可作为捕获作物，诱导列当种子自杀式发芽。表明椒蒿植物是一种有潜力的诱捕作物。
具体实施方式
实施例1
一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用，应用包括如下步骤：
(1)椒蒿提取物的提取：椒蒿晒干剪碎后，依次用体积分数为95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和水各浸泡48小时，旋转蒸发器浓缩后得到乙醇浸提物，再用正己烷提取乙醇浸提物，旋转蒸发器浓缩得到相应的正己烷提取物，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中备用；
(2)列当种子的表面消毒：选取适量的列当种子装入5mL的离心管中，用移液枪向离心管中加入适量2.1wt％的次氯酸钠，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；用移液枪吸出混合液，在离心管中继续加入蒸馏水冲洗3次；再加入75％的酒精，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；移液枪吸去上层液体，剩余列当种子继续用蒸馏水冲洗3次后，倒在吸水纸上，晾干备用；
(3)预培养：在一次性培养皿内铺上双层直径为90mm的定性滤纸，一次性培养皿的直径为90mm，高为20mm，加入适量的蒸馏水浸湿，在滤纸上放入多片适当大小的玻璃纤维滤纸，将消毒过的列当种子均匀地撒在玻璃纤维滤纸片上，盖上培养皿，封口膜密封培养皿，置于25℃的恒温培养箱中暗培养4天；
(4)列当种子发芽实验：用电子天平称取椒蒿提取物于1.5mL离心管中，加入甲醇溶液稀释14倍，此时浓度为7.14×104g/mL，另取5个离心管，依次将椒蒿提取物稀释成3.57×103、178.5、8.93、0.45、0.022g/mL。用打孔器将玻璃纤维滤纸打成直径为8mm的滤纸片，移液枪吸取6个浓度的椒蒿提取物各40μL将滤纸片浸湿，放置干燥，每个浓度10次重复。最后在90mm的培养皿中铺上双层定性滤纸，加入蒸馏水浸湿至不滴漏以保持培养皿内湿润。将干燥后的玻璃纤维滤纸片放在定性滤纸上，在显微镜下挑选饱满、大小一致的步骤(3)预培养后的列当种子，每个滤纸片上放25-30粒种子，盖上培养皿，用Parafilm封口膜密封，置于25℃的恒温培养箱中黑暗培养。8天后，在显微镜下观察列当种子的发芽情况。
实施例2
一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用，应用包括如下步骤：
(1)椒蒿提取物的提取：椒蒿晒干剪碎后，依次用体积分数为95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和水各浸泡48小时，旋转蒸发器浓缩后得到乙醇浸提物，再用氯仿提取乙醇浸提物，旋转蒸发器浓缩得到氯仿提取物，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中备用；
(2)列当种子的表面消毒：选取适量的列当种子装入5mL的离心管中，用移液枪向离心管中加入适量2.1wt％的次氯酸钠，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；用移液枪吸出混合液，在离心管中继续加入蒸馏水冲洗3次；再加入75％的酒精，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；移液枪吸去上层液体，剩余列当种子继续用蒸馏水冲洗3次后，倒在吸水纸上，晾干备用；
(3)预培养：在一次性培养皿内铺上双层直径为90mm的定性滤纸，一次性培养皿的直径为90mm，高为20mm，加入适量的蒸馏水浸湿，在滤纸上放入多片适当大小的玻璃纤维滤纸，将消毒过的列当种子均匀地撒在玻璃纤维滤纸片上，盖上培养皿，封口膜密封培养皿，置于25℃的恒温培养箱中暗培养4天；
(4)列当种子发芽实验：用电子天平称取71.4mg椒蒿提取物于1.5mL离心管中，加入甲醇溶液稀释14倍，此时浓度为7.14×104g/mL，另取5个离心管，依次将椒蒿提取物稀释成3.57×103、178.5、8.93、0.45、0.022g/mL。用打孔器将玻璃纤维滤纸打成直径为8mm的滤纸片，移液枪吸取6个浓度的椒蒿提取物各40μL将滤纸片浸湿，放置干燥，每个浓度10次重复。最后在90mm的培养皿中铺上双层定性滤纸，加入蒸馏水浸湿至不滴漏以保持培养皿内湿润。将干燥后的玻璃纤维滤纸片放在定性滤纸上，在显微镜下挑选饱满、大小一致的步骤(3)预培养后的列当种子，每个滤纸片上放25-30粒种子，盖上培养皿，用Parafilm封口膜密封，置于25℃的恒温培养箱中黑暗培养。8天后，在显微镜下观察列当种子的发芽情况。
实施例3
一种椒蒿提取物在刺激列当种子发芽中的应用，应用包括如下步骤：
(1)椒蒿提取物的提取：椒蒿晒干剪碎后，依次用体积分数为95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和水各浸泡48小时，旋转蒸发器浓缩后得到乙醇浸提物，再用乙酸乙酯提取乙醇浸提物，旋转蒸发器浓缩得到乙酸乙酯提取物，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中备用；
(2)列当种子的表面消毒：选取适量的列当种子装入5mL的离心管中，用移液枪向离心管中加入适量2.1wt％的次氯酸钠，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；用移液枪吸出混合液，在离心管中继续加入蒸馏水冲洗3次；再加入75％的酒精，振动摇匀4min，静置1min至沉淀；移液枪吸去上层液体，剩余列当种子继续用蒸馏水冲洗3次后，倒在吸水纸上，晾干备用；
(3)预培养：在一次性培养皿内铺上双层直径为90mm的定性滤纸，一次性培养皿的直径为90mm，高为20mm，加入适量的蒸馏水浸湿，在滤纸上放入多片适当大小的玻璃纤维滤纸，将消毒过的列当种子均匀地撒在玻璃纤维滤纸片上，盖上培养皿，封口膜密封培养皿，置于25℃的恒温培养箱中暗培养4天；
(4)列当种子发芽实验：用电子天平称取71.4mg椒蒿提取物于1.5mL离心管中，加入甲醇溶液稀释14倍，此时浓度为7.14×104g/mL，另取5个离心管，依次将椒蒿提取物稀释成3.57×103、178.5、8.93、0.45、0.022g/mL。用打孔器将玻璃纤维滤纸打成直径为8mm的滤纸片，移液枪吸取6个浓度的椒蒿提取物各40μL将滤纸片浸湿，放置干燥，每个浓度10次重复。最后在90mm的培养皿中铺上双层定性滤纸，加入蒸馏水浸湿至不滴漏以保持培养皿内湿润。将干燥后的玻璃纤维滤纸片放在定性滤纸上，在显微镜下挑选饱满、大小一致的步骤(3)预培养后的列当种子，每个滤纸片上放25-30粒种子，盖上培养皿，用Parafilm封口膜密封，置于25℃的恒温培养箱中黑暗培养。8天后，在显微镜下观察列当种子的发芽情况。
实验结果
种子萌发以发芽管突破种皮为标准，记录每片玻璃纤维滤纸上的总种子数和发芽数，计算种子发芽率。甲醇溶液作为空白对照，适当浓度的独角金内酯(GR24)为参比对照。
对比了实施例1-3制备的正己烷提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物对刺激列当种子发芽率的影响，同时研究了窃衣、一枝蒿、香青兰和驱虫斑鸠菊提取物对刺激列当种子发芽率的影响，方法与椒蒿相同，实验结果如表1-3所示。
表1正己烷提取物刺激列当种子发芽率(％)
注：不同英文小写字母表示在0.05水平上有显著差异
表2氯仿提取物刺激列当种子发芽率(％)
注：不同英文小写字母表示在0.05水平上有显著差异
表3乙酸乙酯提取物刺激列当种子发芽率(％)
注：不同英文小写字母表示在0.05水平上有显著差异
研究发现：氯仿提取物刺激种子发芽的活性最高，次之为正己烷提取物，活性最弱的是乙酸乙酯提取物。5种植物的氯仿提取物刺激列当种子发芽活性依次为：椒蒿＞窃衣＞香青兰＞驱虫斑鸠菊＞一枝蒿。供试植物中活性最高的是椒蒿，其氯仿提取物在浓度为0.022g/mL时，列当种子发芽率可高达99.2％，表明椒蒿植物是一种有潜力的诱捕作物。
从表1-3可以看出，椒蒿正己烷提取物在浓度为8.93g/mL时，列当种子发芽率为14.10％；椒蒿氯仿提取在浓度为0.022g/mL时，列当种子发芽率最高，可达99.20％；椒蒿乙酸乙酯提取物在浓度为0.022g/mL时，列当种子发芽率为10.27％；其中椒蒿氯仿提取物在的发芽率最高，高达99.2％，甚至高于与参比对照独角金内酯GR24的发芽率(89.20％)，该植物可作为捕获作物，诱导列当种子自杀式发芽。
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