激活细胞gxp4酶的铁死亡抑制剂药物及其应用
阅读说明：本技术 激活细胞gxp4酶的铁死亡抑制剂药物及其应用 (Iron death inhibitor medicine for activating GXP4 enzyme of cells and application thereof ) 是由 黄楚鹰 王莉 于 2021-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂药物及其应用,硒蛹虫草作为一种药物制剂能够提高GPX4酶的活性3倍,抑制铁死亡诱导剂Erastin和RSL3诱导的铁死亡。在0.75mg/kg剂量下(按照人体400μg/天进行换算)具有抑制阿霉素诱导的心脏细胞铁死亡,有效率为90％,远远高于临床药物右丙亚胺(50％)。硒蛹虫草通过提高谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)的活性抑制铁死亡,是治疗铁死亡相关疾病的一种新的方法。(The invention provides an iron death inhibitor medicine for activating GXP4 enzyme of cells and application thereof, and selenium cordyceps militaris as a medicinal preparation can improve the activity of GPX4 enzyme by 3 times and inhibit iron death induced by iron death inducers Erastin and RSL 3. Under the dosage of 0.75mg/kg (converted according to 400 mug/day of human body), the adriamycin-induced cardiac cell iron death is inhibited, and the effective rate is 90 percent and is far higher than that of clinical medicine dexrazoxane (50 percent). Selenium cordyceps militaris inhibits iron death by improving activity of glutathione peroxidase (GPX4), and is a new method for treating diseases related to iron death.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体是关于一种激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂药 物及其应用，具体的说，本发明提供了硒蛹虫草在制备调节细胞谷胱甘肽过氧化 物酶(GPX4)活性药物中的应用。本发明还提供了硒虫草在抑制细胞铁死亡中 的应用。
背景技术
(1)铁死亡是一种由铁催化，多不饱和脂肪酸过氧化介导的程序性死亡。 细胞内亚铁离子的蓄积，脂质过氧化及细胞膜过氧化损伤的保护机制失活是触发 铁死亡的三个关键因素。细胞中铁池主要以亚铁离子存在，可以通过芬顿反应催 化脂质过氧化反应。脂质的过氧化分为自发的过氧化及酶催化的过氧化。羟基是 细胞中活性氧的主要形式，主要由铁催化芬顿反应产生。羟基氧化多不饱和脂肪 酸后形成脂质原子团(L-)，在氧的催化下形成脂质过氧化原子团(LOO-)。脂 质过氧化原子团可以氧化临近的多不饱和脂肪酸形成氢过氧化物(LOOH)及新的 脂质过氧化原子团，从而触发新的脂质原子团的链式反应。细胞膜过氧化损伤的 保护机制包括谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、谷胱甘肽(GSH)、FSP1/CoQ10。 经典的铁死亡通过细胞膜过氧化损伤的保护机制失活诱发。RSL3,ML210可以通 过直接抑制GPX4的活性诱发铁死亡。
(2)临床上由于细菌感染引起心肌细胞铁死亡，对患者心脏功能造成不可 逆的损伤，而且缺乏特效药预防并发症的发生。同样，部分化疗药物(例如氟尿 嘧啶、阿霉素、顺铂、多西他赛)具有心脏毒性，顺铂、阿霉素被证实可以诱导 心肌细胞铁死亡。阿霉素的心脏毒性严重限制了该药品在临床中的使用。右丙亚 胺是国家药品监督管理局唯一批准的可减少阿霉素引起的心脏毒性的发生率和 严重程度的药物。但是右丙亚胺可加重化疗药物引起的骨髓抑制，和化疗联合使 用影响抗肿瘤效果，长期使用可以发生继发性恶性肿瘤。本发明能够降低化疗药 物诱导的心肌细胞铁死亡，减轻化疗的毒副作用,增加化疗药物的抗肿瘤活性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)激活剂 及其制备方法。
一种激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂药物，包含硒蛹虫草水提物作为有效 成分。
硒蛹虫草水提取物中按总硒计算的给药剂量为10-800μg/天；优选地，硒蛹 虫草水提取物中总硒的给药剂量为400μg/天。
硒蛹虫草水提物在制备激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂药物中的应用。
硒蛹虫草水提物是按照以下方法制备的：取富硒蛹虫草90g加1000mL去 离子水，使用磁力搅拌器在25℃条件下搅拌20-30分钟，离心取上清，用0.22 μm滤膜过滤除菌，得到水提物母液，水提物中硒含量的质量分数为0.001％。
硒提高GPX4酶的活性，硒蛹虫草具有抗肿瘤活性，硒蛹虫草与阿霉素联合 使用增加阿霉素抗肿瘤的活性，硒蛹虫草具有减毒增效的作用。
硒蛹虫草水提物制备为口服液、颗粒剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、注射液或 其它合适剂型的药剂。
功能性食品原料，将具有激活细胞GXP4酶和铁死亡抑制作用的硒蛹虫草水 提物作为功能性成分配合在食品原料中。
功能性食品，其特征是：作为功能性成分含有具有激活细胞GXP4酶和铁死 亡抑制作用的硒蛹虫草水提物。其中上述食品是营养辅助食品、营养剂、治疗用 食品、营养辅助食品或健康食品。
本发明使用质谱方法鉴定到硒蛹虫草中有机硒由硒甲基硒代半胱氨酸 (69％)、硒代蛋氨酸(31％)组成。本发明的目的还在于提供上述有机硒复方 制剂在制备治疗和预防各种铁死亡相关疾病中的应用。本发明中硒蛹虫草可以抑 制阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡，从而起到保护心脏的作用。硒蛹虫草成本低， 具有抗肿瘤活性，抑制细胞铁死亡疗效显著。
本发明通过细胞实验发现该制剂可以提高GPX4活性3倍左右。在人肺癌细 胞A549及H1975细胞铁死亡模型中，我们发现该制剂可以抑制铁死亡诱导剂 Erastin及RSL3诱导的铁死亡发生。在小鼠心脏铁死亡模型中，我们发现该制剂 可以抑制阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡，且疗效显著优于临床药物右丙亚胺。
顺铂、阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡严重限制了该药品在临床中的使用，给 肿瘤患者造成不可逆的心脏损伤。因此，迫切需要筛选出能够抑制铁死亡的药物。 本发明的一个目的在于提供一种激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂的药物。
本案发明人在研究中发现，补硒可以显著提高谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4) 的活性，进而抑制由Erastin及RSL3诱导的细胞铁死亡。
本案发明人在研究中发现，富硒蛹虫草与亚硒酸钠、硒代半胱氨酸比较，具 有低毒，高效的抑制由阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡，减轻其心脏毒性。低剂量 硒蛹虫草持续给药(化疗前1周灌胃1次0.75mg/kg，化疗开始后每周1次 0.75mg/kg，持续灌胃2周)抑制心肌细胞铁死亡效果最佳。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，富硒蛹虫草水提物制备方法为：取 富硒蛹虫(总硒含量110mg/kg)90g加1000mL去离子水，使用磁力搅拌器在 25℃条件下搅拌20-30分钟，离心取上清，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到水提 物母液，分装冻存-80℃冰箱保存。这种水提物中硒含量为0.001％(质量分数)。
根据本发明的具体实施方案，本发明发现富硒蛹虫草中硒甲基硒代半胱氨酸 占69％、硒代蛋氨酸占31％。
根据本发明的具体实施方案，本发明发现硒蛹虫草具有有抗肿瘤活性， 0.5mg/ml对乳腺癌4T1细胞的抑制率达到60％。因此硒蛹虫草的既可以抑制阿 霉素诱导的心肌细胞铁死亡，又增加阿霉素的抗肿瘤活性，避免了右丙亚胺作为 铁螯合剂造成的铁缺乏引起诸多不良反应，从而起到减毒增效的功能。
本申请还涉及一种激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂的药物的缓释装置，包 括在较高浓度的富硒蛹虫草水提物溶液中浸泡过的二氧化硅纳米颗粒，每个二氧 化硅纳米颗粒具有数百个空通道，经过分离、干燥，二氧化硅纳米颗粒的空通道 内孔直径稍大于硒甲基硒代半胱氨酸分子、硒代蛋氨酸分子、阿霉素分子的尺寸， 硒甲基硒代半胱氨酸分子、硒代蛋氨酸分子、阿霉素分子吸附在二氧化硅纳米颗 粒的空通道内，多个空通道之间没有互连，二氧化硅纳米颗粒的外层包裹有温敏 材料或酸性分解材料，使富硒蛹虫草水提物能够在到达目标细胞或组织的酸性环 境之后浸出，或通过外部装置加热目标部位，使得温敏材料在目标细胞或组织中 分解，继而缓慢释放富硒蛹虫草水提物，二氧化硅纳米颗粒浓度低于每104个细 胞9μg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明发现硒蛹虫草低剂量组(按照人体补硒 标准400μg/天进行换算)未出现硒中毒现象。
本发明的有益效果为：
(1)本发明发现了硒蛹虫草可以通过提高胱甘肽过氧化物酶的活性消除细 胞膜脂质的过氧化，抑制铁死亡，为化疗药物诱发的心脏细胞铁死亡的治疗提供 了新的解决方案。
(2)硒蛹虫草的减毒增效功能克服了右丙亚胺的副作用及临床使用限制。
(3)硒蛹虫草价格便宜，有利于降低医疗成本，节约医保资金。
(4)硒蛹虫草在湖北恩施地区广泛种植，若能成功开发，对于促进当地经 济发展具有重大意义。
附图说明
下面将结合附图对本发明的实施具体说明：
图1.补硒提高细胞GPX4的活性示意图；
图2.补硒可以抑制细胞铁死亡的示意图；
图3.硒蛹虫草具有抗肿瘤活性示意图；
图4.硒蛹虫草能够增加阿霉素抗肿瘤活性示意图；
图5.高浓度亚硒酸钠(1.73mg/kg)不能减轻小鼠阿霉素心脏性，高浓度硒 蛹虫草(1.73mg/kg)在生存曲线方面对小鼠阿霉素心脏毒性无保护示意图；
图6.低浓度硒蛹虫草在生存曲线方面对小鼠阿霉素心脏毒性保护的示意图；
图7.硒代半胱氨酸在生存曲线方面对小鼠阿霉素心脏毒性无保护示意图；
图8.硒蛹虫草在生存曲线方面对小鼠阿霉素心脏毒性保护作用优于fer-1和 右丙亚胺示意图；
图9.激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂的药物的缓释装置示意图。
具体实施方式
以下所描述的实施例，并非仅仅是针对某一个具体实施例的描述，而是对于 具有某类技术特征的潜在的实施例的选择性描述，某些技术特征并非是必须存在 的。具体到某一具体实施例，其是下面某些技术特征的组合，只要这种组合不是 逻辑上的相互矛盾，或者无意义。本发明任意位置出现的“可以/可以是”(may， may be，表示选择，暗示可能还存在其它的替代方式；如果语境中表达“能力”的 则除外)，是一种优选的实施例的描述方式，其可以是潜在的其它的替代方式。 本发明任意位置出现的技术术语“大致”、“近似”“接近”等近似描述词语(如果存在) 描述时，其所要表达的含义是并非要求在严格的实际参数测量后，得出的数据严 格符合一般的数学定义，因为不存在完全符合数学定义的物理实体，并非含糊其 辞、模棱两可从而导致不清楚。
研究方法
富硒蛹虫草水提物制备方法为：取富硒蛹虫(总硒含量110mg/kg)90g加 1000mL去离子水，使用磁力搅拌器在25℃条件下搅拌30分钟，离心取上清， 用0.22μm滤膜过滤除菌，得到水提物母液，分装冻存-80℃冰箱保存。这种水 提物中硒含量为0.001％(质量分数)。
实验材料：
硒蛹虫草由实验室提取，阿霉素、右丙亚胺、亚硒酸钠、erastin、RSL3、ferrostatin-1、NDGA、DFO、DPD、ZVAD、Necrostatin-1购于Selleck公司，硒 代半胱氨酸购买盖诺化工。人肺癌细胞系A549购于美国模式菌种收集中心 (ATCC)。Cell Quanti-Blue购于美国Bioassay公司。C57BL/6小鼠购置于三峡大 学动物中心。
细胞实验：
细胞培养
人肺癌A549、H1975，小鼠4T1细胞系使用含10％胎牛血清的1640培养 基，37℃、5％CO2条件下培养。
细胞活性测定(Cell Quanti-BlueTM Cell Viability Assay Kits)
96孔板每孔接种5000个细胞，细胞贴壁后加入不同浓度药物处理24小 时，吸出培养基，每孔加入10ul Cell Quanti-Blue溶液+90ul培养基，37℃孵育 2.5小时，酶标仪ex/em＝540/600测荧光值。
GPX4活性检测：
1.细胞样品的准备：用细胞刮收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤一遍。 按照每100万细胞加入100-200微升裂解液的比例进行裂解。随后4℃，12000g 离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。
2.62.5mM NADPH溶液的配制。11.5mg NADPH中加入220微升Milli-Q 级纯水，溶解并混匀，即为62.5mM NADPH溶液。
3.75mM GSH溶液的配制。10mg GSH中加入433微升Milli-Q级纯水， 溶解并混匀，即为75mM GSH溶液。
4.用96孔板，依次加入检测缓冲液、待测样品和GPx检测工作液，混匀， 加入40微升GPX4检测工作液后，室温孵育15分钟，以消耗掉样品中的GSSG， 排除对后继检测的干扰。
5.每孔加入10微升30mM过氧化物试剂溶液，混匀。
6.立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A340，连续测定5 分钟或自动每隔1分钟测定一次A340。
7.样品中谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的计算。
动物实验：
1.动物饲养
C57BL/6小鼠饲养于SPF级别环境，标准饲料喂养2周后随机分组。
2.将12周龄的小鼠随机分为7组：①空白对照组②亚硒酸钠持续组③硒 蛹虫草高剂量持续组④硒蛹虫草低剂量组⑤硒蛹虫草低剂量持续组⑥硒代半 胱氨酸低浓度持续组⑦右丙亚胺组。
药物剂量：①空白对照组：生理盐水；②亚硒酸钠持续组：亚硒酸钠化 疗前1周灌胃1次1.73mg/kg，化疗开始后每周1次0.865mg/kg，持续灌胃2周； ③硒蛹虫草高剂量持续组：化疗前1周灌胃1次1.73mg/kg，化疗开始后每周1 次0.865mg/kg，持续灌胃2周；④硒虫草低剂量组：化疗前1周灌胃1次0.75mg/kg； ⑤硒蛹虫草低剂量持续组：化疗前1周灌胃1次0.75mg/kg，化疗开始后每周1 次0.75mg/kg，持续灌胃2周；⑥硒代半胱氨酸低浓度持续组：化疗前1周灌胃 1次0.75mg/kg，化疗开始后每周1次0.75mg/kg，持续灌胃2周；⑦右丙亚胺组： 50mg/kg，阿霉素注射前2h腹腔注射。每组小鼠均接受阿霉素治疗，阿霉素的使 用方法是：阿霉素溶于生理盐水，高浓度组15mg/kg，低浓度组：20mg/kg腹腔 注射。
3.所有小鼠每周测量体重1次。
统计方法
所有数据采用平均数±标准差，Prism 8.0软件用于制作生存曲线及统计 分析，p值＜0.05认为具有统计差异。
实验结果
1.补硒提高细胞GPX4的活性
使用0.1μM硒处理A549细胞72h，与对照组比较显著提高GPX4的 活性3倍，参见图2(说明：硒能够提高GPX4酶的活性)。
2.硒蛹虫草可以抑制细胞铁死亡
使用0.1μM硒处理A549细胞72h，DMSO作为对照组。96孔板每孔 加入5000个细胞过夜，加入经典铁死亡抑制剂10μM Erastin和2.5μM RSL3作 用24h。去除培养基，每孔加入100μL含10％Cell Quanti-Blue溶液孵育3.5小时， 酶标仪ex/em＝540/600测荧光值。结果显示：Erastin及RSL3诱导的细胞死亡 能够被铁死亡特异性抑制剂ferrostatin-1、DFO及DPD挽救，不能够被凋亡抑制 剂ZVAD和坏死抑制剂Necrostatin-1挽救，证明该死亡方式为铁死亡(参见图 1A,1B)。补硒显著抑制铁死亡诱导剂Erastin和RSL3诱导的铁死亡(参见图1C,1D)。
3.硒蛹虫草具有抗肿瘤活性，使用0.5mg/ml时对乳腺癌细胞的抑制率高 达60％(参见图3)。
4.硒蛹虫草与阿霉素(4uM)联合使用增加阿霉素抗肿瘤的活性，说明硒 蛹虫草具有减毒增效的作用(参见图4,注：图4b中，所有组阿霉素的剂量为 2μM)。
5.高浓度亚硒酸钠(1.73mg/kg)不能减轻小鼠阿霉素心脏毒性，高浓度 硒蛹虫草(1.73mg/kg)在生存曲线方面对小鼠阿霉素心脏毒性的预防效果不明 显(参见图5,注：亚硒酸钠组：亚硒酸钠化疗前1周灌胃1次1.73mg/kg，化疗 开始后每周1次0.865mg/kg，持续灌胃2周；硒虫草组：高剂量组，化疗前1 周灌胃1次1.73mg/kg，化疗开始后每周1次0.865mg/kg，持续灌胃2周，DOX: 阿霉素15mg/kg)。
6.硒蛹虫草治疗组的小鼠死亡率显著低于蛹虫草对照组，说明硒蛹虫草可 以通过激活GPX4抑制阿霉素诱导的心脏细胞铁死亡(参见图6,注：硒虫草： 持续给药，化疗前1周灌胃1次0.75mg/kg，化疗开始后每周1次0.75mg/kg， 持续灌胃2周DOX:阿霉素)。
7.硒代半胱氨酸标准品治疗组小鼠死亡率与生理盐水对照组比较无显著 差异。说明硒代半胱氨酸不具有保护心脏的功能(参见图7,注：DOX:阿霉素)。
8.硒蛹虫草组小鼠死亡率低于右丙亚胺，说明硒蛹虫草抑制阿霉素诱导的 心脏细胞铁死亡效果优于右丙亚胺(参见图8,注：DXZ：右丙亚胺，DOX:阿 霉素)。
9.综上所述，硒蛹虫草作为一种药物制剂能够提高GPX4酶的活性3倍， 抑制铁死亡诱导剂Erastin和RSL3诱导的铁死亡。在0.75mg/kg剂量下(按照 人体400μg/天进行换算)具有抑制阿霉素诱导的心脏细胞铁死亡，有效率为90％， 远远高于临床药物右丙亚胺(50％)。硒蛹虫草通过提高谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX4)的活性抑制铁死亡，是治疗铁死亡相关疾病的一种新的方法。
另一实施例，激活细胞GXP4酶的铁死亡抑制剂药物，包括在较高浓度的富 硒蛹虫草水提物溶液中浸泡过的二氧化硅纳米颗粒1(参见图9)，每个二氧化硅 纳米颗粒1具有数百个空通道2，经过分离、干燥，二氧化硅纳米颗粒1的空通 道2内孔直径稍大于硒甲基硒代半胱氨酸分子、硒代蛋氨酸分子、阿霉素分子的 尺寸，硒甲基硒代半胱氨酸分子、硒代蛋氨酸分子、阿霉素分子吸附在二氧化硅 纳米颗粒1的空通道2内，多个空通道2之间没有互连，二氧化硅纳米颗粒1 的外层包裹有温敏材料或酸性分解材料，使富硒蛹虫草水提物能够在到达目标细 胞或组织的酸性环境之后浸出，或通过外部装置加热目标部位，使得温敏材料在 目标细胞或组织中分解，继而缓慢释放富硒蛹虫草水提物，二氧化硅纳米颗粒浓 度低于每104个细胞9μg/mL。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具 体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结 构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对 上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体 特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结 合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的 不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
以上实施例均是对本发明的优选设计描述，根据专利法及其相关的规定，实 际保护范围以权利要求所确定的保护范围为准，而说明书的内容则可以用于解释 权利要求的具体/更进一步的含义。在不脱离本发明的设计要点/精神的基础上， 任何对本发明的润色或修饰，均应落入本发明的保护范围。
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