具体实施方式

缀合物

在一个方面中，本发明的实施方式涉及新缀合物，其可作为用于乙肝治疗药物跨生物膜(例如磷脂细胞膜)进入细胞质的肝靶向递送系统。

分子马达模块

本发明的缀合物包含新的、合理设计的″分子马达″，其被设计为在磷脂膜内，利用与膜偶极电位相关的内部膜电场从膜/水界面移动到膜核心。当连接至乙肝治疗药物时，所述缀合物递送系统发挥将药物拉向膜核心，并便于跨膜移动的作用。例如，该递送系统被设计用于递送治疗性大分子：蛋白质或寡核苷酸(单链或双链DNA或RNA)。例如，所述缀合物递送系统被设计用于递送反义寡核苷酸(ASO)、siRNA和治疗性蛋白质(如Cas9蛋白)。

根据本发明的缀合物的结构原理之一是″不对称极性″的原理(其关于根据它们的logP为疏水、不带电荷的分子分配入生物膜(参见图1A))。所述分子是极性的，它们局部电荷不均匀地分布：局部负电荷高度局部化和集中，而局部正电荷在分子内沿烃链分散。另外，局部正电荷也通过与膜脂质环境内相邻的烃链的London型相互作用(London色散力)掩蔽。因此，如图1A中图示说明，根据本发明的分子马达以带负电荷的分子的形式在膜环境内移动。由于膜内电场在膜/水界面处具有负极，在膜中心处具有正极，分子在相关电场中向膜中心移动，并且当其连接至乙肝治疗药物(如siRNA、ASO、治疗性蛋白质或其它药物)，它将所述药物拉至膜中心。

另外，当在根据本发明的实施方案的分子中包含任选存在的可裂解基团(如二硫键基团或寡核苷酸序列可通过Dicer酶裂解)时，所述可裂解基团可发挥在靶细胞的细胞质中捕获负载物(如siRNA或ASO或其它药物)，并且还辅助维持缀合物跨细胞膜的浓度梯度的作用。因此在本发明的上下文中，术语″可裂解基团″涉及在某些生理条件(如pH变化或氧化还原状态变化)下，能够进行自发性或酶介导的裂解的化学基团。可裂解基团的实例为酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、二硫键[-(S-S)-]、醚(-O-)或硫醚(-S-)。理论上讲，可裂解基团可辅助药物在跨膜通过后在其靶细胞中药物的捕获，或辅助维持跨生物膜的浓度梯度。

例如，在根据本发明的缀合物包含siRNA、ASO或治疗性蛋白质以及二硫键基团的情况中，一旦在细胞质内，普遍的周围还原性环境会发挥将所述二硫键还原为-SH基团，同时从递送缀合物释放负载物的作用。在无″分子马达″(递送基团)下，则负载物大分子会被捕获在细胞质中，其中例如，在siRNA的情况中，其会易于与RNA诱导沉默复合物(RISC)相互作用，以沉默特定基因的表达。

如下文所示例，本发明的实施方式包括含有一个或多个″分子马达″和所述乙肝治疗药物的缀合物。

根据本发明的缀合物通常包含根据不对称极性原理(如上文所解释)设计的疏水的(辛醇/水分配系数(logP＞1))、偶极的、不带电荷的化学基团。如所讨论的，当将分子(其为疏水的、中性的，但含有集中的局部负电荷和分散的局部正电荷)的独特结构放入膜的力场(通过其分子在磷脂膜中移动，从膜/水界面至膜中心)中，其创建矢量系统。当连接至药物时，该分子会分别地将所述药物拉至膜中心。

如图1B中图示说明，根据本发明的缀合物通常包含″分子马达″，所述分子马达通常是下列结构元素的组合：

(i).负极(A)：通常包含至少1个选自卤素(如氟原子)和氧的负电性原子；其中在所述极包含数个负电性原子的情况下，它们以集中的、球形的(或接近球形)的排布方式排布。由于所述原子的吸电子特性和它们的空间排布，所述化合物的负极是富电子焦点。

(ii).正极(B)：包含选自碳、硅、硼、磷和硫的相对正电性原子；以当被放入磷脂膜中时能够与相邻的烃链的最大化相互作用的方式排布，优选通过以线性、支化或环状链的脂族或芳族结构或者其组合的形式排布。在本发明的一个实施方式中，所述正极包含线性饱和烃链，或者类固醇基团，例如胆固醇、胆汁酸、雌二醇、雌三醇或其组合。

除了″分子马达″外，根据本发明的缀合物可包含一个或多个进一步如下所述的连接基(L)和可裂解基团(Q)。分子马达化合物可通过连接基或可裂解基团与药物(D)缀合或与之连接。

根据本发明的缀合物可在改善治疗乙肝的siRNA、ASO或治疗性蛋白质通过细胞膜的递送中是有益的，从而改善siRNA或ASO在一个或多个方面(例如功效、毒性或药物代谢动力学)的性能。

如上所述，作为非限制性的可能的作用机制(MOA)，当根据本发明的实施方式的包含乙肝治疗药物(如siRNA或治疗性蛋白质)的缀合物位于磷脂膜内时，″分子马达″发挥将所述药物拉向膜中心的作用。理论上说，在磷脂首基的侧方运动并生成瞬间膜孔(通过其可发生药物的跨膜通过)下，接着发生膜的局部失稳。该可能的MOA在图2中图示总结。

在一个实施方式中，如图2中图示呈现，缀合物包含乙肝治疗药物(其为siRNA、ASO或治疗性蛋白质)，和用于将所述药物捕获在细胞质中的二硫键基团。在第一阶段(A)中，由于不对称极性的原理，通过内部膜电场供能，″马达″从膜表面移动到膜中心。

在第二阶段(B)中，连接至所述″马达″的大分子集中靠近膜表面，从而扰乱水合外层。由此，发生磷脂首基的侧方运动并形成瞬间膜孔，通过其大分子被递送入细胞。所述瞬间孔的随后闭合是热力学有利的(C)。

肝靶向配体模块

本发明的缀合物还包含新的、合理设计的基于GalNAc(N-乙酰半乳糖)的肝靶向配体模块。GalNAc缀合物将乙肝治疗药物靶向肝脏细胞。其与乙肝治疗药物的连接方式可参见图3。在图3中，示例性的乙肝治疗药物是RNA。

在一个优选实施方式中，所述肝靶向配体部分的接头模块选自可切割或不可切割的连接基团。在进一步优选的实施方式中，所述连接基团选择氧化还原可切割的连接基团、基于磷酸酯的可切割的连接基团、酸可切割连接基团、基于酯的可切割的连接基团、基于肽的可切割的连接基团。

在一个优选实施方式中，所述乙肝治疗药物选自siRNA、ASO和治疗性蛋白质，其经跨细胞膜递送以对肝细胞内的抗乙肝病毒靶点发挥有益的治疗作用。

在一个优选实施方式中，所述siRNA或ASO选自：ARC-520、ARC-521、ARB-1467、ARB-1740、RG6004、ARO-HBV、ALN-HBV、Hepbarna和Lunar-HBV。

在一个优选实施方式中，其中所述治疗性蛋白质选自CRISPR蛋白或抗体；更优选选自Cas9蛋白、EBT106和GC1102(单克隆抗体)。

综上所述，本发明提供了一种用于跨越生物膜递送乙肝治疗药物的如式(I)所述结构的肝靶向缀合物：

(G)y-D-(E)z 式(I)

或其药学上可接受的盐、溶剂合物和金属螯合物，其中：

D是待跨越生物膜递送的乙肝治疗药物，其选自用于治疗乙肝的小分子药物、肽、蛋白质和天然或改性的单链或双链DNA或RNA、siRNA或反义寡核苷酸(ASO)；y和z各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6的整数，条件是y或z中的至少一个不为0；G为具有一个或多个GalNAc(N-乙酰半乳糖)模块以及任选的接头模块的肝靶向配体部分；E为具有如通式(II)所示的结构：

(A)a-B-Q-L

(式II)

其中a为1、2、3或4的整数，并且其中A选自如式III、IV和V所示的结构

其中M选自-O-或-CH₂-；并且g和h独立地为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16的整数；并且其中

B为饱和或部分饱和的线性、支化或环状的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀、C₂₁、C₂₂、C₂₃、C₂₄、C₂₅、C₂₆、C₂₇、C₂₈、C₂₉、C₃₀、C₃₁、C₃₂、C₃₃、C₃₄、C₃₅、C₃₆、C₃₇、C₃₈、C₃₉、C₄₀、C₄₁、C₄₂烷基、亚烷基、亚杂烷基、芳基、杂芳基；甾体或其组合；

Q不存在或者选自酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、二硫键[-(S-S)-]、醚[-O-]、pH敏感基团和氧化还原敏感基团；

L不存在或者为任选被取代的线性、环状或支化的饱和、不饱和或部分饱和的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀、C₂₁、C₂₂、C₂₃、C₂₄、C₂₅、C₂₆、C₂₇、C₂₈、C₂₉、C₃₀、C₃₁、C₃₂、C₃₃、C₃₄、C₃₅、C₃₆、C₃₇、C₃₈、C₃₉、C₄₀、C₄₁、C₄₂烷基、亚烷基、亚杂烷基、芳基、杂芳基；甾体或-(O-CH₂-CH₂)_u-，其中u为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的整数；或其组合。

在一个优选实施方式中，所述肝靶向配体部分包含如下结构：

在一个优选实施方式中，所述肝靶向配体部分包含如下结构：

在一个优选实施方式中，所述肝靶向配体部分的接头模块选自可切割或不可切割的连接基团。在进一步优选的实施方式中，所述连接基团选择氧化还原可切割的连接基团、基于磷酸酯的可切割的连接基团、酸可切割连接基团、基于酯的可切割的连接基团、基于肽的可切割的连接基团。

在一个优选实施方式中，E可如式(VI)所示：

其中n和m为各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的整数；k为选自2、3、4、5、6、7的整数；并且z不存在或者为-S-S-；并且Q为与乙肝治疗药物的连接点。

在一个优选实施方式中，E可如式VII所示：

在一个优选实施方式中，E可如式VIIa所示：

在一个优选实施方式中，E可如式VIII所示：

其中n和m为各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的整数；Z不存在或者为-S-S-；并且Q为与乙肝治疗药物的连接点。

在一个优选实施方式中，E可如式IX所示：

在一个优选实施方式中，E可如式IXa所示：

在一个优选实施方式中，所述乙肝治疗药物选自siRNA、ASO和治疗性蛋白质。

在一个优选实施方式中，所述siRNA或ASO选自：ARC-520、ARC-521、ARB-1467、ARB-1740、RG6004、ARO-HBV、ALN-HBV、Hepbarna和Lunar-HBV。

在一个优选实施方式中，其中所述治疗性蛋白质选自CRISPR蛋白或抗体；更优选选自Cas9蛋白、EBT106和GC1102。

脂质体

在第二方面中，本发明提供了一种用于治疗乙肝的药物组合物，其包含至少一种脂质基载体、上述任一实施方式中所述的缀合物、以及任选的标记和/或肝靶向配体。

在第三方面中，本发明提供了用于制备本发明所述的用于治疗乙肝的药物组合物的方法，其包括如下步骤：(a)将脂质材料溶于有机溶剂中，混合均匀，减压除去有机溶剂，得到脂膜；(b)加入缓冲溶液和/或pH调节剂调节pH，振摇，搅拌，使脂膜完全水化，高速匀质乳化，微孔滤膜过滤，制得空白脂质体混悬液；(c)将本发明任一实施方式所述的缀合物分散于水中，再加入空白脂质体混悬液中以制得最终脂质体。

载体

在一些实施方式中，所述至少一种脂质基载体为脂质体。

在一个实施方式中，载体(如，脂质体)的直径小于500nm，以促进其通过胞外基质进入细胞。在一个实施方式中，载体(如，脂质体)的直径小于400nm，以促进其通过胞外基质进入细胞。

在另一实施方式中，载体(如，脂质体)的直径为至少1nm、至少5nm、至少10nm、至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少1500nm、至少200nm、至少250nm或至少300nm。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，用于静脉施用的载体的直径为5-250nm。在一些实施方式中，其中用于静脉施用的载体是脂质体，载体的直径为40-250nm。

在一个实施方式中，可以选择和/或制备载体以优化治疗药物至靶细胞的递送。例如，对于本发明所述的靶细胞是肝细胞的情形，可以优化转移载体的性质(如，大小、电荷和/或pH)以向靶细胞有效递送这样的载体。

脂质体并入的治疗药物/缀合物、标记和/或肝靶向配体可以完全地或部分地位于脂质体的内部空间，在脂质体的双层膜内，或缀合至脂质体脂质材料上。将试剂并入脂质体在本文中也称为“封装”，其中试剂被完全包含在脂质体的内部空间内。将试剂并入载体如脂质体的目的常常是为了保护试剂不受环境损害，环境可能包含降解试剂的酶或化学试剂和/或引起试剂的快速排泄的系统或受体。因此，在本发明的优选实施方式中，选择的转移载体能够增强缀合物以及任选地包含在其中的标记肝靶向配体的稳定性。脂质体可以使封装的试剂到达靶细胞和/或可以优先使封装的试剂到达靶细胞，或可选地限制试剂至其它不期望的靶部位或细胞的递送。

在另一实施方式中，所述至少一种载体是纳米脂质体。纳米脂质体能够通过提高生物活性试剂的溶解度和生物利用率、体内外稳定性，以及避免他们与其他分子的不希望的相互作用来增强他们的性能。纳米脂质体的另一优点是细胞特异性靶向，其是获得靶细胞中最优治疗效果同时最小化对健康细胞和组织的副作用所需的药物浓度的先决条件。

本发明的组合物中使用的脂质体载体可以通过目前在本领域内已知的各种技术来制备。例如，通过在合适的溶剂中溶解脂质然后蒸发溶剂以在器皿的内部上留下薄膜或通过喷雾干燥而在适合的容器或器皿的内壁上沉积选择的脂质。然后可以利用涡流运动将水相添加至器皿，其可以导致多层小泡(MLV)的形成。然后可以通过均化、超声或挤出多层小泡来形成单层小泡(ULV)。另外，可以通过洗涤剂去除技术来形成单层小泡。

在一个实施方式中，脂质体的制备包括如下步骤：(a)将脂质材料溶于有机溶剂中，混合均匀，减压除去有机溶剂，得到脂膜；(b)加入缓冲溶液和/或pH调节剂调节pH，振摇，搅拌，使脂膜完全水化，高速匀质乳化，微孔滤膜过滤，制得空白脂质体混悬液；(c)将活性药物分散于水中，再加入空白脂质体混悬液中以制得最终脂质体。

在一些实施方式中，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙醇、甲醇、叔丁醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、乙醚、乙腈、苯甲醇、正己烷中的一种或多种；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种；所述pH调节剂选自氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、枸橼酸钠、盐酸、枸橼酸、磷酸中的一种或多种。

在某些实施方式中，本发明的组合物可以装载有诊断放射性核素、荧光材料或体外和体内应用二者中可检测的其他材料。

在一些实施方式中，本发明的载体包括40-70％mol的形成脂质体的脂质。在一些实施方式中，本发明的载体包括0-50％mol的胆固醇。在一些实施方式中，本发明的载体包括0-8％mol的PEG-脂质。在一些实施方式中，本发明的载体还任选包括包括0-3％mol的功能脂质(如，阳离子脂质或具有靶向部分的脂质)。根据具体实施方式，包括40-70％mol的形成脂质体的脂质、0-50％mol的胆固醇、0-8％mol的PEG-脂质和0-3％mol的功能脂质的纳米颗粒适合用于静脉施用。

在一些实施方式中，脂质是天然存在的磷脂。磷脂的实例包括但不限于甘油磷脂、磷脂酰甘油(PG)，其包括二肉豆蔻磷脂磷脂酰甘油酯；磷脂酰胆碱(PC)，其包括蛋黄磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1-十六酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；磷脂酸(PA)；磷脂酰肌醇(PI)；磷脂酰丝氨酸(PS)。

已知胆固醇对脂质的组织结构特性(脂质组装)具有作用，并且可用于稳定化，用于影响表面电荷、膜流动性和/或帮助将活性药物装载入脂质结构。因此，在一些实施方式中，采用胆固醇以便于控制脂质结构的流动性。胆固醇：脂质的比率(形成脂质的结构)越大，脂质结构的刚性越大。

阳离子脂质的实例可以包括，例如，1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵丙烷(DMTAP)、1，2-二油酰氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)、N-[1-(2，3，-双四癸氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-[1-(2，3，-二油酰氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基-溴化铵(DORIE)、N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(DC-胆固醇)、二甲基-双十八烷基铵(DDAB)、N-[2-[[2，5-双[3-氨丙基)氨基]-1-氧代戊基]氨基]乙基]-N，N-二甲基-2，3-双[(1-氧代-9-十八烯基)氧代]-1-丙铵(DOSPA)和神经酰胺氨基甲酰基精胺(CCS)，或用聚赖氨酸衍生以形成阳离子脂质聚合物的中性脂质二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

脂质体可以是下列的任一种：单层脂质体(SLV)、多层脂质体(MLV)、多泡囊泡(MVV)、小的单层囊泡(SUV)、大的单层囊泡(LUV)或者大的多泡囊泡(LMVV)。在一些实施方式中，脂质体是单层脂质体或多层脂质体。

乙肝治疗药物

在一个优选实施方式中，乙肝治疗药物选自siRNA、ASO和治疗性蛋白质。

在一个优选实施方式中，所述siRNA或ASO选自：ARC-520、ARC-521、ARB-1467、ARB-1740、RG6004、ARO-HBV、ALN-HBV、Hepbarna和Lunar-HBV。

在一个优选实施方式中，其中所述治疗性蛋白质选自CRISPR蛋白或抗体；更优选选自Cas9蛋白、EBT106和GC1102。

在一些其它实施方式中，所述乙肝治疗药物选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺中的一种或多种，例如选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺中的一种或选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺中的至少两种。

除了上述活性药物外，本文所述的药物组合物还可任选地包含一种或多种另外的用于治疗HBV的其他药物，其例如但不限于3-双加氧酶(IDO)抑制剂，靶向病毒mRNA的反义寡核苷酸，载脂蛋白A1调节剂，精氨酸酶抑制剂，B-和T-淋巴细胞减毒剂抑制剂，Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，CCR2趋化因子拮抗剂，CD137抑制剂，CD160抑制剂，CD305抑制剂，CD4激动剂和调节剂，靶向HBcAg的化合物，靶向乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的化合物，共价闭合环状DNA(cccDNA)抑制剂，亲环蛋白抑制剂，细胞因子，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(ipi4)抑制剂，DNA聚合酶抑制剂，核酸内切酶调节剂，表观遗传修饰剂，法尼醇X受体激动剂，基因修饰剂或编辑物，HBsAg抑制剂，HBsAg分泌或组装抑制剂，HBV抗体，HBV DNA聚合酶抑制剂，HBV复制抑制剂，HBV RNA酶抑制剂，HBV疫苗，HBV病毒进入抑制剂，HBx抑制剂，乙型肝炎大包膜蛋白调节剂，乙型肝炎大包膜蛋白刺激剂，乙型肝炎结构蛋白调节剂，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制剂，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌或组装抑制剂，乙型肝炎病毒E抗原抑制剂，乙型肝炎病毒复制抑制剂，肝炎病毒结构蛋白抑制剂，HIV-1逆转录酶抑制剂，透明质酸酶抑制剂，IAP抑制剂，IL-2激动剂，IL-7激动剂，免疫球蛋白激动剂，免疫球蛋白G调节剂，免疫调节剂，吲哚胺-2，核糖核苷酸还原酶抑制剂，干扰素激动剂，干扰素α1配体，干扰素α2配体，干扰素α5配体调节剂，干扰素α配体，干扰素α配体调节剂，干扰素α受体配体，干扰素β配体，干扰素配体，干扰素受体调节剂，白介素-2配体，ipi4抑制剂，赖氨酸脱甲酶抑制剂，组蛋白脱甲酶抑制剂，KDM5抑制剂，KDM1抑制剂，杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1抑制剂，淋巴细胞活化基因3抑制剂，淋巴毒素β受体激活剂，微RNA(miRNA)基因治疗剂，Axl调节剂，B7-H3调节剂，B7-H4调节剂，CD160调节剂，CD161调节剂，CD27调节剂，CD47调节剂，CD70调节剂，GITR调节剂，HEVEM调节剂，ICOS调节剂，Mer调节剂，NKG2A调节剂，NKG2D调节剂，OX40调节剂，SIRPα调节剂，TIGIT调节剂，Tim-4调节剂，Tyro调节剂，Na+-牛磺酸盐协同转运多肽(NTCP)抑制剂，天然杀伤细胞受体2B4抑制剂，NOD2基因刺激剂，核蛋白抑制剂，核蛋白调节剂，PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂，PEG-干扰素λ，肽基脯氨酰异构酶抑制剂，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂，重组清道夫受体A(SRA)蛋白，重组胸腺素α-1，维甲酸诱导基因1刺激物，逆转录酶抑制剂，核糖核酸酶抑制剂，RNA DNA聚合酶抑制剂，短干扰RNA(siRNA)，短合成发夹RNA(sshRNA))，SLC10A1基因抑制剂，SMAC模拟物，Src酪氨酸激酶抑制剂，干扰素基因刺激物(STING)激动剂，NOD1刺激物，T细胞表面糖蛋白CD28抑制剂，T细胞表面糖蛋白CD8调节剂，胸腺素激动剂，胸腺素α1配体，Tim-3抑制剂，TLR-3激动剂，TLR-7激动剂，TLR-9激动剂，TLR9基因刺激剂，toll样受体(TLR)调节剂，病毒核糖核苷酸还原酶抑制剂，锌指核酸酶或合成核酸酶(TALEN)及其组合。

如本文中所使用，“治疗有效量”或“有效量”是指在剂量下有效并且持续所需时间周期以实现期望的治疗结果的量。乙肝治疗剂的治疗有效量将取决于障碍或症状的性质并取决于特定的试剂，且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。

治疗结果可以是，如，减轻症状、延长存活、提高移动性等。治疗结果不需要是“治愈”。治疗结果也可以是预防性的。

标记

在另一实施方式中，本发明的一种或多种载体任选地包括至少一种标记或可检测的部分。

可用于本发明的组合物和方法的标记包括但不限于荧光团、发色团、化学发光分子、放射性标记物、金属、稀土元素、磁性颗粒或染料。

在一些实施方式中，标记或可检测的部分是在试验中有用的标记，其包括但不限于免疫测定，诸如ELISA，珠基、芯片基或平板基多重免疫测定、质谱法、电泳、免疫比浊法、酶促测定、比色或荧光测定，如通过光度计可评估的，和基于荧光相关细胞分选(FACS)的分析或通过其他临床建立的测定。所有这些方法对本领域技术人员是已知的，且在文献中描述。

通常，标记的量将取决于待执行的测定，并且可通过本领域技术人员的能力确定，并且很好地在本领域技术人员能力下。在一些实施方式中，载体包括所述标记的一个分子或多个分子。

肝靶向配体

在一些实施方式中，任选包含的肝靶向配体用于协助将药物组合物靶向至肝脏靶标，所述肝靶向配体包括具有肝靶向功效的蛋白质、抗体、肽类、小分子物质、适体和/或糖类等。

在一个实施方式中，肝靶向配体一般可连接于隐形脂质体上的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链的外端，同时PEG可减少MPS清除而使脂质体具有长循环性。肝脏细胞表面高度表达多种载体和细胞内吞作用的受体，肝靶向配体修饰的脂质体通过定位于肝脏内细胞膜上的特定位点，以受体-配体的相互作用等实现主动靶向作用。

在一个实施方式中，肝靶向配体的实例包括但限于包膜蛋白preS1肽、甘草次酸、去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptors，ASGPR)、适体、载脂蛋白A1、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、胆盐、NK4蛋白分子等。

如本文中所使用，当与值组合时，术语“大约”指参考值的正负10％。例如，大约1000纳米(nm)的长度指1000nm+-100nm的长度。

在查阅了下面的实施例之后，本发明的另外的目的、优势和新特征对本领域普通技术人员将变得显而易见。

实施例

实施例1合成根据本发明的实施方案的包含寡核苷酸的缀合物的一般方法

首先，基于基因在疾病病因学或发病机制中的作用选择要沉默的基因。然后，基于本领域已知的生物信息学方法学，确定ASO的DNA序列的各siRNA的核苷酸序列(对于RISC底物通常19-21个碱基对，并且对于Dicer底物25-29个)。

合成以3′到5′的方向进行。应用固相合成，使用亚磷酰胺结构单元，其得自保护的2′-脱氧核苷(dA、dC、dG和T)、核糖核苷(A、C、G和U)或者化学修饰的核苷，如LNA(锁定核酸)或BNA(桥连核算)。结构单元顺序(以由期望的siRNA或ASO的序列要求的顺序)偶联至增长的寡核苷酸链。

在构建寡核苷酸后，将根据本发明的化合物作为寡核苷酸的结构单元之一加入。可将所述化合物任选地以如上所述的其前体形式加入。对于在寡核苷酸的5′-末端添加所述化合物，其前体形式的化合物可包含亚磷酰胺基团。对于在寡核苷酸的3′-末端添加化合物，其前体形式的化合物可包含乙炔或叠氮基团。通常，所述过程是完全自动的。一旦完成链的组装，产物从固相释放至溶液，脱保护并收集。然后通过高效液相色谱法(HPLC)收集并分离期望的缀合物，以高纯度地获得期望的寡核苷酸。在siRNA的情况中，将各互补RNA链分开合成，然后进行两条链的退火，以得到期望的siRNA双链RNA。

实施例2脂质体合成/制备/表征

使用本领域内已知的方法制备脂质体。将HSPC、PEG-DSPE和胆固醇58％、2％、40％溶解在纯的乙醇中并在65℃下加热直到完全溶解。

合成空白脂质体：脂质体包含下列的脂质组合物：58％mol的氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、Mw 762.1；2mol％的聚乙二醇二硬脂酰-磷酸乙醇胺(m2000PEG DSPE)-其作用是降低脂质体由于空间效应的聚集/融合，Mw 2805.54；和40mol％的胆固醇Mw 386.65。溶液中总脂质的工作浓度为50mM。培养基为去离子水中10％PBS/5％葡萄糖。首先，将脂质溶解在纯乙醇中，升温至65℃并加入至1ml的培养基(也升温至相同的温度)。在直接注入和移液之后，加入更多培养基以达到最终的脂质浓度。氢化大豆磷脂酰胆碱由Lipoid贡献(Ludwigshafen，Germany)；m2000PEG-DSPE从Avanti(AIabaster，Alabama，USA)购买和胆固醇(分类号：C8667-500MG)来自Sigma(Rehovot，Israel)。

合成载缀合物脂质体：参考以上空白脂质体的合成方法，区别在于在乙醇溶解过程中一并引入缀合物的不同浓度系列稀释液，或将缀合物分散于水中，再加入上述空白脂质体混悬液中以制得最终脂质体。

挤出过程：通过400nm和200nm的膜挤出脂质溶液3次。挤出机温度被设置为65摄氏度(℃)。

脂质体包封率与载药量的测定：采用葡聚糖凝胶柱层析法，取脂质体混悬液0.5mL，上Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱，用HEPES缓冲液(pH6.8)洗脱收集，分离脂质体与游离药物，加甲醇对脂质体破乳，高效液相色谱法(HPLC)测定含量，计算脂质体包封率与载药量。

粒径分布：运用马尔文ZEN1690型激光粒度分析仪检测制备的脂质体粒径分布。将制备的脂质体冻干成品用1mL无菌注射水重悬后，用0.22μm的聚碳酸酯膜滤器过滤除去杂质，取100μL的脂质体溶液，用PBS(pH6.5，0.1mM)稀释到2mL，充分搅拌；取1.2mL上述样品加入样品容器中进行检测。

体外释放度的考察：取脂质体溶液3批，分别吸取1mL移入已处理好的透析袋中，将透析袋两端扎紧，置于200mL pH7.4的PBS中，恒温(37±1)℃、恒速(100r/min)搅拌，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72h取释放液1mL，同时补加同体积同温度的释放介质。样品用10μL冰醋酸酸化2h，将药液以0.22μm的微孔滤膜过滤，HPLC测定含量，计算平均累积释放百分率。

实施例3载缀合物脂质体在慢性乙型病毒性肝炎患者中的治疗作用

本实施例利用实施例2中制备的脂质体成品，对经筛选的慢性乙型病毒性肝炎患者进行治疗，探索其在慢性乙型病毒性肝炎中的治疗作用及效果。

(1)受试对象的选择：选择慢性乙型病毒性肝炎患者作为受试对象。

(2)给药方式：用上臂皮下注射方式给药，每次给予900μg脂质体成品；将脂质体成品溶解在3mL无菌水中分别在治疗的第0、4、8、12、20、28周皮下注射给药6次。

(3)疗效评价：慢性乙型病毒性肝炎患者经过本发明实施例2的脂质体治疗后，分别在第12、28、32、40、52、64、76周采集受试患者的外周血，分别检测HBeAg/抗HBe转换率、血清HBV病毒滴度及血清谷丙转氨酶(ALT)浓度，评价脂质体治疗效果。

虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。