一种中空二氧化锰纳米球的制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种中空二氧化锰纳米球的制备方法与应用 (Preparation method and application of hollow manganese dioxide nanospheres ) 是由 毕雪东 于 2020-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种中空的二氧化锰纳米球的制备方法和应用。本发明所述方法中,首先制备模板二氧化硅纳米球,再以二氧化硅纳米球为模板,水热法合成具有核壳结构的SiO-(2)@MnO-(2)纳米球,通过氢氧化钠刻蚀,得到中空二氧化锰纳米球,通过在该纳米球表面包覆肿瘤细胞的细胞膜,可实现肿瘤细胞的靶向治疗。该合成工艺简单、产品粒径均匀、分散度高、水溶性好、性质稳定。合成的中空二氧化锰纳米球可用于负载药物并能特定地在肿瘤细胞中释放,并通过类芬顿反应产生活性氧起到肿瘤治疗的作用,同时还能作为核磁共振成像的造影剂用于肿瘤成像。(The invention discloses a preparation method and application of hollow manganese dioxide nanospheres. In the method of the present invention, a template is first preparedSynthesizing SiO with core-shell structure by using silica nanospheres as templates and using a hydrothermal method 2 @MnO 2 The nanospheres are etched by sodium hydroxide to obtain hollow manganese dioxide nanospheres, and the surfaces of the nanospheres are coated with cell membranes of tumor cells, so that the targeted therapy of the tumor cells can be realized. The synthesis process is simple, and the product has uniform particle size, high dispersity, good water solubility and stable property. The synthesized hollow manganese dioxide nanospheres can be used for loading drugs and specifically releasing in tumor cells, generate active oxygen through Fenton-like reaction to play a role in tumor treatment, and can also be used as a contrast agent for magnetic resonance imaging to be used for tumor imaging.)
技术领域
本发明涉及医用纳米材料领域，具体而言，涉及一种中空二氧化锰纳米球的制备方法及其应用。
背景技术
癌症是严重威胁着人类健康的头号杀手，癌症的治疗目前依旧是采用传统的手术切除、放射疗法和化学疗法，这些方法的治疗效果并不是很理想，同时其副作用还给患者带来巨大的身心痛苦。因此，迫切需要开发能够微创、靶向、高效的治疗癌症的方法。
二氧化锰是一种重要的无机纳米材料，其在电化学催化领域以及纳米生物医学领域等方面展现了广阔的应用前景。在生物医学领域，二氧化锰因其成本低、生物毒性小等特性，近年来备受关注。研究表明，肿瘤组织中为缺氧环境，另外肿瘤细胞和组织中的pH值为酸性，此外，肿瘤细胞和组织在代谢过程中会产生过量的H2O2和GSH，肿瘤微环境的这些异常性质对癌症的发生发展起着重要的作用。二氧化锰纳米粒子在肿瘤细胞中可以被还原型谷胱甘肽GSH还原，产生大量的Mn2+，能够作为造影剂用于T1加权核磁共振成像。同时，二氧化锰纳米粒子分解产生的Mn2+在肿瘤细胞的酸性环境下，还能够与肿瘤细胞内源性的过量H2O2发生类芬顿反应，催化H2O2分解产生O2和活性氧如·OH等，产生的O2可有效缓解肿瘤缺氧，另外大量的ROS聚积和GSH耗竭还会造成肿瘤细胞的氧化应激损伤，最终造成肿瘤细胞凋亡。因此，二氧化锰纳米粒子既能作为治疗剂用于癌症的治疗，又能作为核磁成像的造影剂用于疾病诊断。进一步的，由于中空介孔的二氧化锰纳米粒子还兼具高效的药物负载能力，因而可以作为抗肿瘤药物载体，发挥其协同治疗的作用。
目前，已有研究报道基于二氧化锰的纳米材料用于肿瘤治疗，但合成步骤繁琐、成本高、且产物易出现团聚、形貌和尺寸不规则等，另外存在纳米材料靶向性差、不易被细胞分解等问题。基于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中空二氧化锰纳米球的制备方法及其应用，该制备方法简单，产物分散度高，水溶性好，能够靶向同源的肿瘤细胞，且在肿瘤细胞中容易被降解。
本发明提供了一种中空二氧化锰纳米球的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用stober法制备二氧化硅纳米球；
(2)以二氧化硅纳米球为模板，在二氧化硅分散液中加入高锰酸钾溶液，水热法合成具有核壳结构的SiO2@MnO2纳米球；
(3)用氢氧化钠刻蚀掉模板二氧化硅得到中空的二氧化锰纳米球；
(4)用癌细胞膜对二氧化锰纳米球进行包覆，得到具有同源靶向性的纳米球。
进一步的，本发明中所述制备方法步骤如下：
(1)制备二氧化硅纳米球：
①将乙醇、去离子水、氨水搅拌混合均匀；
②向步骤①所得混合溶液中缓慢滴加正硅酸乙酯，继续搅拌反应；
③将步骤②所得溶液离心后弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗后，即得模板二氧化硅纳米球。
优选的，所述步骤①中的氨水浓度为30％；
优选的，所述步骤②中反应温度为25℃，反应时间为12小时。
(2)制备具有核壳结构的SiO2@MnO2纳米球
①将二氧化硅纳米球复溶后与高锰酸钾溶液超声下混合；
②将步骤①得到的混合溶液转移到特氟龙内衬的高压釜中，置于高温烘箱中反应；
③将步骤②所得反应溶液离心后弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗后，即得到核壳结构的SiO2@MnO2纳米球。
优选的，所述步骤②中反应温度为160℃，反应时间为24小时。
(3)制备中空二氧化锰纳米球
①将核壳结构的SiO2@MnO2纳米球溶液离心后弃上清液，用NaOH溶液对棕色的沉淀物进行刻蚀。
②将步骤①的分散液离心后弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗后，即得中空得二氧化锰纳米球。
优选的，所述步骤①中的刻蚀温度为60℃，时间为12h。
(4)制备癌细胞膜包覆的中空二氧化锰纳米球
①将培养好的癌细胞进行消化，获得细胞沉淀。
②将步骤①的细胞沉淀进行超声破碎，对破碎好的细胞差速离心，获得细胞膜碎片。
③将步骤②所得细胞膜碎片与中空二氧化锰纳米球混合，反应后离心，即得癌细胞膜包覆的中空二氧化锰纳米球。
优选的，所述步骤②中差速离心模式为，先600g，离心10min，弃掉沉淀，保留上清液，再对上清液12000g，离心10min，弃掉沉淀取上清液。
优选的，所述步骤③中的反应方法为4℃缓慢搅拌12h。
本发明提供了一种中空二氧化锰纳米球复合材料，包括中空二氧化锰纳米球，及在所述中空二氧化锰纳米球表面包覆的癌细胞膜。
所述的中空二氧化锰纳米球的粒径为100-200nm，比表面积为272m2g-1，平均孔径为2.9nm。
本发明提供了一种中空二氧化锰纳米球在制备肿瘤治疗剂和造影剂中的应用：
所述中空二氧化锰纳米球为上述技术方案所述方法制备的中空二氧化锰纳米球。
进一步的，本发明提供了所述中空二氧化锰纳米球在药物负载中的应用。
优选的，中空二氧化锰纳米球可以作为药物载体负载抗癌药物阿霉素，载药量为63％。
进一步的，本发明提供了所述中空二氧化锰纳米球在化学动力学疗法治疗肿瘤中的应用。
进一步的，本发明提供了所述中空二氧化锰纳米球在磁共振成像造影剂的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的制备方法简便，可用于大量制备中空二氧化锰纳米球。
(2)本发明方法制备出的中空二氧化锰纳米球，粒径均匀、孔径适度、分散度高、水溶性好，表面的片层状结构有利于其在肿瘤细胞内的降解。
(3)本发明方法制备出的中空二氧化锰纳米球，表面包覆了肿瘤细胞的细胞膜，具备了同源靶向功能，可实现肿瘤细胞的靶向治疗。
(4)中空二氧化锰纳米球的内部中空结构有利于实现药物的高效负载。
(5)中空二氧化锰纳米球可以与肿瘤细胞内过量的H2O2发生类芬顿反应，催化H2O2分解产生O2和活性氧如·OH等，产生的O2可有效缓解肿瘤缺氧，另外大量的ROS聚积和GSH耗竭还会造成肿瘤细胞的氧化应激损伤，最终造成肿瘤细胞凋亡。
(6)中空二氧化锰纳米球在肿瘤细胞中可以被还原型谷胱甘肽GSH还原，产生大量的Mn2+，能够作为造影剂用于T1加权核磁共振成像。
附图说明
图1为本发明合成中空二氧化锰纳米球的流程图；
图2为实施例1中模板二氧化硅纳米球的透射电镜(TEM)图；
图3为实施例1中中空二氧化锰纳米球的透射电镜图；
图4为实施例1中制备得到的中空二氧化锰纳米球的透射电镜图；
图5为实施例3中癌细胞膜包覆的二氧化锰纳米球透射电镜图；
图6为实施例4中中空二氧化锰纳米球负载的药物阿霉素逐渐被释放到细胞中的荧光照片；
图7为实施例5中中空二氧化锰纳米球在Hela细胞中产生活性氧的显微照片。
具体实施方式
本发明提供了一种中空二氧化锰纳米球的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用stober法制备二氧化硅纳米球；
(2)以二氧化硅纳米球为模板，在二氧化硅分散液中加入高锰酸钾溶液，水热法合成具有核壳结构的SiO2@MnO2纳米球；
(3)用氢氧化钠刻蚀掉模板二氧化硅得到中空的二氧化锰纳米球；
(4)用癌细胞膜对二氧化锰纳米球进行包覆，得到具有同源靶向性的纳米球。
本发明提供的制备方法简单易操作，以二氧化硅纳米球为模板，一次实验可以获得大量形貌可控、粒径均匀、分散度高、水溶性好的空心结构的二氧化锰纳米球，经过简单的癌细胞膜包覆后，具有同源靶向性，能够高效地靶向肿瘤细胞。
进一步地，本发明的具体制备步骤如下：
(1)制备二氧化硅纳米球：
①将乙醇、去离子水、氨水搅拌混合均匀；
此步骤中，所选氨水的浓度为30％，优选无水乙醇、去离子水、30％氨水的体积比为7:1:0.5。
②向步骤①所得混合溶液中缓慢滴加正硅酸乙酯，继续搅拌反应；
此步骤中，优选正硅酸乙酯与步骤①中所加30％氨水的体积比为1:10。
同时，此步骤反应温度优选为25℃，反应时间为12小时，有利于二氧化硅缓慢成球，得到粒径均匀分散度好的模板二氧化硅。
③将步骤②所得溶液离心后弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗后，即得模板二氧化硅纳米球。
此步骤中，优选依次用无水乙醇和去离子水进行清洗3次。
(2)制备具有核壳结构的SiO2@MnO2纳米球
①将二氧化硅纳米球复溶后与高锰酸钾溶液超声下混合；
此步骤中，优选将二氧化硅分散液用500W，40KHz超声15min后，与高锰酸钾溶液混合，再继续超声15min。
②将步骤①得到的混合溶液转移到特氟龙内衬的高压釜中，置于高温烘箱中反应；
此步骤中，优选反应温度为140～180℃，更优选为160℃；反应时间优选为24～48小时，更优选为24小时。
③将步骤②所得反应溶液离心后弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗后，即得到核壳结构的SiO2@MnO2纳米球。
此步骤中，优选依次用无水乙醇和去离子水进行清洗3次。
(3)制备中空二氧化锰纳米球
①将核壳结构的SiO2@MnO2纳米球溶液离心后弃上清液，用NaOH溶液对棕色的沉淀物进行刻蚀。
此步骤中，优选NaOH溶液的质量分数为20％，刻蚀温度为60℃，刻蚀时间为12h。
②将步骤①的分散液离心后弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗后，即得中空二氧化锰纳米球。
此步骤中，优选依次用无水乙醇和去离子水进行清洗3次。
(4)制备癌细胞膜包覆的中空二氧化锰纳米球
①将培养好的癌细胞进行消化，获得细胞沉淀。
②将步骤①的细胞沉淀进行超声破碎，对破碎好的细胞差速离心，获得细胞膜碎片。
此步骤中，优选用Tris，MgCl2(pH＝7.4)的缓冲液洗涤细胞两次，再重悬于加了蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液中，利用均质器对细胞进行破碎。
优选每隔2min破碎一次，每次持续时间15s，共10次，全程在冰水浴中进行操作。
同时，此步骤中差速离心模式优选为，先600g离心10min，弃掉沉淀，保留上清液，再对上清液12000g离心10min，弃掉沉淀取上清液。
③将步骤②所得细胞膜碎片与中空二氧化锰纳米球混合，反应后离心，即得癌细胞膜包覆的中空二氧化锰纳米球。
此步骤中，优选的包覆方法为4℃下缓慢搅拌12h。
本发明提供的中空二氧化锰纳米球的粒径为100-200nm，优选为150nm，比表面积为272m2g-1，平均孔径为2.9nm。
本发明提供了一种中空二氧化锰纳米球在制备肿瘤治疗剂和造影剂中的应用：
所述中空二氧化锰纳米球为上述技术方案所述方法制备的中空二氧化锰复合纳米球。
进一步的，本发明提供了所述中空二氧化锰纳米球在药物负载中的应用。
优选的，中空二氧化锰纳米球可以作为药物载体负载抗癌药物阿霉素，载药量为63％。
进一步的，本发明提供了所述中空二氧化锰纳米球在化学动力学疗法治疗肿瘤中的应用。
本发明所提供的的中空二氧化锰纳米球可以与肿瘤细胞内过量的H2O2发生类芬顿反应，催化H2O2分解产生O2和活性氧如·OH等，产生的O2可有效缓解肿瘤缺氧，另外大量的ROS聚积和GSH耗竭还会造成肿瘤细胞的氧化应激损伤，最终造成肿瘤细胞凋亡。
进一步的，本发明提供了所述中空二氧化锰纳米球在磁共振成像造影剂的应用。
本发明所提供的中空二氧化锰纳米球在肿瘤细胞中可以被还原型谷胱甘肽GSH还原，产生大量的Mn2+，能够作为造影剂用于T1加权核磁共振成像。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的中空二氧化锰纳米球制备方法及其应用进行详细地描述，但不能理解为对本发明专利保护范围的限制。
实施例1：中空二氧化锰纳米球的制备
(1)二氧化硅纳米球的制备
①将140mL无水乙醇，20mL去离子水，10mL 30％氨水依次加入到250mL圆底烧瓶中，密封后磁力搅拌15min。
②向搅拌中的混合溶液内缓慢滴加1mL正硅酸乙酯，密封后继续搅拌反应，搅拌速度为450rpm，反应温度为20～25℃，反应时间为12h。
③将反应后所得溶液10000g离心后弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水清洗3次。最后将获得的沉淀置于60℃烘箱中干燥12h。
图2为本发实施例明中制备得到的二氧化硅纳米球的透射电镜图。
(2)制备具有核壳结构的SiO2@MnO2纳米球
①称取2g二氧化硅纳米球，用10mL去离子水500W，40KHz超声15min复溶，与40mL物质的量浓度为20mM的高锰酸钾溶液在超声下混合；
②将上述混合液转移到两个容量为50mL特氟龙内衬的高压釜中，置于高温烘箱中160℃反应24h；
③将反应后的溶液10000g离心后，弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗三次，即得到核壳结构的SiO2@MnO2纳米球。
图3为本实施例中制备得到的核壳结构的SiO2@MnO2纳米球的透射电镜图。
(3)制备中空二氧化锰纳米球
①将核壳结构的SiO2@MnO2纳米球溶液10000g离心10min后，弃上清液，用质量分数为20％的NaOH溶液对棕色的沉淀物进行重悬和刻蚀，刻蚀温度为60℃，刻蚀时间为12h。
②将刻蚀后的分散液10000g离心10min后，弃上清液，将所得沉淀物依次用无水乙醇和去离子水进行清洗三次后，即得中空二氧化锰纳米球。
图4为本实施例中制备得到的中空二氧化锰纳米球的透射电镜图。获得的中空二氧化锰纳米球的粒径为150nm左右，表面为片层状结构。BET实验测得中空二氧化锰纳米球的比表面积为272m2g-1，平均孔径为2.9nm。
实施例2：中空二氧化锰纳米球负载抗癌药物
实施例1中制备的纳米材料具备较大的比表面积和介孔结构，可以作为药物载体高效的负载药物。
为了研究中空二氧化锰纳米球的药物负载能力，设计以下实验：
①称取6mg中空二氧化锰纳米球溶于2mL去离子水中，随后加入2mg阿霉素，所的混合物在室温下避光低速旋转24h，使阿霉素能够被负载进纳米球的空腔中。
②将溶液10000g离心以获得装载有药物的纳米材料。
③通过在480nm波长下的UV-vis光谱检测获得中空二氧化锰纳米球吸附的阿霉素的量。
实施例3：制备癌细胞膜包覆的中空二氧化锰纳米球
为了使制备得到的纳米材料具备靶向性，设计在其表面包覆一层癌细胞膜，具体实施方式如下：
①将培养好的癌细胞Hela进行消化，1000g离心获得细胞沉淀。
②用Tris，MgCl2(pH＝7.4)的缓冲液洗涤细胞两次，再重悬于加了蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液中，利用均质器对细胞进行破碎。每隔2min破碎一次，每次持续时间15s，共10次，全程在冰水浴中进行操作。对破碎好的细胞差速离心获得细胞膜碎片，先600g离心10min，弃掉沉淀，保留上清液，再将上清液12000g离心10min，弃掉沉淀取上清液。
③将所得细胞膜碎片与负载了阿霉素的二氧化锰纳米球混合，在4℃下缓慢搅拌12h，反应后离心，即得癌细胞膜包覆的二氧化锰纳米球，其透射电镜图如图5所示。
实施例4：中空二氧化锰纳米球在肿瘤细胞内的药物释放
为了检测负载了阿霉素的中空二氧化锰纳米球在肿瘤细胞内的药物释放情况，进行了如下实验验证：
在培养盘中放入灭好菌的细胞爬片，在细胞爬片上培养Hela细胞，随后将负载了阿霉素的中空二氧化锰纳米球加入到Hela细胞的培养基中，分别孵育10min、30min、1h、3h和6h，孵育后，用PBS溶液漂洗细胞后，将细胞爬片用含DAPI染料的封片剂粘于载玻片上，然后用荧光倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。阿霉素在480nm处能发出红色荧光，因此能根据细胞内的红色荧光强度判断中空二氧化锰纳米球中药物的释放情况。
如图6结果所示，随着时间的推移，纳米材料中的药物阿霉素逐渐被释放到细胞中。
实施例5：中空二氧化锰纳米球在肿瘤细胞中进行治疗和成像
用细胞培养盘培养Hela细胞，将实施例3中的表面包覆Hela细胞膜的中空二氧化锰纳米球加入到细胞培养基中，同时添加100uM的H2O2，孵育48h后，用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针进行细胞内活性氧的检测。
如图7的结果所示，中空二氧化锰纳米球在Hela细胞中能够产生活性氧。同时中空二氧化锰纳米球能与细胞中的还原型谷胱甘肽GSH反应，反应释放的锰离子可作为造影剂，用于T1加权的核磁成像，从而可以实现肿瘤的精确诊断和治疗。
由以上实施例可知，本发明提供了一种中空二氧化锰纳米球的制备方法，本发明的制备方法简便，可用于大量制备中空二氧化锰纳米球。本发明方法制备出的中空二氧化锰纳米球，粒径均匀、孔径适度、分散度高、水溶性好，表面的片层状结构有利于其在肿瘤细胞内的降解。本发明方法制备出的中空二氧化锰纳米球，表面包覆了肿瘤细胞的细胞膜，具备了同源靶向功能，可实现肿瘤细胞的靶向治疗。中空二氧化锰纳米球的内部中空结构有利于实现药物的高效负载。中空二氧化锰纳米球可以与肿瘤细胞内过量的H2O2发生类芬顿反应，催化H2O2分解产生O2和活性氧如·OH等，产生的O2可有效缓解肿瘤缺氧，另外大量的ROS聚积和GSH耗竭还会造成肿瘤细胞的氧化应激损伤，最终造成肿瘤细胞凋亡。中空二氧化锰纳米球在肿瘤细胞中可以被还原型谷胱甘肽GSH还原，产生大量的Mn2+，能够作为造影剂用于T1加权核磁共振成像。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，在不脱离本发明的原理的前提下，还可进行若干的修改和改进，这些修改和改进也应视为本发明的保护范围。
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