α-芋螺毒素肽TxIE、其药物组合物及用途
阅读说明：本技术 α-芋螺毒素肽TxIE、其药物组合物及用途 (Alpha-conotoxin peptide TxIE, and pharmaceutical composition and application thereof ) 是由 罗素兰 长孙东亭 朱晓鹏 吴勇 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物和医药领域,涉及一种新的α-芋螺毒素肽TxIE、其药物组合物及用途。具体地,本发明涉及一种分离的多肽,其为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽或其突变体；其中,所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为谷氨酸或天冬氨酸；和/或,将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。本发明的多肽能够特异性地阻断乙酰胆碱受体,特别是对成瘾和帕金森症的药物靶点α6/α3β2β3 nAChR、以及跟疼痛相关的药物靶点α6/α3β4 nAChR具有高选择性强阻断活性,具有制备用于戒烟、戒毒或镇痛药物,或者制备预防和/或治疗帕金森症、抑郁、痴呆、精神分裂症的药物的潜力。(The invention belongs to the fields of biology and medicine, and relates to a novel alpha-conotoxin peptide TxIE, a pharmaceutical composition thereof and application thereof. Specifically, the invention relates to an isolated polypeptide, which is a polypeptide with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 1 or a mutant thereof; wherein the amino acid sequence of the mutant is that the 1 st glycine in the sequence shown by SEQ ID NO. 1 is replaced by glutamic acid or aspartic acid; and/or the methionine at position 15 in the sequence shown in SEQ ID NO. 1 is replaced by alanine, leucine or isoleucine. The polypeptide of the invention can specifically block acetylcholine receptors, particularly has high selectivity and strong blocking activity on drug target points alpha 6/alpha 3 beta 2 beta 3nAChR of addiction and Parkinson's disease and drug target points alpha 6/alpha 3 beta 4nAChR related to pain, and has the potential of preparing drugs for smoking cessation, drug rehabilitation or pain relief, or preparing drugs for preventing and/or treating Parkinson's disease, depression, dementia and schizophrenia.)
技术领域
本发明属于生物和医药领域，涉及一种新的α-芋螺毒素肽TxIE、其药物组合物及用途。本发明还涉及TxIE的突变体。
背景技术
芋螺毒素按其受体靶位可分为α、ω、μ、δ等多种药理学家族。每个超家族根据受体靶类型，又可分为α、αA、κA(A-超家族)，ω、δ、κ、μO(O-超家族)，μ、ψ、KM(M-超家族)等家族。其中的α-芋螺毒素是目前发现的选择性最好的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)亚型特异阻断剂(Wu RJ,Wang L,Xiang H.The Structural Features ofα-Conotoxin SpecificallyTarget Different Isoforms of Nicotinic Acetylcholine Receptors.Curr Top MedChem.2015,16(2),156-169.Lebbe EK,Peigneur S,Wijesekara I,Tytgat J.Conotoxinstargeting nicotinic acetylcholine receptors:an overview.Mar Drugs.2014,12(5),2970-3004.)。
α-芋螺毒素是人们最早发现的一类芋螺毒素，通常分子量较小，一般由12～19个氨基酸残基组成，富含二硫键。α-芋螺毒素种类繁多，活性多样，结构变化复杂。通过其高度保守的信号肽序列、药理学活性及半胱氨酸模式可对α-芋螺毒素进行分类。α-芋螺毒素的半胱氨酸模式为CC-C-C，其中二硫键连接方式为C1-C3与C2-C4，二硫键间形成2个loop环，根据二三及三四半胱氨酸间氨基酸数量不同又可把α-芋螺毒素分为α3/5，α4/7，α4/6，α4/4和α4/3等多种亚家族，每个loop的特征和残基组成的不同是毒素作用于不同受体亚型的基础(Ulens C,Hogg RC,Celie PH,et al.Structural determinants of selective alpha-conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP[J].ProcNatl Acad Sci USA 2006；103:3615–20.)
烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是细胞膜上的变构膜蛋白，介导众多中枢和外周神经系统、以及免疫系统等的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放(Giribaldi J,Dutertre S.α-Conotoxins to explore the molecular,physiological andpathophysiological functions of neuronal nicotinic acetylcholinereceptors.Neurosci Lett.2017Dec 2.pii:S0304-3940(17)30972-2)。nAChRs由不同的α和β亚基组装成很多种亚型，每种亚型都有截然不同的药理学特征。其中肌肉型乙酰胆碱受体由5个亚基构成，含2个α1亚基，1个β亚基，1个δ亚基和1个γ或ε亚基，γ或ε亚基取决于其是否为胎儿或成体的乙酰胆碱受体。哺乳动物神经型nAChRs亚型比肌肉型nAChRs复杂得多，至少有8种α亚基、3种β亚基，分别为α2-α7,α9，α10(在雏鸡中存在α8)，以及β2-β4。其中α2,α3和α4可以分别同β2或者β4结合，形成功能性受体，比如α2β2,α3β2,α2β4等。此外，α7和α9可以形成同源多聚体。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。
研究表明，含α6亚基的nAChRs(缩写为α6*nAChRs)主要分布于视觉系统和视网膜、儿茶酚胺能核、海马体、背根神经节和中脑多巴胺能区域，其能介导生物体的一些重要生理调节功能，如：情绪、疼痛、成瘾、奖赏、抑郁等。α6*nAChRs主要是治疗尼古丁成瘾和多巴胺能神经系统损伤引起的神经退行性疾病的重要靶点。表达在多巴胺能(DA)神经元的nAChRs，是治疗神经精神疾病，如烟碱、吗啡与可卡因等的成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症、抑郁等的药物作用靶点(Larsson,A.；Jerlhag,E.；Svensson,L.；Soderpalm,B.；Engel,J.A.,Is an alpha-conotoxin MII-sensitive mechanism involved in theneurochemical,stimulatory,and rewarding effects of ethanol？Alcohol 2004,34(2-3),239-50.Jerlhag,E.；Egecioglu,E.；Dickson,S.L.；Svensson,L.；Engel,J.A.,Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors are involved inmediating the ghrelin-induced locomotor stimulation and dopamine overflow innucleus accumbens.European neuropsychopharmacology，2008,18(7),508-18)。DA神经元中含有α6亚基的nAChRs表达量非常高，由于缺乏α6*nAChRs特异的药理学分子探针，α6nAChR在成瘾中所具有的重要作用的机制还不清楚。哺乳动物脑中纹状体上的α6β2*-nAChRs亚型被认为是治疗烟瘾、毒瘾和酒瘾的药物作用靶点(Exley,R.；Clements,M.A.；Hartung,H.；McIntosh,J.M.；Cragg,S.J.,Alpha6-containing nicotinic acetylcholinereceptors dominate the nicotine control of dopamine neurotransmission innucleus accumbens.Neuropsychopharmacology 2008,33(9),2158-66。Gao,F.；Chen,D.；Ma,X.；Sudweeks,S.；Yorgason,J.T.；Gao,M.；Turner,D.；Eaton,J.B.；McIntosh,J.M.；Lukas,R.J.；Whiteaker,P.；Chang,Y.；Steffensen,S.C.；Wu,J.Alpha6-containingnicotinic acetylcholine receptor is a highly sensitive target ofalcohol.Neuropharmacology 2019,149,45-54.)。α6亚基在脑中并不是广泛分布的，但却在中脑部分的多巴胺能神经元区域富集表达，这个区域是与愉快、奖赏与心情控制密切相关的区域，这意味着α6*nAChRs在药物引起的成瘾与情绪控制等的调控中起关键作用(Yang,K.C.,G.Z.Jin,et al.(2009).Mysterious alpha6-containing nAChRs:function,pharmacology,and pathophysiology.Acta Pharmacol Sin 30(6):740-751.Klink,R.；deKerchove d'Exaerde,A.；Zoli,M.；Changeux,J.P.,Molecular and physiologicaldiversity of nicotinic acetylcholine receptors in the midbrain dopaminergicnuclei.The Journal of neuroscience,2001,21(5),1452-63.Azam,L.；Winzer-Serhan,U.H.；Chen,Y.；Leslie,F.M.,Expression of neuronal nicotinic acetylcholinereceptor subunit mRNAs within midbrain dopamine neurons.The Journal ofcomparative neurology 2002,444(3),260-74.Champtiaux,N.；Gotti,C.；Cordero-Erausquin,M.；David,D.J.；Przybylski,C.；Lena,C.；Clementi,F.；Moretti,M.；Rossi,F.M.；Le Novere,N.；McIntosh,J.M.；Gardier,A.M.；Changeux,J.P.,Subunitcomposition of functional nicotinic receptors in dopaminergic neuronsinvestigated with knock-out mice.The Journal of neuroscience,2003,23(21),7820-9.Pons,S.；Fattore,L.；Cossu,G.；Tolu,S.；Porcu,E.；McIntosh,J.M.；Changeux,J.P.；Maskos,U.；Fratta,W.,Crucial role of alpha4 and alpha6 nicotinicacetylcholine receptor subunits from ventral tegmental area in systemicnicotine self-administration.The Journal of neuroscience,2008,28(47),12318-27。Berry,J.N.；Engle,S.E.；McIntosh,J.M.；Drenan,R.M.alpha6-Containing nicotinicacetylcholine receptors in midbrain dopamine neurons are poised to governdopamine-mediated behaviors and synaptic plasticity.Neuroscience 2015,304,161-175.Chen,D.；Gao,F.；Ma,X.；Eaton,J.B.；Huang,Y.；Gao,M.；Chang,Y.；Ma,Z.；Der-Ghazarian,T.；Neisewander,J.；Whiteaker,P.；Wu,J.；Su,Q.Cocaine Directly Inhibitsalpha6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors in Human SH-EP1 Cells andMouse VTA DA Neurons.Front Pharmacol 2019,10,72)。
α6*nAChRs也表达在儿茶酚胺能神经元与视网膜上(Le Novere,N.；Zoli,M.；Changeux,J.P.,Neuronal nicotinic receptor alpha 6subunit mRNA is selectivelyconcentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain.The Europeanjournal of neuroscience 1996,8(11),2428-39.Vailati,S.；Hanke,W.；Bejan,A.；Barabino,B.；Longhi,R.；Balestra,B.；Moretti,M.；Clementi,F.；Gotti,C.,Functionalalpha6-containing nicotinic receptors are present in chick retina.Molecularpharmacology 1999,56(1),11-9.).α6β2*nAChRs表现出具有调控多巴胺释放的功能(Wang,L.；Shang,S.；Kang,X.；Teng,S.；Zhu,F.；Liu,B.；Wu,Q.；Li,M.；Liu,W.；Xu,H.；Zhou,L.；Jiao,R.；Dou,H.；Zuo,P.；Zhang,X.；Zheng,L.；Wang,S.；Wang,C.；Zhou,Z.Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevantlevels of nicotine.Nat Commun 2014,5,3925.)。
在灵长类的1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine动物模型与人类帕金森症疾病模型上，α6β2*nAChRs的数量明显降低(Champtiaux,N.；Han,Z.Y.；Bessis,A.；Rossi,F.M.；Zoli,M.；Marubio,L.；McIntosh,J.M.；Changeux,J.P.,Distribution andpharmacology of alpha 6-containing nicotinic acetylcholine receptors analyzedwith mutant mice.The Journal of neuroscience,2002,22(4),1208-17.Quik,M.；Polonskaya,Y.；Kulak,J.M.；McIntosh,J.M.,Vulnerability of 125I-alpha-conotoxinMII binding sites to nigrostriatal damage in monkey.The Journal ofneuroscience,2001,21(15),5494-500.Quik,M.；Bordia,T.；Forno,L.；McIntosh,J.M.,Loss of alpha-conotoxin MII-and A85380-sensitive nicotinic receptors inParkinson's disease striatum.Journal of neurochemistry 2004,88(3),668-79。Gotti,C.,Moretti,M.,Bohr,I.,Ziabreva,I.,Vailati,S.,Longhi,R.,Riganti,L.,Gaimarri,A.,McKeith,I.G.,Perry,R.H.,Aarsland,D.,Larsen,J.P.,Sher,E.,Beattie,R.,Clementi,F.,and Court,J.A.(2006)Selective nicotinic acetylcholine receptorsubunit deficits identified in Alzheimer's disease,Parkinson's disease anddementia with Lewy bodies by immunoprecipitation.Neurobiol Dis 23,481-489).因而，α6/α3β2β3 nAChR的特异阻断剂是研究解释不同组织中存在的α6*nAChRs生理功能的有价值的工具，以及与之有关的如成瘾等疾病的治疗药物。
含α6亚基的nAChRs主要分为两个亚型组合(α6β2*或α6β4*)。α6β4*nAChRs亚型表达分布较为局限，对其基本功能缺乏认识。研究表明，α6β4*亚型在视网膜(Marritt,A.M.,Cox,B.C.,Yasuda,R.P.,McIntosh,J.M.,Xiao,Y.,Wolfe,B.B.,and Kellar,K.J.(2005)Nicotinic cholinergic receptors in the rat retina:simple and mixedheteromeric subtypes.Mol Pharmacol 68,1656-1668)、肾上腺嗜铬细胞(Hernandez-Vivanco,A.,Hone,A.J.,Scadden,M.L.,Carmona-Hidalgo,B.,McIntosh,J.M.,andAlbillos,A.(2014)Monkey adrenal chromaffin cells express alpha6beta4*nicotinic acetylcholine receptors.PLoS One 9,e94142。Perez-Alvarez,A.,Hernandez-Vivanco,A.,McIntosh,J.M.,and Albillos,A.(2012)Native alpha6beta4*nicotinic receptors control exocytosis in human chromaffin cells of theadrenal gland.FASEB J 26,346-354)、海马(Azam,L.,Maskos,U.,Changeux,J.P.,Dowell,C.D.,Christensen,S.,De Biasi,M.,and McIntosh,J.M.(2010)alpha-ConotoxinBuIA[T5A；P6O]:a novel ligand that discriminates between alpha6ss4 andalpha6ss2 nicotinic acetylcholine receptors and blocks nicotine-stimulatednorepinephrine release.FASEB J 24,5113-5123。)和背根神经节(Vincler,M.,andEisenach,J.C.(2004)Plasticity of spinal nicotinic acetylcholine receptorsfollowing spinal nerve ligation.Neurosci Res 48,139-145。Hone,A.J.,Meyer,E.L.,McIntyre,M.,and McIntosh,J.M.(2012)Nicotinic acetylcholine receptors indorsal root ganglion neurons include the alpha6beta4*subtype.FASEB J 26,917-926。Smith,N.J.,Hone,A.J.,Memon,T.,Bossi,S.,Smith,T.E.,McIntosh,J.M.,Olivera,B.M.,and Teichert,R.W.(2013)Comparative functional expression of nAChRsubtypes in rodent DRG neurons.Front Cell Neurosci 7,225)等组织中均有表达。在DRG中表达的α6β4*nAChRs与P2X2/3受体有直接的相互作用和交叉抑制，所引起的神经性疼痛症状与CHRNA6表达水平呈负相关(Hone,A.J.,Talley,T.T.,Bobango,J.,HuidobroMelo,C.,Hararah,F.,Gajewiak,J.,Christensen,S.,Harvey,P.J.,Craik,D.J.,andMcIntosh,J.M.(2018)Molecular determinants of alpha-conotoxin potency forinhibition of human and rat alpha6beta4 nicotinic acetylcholine receptors.JBiol Chem 293,17838-17852。Hone,A.J.,and McIntosh,J.M.(2018)Nicotinicacetylcholine receptors in neuropathic and inflammatory pain.FEBS Lett 592,1045-1062。Limapichat,W.,Dougherty,D.A.,and Lester,H.A.(2014)Subtype-specificmechanisms for functional interaction between alpha6beta4*nicotinicacetylcholine receptors and P2X receptors.Mol Pharmacol 86,263-274)。这项研究表明α6β4*nAChRs是神经性疼痛的一个新的潜在治疗靶点。
鉴于对α6β4*nAChRs生理和病理研究的匮乏，寻找一种选择性强的α6β4 nAChRs阻滞剂，特别是能够区分其它结构相似、分布重叠的nAChRs亚型的阻滞剂，例如α3β4 nAChRs等，具有重要意义。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了一个新的α-芋螺毒素肽(命名为TxIE)，并进一步制得了TxIE的突变体。本发明人惊奇地发现，TxIE或其突变体能够特异性地阻断乙酰胆碱受体，特别是对成瘾和帕金森症的药物靶点α6/α3β2β3 nAChR、以及跟疼痛相关的药物靶点α6/α3β4 nAChR具有高选择性强阻断活性，具有制备用于戒烟、戒毒或镇痛药物，或者制备预防和/或治疗帕金森症、抑郁、痴呆、精神分裂症的药物的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽或其突变体；
其中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为谷氨酸或天冬氨酸；和/或，将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；
优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NOs:2-7中的任一序列所示。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为谷氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为天冬氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为丙氨酸(SEQ ID NO:2)。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为异亮氨酸(SEQ ID NO:3)。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为亮氨酸(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为谷氨酸；和，将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为丙氨酸(SEQ ID NO:5)。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为谷氨酸；和，将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为异亮氨酸(SEQ ID NO:6)。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为谷氨酸；和，将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为亮氨酸(SEQ ID NO:7)。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为天冬氨酸；和，将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为丙氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为天冬氨酸；和，将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为异亮氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为将SEQ ID NO:1所示序列中第1位的甘氨酸替换为天冬氨酸；和，将SEQ ID NO:1所示序列中第15位的甲硫氨酸替换为亮氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其氨基酸序列为在SEQ ID NOs:1-7中任一序列的C-末端增加一个甘氨酸(第17位)或者增加两个甘氨酸(第17位和第18位)。
在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其氨基酸序列为在SEQ ID NO:1所示序列的C-末端增加一个甘氨酸(第17位，SEQ ID NO:9)或者增加两个甘氨酸(第17位和第18位，SEQ ID NO:10)。
在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其氨基酸序列为在SEQ ID NOs:2-7中任一序列的C-末端增加一个甘氨酸(第17位)或者增加两个甘氨酸(第17位和第18位)。
在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其中：
所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或者
所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键；或者
所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键，并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；
优选地，所述多肽的羧基末端是酰胺化的。
本发明中：
氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽是成熟肽，也称为α-conotoxin TxIE或TxIE或Peptide 1；
TxIE为芋螺毒素肽；具体地，是α-芋螺毒素肽。
氨基酸序列依次如SEQ ID NOs：2-7所示的多肽也称为Peptide 2-7，或依次分别称为[M15A]TxIE、[M15I]TxIE、[M15L]TxIE、[G1E,M15A]TxIE、[G1E,M15I]TxIE、[G1E,M15L]TxIE)；
氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的多肽是前体肽，也称为α-conotoxin TxIEprecursor或TxIE precursor。
本发明的另一方面涉及本发明中任一项所述的多肽的制备方法，包括下述步骤：
1)在ABI Prism 433a多肽合成仪、或其它多肽合成仪上，或者手工方法合成线性多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)；半胱氨酸用Trt或Acm保护基团，分别在相应的半胱氨酸之间定点形成二硫键；
2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性多肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化；
3)将步骤2)中得到的产物进行两步氧化折叠。
本发明的另一方面涉及一种分离的融合蛋白，其包含至少一种本发明中任一项所述的多肽。
本发明的再一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明中任一项所述的多肽。
本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其含有本发明的多核苷酸；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述核酸构建体为重组表达载体。
本发明的再一方面涉及一种转化的细胞，其含有本发明的多核苷酸，或者本发明的核酸构建体。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有至少一种本发明中任一项所述的多肽；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
所述药物组合物可用于研究、诊断、缓解或治疗与成瘾、神经痛、癌症、智障、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。
含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物非肠道给药、口服、脑池内给药、鞘内给药等。“药学上可接受的辅料”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽在制备阻断α6*乙酰胆碱受体的药物中的用途；优选地，所述α6*乙酰胆碱受体是α6/α3β2β3乙酰胆碱受体或α6/α3β4乙酰胆碱受体。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽在制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物中的用途，或者在制备镇痛、戒烟或戒毒的药物中的用途；
优选地，所述神经系统疾病为成瘾、神经痛、帕金森症、痴呆、精神分裂症和抑郁中的至少一种；
优选地，所述成瘾由如下因素中的至少一种导致：各种精神活性物质例如尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻、可卡因或酒精；
优选地，所述神经痛选自如下的至少一种：坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛以及复合神经痛；
优选地，所述神经痛由如下因素中的至少一种导致：癌症、癌症化疗、酒精中毒、糖尿病、硬化症、带状疱疹、机械伤、手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、骨髓瘤、慢性先天性感觉神经病、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症。
研究表明，α6/α3β2β3 nAChR是治疗神经精神疾病，如烟碱、吗啡与可卡因等的成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症、抑郁等的药物作用靶点；α6β4*nAChRs是神经性疼痛的一个新的潜在治疗靶点(参见背景技术中的有关文献)。因此，本发明的新α-芋螺毒素TxIE及其突变体在上述疾病的机理研究、诊断、治疗方面具有极高的应用价值。
给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是，剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外阻断α6*乙酰胆碱受体或者调节α6*乙酰胆碱水平的方法，包括给予受试者或者施加给细胞以有效量的本发明中任一项所述的多肽的步骤；优选地，所述α6*乙酰胆碱受体是α6/α3β2β3乙酰胆碱受体或α6/α3β4乙酰胆碱受体。
本发明中：
术语“成瘾(addiction)”，是指反复使用精神活性物质者处于周期性或慢性中毒状态。精神活性物质指尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻、可卡因以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品等。成瘾与大脑中大量产生的多巴胺(Dopamine)有关。表现为不可遏制地应用偏爱的物质和难以自制或难以矫正使用行为，为获取精神活性物质达到感觉良好或避免戒断痛苦之目的，可以不择手段。典型情况是耐受性增高，并在物质使用中断后常出现戒断症状。成瘾者的生活可能完全由物质使用主宰，因而严重影响，甚至抛弃了其他重要活动和一切责任。因此，物质使用既给个人，也给社会带来损害。当用于酒精使用时，与慢性酒精中毒的概念等同。成瘾一词还涵盖躯体及心理两方面的内容。心理成瘾强调对饮酒、服药的自控力受损体验，而躯体成瘾指耐受和戒断症状。
术语“核酸构建体”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建体还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现。
在本发明中，术语“载体”指的是，可将抑制某蛋白的多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件。
在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
本发明中，如果没有特别说明，浓度单位μM表示μmol/L，mM表示mmol/L，nM表示nmol/L。
本发明中，提到细胞中的加药量时，如果没有特别说明，一般是指加药后药物的终浓度。
本发明中提到术语“氨基酸”或者具体的氨基酸名称时，如果没有特别说明，是指L型的氨基酸。
发明的有益效果
本发明的芋螺毒素肽可通过结合α6/α3β2β3、α6/α3β4乙酰胆碱受体(nAChR)发挥作用，具有戒除成瘾与镇痛的活性。可应用于研究、诊断和治疗成瘾、神经痛、帕金森病、痴呆、精神分裂症、抑郁等神经系统疾病、以及作为有用的分子探针用于研究等方面。不同的α-CTX对脊椎动物受体的亲和性不同,有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得α-CTX可作为有用的探针用于研究脊椎动物nAChR的种系发生，可作为分子探针来确定nAchR的不同亚型。它们是新药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。
附图说明
图1：α-芋螺毒素TxIE(多肽1,Peptide 1)及其突变体(多肽2-7,Peptide 2-7)的序列及其二硫键连接方式Cys(I-III,II-IV)。每个取代的氨基酸以下划线标出。半胱氨酸用斜体标出。#表示C-末端酰胺化。
图2A：α-芋螺毒素TxIE前肽基因序列及其编码产生的前肽与翻译后修饰产生的成熟肽。箭头所指为翻译后修饰的加工位点。推断的蛋白酶水解加工位点1(processing site1)在碱性氨基酸赖氨酸(K)的后面；C-末端酰胺化加工位点可能在箭头所指的两个甘氨酸的位置，即processing site 2。成熟肽C-末端紧挨半胱氨酸(Cys)的甘氨酸残基往往是酰胺化翻译后修饰的加工位点，从processing site 2进行酰胺化产生的成熟肽命名为TxIE，序列为：GCCSNPPCIAKNPHMC#(#表示C-末端酰胺。前肽区用斜体字表示，成熟肽用下划线表示，其中的半胱氨酸(C)用加粗字体显示，终止密码子用*表示。
图2B,α-芋螺毒素TxIE及其二硫键连接方式Cys(I-III,II-IV),#表示C-末端酰胺化。
图3A-3B：分别是TxIE的高压液相色谱图和ESI-MS质谱图。
图3C-3D：分别是[M15A]TxIE(多肽2)的高压液相色谱图和ESI-MS质谱图。
图3E-3F：分别是[M15I]TxIE(多肽3)的高压液相色谱图和ESI-MS质谱图。
图3G-3H：分别是[M15L]TxIE(多肽4)的高压液相色谱图和ESI-MS质谱图。
其中图3A、3C、3E和3G中：
HPLC分析条件为：C18柱(Vydac)，洗脱线性梯度为在0-40min内10-40％B60(含60％的乙腈水溶液)，监测波长为214nm。溶剂B60是含90％乙腈(ACN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A是0.05％TFA的水溶液；
HPLC色谱图中的分钟数，表示该色谱峰的保留时间；
横坐标是洗脱时间，单位为分钟(min)；纵坐标是在波长为214nm下的紫外吸收值(UV214)。
图4A-4B：分别是[G1E,M15A]TxIE(多肽5)的HPLC色谱图和质谱图。
图4C-4D：分别是[G1E,M15I]TxIE(多肽6)的HPLC色谱图和质谱图。
图4E-4F：分别是[G1E,M15L]TxIE(多肽7)的HPLC色谱图和质谱图。
其中图4A、4C和4E中的HPLC分析条件与图3A、3C、3E和3G中相同。
图5：α-CTx TxIE(多肽1)(10μM)对表达在非洲爪蟾卵母细胞中nAChRs各个亚型电流的影响。所有数据代表Mean±S.E.M，n＝4-6。横坐标是电流反应百分数％，计算公式为：每种nAChRs亚型在TxIE 10μM浓度下的电流除以各自的Control电流(对照ND96)的百分数。此处Control是指与药物TxIE相同体积的ND96缓冲液加入细胞槽中孵育5min后，Ach激发产生的电流，即为对照电流。
图6A-6H：TxIE(多肽1)和[M15I]TxIE(多肽3)阻断大鼠α6/α3β2β3和α6/α3β4nAChRs的电流轨迹图,是α6/α3β2β3与α6/α3β4 nAChRs的高选择性特异阻断剂。图中“C”是指的对照(ND96)电流，紧接“C”后面的是多肽的浓度。箭头所指的是温育5分钟后，多肽阻断相应受体亚型的第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。其中：
图6A：1μM TxIE对α6/α3β4 nAChR的电流影响情况；
图6B：1μM TxIE对α6/α3β2β3 nAChR的电流影响情况；
图6C：10μM TxIE对α3β4 nAChR的电流影响情况；
图6D：10μM TxIE对α3β2 nAChR的电流影响情况；
图6E：1μM[M15I]TxIE对α6/α3β4 nAChR的电流影响情况；
图6F：1μM[M15I]TxIE对α6/α3β2β3 nAChR的电流影响情况；
图6G：10μM[M15I]TxIE对α3β4 nAChR的电流影响情况；
图6H：10μM[M15I]TxIE对α3β2 nAChR的电流影响情况。
大鼠α6/α3β2β3和α6/α3β4 nAChRs表达在非洲爪蟾卵母细胞中，电生理记录时的钳制电压是-70mV，根据实验操作程序每隔1分钟给1秒(s)的Ach脉冲。TxIE能完全阻断α6/α3β4(图6A)和α6/α3β2β3(图6B)nAChR的电流，但对α3β4(图6C)和α3β2(图6D)nAChR无阻断活性。[M15I]TxIE也能完全阻断α6/α3β4(图6E)和α6/α3β2β3(图6F)nAChR的电流，但对α3β4(图6G)和α3β2(图6H)nAChR无阻断活性。
图7A-7D：TxIE(多肽1)及其突变体(多肽2-7)对大鼠α6/α3β2β3和α6/α3β4 nAChRs的浓度反应曲线图。图中横坐标为所用多肽的摩尔浓度(M)的对数值(Log[Peptide]M)；纵坐标为浓度反应百分数(Response％)，是指相应浓度的多肽作用下，乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数。图中各个数值是取自4-6个非洲爪蟾卵母细胞的电流平均值，即Mean±S.E.M，n＝4-6。其中：
图7A：TxIE及其突变体(多肽2-4)对大鼠α6/α3β2β3 nAChR的浓度-反应曲线图；
图7B：TxIE及其突变体(多肽5-7)对大鼠α6/α3β2β3 nAChR的浓度-反应曲线图；
图7C：TxIE及其突变体(多肽2-4)对大鼠α6/α3β4 nAChR的浓度-反应曲线图；
图7D：TxIE及其突变体(多肽5-7)对大鼠α6/α3β4 nAChR的浓度-反应曲线图。
图8：TxIE(多肽1)对所有nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线，图中横坐标为所用TxIE多肽的摩尔浓度(M)的对数值(Log[Peptide]M)；纵坐标为浓度反应百分数(Response％)，是指相应浓度的多肽作用下，乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数。图中各个数值是取自4-6个非洲爪蟾卵母细胞的电流平均值，即Mean±S.E.M，n＝4-6。
图9A-9C：TxIE(多肽1)及其突变体(多肽2-4)的核磁共振(NMR)空间结构。其中：
图9A：多肽1-4的αH二级化学位移；
图9B：TxIE(多肽1)的20种能量最低的空间结构重叠图，图中蓝色曲线代表该多肽的原子骨架，黄色曲线代表二硫键；其中N-terminal表示N-末端，C-terminal表示C-末端。
图9C：TxIE(多肽1)的三维结构彩带图，显示有2个α螺旋结构、以及两对二硫键的连接方式。
图10A-图10H：TxIE(多肽1)与α3β2,α3β4,α6β2和α6β4nAChRs的α/β交界面正性结合位点的相互作用分子对接模型。图10A-图10D显示TxIE在α/β交界面正性结合位点的相互作用模型，溶剂可接触表面的颜色根据受体产生的静电势来确定，从红色(-5kT/e)到白色(0kT/e)再到蓝色(5kT/e)。图10E-图10H显示TxIE的Lys-11与受体之间的相互结合区域放大图，图中α亚基为蓝色、β亚基为绿色。该图中显示的分子对接模型呈矩心框架，是对每个系统进行100ns分子动力学模拟产生的。在所有分子对接模型中，芋螺毒素TxIE用橙色卡通和棒状图表示。在图的上半部分，白色虚线圈定部位代表TxIE的Lys-11头部带电基团与受体之间相互作用的区域。TxIE的N-末端用白色的“N”表示。静电势用具有默认参数的APBS1.4，在150mM盐浓度的条件进行计算。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：α-芋螺毒素TxIE基因的克隆和序列分析
1.织锦芋螺基因组DNA的提取
分别以从海南岛、西沙群岛等沿海采集的织锦芋螺(C.textile Linnaeus)活体为材料，储存在-80℃备用。先将芋螺毒腺解剖出来，并称重。然后用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京天根生化科技有限公司)，提取毒腺的基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
将提取的芋螺基因组总DNA溶于100μL TE中，取5μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，以λ-EcoT14 I digest DNA Marker为标准，检测所得DNA的完整性和大小。用核酸蛋白质分析仪测定DNA溶液的OD260、OD280值以及OD260/OD280比值，并计算DNA的浓度(μg·ml-1)、纯度和DNA产率(μg·g-1)。所提取的完整DNA用于下一步PCR扩增进行芋螺毒素基因克隆的模板。
2.PCR反应及其产物的克隆、测序、和序列分析
根据α-芋螺毒素前体基因内含子序列及其3’端非翻译区(3’-UTR)序列，设计α-芋螺毒素特异引物，每条引物均为18个碱基的寡核苷酸片段。
上游内含子引物序列为5’-GTGGTTCTGGGTCCAGCA-3’(SEQ ID NO：11)；
下游3’-UTR引物序列为5’-GTCGTGGTTCAGAGGGTC-3’(SEQ ID NO：12)。
将所提取的基因组DNA原液稀释后作为PCR扩增的模板。回收PCR特异扩增产物，与T-easy载体(Promega)连接后转化大肠杆菌XL1菌株，利用蓝白菌落和氨苄青霉素抗性挑选重组子，抽提纯化重组子质粒用于测序分析。
所获PCR特异扩增产物序列经DNAStar软件分析，获知其编码蛋白序列、3’-非翻译区(UTR)序列。芋螺毒素前体蛋白的信号肽、前肽以及成熟肽的预测，采用在线ProP1.0Server进行分析(Duckert,P.；Brunak,S.；Blom,N.,Prediction of proproteinconvertase cleavage sites.Protein engineering,design&selection:PEDS 2004,17(1),107-12.)。
经序列分析比较，获得了一种新的α-芋螺毒素(命名为TxIE)前体基因(图2A)：
GTGGTTCTGGGTCCAGCATCTGATGGCAGGAAAGCTGCAGTGTCTGACCTGATCACTCTGACCATCAAGGGATGCTGTTCTAATCCTCCCTGTATCGCGAAGAATCCACACATGTGTGGTGGAAGACGCTGA(SEQ ID NO:13)
根据前体基因及芋螺毒素特点，推测出TxIE芋螺毒素前肽，它的氨基酸序列如下：
VVLGPASDGRKAAVSDLITLTIKGCCSNPPCIAKNPHMCGGRR(SEQ ID NO：8)
根据前肽序列再推测出成熟肽TxIE，其氨基酸序列为GCCSNPPCIAKNPHMC(SEQ IDNO：1)，推断的方法和原理请参考Luo S,Zhangsun D,Zhang B,Quan Y,Wu Y.Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,and their sequence diversity.J Pept Sci.2006,12(11):693-704。推导结果详见图1，图2A-2B。
TxIE(多肽1)是新的α-芋螺毒素，其C-末端具有酰胺化的修饰。TxIE含有CC-C-C半胱氨酸模式，其二硫键连接方式为Cys(I-III,II-IV)(图1,图2B)，即在第一和第三个半胱氨酸之间，以及第二和第四个半胱氨酸之间分别形成两对二硫键。TxIE与其它已知的α-芋螺毒素都不同。
实施例2：α-芋螺毒素TxIE突变体的设计
在TxIE的序列结构基础上，针对第1位的甘氨酸(G)与第15位的甲硫氨酸(M)，分别进行点突变，设计了图1所示的6个突变体(多肽2-7，如表1)，其氨基酸序列如SEQ ID NOs：2-7所示。进一步地，6个突变体的二硫键连接方式，C-末端酰胺化。
根据多肽2-7的序列，推导出其前体基因的DNA序列如表1所示。
表1.TxIE及其突变体的多肽序列
名称
序列
TxIE
GCCSNPPCIAKNPHMC#
[M15A]TxIE
GCCSNPPCIAKNPH<u>A</u>C#
[M15I]TxIE
GCCSNPPCIAKNPH<u>I</u>C#
[M15L]TxIE
GCCSNPPCIAKNPH<u>L</u>C#
[G1E,M15A]TxIE
<u>E</u>CCSNPPCIAKNPH<u>A</u>C#
[G1E,M15I]TxIE
<u>E</u>CCSNPPCIAKNPH<u>I</u>C#
[G1E,M15L]TxIE
<u>E</u>CCSNPPCIAKNPH<u>L</u>C#
注：突变的氨基酸位点用下划线标出，半胱氨酸用斜体标出。
实施例3：α-芋螺毒素TxIE及其突变体的人工合成
根据α-芋螺毒素成熟肽TxIE及其突变体的氨基酸序列(表1)，采用Fmoc方法人工合成线性肽(图1)。具体方法如下：
树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成，可用多肽合成仪或手工合成法合成树脂肽。除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团。TxIE及其突变体的第1和第3个半胱氨酸(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护，第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护。
具体的合成步骤为：采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了图1中的7个线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr),OBut(Asp),Boc(Lys)。采用Fmoc HOBT DCC方法,Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全,在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂肽。用reagent K(trifluoroaceticacid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole；90:5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化，洗脱线性梯度为在0-40min内10-40％B90，监测波长为214nm。溶剂B90是含90％乙腈(CAN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A是0.05％TFA的水溶液。
纯化后的线性肽用分析型的HPLC C18柱(Vydac)进行纯度检测，其洗脱条件同上，流速为1mL/min。其纯度达95％以上，用于氧化折叠。
参照文献(Dowell,C.；Olivera,B.M.；Garrett,J.E.；Staheli,S.T.；Watkins,M.；Kuryatov,A.；Yoshikami,D.；Lindstrom,J.M.；McIntosh,J.M.,Alpha-conotoxin PIA isselective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors.TheJournal of neuroscience 2003,23(24),8445-52.)对TxIE及其突变体的线性肽进行两步氧化折叠反应，过程简述如下:
首先通过铁氰化钾氧化法(20mM potassium ferricyanide,0.1M Tris,pH 7.5，45min)，在Trt保护基团的两个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。单环肽经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化后，进行碘氧化(10mM iodine in H2O:trifluoroacetic acid:acetonitrile(78:2:20by volume，10min)，移去另外2个半胱氨酸上的Acm,同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化，即获得按照从N端至C端的顺序在相应的半胱氨酸之间定向形成二硫键的α-芋螺毒素，并通过质谱(electrospray-massspectroscopy，ESI-MS)鉴定。
氧化折叠后的TxIE及其突变体的HPLC色谱图、ESI-MS质谱图如图3A-3H和图4A-4F所示。合成的TxIE及其突变体的纯度均在95％以上。TxIE及其突变体的实测分子量与理论分子量一致(表2)，所合成的7个多肽的分子量正确，纯度高。多肽浓度用280nm波长下比色测定，根据Beer-Lambert方程(equation)计算多肽浓度和质量。这些定量过的折叠好的多肽用于后续的活性测试。
表2.α-CTx TxIE及其突变体的分子量
多肽
理论分子量(Da,平均)
实测分子量(Da)
TxIE
1670.00
1669.80
[M15A]TxIE
1609.89
1609.68
[M15I]TxIE
1651.97
1651.98
[M15L]TxIE
1651.97
1651.89
[G1E,M15A]TxIE
1681.95
1681.80
[G1E,M15I]TxIE
1724.03
1724.01
[G1E,M15L]TxIE
1724.03
1723.92
实施例4：α-芋螺毒素TxIE对α6/α3β2β3、α6/α3β4nAChRs，以及其它所有nAChRs亚 型的活性研究
参照文献(Azam L,Yoshikami D,McIntosh JM.Amino acid residues thatconfer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptorsubunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008；283(17):11625-32.)中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitro transcription kit(Ambion,Austin,TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7)、以及小鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。肌肉nAChR每个亚基注射0.5-2.5ngDNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－4天内用于nAChRs的电压钳记录。
将1个注射过cRNA的蛙卵置于30uL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm)，重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)的ND96灌流液(96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl2,1.0mM MgCl2,5mM HEPES,pH 7.1-7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(SmartValve,Cavro Scientific Instruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves,model161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries，WPI Inc.,Sarasota,FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达肌肉型的nAChRs和神经型α9α10nAChRs卵为10μM；表达神经型的nAChRs之α7为200μM,其它的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。
测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC50等多种有关多肽阻断nAChRs的各种参数。
结果表明，TxIE(实施例3制备)对大鼠α6/α3β2β3 nAChR的阻断活性最强，其半阻断剂量(IC50)仅为2.4nM，其次为α6/α3β4 nAChR，其半阻断剂量(IC50)为91nM。TxIE对α6/α3β2β3的阻断活性，比对α6/α3β4 nAChR亚型的阻断活性要强39倍(图5、图6A-6H、图7A-7D、图8，表3-表4)。TxIE在10μM的高浓度下，对其它所有亚型的受体都没有阻断作用，它们的电流与对照电流相比的反应百分数均在90％以上(图5、图6C、图6D，表3-表4)。1μM TxIE几乎完全阻断了由Ach门控的大鼠α6/α3β2β3(图6B)和α6/α3β4(图6A)nAChRs开放产生的电流。TxIE阻断α6/α3β2β3受体后，洗脱速率较快，4min内即可洗脱回对照电流的大小(图6B)，而TxIE阻断α6/α3β4受体后，洗脱速率很慢，需要19min才能洗脱回对照电流的大小(图6A)。TxIE对这两个亚型的阻断均是可逆的，其洗脱速率差异很大(图6A、6B)。
TxIE对含有α6亚基(α6*)的nAChR亚型，即α6/α3β2β3(表3-表4)和α6/α3β4的阻断活性强、选择性高。10μM TxIE对与α6*nAChRs非常接近的α3β4和α3β2 nAChRs都没作用(图6A、6B、6C、6D)。
表3.α-CTx TxIE和其突变体
作用α6/α3β2β3和α6/α3β4 nAChRs的IC50值汇总表
注：a代表Hill常数；b代表作用于α6/α3β4与α6/α3β2β3 nAChR IC50的比值
表4.TxIE和[M15I]TxIE
分别作用于不同烟碱型乙酰胆碱受体亚型的IC50值
a代表在10μM的浓度下，抑制率小于50％。
实施例5：α-芋螺毒素TxIE突变体对α6/α3β2β3、α6/α3β4 nAChRs的活性研究
按照实施例4的方法，测定了TxIE的6个突变体(SEQ ID NOs：2-7，图1)对nAChRs各个亚型的活性，结果如图6A-6H和图7A-7D，表3所示。TxIE的6个突变体在10μM高浓度下对α6/α3β2β3与α6/α3β4 nAChRs的电流几乎可以完全阻断。TxIE的6个突变体对α6/α3β2β3与α6/α3β4 nAChRs的浓度-反应曲线如图7A-7D所示。
表3和图7A-7D总结了TxIE的6个突变体对α6/α3β2β3与α6/α3β4 nAChRs的IC50和活性变化。从中可以看出，TxIE突变体对α6/α3β2β3与α6/α3β4 nAChRs的阻断活性具有剂量依赖性。第15位甲硫氨酸被取代的3个突变体[M15A]TxIE(SEQ ID NO：2),[M15I]TxIE(SEQ IDNO：3)和[M15L]TxIE(SEQ ID NO：4)对α6/α3β2β3 nAChR的抑制活性无明显变化，而对α6/α3β4 nAChR的抑制活性稍许增强。其中[M15I]TxIE(SEQ ID NO：3)对α6/α3β2β3nAChR的阻断作用最强，其IC50值为1(0.7-1.4)nM，且与本体TxIE相比对α6/α3β4 nAChR的活性也增强了约3倍，IC50值为31(28-34)nM。相反，第1位被取代的3个突变体对α6/α3β2β3与α6/α3β4nAChRs的活性与野生型TxIE相比大大降低，并且它们的浓度-反应曲线整体向右移动(图7B和7D)。[M15I]TxIE对α6/α3β2β3的阻断活性，比对α6/α3β4 nAChR亚型的阻断活性要强31倍。TxIE(SEQ ID NO：1)和[M15I]TxIE(SEQ ID NO：3)对其它受体亚型，如mα1β1δε,rα3β2,rα3β4,rα2β2,rα2β4,rα4β2,rα4β4,rα7和rα9α10nAChRs，在10μM浓度下都无明显阻断作用(表4和图8)。因此，突变体[M15I]TxIE(SEQ ID NO：3)比野生型TxIE的活性显著增强，是能够高效且专一作用于α6*nAChRs的新型多肽。
实施例6：α-芋螺毒素TxIE及其突变体的核磁共振(NMR)三维空间结构解析
利用核磁共振仪对TxIE(SEQ ID NO：1)及其第15位被取代的3个突变体(SEQ IDNO：2-4)的结构进行了解析。具体方法参照Shen,Y.；Bax,A.Protein backbone andsidechain torsion angles predicted from NMR chemical shifts using artificialneural networks.J.Biomol.Nmr.2013,56,227-241.以及Brunger,A.T.；Adams,P.D.；Clore,G.M.；DeLano,W.L.；Gros,P.；Grosse-Kunstleve,R.W.；Jiang,J.S.；Kuszewski,J.；Nilges,M.；Pannu,N.S.；Read,R.J.；Rice,L.M.；Simonson,T.；Warren,G.L.Crystallography&NMR system:A new software suite for macromolecularstructure determination.Acta Crystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.1998,54,905-921.
在水溶液中，这4种肽都具有良好的折叠构象，尽管由于三个脯氨酸残基中存在一个或多个顺反异构化，观察到整体结构具有少量的同分异构体(少于20％)。除了N-末端酰胺基质子外，每个主异构体的骨架质子实现完全共振。TxIE及其3个突变体的αH二级化学位移的变化非常相似。这表明由于甲硫氨酸的替代而导致的主体结构的变化可以忽略不计。位于中间的短的α-螺旋结构部分的序列，是用各个氨基酸残基的二级结构αH化学位移负向柱状图表示的，其数值要小于-0.1ppm(图9A)。
在温度288K下，通过NOESY谱得出的111个距离约束值来计算出TxIE的三维溶液结构。根据TALOS-N的化学位移生成的17个二面体结构和温度系数，计算出20个能量最低的空间结构(图9B)。TxIE(SEQ ID NO：1)的三维结构彩带图如图9C所示，其中有2个α-螺旋二级结构、以及明显的两对二硫键及其连接方式。表5显示了NMR结构及其能量计算的有关数据，其RMSD为根据对三个脯氨酸以及它们之前的氨基酸残基的Hαi-1–HδPi质子间NOE效应和碳13化学位移分析，三个脯氨酸的主要构型皆为反式构象。从图9A和9C中可以看出，Pro-6和Lys-11之间形成了一个较长的α-螺旋结构，且含有两个螺旋环；TxIE的N末端，从Cys-2到Ser-4之间，还有一个“3,10-型”的较短的α-螺旋。
表5.TxIE(SEQ ID NO：1)结构的数据分析
aAll statistics are given as mean±SD.
bAccording to MolProbity
实施例7：α-芋螺毒素TxIE(SEQ ID NO：1)与α3β2,α3β4,α6β2和α6β4 nAChRs的相 互作用分子对接分析
参照文献Sali,A.；Blundell,T.L.Comparative protein modelling bysatisfaction of spatial restraints.J.Mol.Biol.1993,234,779-815.以及Dutertre,S.；Ulens,C.；Buttner,R.；Fish,A.；van Elk,R.；Kendel,Y.；Hopping,G.；Alewood,P.F.；Schroeder,C.；Nicke,A.；Smit,A.B.；Sixma,T.K.；Lewis,R.J.AChBP-targeted alpha-conotoxin correlates distinct binding orientations with nAChR subtypeselectivity.EMBO J.2007,26,3858-3867.，通过同源建模，构建了TxIE与4个nAChRs亚型(α3β2,α3β4,α6β2和α6β4)的α/β交界面结合位点的相互作用分子对接模型(图10A-10H)，并使用100ns分子动力学模拟对其进行完善。RMSD用于评估分子对接模拟结构的稳定性，在20-60ns内，TxIE与α3*和α6*nAChRs相互结合的RMSD大小波动均保持在范围内，四个分子对接模型的Molprobity得分在1.44和1.68之间(Molprobity得分<2.0表明是高质量的结构)。
TxIE与上述4个亚型的相互作用，均发生在α/β交界面结合位点口袋中，4个配体-受体相互结合的模式相似(图10A-10H)。这些分子对接模型，与α-芋螺毒素和AChBP的相互结合产生的复合物晶体结构相似。所建分子对接模型的正构结合位点整体是带负电的，但在结合位点的外侧可以看到电位差。TxIE对α6β2和α6β4 nAChRs有阻断作用，但对α3β2和α3β4 nAChRs无明显活性。这表明由于空间排阻或强静电排斥作用，含α3亚基的受体，包括α3β2和α3β4 nAChRs，其结合位点与TxIE不相容。相比之下，α3和α6这两个亚基的第154位氨基酸不同，分别被α3亚基带正电荷的Lys(K)和α6亚基带负电荷的Glu(E)残基占据。第154位的不同电荷,有助于改变结合位点的外侧静电势，还会影响TxIE与Lys(K)-11的带电荷侧链基团附近的静电势。因此，TxIE的Lys-11和受体α3亚基的第154位氨基酸之间的静电排斥作用，是区分含α3和含α6的nAChRs亚型的关键。该分子对接模型还可以解释TxIE中的第一个氨基酸Gly(G1)，被谷氨酸Glu取代后，其活性下降的原因。G1是TxIE的N-末端残基，在分子模型中位于带负电荷的环境中(图10A-10H)。因此，本发明人观察到的突变体Peptide 5-7(SEQ ID NOs：5-7)的活性下降，推测是由于G1被负电荷的Glu取代后，负电荷相互排斥导致的。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> α-芋螺毒素肽TxIE、其药物组合物及用途
<130> IDC200092
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TxIE
<400> 1
Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Met Cys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [M15A]TxIE
<400> 2
Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Ala Cys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [M15I]TxIE
<400> 3
Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Ile Cys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [M15L]TxIE
<400> 4
Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Leu Cys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [G1E,M15A]TxIE
<400> 5
Glu Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Ala Cys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [G1E,M15I]TxIE
<400> 6
Glu Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Ile Cys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> [G1E,M15L]TxIE
<400> 7
Glu Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Leu Cys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TxIE芋螺毒素前肽
<400> 8
Val Val Leu Gly Pro Ala Ser Asp Gly Arg Lys Ala Ala Val Ser Asp
1 5 10 15
Leu Ile Thr Leu Thr Ile Lys Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile
20 25 30
Ala Lys Asn Pro His Met Cys Gly Gly Arg Arg
35 40
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 突变体
<400> 9
Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Met Cys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 突变体
<400> 10
Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ile Ala Lys Asn Pro His Met Cys
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 11
gtggttctgg gtccagca 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 12
gtcgtggttc agagggtc 18
<210> 13
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TxIE前体基因
<400> 13
gtggttctgg gtccagcatc tgatggcagg aaagctgcag tgtctgacct gatcactctg 60
accatcaagg gatgctgttc taatcctccc tgtatcgcga agaatccaca catgtgtggt 120
ggaagacgct ga 132
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