一株铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株及其应用
阅读说明：本技术 一株铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株及其应用 (Iron reducing bacterium Tessaracococcus oleiagri DH10 strain and application thereof ) 是由 佘跃惠 董浩 孙姗姗 张凡 苏三宝 张涵 翁雪 喻高明 郑安应 李杨 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一株铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株及其应用,所述Tessaracoccus oleiagri DH10菌株已于2021年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为：CCTCC NO：M 2021404。本发明从油藏环境中分离筛选得到了一株可高效还原Fe(III)的铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10,扫描电镜分析等表明其可有效分解贫铁蒙脱石矿物,并抑制黏土膨胀；同时岩心实验表明,Tessaracoccus oleiagri DH10生物制剂可降低储层岩心水敏性,降低注水压力,可将其应用于原油采收中,有效提高原油采收率。(The invention discloses an iron reducing bacterium Tessaracoccus oleiagri DH10 strain and application thereof, wherein the Tessaracoccus oleiagri DH10 strain is deposited in China center for type culture Collection at 04-19.2021, and the deposit numbers are as follows: CCTCC NO: m2021404. The invention separates and screens an iron reducing bacterium Tessaracococcus oleiagri DH10 which can efficiently reduce Fe (III) from an oil reservoir environment, and scanning electron microscope analysis and the like show that the iron reducing bacterium Tessaracococcus oleiagri DH10 can effectively decompose lean iron montmorillonite minerals and inhibit clay swelling; meanwhile, core experiments show that the Tessaracoccus oleiagri DH10 biological agent can reduce the water sensitivity of the reservoir core and reduce the water injection pressure, and can be applied to crude oil recovery to effectively improve the crude oil recovery rate.)
技术领域
本发明属于微生物采油
技术领域
，具体涉及一株铁还原菌Tessaracoccusoleiagri DH10菌株及其应用。背景技术
随着石油工业的发展，我国常规油气资源越来越少，而社会油气资源的需求量却越来越高，这一矛盾导致当下我国石油供给对外依存度持续维持高位，能源安全受到威胁。低渗透油藏和水敏性油藏等油气资源在接下来的很长时间里，都将是增加石油产量的突破点，同时也必将是重点研究领域。众所周知，水敏性粘土矿物是制约低渗透油藏和水敏性油藏开发水平的主要因素之一，所以稳定水敏性粘土矿物是提高低渗透油藏和水敏性油藏开发水平的关键点。低渗透油藏和水敏性油藏通常粘土矿物含量较高。粘土含量决定储层渗透率，粘土含量即使发生很小的变化，也会引起渗透率很大改变，当泥质含量达到35％-40％时，储层几乎不渗透，粘土矿物含量越高、粘土膨胀率越高和阳离子交换能力越强，储层水敏性越强，粘土矿物类型会影响油藏的渗流特性。膨胀性粘土是影响低渗透油藏渗透率的关键因素，膨润土膨胀会减少渗透率。
Fe(Ⅲ)还原功能微生物通常是指具有异化还原Fe(Ⅲ)为Fe(II)的功能微生物，是一类可以利用有机物作为电子供体的特殊微生物群体，在氧化有机物的同时，以Fe3+作为唯一的电子受体使Fe(Ⅲ)还原为Fe(II)，并在还原和代谢过程中获得自身生生长所需能量。铁还原微生物的代谢产物可以改变矿物表面的物理化学环境，是矿物分解的主要动力。微生物分解矿物速率比单一化学分解作用要高出几个数量级，如Kim等人2004年发表在Science杂志的研究发现，一株异化铁还原菌Shewanella oneidensis MR-1能在两周的时间内将富铁蒙脱石中的三价铁还原，并促进蒙脱石向伊利石转化。2002年Daniel等首次发现嗜热厌氧产甲烷菌也能够还原粘土矿物结构中的三价铁，导致粘土矿物发生相变作用。这些发现打破了长期以来人们对蒙脱石发生伊利石转化过程受温度压力和时间控制的认识，突破了粘土矿物之间转化作用时间尺度较大的局限。因此，利用油藏铁还原微生物，抑制粘土水化膨胀或者缩膨，改善原油流体渗流环境，对于油藏提高原油采收率具有重要意义。
在进行微生物采油过程中，不同的油藏对菌种也有一定的要求，目前报道的产铁还原菌很多，但分离自油藏的铁还原菌非常少，而目前关于分离自油藏环境的Tessaracoccus属微生物Tessaracoccus oleiagri功能特征及其在石油开采和抑制黏土膨胀中的应用还未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一株铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株，所述菌株分离自分离自油藏环境，已于2021年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，所述Tessaracoccus oleiagri DH10菌株的保藏编号为：CCTCC NO：M 2021404。
本发明的目的之二在于提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂中包含上述铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株。
进一步地，所述微生物制剂为固体制剂或液体制剂。
本发明的目的之三在于提供了一种生物缩膨菌剂，所述生物缩膨菌剂中包含：营养培养基，以及上述铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株或上述微生物制剂。
进一步地，所述生物缩膨菌剂中的营养培养基为LB培养基或包含：蔗糖10-50g/L，乙酸钠10-40g/L，乳酸钠3-20g/L，MgSO4 0.1-2g/L，KCl 2-18g/L，MnSO4 5-9g/L，CuSO4 5-10g/L，ZnSO4 5-12g/L，KH2PO4 1-7g/L，蒙脱石2-10g/L，pH 5.0-9.0的培养基。
进一步地，将所述铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株或所述微生物制剂接种于营养培养基中，于pH 5-9.5，温度20-60℃条件下发酵，得到所述生物缩膨菌剂。
本发明的目的之四在于提供了所述铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在还原Fe(III)中的应用。
本发明的目的之五在于提供了所述铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在抑制黏土膨胀中的应用。
本发明的目的之六在于提供了所述铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在降低低渗透储层注入压力中的应用。
本发明的目的之七在于提供了所述铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株，或所述微生物制剂，或所述生物缩膨菌剂在提高原油采收率中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从油藏环境中分离筛选得到了一株可还原Fe3+的铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10，扫描电镜和XRD等分析等表明所述Tessaracoccus oleiagri DH10菌株可有效分解腐蚀蒙脱石矿物，将其中的Fe3+还原为Fe2+，并有效抑制黏土膨胀；同时岩心实验表明，Tessaracoccus oleiagri DH10生物制剂可降低石油开发中的注水压力，将所述Tessaracoccus oleiagri DH10菌株应用于原油采收中，可有效提高原油的采收率。
附图说明
图1为本发明实施例1中DH10菌株接种入Fe(OH)3前后培养基的颜色变化；
图2为本发明实施例2中接种DH10菌株后，与空白对照组相比，蒙脱石中Fe2+浓度随时间的变化；
图3为本发明实施例2中DH10菌株作用前后蒙脱石样品的扫描电镜图，其中图3-A为蒙脱石原始样品，图3-B为菌株DH10作用7天后蒙脱石样品。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 铁还原菌的分离鉴定
1、铁还原菌的分离
本发明提供了一株分离自油藏环境的铁还原菌，其筛选方法为：按照常规的菌株筛选方法，取10mL从油田采集的水样，接入盛有100mL Fe(OH)3(0.5％Fe(OH)3，w:v)的厌氧瓶中，35℃静置厌氧培养1周，选取固相颜色变深明显的实验组，在厌氧操作站中，无氧条件下取100μL发酵液涂布于LB琼脂平板培养基，35℃厌氧培养48h；挑取不同形态单菌落，在LB琼脂平板培养基上划线纯化，35℃，培养48h。挑取单菌落经过富集培养接种入Fe(OH)3培养基中，35℃，静置厌氧培养72h，选取固相颜色明显变深的实验组所对应的菌株。本实施例通过初步筛选，发现样品中有能够使固相颜色明显变深的微生物(菌培养前后固相颜色变化如图1所示)，说明筛选得到的微生物能够还原Fe(III)。
本实施例中，通过初步筛选能够以Fe(III)为唯一电子受体进行代谢活动的微生物，进一步经培养、驯化，分离得到1株能够还原Fe(III)的菌株，将其命名为DH10。通过分光光度法对样品中的Fe(III)和Fe(II)浓度进行测定，结果显示，DH10菌株在4天内对培养基中Fe(III)的还原效率可达35.3％。
2、分子生物学鉴定
按照常规菌种的16S rRNA鉴定方法，提取菌株DH10的基因组DNA，设计相应引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送至南京派森诺基因科技有限公司进行DNA测序。DH10的PCR扩增产物测序结果提交NCBI用BLAST进行检索和同源性比较，确定菌株DH10为Tessaracoccus oleiagri(与Tessaracoccus oleiagriola strain SL014B-20A11的相似度为99.72％)。所述DH10菌株的16S rRNA序列与Genbank数据库序列比对结果如表1所示。
表1 DH10的16S rRNA序列与Genbank数据库序列比对结果
本发明的菌株DH10可以采用如下保存方法：
(1)短期保存：将上述菌株于斜面培养基上划线，于35℃培养48h后，置于4℃条件下短期保存。
(2)长期保存：采用甘油冷冻保存法，即从新鲜的斜面培养基上刮取几环菌，转入到已装有1.5mL 30％灭菌甘油的甘油管中，-70℃冷冻保存。
或采用脱脂牛奶冷冻保存法，即从新鲜的斜面培养基上刮取几环菌，转入到已装有灭菌脱脂牛奶的甘油管中，-70℃冷冻保存。
本发明所筛选到的Tessaracoccus oleiagri DH10菌株已于2021年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M 2021404。
实施例2 DH10菌株对蒙脱石的分解
1、菌种
实施例1中筛选得到的Tessaracoccus oleiagri DH10菌株。
2、培养基
培养基的组成为：蔗糖10-50g/L，乙酸钠10-40g/L，乳酸钠3-20g/L，MgSO40.1-2g/L，KCl 2-18g/L，MnSO4 5-9g/L，CuSO4 5-10g/L，ZnSO4 5-12g/L，KH2PO4 1-7g/L，蒙脱石2-10g/L，pH 5.0-9.0。培养基配制完成后于0.1MPa下灭菌30min。
3、发酵培养
将斜面保藏菌株用接种环于平板划线活化，于35℃恒温培养20h，然后从平板上挑取三环(每接种环菌种包含3个以上特征明显的单菌落)菌种接入摇瓶(50mL三角瓶，装液量为30mL)，于35℃，180r/min培养8h，离心收集菌体，无菌水清洗3次后重悬，接入到蒙脱石培养基中，35℃下厌氧培养，
4、微生物对黏土矿物中Fe(III)的还原
Fe(Ⅱ)含量测试方法使用邻菲罗啉分光光度法，具体操作参照《HJ/T345-2007铁的测定邻菲罗啉分光光度法》，接入所述Tessaracoccus oleiagri DH10菌株后，按照标准中方法测定样品中总Fe的含量，培养后每隔一段时间取抽提液5mL，使用亚铁含量测定标准曲线计算Fe(Ⅱ)含量，计算样品中Fe(III)还原效率。接种所述Tessaracoccus oleiagriDH10菌株后，与空白对照组相比，蒙脱石中Fe2+浓度随时间的变化如图2所示。结果显示，所述Tessaracoccus oleiagri DH10可实现蒙脱石中Fe(III)的高效还原，还原效率为41.9％。
5、微生物作用前后黏土矿物的微观形貌观察
利用扫描电镜观察所述Tessaracoccus oleiagri DH10作用前后的粘土矿物结构、形貌及矿物学上的变化。
样品制备方法如下：(1)取1mL对数期菌液于1.5mL EP管中，13400r/min，5min，4℃离心，弃上清；(2)用1mL pH 7.4的PBS洗涤，13400r/min，5min，4℃离心，弃上清，重复3次；(3)将沉淀放置于干净的载玻片上，以浓度为2％多聚甲醛-2.5％的戊二醛为固定液对样品固定1h；(4)使用不同浓度的乙醇对样品进行脱水处理，使用乙醇浓度为25％、50％、75％、95％、100％，每种浓度各两次，每次脱水15-20min；(5)脱水处理完毕后，放入真空冷冻干燥机中处理24h；(6)干燥好的样品在真空中喷金；(7)用扫描电镜观察，得到不同放大倍数下微生物作用前后蒙脱石的微观形貌。
扫描电镜观察结果如图3所示，其中图3-A为蒙脱石原始样品，图3-B为菌株DH10作用7天后的蒙脱石样品。结果显示，蒙脱石的原始样品为较紧致的实心颗粒聚集在一起，而Tessaracoccus oleiagri DH10菌株作用7天后，蒙脱石样品呈松散的网状结构，即蒙脱石样品经Tessaracoccus oleiagri DH10菌株作用后出现明显的溶蚀现象。
实施例3 防膨率测定
在实施例2的基础上，参考标准粘土稳定剂中的粘土防膨胀率的测定方法，对Fe(III)还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10菌株作用前后蒙脱石矿物膨胀性能进行了测定。实验步骤具体为：首先称取0.1g烘干后的对照组蒙脱石样品装入2.0mL离心管中，记录下样品在离心管中膨胀前的体积V0；然后加入1.5mL的膨胀介质溶液(分别以蒸馏水和煤油作为膨胀介质溶液)充分摇匀；在常温下放置24h，放入离心机中，在转速为5000转/分的条件下离心15分钟，读出样品膨胀后的体积V1。重复上述步骤对实验组的蒙脱石样品进行膨胀体积测定，其膨胀前后体积分别记为V2和V3。计算蒙脱石样品抑膨率的公式如下：
式(1)中：η为防膨率，％；V0为对照组干燥蒙脱石样品的体积，mL；V1为对照组蒙脱石在膨胀介质中的膨胀体积，mL；V2为微生物作用后干燥蒙脱石的体积，mL；V3为微生物作用后蒙脱石在膨胀介质中的膨胀体积，mL。
实验结果表明，Tessaracoccus oleiagri DH10菌株具有较好的抑制粘土矿物水化膨胀的作用，其中在水体系中的抑制膨胀率为50.61％，在煤油体系中的抑制膨胀率为87.63％。即本发明所述Tessaracoccus oleiagri DH10菌株具有较好的抑制黏土膨胀的作用。
实施例4 铁还原菌DH10菌株降低储层注入压力
首先使用地层水测试低渗透储层的渗透率，然后注入菌株DH10细胞悬液，培养2周；接着再用地层水测试该低渗透储层的渗透率，从而评价异化铁还原菌DH10对低渗透储层注入压力的影响。具体操作步骤如下：
1、岩心烘烤、称重，然后置入岩心夹持器、加环压、抽真空；
2、注入地层水，流速0.50mL/min，注入体积15PV，记录稳定时期岩心夹持器进口、出口的压差；
3、注入菌株DH10细胞悬浮液，流速0.30mL/min，注入体积2PV，然后关闭进口、出口，55℃培养2周；
4、接着注入地层水，流速0.50mL/min，注入体积15PV，记录稳定时期岩心夹持器进口、出口的压差。
菌株DH10降低低渗透储层注入压力评价的岩心参数如表2所示，测定结果如表3所示。
表2 铁还原菌DH10降低储层注入压力评价岩心参数
表3 铁还原菌DH10降低储层注入压力评价结果
结果显示，对于渗透率<10mD的岩心MD2，使用地层水驱替时压差为0.305MPa；使用铁还原菌DH10作用后，压差降低至0.239MPa，注入压差降低了21.64％，表明铁还原菌DH10能显著降低低渗透储层的注入压力。
实施例5 铁还原菌DH10菌株提高原油采收率
使用岩心模拟实验评价DH10菌株提高原油采收率的效果，具体步骤如下：
1、岩心预处理、驱替装置连接；
2、饱和地层水，流速0.50mL/min，注入体积15PV；
3、饱和原油，流速0.50mL/min，观察出口，直到没有地层水产出为止，由流出水的体积计算岩心原始含油量，55℃下老化72h；
4、地层水一次水驱，流速0.50mL/min，水驱至岩心出口含水98％为止，计量产出油的体积，此为一次水驱采出油体积。
5、对照组注入添加15mM乙酸钠的地层水，实验组注入DH10细胞悬浮液；流速0.30mL/min，注入体积2PV，然后关闭进口、出口，55℃培养2周；
6、接着用地层水驱替，流速0.50mL/min，水驱至岩心出口含水100％为止，计量产出油的体积，此为二次水驱采出油体积。
铁还原菌DH10提高原油采收率评价的岩心参数如表4所示，评价结果如表5所示。
表4 铁还原菌DH10提高原油采收率评价岩心参数
表5 铁还原菌DH10提高原油采收率评价结果
结果显示，使用渗透率70-100mD的岩心，一次水驱岩心ER0、ER1和ER2的采收率分别为48.57％、46.38％和44.44％；使用铁还原菌富集物DH10处理后，二次水驱采收率分别为0.71％、6.52％和5.56％；相比对照组ER0，实验组ER1和ER2的采收率分别提高了5.81％和4.84％，平均值为5.32％。
综上所述，本发明分离筛选得到了一株铁还原菌Tessaracoccus oleiagri DH10，其可有效分解腐蚀蒙脱石矿物，抑制黏土膨胀；同时岩心实验表明，Tessaracoccusoleiagri DH10可降低石油开发中的注水压力，将其应用于原油采收中，显著提高了原油的采收率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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