具有免疫调节功能的CpG ODN及其应用
阅读说明：本技术 具有免疫调节功能的CpG ODN及其应用 (CpG ODN with immunoregulation function and application thereof ) 是由 王立公 邵彦 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种免疫调节CpG ODN及其应用。所述CpG ODN具有良好的免疫刺激活性,可以刺激B细胞增殖,同时产生特异性细胞因子。可以作为疫苗佐剂既单独使用也可与其它佐剂联合发挥协同作用,同时也可以应用在制备预防或治疗肿瘤、感染、过敏的药物中。(The invention relates to an immunoregulation CpG ODN and application thereof. The CpG ODN has good immune stimulation activity, can stimulate B cell proliferation and simultaneously produce specific cytokines. Can be used as vaccine adjuvant, can be used alone or combined with other adjuvants to exert synergistic effect, and can also be used in preparation of medicine for preventing or treating tumor, infection and allergy.)
技术领域
本发明涉及一种免疫调节性CpG ODN及其组合物。所述CpG ODN具有良好的免疫刺激活性，可以刺激B细胞增殖，并产生细胞因子，可以作为疫苗佐剂既单独使用也可与其它佐剂联合发挥协同作用，同时也可以应用在制备预防或治疗肿瘤、感染、过敏的药物中。
背景技术
1984年，研究发现卡介苗(BCG)中的核酸组分在小鼠荷瘤模型中具有抗肿瘤作用，并且成功的将其应用于人类肿瘤的治疗(Tokunaga T，Yamamoto H，Shimada S，etal.Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from mycobacteriumbovis BCG.I.Isolation，physicochemical characterization，and antitumoractivity.J Natl Cancer Inst，1984，72(4)：955-962)。后用核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶降解分析，证明真正起作用的是菌体中脱氧核糖核酸(Tokunaga T，Yamamoto S，NambaK.A synthetic single stranded DNA，Poli(dG，dC)，induces interferon-alpha/betaand gamma，aμgments natural killer activity，and suppresses tumor growth.Jpn JCancer Res，1988，79(6)：682-686；Tokunaga T，Yano O，Kuramoto E，et a1.Syntheticoligonucleotides with particular base sequences from the cDNA encodingproteins of mycobacterium bovis BCG induce interferon and activate naturalkiller cells.Microbiol Immunol，1992，36(1)：55-66)。序列分析显示，凡具有免疫活性的寡脱氧核苷酸(ODN)序列中至少含有一个或多个CG二核苷酸，因为CG之间是以磷(p)相连的，所以把这种寡脱氧核苷酸序列统称为CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，也有称其为免疫激活序列(ISS)。
CpG ODN的免疫刺激活性受自身结构特征影响。在细菌等病原微生物基因组中，含有较多CG二核苷酸，而在人类和脊椎动物基因组中，却很少出现CG二核苷酸，且即便出现，其中的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸通常都是非甲基化的。CpG二核苷酸的缺失、逆转以及胞嘧啶的甲基化均可导致其活性丧失，说明CpG ODN中非甲基化的CpG二核苷酸的存在是其免疫刺激活性的基础(凌世淦.免疫活性寡脱氧核苷酸CpG的研究进展[J].中华微生物学和免疫学杂志，2008，28(6)：571-576)。因为CpG ODN是多个脱氧核苷酸有规律的排列，其组合形式多样。而不同序列结构特征的CpG ODN免疫活性差别非常大，改变序列中的某一个或某几个核苷酸都可能会极大地影响其免疫活性。因此了解并掌握其构效关系将有助于我们设计出更多具有免疫活性的序列。
具有刺激小鼠B淋巴细胞活性的CpG ODN其碱基序列大多有一定规律：CpG二核苷酸近5’端两碱基一般为嘌呤，以GpA更佳，近3’两碱基一般为嘧啶，以TpC或TpT为佳(KriegAM，YiAK，Matson S，et a1.CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation[J].Nature，1995，374(6522)：546-549)。CpG二核苷酸近5’端若为C或G可明显抑制ODN刺激小鼠NK淋巴细胞的活性，而近3’端为C时对活性影响不大。可见，5’端为GA的GACGTT/C是对小鼠作用较强的CpG基序，而改为GC或GG后形成了GCCGTT/C或GGCCTT/C基序后，其免疫活性降低。人外周血单核细胞可被含有“GTCGTT”，“TTCGTT”，或“AACGTT”基序激活，作用最强的基序是GTCGTT(Ballas ZK，Rasmussen W L，Krieg AM.Induction of NKactivity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides andbacterial DNA[J].J Immunol，1996，157(5)：1840-1845)。多个TCG重复序列有助于增强CpG ODN对人B细胞和NK细胞的刺激作用(Hartmann G，Krieg AM.Mechanism and functionof a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells[J].J Immunol，2000，164(2)：944-953)。含多个TCG重复序列的T7和T8，对人PBMC也具有良好的免疫刺激活性。多个TCG重复序列即形成GTCGTC基序，说明CpG二核苷酸3’端为TpC时形成的GTCGTC基序同样对人具有较强的免疫刺激活性(许洪林，王四清，王世峰.两种CpG基序能高度活化人免疫细胞[J].中华微生物学和免疫学杂志，2001，21(5)：471-475)。CpG ODN序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元，且长度为15-35个核苷酸，N不代表A或G。该类CpGODN在体外对人和小鼠免疫细胞均有良好的免疫刺激活性(许洪林.具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用，CN101492672A)。对CpG ODN的核心序列为一个6-核苷酸基序，通式为：5’-X1-X2-CG-Y1-Y2-3’，其中X1为嘌呤碱核苷酸(purine)，X2也为purine或为胸腺嘧啶(T)，Y1、Y2均为嘧啶碱(pyrimidines)。另外，除了这6-核苷酸基序外，周边序列及多个CpG间的序列也对CpG ODN的活性有影响(Krieg AM，Hartmann G，Yi AK.Mechanismofaction ofCpG DNA.Curt Top Microbiol，2000.247(1)：1-21)。还有研究发现CpG两个侧翼紧邻的碱基排列大多遵循以下规律：5’PurPurCGPyrPyr3’，即5’端为两个嘌呤，3’端为两个嘧啶(G.Mutwiri，R.Pontarollo，S.BaBIUK.Bological activity ofimmunostimulatory CpG ODN motif in domestic animals.VeterinaryImmunopathology，2003，91：89-103)。
TLR 9是Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)家族成员之一，主要识别细菌DNA的CpG基序。CpG ODN能以TLR 9依赖的方式刺激机体先天免疫应答。病毒和细菌基因组中的CpG ODN是TLR9的天然激动剂，所以一旦细胞感染或摄取细菌，TLR 9就会启动Th1型优势免疫应答(AHLERS J D，BELYAKOV I M.Memories that last forever：Strategies foroptimizing vaccine T-cell memory[J]Blood，2010，115(9)；1678-1689)。
CpG ODN不仅能够刺激表达TLR 9分子的细胞，引发免疫调节级联反应，最终产生促炎细胞因子和趋化因子，还能改善树突细胞、单核细胞和巨噬细胞的抗原呈递功能，诱导B细胞的增殖，刺激NK细胞的免疫保护活性，诱导机体内免疫应答反应，是一种高效低毒的免疫佐剂，在治疗疾病中有着强大应用价值(SUN S Q，ZHANG X H，TOMGH D F.Type Iinterferon-mediated stimulation of T cells by CpG DNA[J]J.Exp Med，1998，188(12)：2335-2342)。
CpG ODN的疫苗佐剂活性已经在大量预防性和治疗性疫苗的动物实验中得到验证。在小鼠动物模型中，CpG ODN与乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、布氏菌、衣原体、HIV、曲霉、分枝杆菌、锥虫、粘液囊病病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、狂犬病毒、流感病毒等各种疫苗联用。自2000年以来，已有20种以上CpG ODN佐剂疫苗陆续进入临床研究。(KRIEG AM.Therapeutic potential of Toll-like receptor 9activation[J].NatRev Drμg Discov，2006，5(6)：471-484；Dennis M Klinman.CpG DNA as a vaccineadjuvant[J].Expert Rev Vaccines，2003，2(2)：305-315；KRIEG AM.CpG still rocks！Update on an accidental drμg[J].Nucleic Acid Ther.2012，22(2)：77-89)。B型CpGODN是实验的主要研究对象，其作为疫苗佐剂用于防治感染性疾病的研究，其中Dynavax的HEPLISAV-B乙肝疫苗已经与2017年11月FDA批准上市。
CpG ODN对病毒的抑制作用，已在对呼吸道合胞病毒、肝炎病毒、艾滋病病毒等的实验中得到证实(Liu S，Sun w，Cao Y.Study on anti-H BV effects by antisenseoligodeoxynucleotides in vitro.China Journal of Preventive Medicine，2001，35(5)，338-340；Lund OS，Hansen JE.Inhibition of HIV-lreplication by chimericphosphorothioate oligodeoxynucleotides applied in freesolution.Intervirology，1998，41(2-3)，63-68)。
CpG ODN在许多小鼠模型中具有抗肿瘤活性，在肿瘤相对比较小的情况下，CpGODN单独使用就能有效的诱导T细胞介导的肿瘤排斥反应。但对于瘤体较大的肿瘤，需结合其它治疗方法，如单克隆抗体、放疗、手术及化疗等，会产生很强的协同作用，其中CpG ODN介导的肿瘤消退可以是T细胞依赖性、NK细胞非依赖性的，或NK细胞依赖性、T细胞非依赖性的。作为黑色素瘤多肽抗原疫苗的佐剂，CpG7909能够明显改善肿瘤患者的生存状态，并且能诱导较强烈的黑色素瘤蛋白抗原特异的CD8+T细胞反应(van Ojik，H.et al PhaseI/IIstudy with CPG 7909 as adjuvant to vaccination with MAGA-3Protein in Patientswith MAGA-3 Positive tumors.Ann Oncol 2002，13，157；Speiser，D.E.et al.Rapid andstrong human CD8(+)T cell responses to vaccination with peptide，IFA，and CPGoligodeoxynueleotide7909.JClin Invest，2005，115，739-746)。
CpG ODN单独应用或联合抗肿瘤抗体都能诱导Thl型细胞因子分泌，增强ADCC作用(Hartmann，E.et al.Identification and functional analysis of tumor-infiltrating plasmacytoid dendritic cells in head and neck cancer.Cancer Res2003：63，6478-6487)。B型1018ISS与利妥昔单抗合用治疗非何杰金氏淋巴瘤疗效很好，已经进入临床试验(Friedberg，J.W.et al.Combination immunotherapy with a CPGoligonueleotide(1018ISS)and rituximab in Patients with non-Hodgkin lymphoma：inereased interferon-α/β-inducible gene expression，without significanttoxicity.Blood 2005∶105，489-495)。
在临床试验中，在一些复发性胶质母细胞瘤患者肿瘤周围注射CpG ODN后放射治疗，癌细胞的增殖与转移均受到一定程度上的抑制(Senti G，Johansen P，Haμg S，etal.Use of A-type CpG oligodeoxynucleotides as an adjuvant in allergen-specific immunotherapy in humans：a phase I/IIa clinical trial[J].ClinicExperim Allergy，2009，39(4)：562-570；Carpentier A，Laigle-Donadey F，Zohar S，etal.Phase 1trial of a CpG oligodeoxynucleotide for patients with recurrentglioblastoma[J].Neuro-Oncol，2006，8(1)：60-66.)。另有临床试验结果显示，瘤内注射CpG 7909实现了黑色素肿瘤的完全消退，但有5例转移性黑色素瘤患者的远处部位的肿瘤未能阻止(Pashenkov M，Goess G，Wagner C，et al.Phase II trial of a toll-likereceptor 9-activating oligonucleotide in patients with metastatic melanoma[J].Clinical Oncol Offficial J American Society Clinic Oncol，2006.24(36)：5716-5724)。CpG7909的两个临床三期试验的数据显示与单独化疗相比其未能改善临床结果。本领域仍然需要继续发现新的免疫调节性多核苷酸。
CpG ODN是一种高效低毒的免疫佐剂，在治疗感染性疾病、免疫缺陷性疾病、肿瘤、过敏性疾病中有着强大的潜在应用价值。但是目前实际应用有限，还需要进行更多更深入的研究，设计出更多更有效的序列结构，使其能够更广泛的发挥其潜能，更安全、高效地应用于临床。
发明内容
本发明提供一系列具有免疫调节功能的CpG ODN。这些CpG ODN的结构新颖，更为难得的是对小鼠和人都有免疫刺激作用，因此在临床上有很大的应用价值。具体而言，本发明通过以下技术方案解决了本领域中存在的问题：
1.一种免疫调节性CpG ODN，其包含或组成为选自SEQ ID NO：1-6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列中至少一个核苷酸为具有通式I所示的结构的化学修饰的核苷酸：
其中，Y为S或O，R为H或带正电的抗衡离子，B独立地为未修饰或经修饰的核碱基，R1为H、F、Cl、OH、OMe、Me、O-乙基氧甲基。
2.如项目1所述的免疫调节性CpG ODN，其中Y为S。
3.如项目1或2所述的免疫调节性CpG ODN，其中所述CpG ODN的核苷酸序列的全部核苷酸均为具有通式I所示的结构的化学修饰的核苷酸。
4.如项目3所述的免疫调节性CpG ODN，其序列为：SEQ ID NO：3，优选地，为全部硫代磷酸酯化的SEQ ID NO：3。
5.一种药物组合物，其包含项目1～4任意一项所述的免疫调节性CpG ODN和药学上可接受的载体。
6.项目1～4任意一项所述的免疫调节性CpG ODN在制备疫苗佐剂中的用途，优选地，所述疫苗为狂犬病疫苗，优选地，所述CpG ODN的量为0.01μg-1000μg/ml，更优选为1-10μg，例如，1、3、或10μg。
7.项目6所述的用途，其中所述疫苗佐剂还包含一种或多种与所述免疫调节性CpGODN共同发挥作用的其他佐剂，例如不溶性铝盐类胶体、油水乳剂、微生物及代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、免疫刺激复合物、蜂胶、和脂质体。
8.项目1～4任意一项所述的免疫调节性CpG ODN或项目5的药物组合物在制备预防或治疗受试者的肿瘤、微生物感染或过敏的药物中的用途。
9.项目7所述的用途，其中所述受试者为人或动物，例如小鼠、大鼠，家畜，如狗、猪、牛、马；家禽，如鸡、鸭、鹅。
附图说明
图1显示了CpG ODN对小鼠脾脏T、B细胞增殖的作用。
图2显示了CpG ODN刺激小鼠脾细胞产生细胞因子IFN-α作用。
图3显示了CpG ODN刺激小鼠脾细胞产生细胞因子IL-6作用。
图4显示了CpG ODN刺激小鼠脾细胞产生细胞因子TNF-α作用。
图5显示了CpG ODN对人PBMCs T、B细胞增殖的作用。
图6显示了CpG ODN刺激人PBMCs IFN-α分泌作用。
图7显示了CpG ODN刺激人PBMCs IL-6分泌作用。
图8显示了CpG ODN刺激人PBMCs TNF-α分泌作用。
图9显示了CpG刺激HEK-Blue hTLR9细胞检测结果。
图10显示了CpG刺激HEK-Blue mTLR9细胞检测结果。
图11显示了CpG刺激Ramos-Blue细胞检测结果。
图12显示了ODN3对狂犬病毒中和抗体滴度影响。
图13显示了不同剂量的ODN3与狂犬疫苗组合的免疫增效作用。
图14显示了不同剂量狂犬疫苗与ODN3组合的免疫增效作用。
图15显示了不同CpG ODN与狂犬疫苗组合对狂犬病毒中和抗体滴度影响。
术语释义
CpG ODN
本发明中所述的CpG ODN是由磷酸二酯键连接成的非甲基化的二核苷酸，具有免疫刺激作用。CpG ODN能促进B细胞增殖分化并分泌IL-6，从而诱导抗体的分泌；激活单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等提呈细胞分泌多种细胞因子(例如，IL-12，IL-6，TNF-α，IFN-α和IFN-β等)。通过细胞因子间接促进杀伤性T细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，诱导细胞内病原体产生细胞免疫，并诱导NK细胞和T细胞分泌IFN-γ。除了诱导天然免疫反应之外，CpG ODN还可以增强抗原特异性反应，这是由于(1)通过B细胞抗原受体引发的信号传导途径和通过CpG引发的B细胞信号传导途径之间存在强烈的协同作用；(2)能够增加抗原特异性的T辅助的Thl样细胞因子，从而增强了B细胞和T细胞的抗原特异型反应，以及(3)细胞反应需要有共刺激分子的正调控。
早在19世纪90年代，人们就发现给癌症患者注射细菌提取物能明显减轻病情，后来研究表明，细菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗肿瘤作用。通过合成的寡聚脱氧核苷酸进行实验研究，发现细菌DNA的免疫刺激作用和其中的非甲基化CpG二核苷酸有关。
具有免疫刺激活性的CpG ODN的基本结构特点如下：
a.CpG基序是CpG ODN产生免疫刺激作用的基本结构，其由CpG二核苷酸及其5’端和3’端的各两个碱基构成。
b.CpG两侧的嘌呤和嘧啶以及CpG的间隔都会影响CpG ODN的免疫刺激活性及其作用特点。
c.ODN所含CpG基序的数目，通常含有2-4个CpG基序是最佳的，CpG基序间的间隔，通常至少要间隔两个碱基，而且最好是胸腺嘧啶。
d.含有poly-G序列(3个或以上鸟嘌呤组成)的CpG ODN具有较强的刺激浆细胞样树突细胞(pDC)产生干扰素-α的作用；全部硫代修饰的CpG ODN最稳定，且对B细胞的刺激作用最佳，但全部硫代修饰的CpG ODN刺激pDC产生IFN-α的作用却不及部分硫代修饰的CpGODN。
基于功能特征，CpG ODN可分为三种类型(Tomoki Ito，et al.，Blood，2006，Vol107，Num6：2423-2431)：
(1)A型CpG ODN，通过嵌合骨架合成，其中骨架的5’和3’末端是硫代磷酸酯，中间CpG区域是磷酸二酯，这些ODN能很好地激活天然杀伤细胞(NK细胞)和浆细胞样树突细胞(pDC细胞)使其大量产生IFN-α，但只能有限地激活B细胞；
(2)B型CpG ODN，通过可抵抗核酸酶的硫代磷酸酯骨架合成，很好地激活B细胞和pDC细胞，使其产生IL-12并诱导抗体分泌，但是只能有限地激活NK细胞，通常B型CpG ODN可有效作为疫苗佐剂；以及
(3)C型CpG ODN，通过硫代磷酸酯骨架合成，具有介于A型和B型CpG ODN之间的刺激活性，例如，很好地激活B细胞，也能很好地激活NK细胞和pDC细胞。
本发明使用的免疫调节性CpG ODN包含或组成为选自SEQ ID NO：1-6的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列中至少一个核苷酸为具有通式I所示的结构的化学修饰的核苷酸：
其中，Y为S或O，特别是S，R为H或带正电的抗衡离子，B独立地为未修饰或经修饰的核碱基，R1为H、F、Cl、OH、OMe、Me、O-乙基氧甲基。这里Me表示甲基。
本发明的CpG ODN中的碱基可为未修饰的，或部分修饰的，或全部修饰的核碱基(天然的核碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)。CpG ODN的骨架修饰可包括使用硫代磷酸酯部分修饰或全部修饰本发明的CpG ODN中的碱基。所述修饰可在寡核苷酸的合成过程中进行或者在合成之后进行，并且所述修饰可发生在核苷之间的磷酸二酯桥键上、核糖单元上和/或天然核碱基(即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)上。当在合成寡核苷酸的过程中进行修饰时，被修饰的碱基可被掺入寡核苷酸内部或位于寡核苷酸末端。当在合成寡核苷酸之后进行修饰时，所述修饰可通过使用活性基团进行，例如，通过氨基修饰成分进行，通过3’或5’羟基进行，或通过磷酸酯基团进行。
本发明所述的化学修饰可包括对本发明的CpG ODN的骨架进行修饰，包括但不限于，用硫代磷酸酯对骨架进行修饰，得到硫代磷酸酯骨架，这种骨架是一种稳定的核酸分子的糖磷酸酯骨架，在该骨架中，至少一个核苷酸之间的键上，硫取代了未桥接的磷酸酯的氧，或者，在每个或每隔一个核苷酸之间的键上，硫取代了未桥接的磷酸酯的氧。还可对寡核苷酸骨架进行其他修饰，例如，使用非离子型DNA类似物，例如，烷基磷酸酯和芳基磷酸酯，对骨架进行修饰，其中，由烷基或芳基取代带电荷的磷酸酯中的氧，或者使用磷酸二酯和烷基磷酸三酯对骨架进行修饰，其中，将带电荷的氧烷基化。
本发明的免疫调节性CpG ODN的序列结构新颖，更为难得的是对小鼠和人都有免疫刺激作用，因此在临床上有很大的应用价值。
在一个具体实施方案中，本发明的免疫调节性CpG ODN的序列为ODN3，其包含至少一个具有通式I所示的结构的化学修饰的核苷酸，其中所述通式的取代基团如前述定义。
在一个实施方案中，本发明还提供了一种药物组合物，其包含本文所述的免疫调节性CpG ODN和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者是无毒性的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
受试者
本发明使用的术语“受试者”是指动物，包括，但不限于，灵长类动物(例如，人类)，牛、绵羊、山羊、马、狗、猪、猫、兔子、大鼠、小鼠、鱼，鸟，如家禽，如鸡、鸭、鹅等等。优选地，所述动物为哺乳动物。在优选的实施方式中，所述受试者为人类。
免疫细胞
本发明中的免疫细胞是指所有参与免疫应答及与免疫应答有关的细胞及其前体细胞，免疫细胞包括T细胞(例如，CD4+细胞，CD8+细胞和各种其他T细胞亚类)，B细胞(例如CD19)，自然杀伤细胞(NK细胞)，巨噬细胞，单核细胞，树突细胞和嗜中性粒细胞。
表达特异性抗原受体的特异性T淋巴细胞和特异性B淋巴细胞参与介导获得性免疫应答。其中B淋巴细胞接受抗原特异性刺激后可活化增殖并分化为浆细胞，产生特异性抗体，介导体液免疫应答；T淋巴细胞受到抗原特异性刺激后可活化增殖并分化为效应T细胞，介导细胞免疫应答，并辅助体液免疫应答。另外，在获得性免疫应答启动阶段，树突状细胞、单核巨噬细胞等专职APC参与进来，提呈抗原激活T细胞；在获得性免疫应答的效应阶段，单核巨噬细胞、NK细胞等参与进来，协同T细胞、抗体等发挥清楚抗原的作用。
参与固有性免疫应答的细胞主要有单核巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、NK细胞、内皮细胞、肥大细胞、红细胞、血小板等以及少数T、B淋巴细胞亚群。其中，NK细胞是第三类淋巴细胞，具有非特异性细胞毒活性，在固有免疫应答抗病毒感染和抗肿瘤方面发挥重要作用。单核巨噬细胞、粒细胞等具有较强的吞噬杀伤功能，并通过释放大量的活性产物参与炎症反应。
本发明的抗原与CpG ODN的协同作用，同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答，加强Thl型T细胞免疫功能，大大增强T细胞免疫反应。
疫苗
本发明的“疫苗”是本领域普通技术人员熟知的疫苗，泛指一切通过注射或黏膜途径接种后，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体和/或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品，包括蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子等。疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。
本发明所述的“疫苗”是指设计为诱导针对抗原的免疫反应的制剂。疫苗可为治疗性的，在治疗过程中给予疫苗以加强免疫反应或驱动特定方向的反应，或者疫苗可为预防性的，在患上疾病之前或刚刚患上疾病不久给予疫苗。在治疗已产生的疾病和预防将来会复发的疾病方面，疫苗可同时既为治疗性的也为预防性的。疫苗可通过本领域常用的给药方法给药于受试者。本文使用的术语“给药”或“施用”包括向患者提供物质的所有合适的方式。常见途径包括口服给药、舌下给药、跨粘膜给药、透皮给药、直肠给药、阴道给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、鞘内给药、通过导管给药、通过植入物给药，等等。
本发明的抗原可用于制备用于诱导受试者体内针对所述抗原的免疫反应的药物。在一种实施方式中，本发明的抗原可用于制备狂犬病疫苗。在本发明的优选实施方式中，本发明的抗原可用于制备动物和人狂犬病疫苗。动物用狂犬疫苗包括灭活疫苗，弱毒苗和基因工程疫苗等。人用狂犬病疫苗包括神经组织来源疫苗，禽胚培养疫苗，细胞培养疫苗，亚单位和精制疫苗，基因工程疫苗等。
疫苗佐剂
本发明的“疫苗佐剂”或“佐剂”是本领域普通技术人员熟知的疫苗佐剂。佐剂一词起源于拉丁文“Aduvare”，是辅助或者增强的意思。疫苗佐剂是疫苗的一种添加剂，当它先于抗原或与抗原混合注入机体后，能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫反应的类型，属于非特异性的免疫增强剂，而其本身无抗原性。
目前，国际上对于佐剂的分类尚无统一标准，常用的佐剂主要有不溶性铝盐类胶体、油水乳剂、微生物及代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、免疫刺激复合物、蜂胶、脂质体等。本发明的免疫调节性CpG ODN也可用作疫苗佐剂，并且可以发挥优良的佐剂功能。本发明的免疫调节性CpG ODN可以单独作为疫苗(如狂犬病疫苗)的佐剂，或者与其他常用的佐剂联合作为疫苗(如狂犬病疫苗)的佐剂。所述免疫调节性CpG ODN和这些常用的佐剂可以发挥加合作用或者协同作用，提高抗原的免疫原性，从而可以减少疫苗用量或者提高疫苗效果(如减量施用疫苗或者减少疫苗施用次数)。因此，在一个实施方案中，本发明还提供了本文所述的免疫调节性CpG ODN在制备疫苗佐剂中的用途，优选地，所述疫苗为狂犬病疫苗。在一个实施方案中，本文所述的疫苗佐剂还包含一种或多种与所述免疫调节性CpG ODN共同发挥佐剂作用的其他物质。当用作狂犬病疫苗的佐剂时，本文所述的免疫调节性CpGODN的有效量可以通过本领域技术人员通过常规实验确定，例如，所述有效量可以为0.01μg-1000μg/ml疫苗，包括0.01μg-1000μg/ml范围内的任何数值，例如，0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.3μg/ml，0.4μg/ml，0.5μg/ml，0.6μg/ml，0.7μg/ml，0.8μg/ml，0.9μg/ml，1.0μg/ml，1.1μg/ml，1.2μg/ml，1.3μg/ml，1.4μg/ml，1.5μg/ml，1.6μg/ml，1.7μg/ml，1.8μg/ml，1.9μg/ml，2.0μg/ml，3.0μg/ml，4.0μg/ml，5.0μg/ml，6.0μg/ml，7.0μg/ml，8.0μg/ml，9.0μg/ml，10.0μg/ml，20.0μg/ml，30.0μg/ml，40.0μg/ml，50.0μg/ml，60.0μg/ml，70.0μg/ml，80.0μg/ml，90.0μg/ml，100.0μg/ml，200.0μg/ml，300.0μg/ml，400.0μg/ml，500.0μg/ml，600.0μg/ml，700.0μg/ml，800.0μg/ml，900.0μg/ml，1000.0μg/ml疫苗。
药物
术语“药物”或“药物制剂”指一种制剂，其以此类形式以允许包含在其中的活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含对将被施用所述制剂的受试者不可接受的毒性的额外的组分。在一个实施方案中，本文涉及所述的免疫调节性CpG ODN或本文所述的药物组合物在制备预防或治疗受试者的肿瘤、微生物感染或过敏的药物中的用途。所述受试者为人或动物，例如小鼠、大鼠，家畜，如狗、猪、牛、马；家禽，如鸡、鸭、鹅。本领域技术人员可以根据常规方法确定所述药物或药物制剂中所述的免疫调节性CpG ODN的有效量，并且根据常规方法确定所述药物的给药方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。本发明的保护范围由后附的权利要求书定义，下面的实施方式仅是用于示例性说明的目的。
实施例
材料和方法
所有CpG ODN由苏州瑞博生物科技有限公司合成。其中包括ODN 1(5′-tcgcgacgttcgcgggacgttcccta-3′，SEQ ID NO：1)、ODN2(5′-tcgcgacgttcgcgcgacgttcgcta-3′.SEQ ID NO：2)、ODN3(5′-tcgcgacgttcgccgacgttcgta-3′，SEQ ID NO：3)、ODN4(5′-tggacgttcgtcgttcgtccttc-3’，SEQ ID NO：4)、ODN5(5′-tcgtcgttcgtcgttcgacgttc-3’，SEQ ID NO：5)、ODN6(5′-tcgaggttcgtcgttcctcgttc-3’，SEQ ID NO：6)等，其中ODN 1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN6均为全部硫代磷酸酯化的序列。HP3004为阳性对照CpG ODN(5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’，SEQ ID NO：7，全部硫代磷酸酯化)，HP0000为阴性对照CpG ODN(5’-tggccaagcttgggccccttgcaagggcc-3’，SEQ ID NO：8，全部硫代磷酸酯化)。所有的CpG ODN溶解于无菌/无内毒素水(InvivoGen，美国)，-40℃保存备用。狂犬疫苗采自长春生物制品所(Vero细胞狂犬疫苗)/成都康华生物制品有限公司(人二倍体细胞狂犬疫苗)。
人外周血浓缩白细胞和实验动物：
人外周血浓缩白细胞购自长春市中心血站。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠购自长春生物制品研究所有限责任公司。
人外周血单核细胞(PBMCs)的分离和培养：
用两倍体积生理盐水稀释人外周血浓缩白细胞后，1∶1加到塑料离心管中的Ficoll分离液(Coming，美国)表面，2800rpm离心20min(升8降0)，收集单核细胞层悬液，1×PBS洗涤3次，1500rpm离心5min，吸弃上清，使用添加10％胎牛血清(Clark，美国)、1％双抗(Hyclone，美国)和1％HEPES(Invivogen，美国)的RPMI-1640(Coming，美国)完全培养基悬浮细胞，2×105/孔铺于96孔U型板中，分别加入不同浓度的CpG(0.03、0.1、0.3、1和3uM)，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
细胞因子分泌检测：
人PBMCs(2×105/孔)和小鼠脾脏细胞(1×106/孔)铺于96孔U型板中，分别加入不同浓度的CpG(0.03、0.1、0.3、1和3uM)，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养16h后，收集上清，按照ELISA试剂盒说明书检测上清中人IFN-α(Mabtech，瑞典)、小鼠IFN-α(eBioscience，澳大利亚)、小鼠IL-6(Mabtech，瑞典)和小鼠TNF-α(Mabtech，瑞典)的含量。
实施例1.CpG ODN的制备
使用自动化DNA合成仪按一定规模，采用固相亚磷酸胺三酯法按照脱保护，活化，硫代，加帽几个步骤合成。合成以后，利用浓氨水对寡核苷酸进行脱保护，然后纯化，脱盐。纯化的寡核苷酸在使用前以钠盐形式冻干，通过MS定性。后得到纯度＞90％的CpG ODN序列。将ODN1，ODN2，ODN3，ODN4，ODN5，ODN6所示的CpG ODN用于后续的实验。
5’-DMT dA、dG、dC、dT等亚磷酰胺单体购自上海兆维科技发展有限公司。对应载体购自Chemgenes(Wilmington，MA)。2’-取代核糖核苷亚磷酰胺购自上海兆维科技发展有限公司，Promega(Obispo，CA)。
实施例2 CpG ODN对小鼠脾脏细胞T、B细胞增殖的作用
小鼠脾脏细胞的分离和培养：
无菌条件下分离小鼠脾脏，经研磨过滤后制备成BALB/c小鼠脾脏细胞悬液，使用RPMI-1640完全培养基悬浮细胞，5××105或1×106/孔铺于96孔U型板中，分别加入不同浓度的CpG(0.03、0.1、0.3、1和3uM)，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
培养16h后，收集细胞，用1×PBS洗涤2次，1500rpm离心5min。用1×PBS重悬细胞，向细胞悬液中加入抗CD4、抗CD8和抗CD19抗体(BD，美国)，4℃避光孵育30min。1×PBS洗涤2次，1500rpm离心5min，1×PBS重悬细胞，采用BD LSRFortessaTM流式细胞仪(BD，美国)进行流式细胞分析。
收集上清用于ELISA分析。通过夹心ELISA测定上清中CD4、CD8、CD19的水平，得出CpG ODN对小鼠脾脏细胞T、B细胞增殖的作用。测定结果见图1。
结论：CpG ODN可极大刺激小鼠脾脏B细胞活化(通过CD19水平反映)，诱导小鼠脾脏B细胞增殖，进而上调共刺激分子的表达和分泌细胞因子(如IL-6、TNF-a)。
实施例3：小鼠脾细胞培养物中的细胞因子诱导
制备来自4-8周龄C57BL/6的脾细胞，培养在RPMI完全培养基中。将小鼠脾细胞以5×106细胞/ml接种在24孔培养皿中。向细胞培养物中添加溶于PBS缓冲液的CpG ODN至终浓度分别为0.03、0.1、0.3、1和3uM。然后将细胞在37℃孵育24h，收集上清用于ELISA分析。通过夹心ELISA测定上清中IFN-α，IL-6，TNF-α的水平。所需试剂，包括细胞因子抗体和标准品，均购自BD PharMingen。测定结果见图2，3，4。其中图2显示了不同CpG ODN有效刺激pDC分泌IFN-α水平，其中HP3004为阳性对照。图3显示了不同CpG ODN刺激B细胞产生IL-6水平，其中HP3004为阳性对照。图4显示了不同CpG ODN刺激B细胞产生TNF-α水平，其中HP3004为阳性对照。
结论：不同CpG ODN序列上调刺激分泌细胞因子IL-6和TNF-α。
实施例4 CpG ODN对人PBMC诱导T、B细胞增殖的作用
用于分析的培养基的组成为RPMI1640培养基，添加有1.5mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必须氨基酸，50uM 2-巯基乙醇，100IU/ml青霉素-链霉素合剂和10％热灭活的胎牛血清。在96孔平底板中对总共每ml 0.5×106个B细胞(即1×106/200ul/孔)用不同浓度的待测CpG ODN(0.03、0.1、0.3、1和3uM)刺激，一式三份重复，为时共72h。66h后，在每孔20ul RPMI1640培养基(无血清)中将细胞用0.75u Ci的[3H]-胸腺嘧啶核苷(1Ci＝37GBq；Perkin Elmer Life Science)刺激(pulse)，8h后收获。利用细胞收集器收获平板，并利用标准液体闪烁技术测定放射性掺入。结果表示为平均cpm+/-SD或者增殖指数(cpm处理组/cpm培养基对照)。测定结果见图5，其中HP3004为阳性对照。
结论：CpG ODN可使人PBMC细胞活化，诱导B细胞增殖，进而上调共刺激分子的表达和分泌细胞因子(如IL-6、TNF-a)。
实施例5在PBMC培养物中CpG ODN细胞因子诱导作用
将人PBMC以5×106细胞/ml接种于96孔板。向细胞培养物中添加溶于磷酸缓冲液(PBS，pH7.4；Mediatech)的CpG ODN至终浓度为10.0μg/ml。然后将细胞在37℃孵育24h，收集上清用于ELISA分析。各实验进行一式3孔重复。通过夹心ELISA测定IFN-α、IL-6和TNF-α的水平。所需试剂，包括细胞因子抗体和标准品，均购自PharMingen。测定结果见图6-8。
结论：CpG ODN序列可以大幅提高IL-6和TNF-α水平。
实施例6：HEK-BLUE检测
细胞传代
在添加10μg/ml的杀稻瘟素(Blasticidin)和100μg/ml的ZeocinTM的增殖培养基中维持和传代培养细胞。
增殖培养基：DMEM，4.5g/L葡萄糖，10％(v/v)胎牛血清，50U/ml青霉素，50U/ml链霉素，100μg/ml NormocinTM，2mM-谷氨酰胺。
传代培养基
当达到70％-80％的密度时，细胞应该被传代，用PBS替代原有培养基后，由轻敲细颈瓶或使用细胞刮刀分离细胞。收集分离出的细胞，进行离心5min。细胞计数，在96孔板种入2-4x104个细胞，2-3天后加药。
阳性对照(HP3004)，阴性对照(HP0000)和CpG ODN的预设终浓度均为0.003，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，及100μg/ml，且培养基的浓度不低于90％。在相应的孔中加入10ul的阴性，阳性对照和受试物。于5％CO2的培养箱中孵育24h。将培养基倒入250ml的细颈瓶中，加入100ml水，搅拌均匀后37度加热30min。取细胞上清液50ul，离心5min。加入上清20ul样品，180ul QUANTI-Blue到96孔板的各孔中，37℃孵育6h。用微板读板器测量在655nm波长的吸光值。见图9-11。
结果：由图9-11可知，设计CpG ODN对HEK-Blue hTLR9细胞，HEK-Blue mTLR9细胞和Ramos-Blue细胞的活性都很好。
实施例7：ODN3与狂犬病疫苗联合使用对小鼠抗狂犬病毒中和抗体滴度的影响
将小鼠共分为8组，每组8只，免疫前2天各留取一组小鼠的本底血清，注射疫苗时间为：第0，3，7天；分别于免疫后6天，8天，10天，14天，28天，56天摘眼球取血，分离血清，使用RFFIT方法逐只测定小鼠血清中抗狂犬病病毒中和抗体的效价。测定结果见图12。
具体分组情况如下：
结果：由图12可知，狂犬疫苗与不同剂量ODN3联用组产生抗体的水平随着时间增加而不断变化，但是总体呈现增加趋势，较之无佐剂的疫苗组，狂犬疫苗+1μg ODN3，狂犬疫苗+3μg ODN3，狂犬疫苗+10μg ODN3三组抗体水平要高。在免疫接种14天后，狂犬疫苗，狂犬疫苗+1μgODN3，狂犬疫苗+3μgODN3，狂犬疫苗+10μg ODN3四组抗体水平达到峰值，随后回落。其中狂犬疫苗+10μg ODN3组在所有检测时间范围内的抗体水平都是最高。无论动中和抗体产生时间，达到的峰值及延续性方面考虑，10μg ODN3组的实验结果都优于其它剂量组。
实施例8不同剂量ODN3增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较
取小白鼠112只，雌、雄各半，体重18-22克，狂犬疫苗：1ml/支(含2.5IU)，ODN3。实验分组：每组8只，雌雄各半。狂犬疫苗，狂犬疫苗+0.3μg ODN3，狂犬疫苗+1μg ODN3，狂犬疫苗+3μg ODN3，狂犬疫苗+10μg ODN3上述狂犬疫苗和CpG ODN均溶于PBS中。于0天、3天、7天、14天、28天，按不同的分组分别给小白鼠进行免疫。免疫方式是小鼠腹腔注射。于35天进行小白鼠尾静脉采血，分离血清，用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检测小白鼠血清中狂犬疫苗抗体的效价。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
结果：随着时间增加，各分组的狂犬疫苗免疫效果增强；随着ODN3增加，狂犬疫苗免疫效果增强。结果见图13。
结论：ODN3能够显著增加强狂犬疫苗的免疫效果。
实施例9ODN3作为狂犬疫苗佐剂降低狂犬疫苗用量
使用小白鼠128只，雌、雄各半，体重18-22克，狂犬疫苗：1ml/支(含2.5IU)。实验分组：每组8只，雌雄各半。狂犬疫苗，狂犬疫苗+1μgODN3，1/2狂犬疫苗+1μg ODN3，1/4狂犬疫苗1μg ODN3，1/8狂犬疫苗+1μg ODN3。将上述狂犬疫苗和ODN3均溶于PBS中。小白鼠免疫：于0天、3天、7天、14天、21天，按不同的分组分别给小白鼠进行免疫。免疫方式是小鼠腹腔注射。于28天小白鼠尾静脉采血，分离血清，用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检测小白鼠血清中狂犬疫苗抗体的效价。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
结果：狂犬疫苗减量后与ODN3联合应用仍然能够刺激小白鼠产生较高水平的狂犬病毒特异性抗体，狂犬疫苗+1μgODN3，1/2狂犬疫苗+1μg ODN3，1/4狂犬疫苗1μg ODN3，1/8狂犬疫苗+1μg ODN3均能达到高于单独使用狂犬疫苗时的抗体效价(GMT)，说明CpG ODN能够降低狂犬疫苗的用量，结果见图14。
结论：ODN3能够降低狂犬疫苗的用量。
实施例10不同CpG ODN序列用作狂犬疫苗佐剂
将BALB/c鼠随机分成八组，人用狂犬病疫苗组，人用狂犬病疫苗+ODN1(10μg/只)组，人用狂犬病疫苗+ODN2(10μg/只)组，人用狂犬病疫苗+ODN3(10μg/只)组，人用狂犬病疫苗+ODN4(10μg/只)组，人用狂犬病疫苗+ODN5(10μg/只)组，人用狂犬病疫苗+ODN6(10μg/只)组，人用狂犬病疫苗+HP0000(10μg/只)组，各组均经后肢肌肉分别于第0、7、21天免疫三次，每次免疫剂量均为0.2ml/只。分别于免疫后第4、6、10、17、31、45、59天摘眼球取血，分离血清，检测血清抗狂犬病毒抗体含量。免疫后17天中和抗体滴度结果见图15。
结论：CpG ODN能够提高抗体滴度的水平。
等同方案
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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