菊花锌指蛋白bbx19及其相关因子在调节干旱胁迫耐性上的应用
阅读说明：本技术 菊花锌指蛋白bbx19及其相关因子在调节干旱胁迫耐性上的应用 (Application of chrysanthemum zinc finger protein BBX19 and related factors thereof in adjusting drought stress tolerance ) 是由 洪波 高俊平 徐彦杰 赵鑫 帕丽努尔·艾外力 于 2020-04-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供了菊花锌指蛋白BBX19及其相关因子在调节干旱胁迫耐性上的应用。具体地说,本发明提供了一种利用CmBBX19和/或CmBBX19相关因子调节植物干旱胁迫耐性的方法,其中通过调控CmBBX19和/或其相关因子的表达来进行。本发明还提供了CmBBX19和/或其相关因子在提高植物在干旱胁迫中的存活率和同时降低植物的蒸腾速率、气孔导度、水分损失和光合速率以及植物耐旱育种、调节植物ABA依赖途径基因表达等中的应用。本发明明确了CmBBX19和/或其相关因子的功能,因此可以通过调节CmBBX19和/或相关因子的表达、CmBBX19与CmABF3之间的蛋白互作等实现上述的应用。(The invention provides application of chrysanthemum zinc finger protein BBX19 and related factors thereof in adjusting drought stress tolerance. In particular, the present invention provides a method for modulating drought stress tolerance in plants using CmBBX19 and/or CmBBX 19-related factors by modulating expression of CmBBX19 and/or its related factors. The invention also provides application of CmBBX19 and/or related factors thereof in improving the survival rate of plants in drought stress, reducing the transpiration rate, stomatal conductance, water loss and photosynthetic rate of the plants, breeding drought tolerance of the plants, regulating ABA-dependent pathway gene expression of the plants and the like. The invention defines the function of CmBBX19 and/or related factors thereof, so the application can be realized by regulating the expression of CmBBX19 and/or related factors, protein interaction between CmBBX19 and CmABF3 and the like.)
技术领域
本发明涉及菊花的园艺栽培、生产以及菊花应对非生物胁迫的调节领域，具体涉及菊花锌指蛋白BBX19及其相关因子在调节干旱胁迫耐性上的应用。
背景技术
干旱胁迫是一种严重限制作物生产和分布的全球性现象。植物为了应对干旱胁迫，进化出了复杂的形态、生理、细胞和分子水平的系统。其中，植物激素脱落酸(ABA)，它在植物生长发育的几个方面以及对环境胁迫的适应中发挥着关键作用。目前已经确定了两种独立但联系紧密的介导干旱胁迫反应的途径:依赖ABA途径和独立于ABA的干旱途径。
ABA信号通路包括三个基本核心成分：1)ABA受体PYR/PYL/RCAR蛋白；2)PP2C蛋白；3)SnRK蛋白。在ABA存在下，PYR1/PYL/RCAR蛋白结合，并抑制PP2C蛋白的活性，进而解除对SnRK2的抑制。这些被激活的SnRK2蛋白随后磷酸化下游转录因子，从而进一步触发ABA响应基因如RAB18、RD29B和ADH1的表达。
在拟南芥ABA信号转导过程中，受SnRK2蛋白磷酸化的转录因子中，ABF2/AREB1、ABF3和ABF4/AREB2是参与干旱胁迫反应的关键转录因子。这些转录因子通过与启动子中的ABA响应元件(ABRE、PyACGTGG/TG)结合，激活其下游靶基因的表达。已有文献报道ABF/AREB蛋白是bZIP转录因子，可在细胞核内形成异源二聚体或同源二聚体。然而，关于它们可能与其他转录因子的互作，或与非生物胁迫耐性相关机制的报道仍非常有限。
另一类在非生物胁迫耐性中起作用的蛋白是B-box(BBX)家族成员，这是锌指蛋白的一个亚族，其N端有一个或两个B-box结构域。B-box结构域对于转录调控和蛋白间互作非常重要，根据B-box和CCT域的数量，BBX家族成员可以分为五个亚族。BBX蛋白还在光调控的发育过程中发挥作用，如种子萌发、幼苗光形态建成、避荫和成花光周期调控。BBX18抑制拟南芥的耐热性，而BBX24诱导了耐盐性。在拟南芥中，异源过表达菊花(Chrysanthemummorifolium)BBX家族成员CmBBX22被证明可以改善耐旱性并延缓叶片衰老，我们之前也发现CmBBX24在调节非生物胁迫和花期方面具有双重作用。
一些文章已经报道了BBX蛋白影响非生物胁迫响应机制。拟南芥中BBX18调控一组热休克反应基因的表达，而在菊花中CmBBX24调控着赤霉素(GA)的生物合成。此外，当在拟南芥中过表达CmBBX22时，它通过转录激活ABA信号通路的下游基因，如ABI3和ABI5，在抗旱中发挥作用。另一个研究中表明BBX蛋白与ABA信号元件之间关系的例子是，BBX21通过与ABI5的物理互作和与ABI5启动子的结合，在ABA控制的种子萌发过程中作为抑制子发挥作用。然而，在响应非生物胁迫时，特别是干旱胁迫时，BBX蛋白和ABA信号组分之间是否存在交互作用目前还不清楚。
菊花是全球重要的观赏植物。干旱作为一种主要的非生物胁迫，限制着菊花的种植面积和产量。因此，急需了解干旱胁迫耐性的分子调控机制，以培育出具有旱胁迫耐性耐旱的菊花品种。
发明内容
为了解决现有技术中的上述一个或多个问题，本发明人经过长期深入地研究发现，CmBBX19，一个菊花BBX家族基因，在干旱胁迫或ABA处理后下调，且主要通过与ABA依赖途径中的主要转录因子CmABF3互作调节干旱耐性，由此完成了本发明。
本申请在第一方面提供了一种利用CmBBX19和/或CmBBX19相关因子调节植物干旱胁迫耐性的方法，其特征在于，所述方法通过调控CmBBX19和/或CmBBX19相关因子的表达来进行，所述CmBBX19相关因子为ABA依赖途径中受CmBBX19调节的相关因子。
可选的是，所述调节植物干旱胁迫耐性为降低植物干旱胁迫耐性，并且通过过表达所述CmBBX19和/或降低所述CmBBX19相关因子的表达来进行。
优选的是，所述调节植物干旱胁迫耐性为提高植物干旱胁迫耐性，并且通过降低CmBBX19的表达和/或提高所述CmBBX19相关因子的表达来进行。
另外优选的是，所述调控为转录水平调控和/或翻译水平调控。
另外优选的是，所述CmBBX19相关因子包括CmBBX19互作因子或该互作因子的下游因子。优选的是，所述CmBBX19互作因子为ABF3尤其是CmABF3；和/或所述下游因子选自由RAB18、RD29B、ERD7和LTI65组成的组，尤其是选自由CmRAB18、CmRD29B、CmERD7和CmLTI65组成的组。
另外优选的是，所述方法通过如下至少一种方式进行：
(1)敲除或敲低所述CmBBX19基因或过表达所述CmBBX19相关因子基因；
(2)RNA干扰所述CmBBX19基因或过表达所述CmBBX19相关因子基因的表达；
(3)阻断CmBBX19与CmABF3的蛋白互作；
其中，所述CmBBX19相关基因包括CmBBX19互作因子基因或该互作因子的下游因子基因。
优选的是，所述CmBBX19互作因子基因为ABF3，更优选为CmABF3；和/或所下游因子基因选自由RAB18、RD29B、ERD7和LTI65组成的组，更优选选自由CmRAB18、CmRD29B、CmERD7和CmLTI65组成的组。
另外优选的是，所述植物为菊科植物，优选为菊花，更优选为地被菊，进一步优选为地被菊品种(Chrysanthemum morifolium,cv.Fall Color)。
本发明在第二方面提供了CmBBX19基因和/或CmBBX19相关因子在如下方面中的应用：(1)恢复植物在干旱胁迫之后顶端枝条的继续生长；(2)提高植物在干旱胁迫中的存活率；(3)同时降低植物的蒸腾速率、气孔导度、水分损失和光合速率；其中，所述CmBBX19相关因子包括CmBBX19互作因子或该互作因子的下游因子；优选的是，所述CmBBX19互作因子为ABF3尤其是CmABF3；和/或所述下游因子选自由RAB18、RD29B、ERD7和LTI65组成的组，尤其是选自由CmRAB18、CmRD29B、CmERD7和CmLTI65组成的组优选的是，所述应用通过本发明第一方面所述的方法来实现。
本发明在第三方面提供了一种植物耐旱育种方法，其特征在于，所述方法通过如下至少一种方式进行：(1)降低CmBBX19的表达；(2)提高ABA依赖途径中CmBBX19相关因子的表达，其中所述CmBBX19相关因子包括CmBBX19互作因子或该互作因子的下游因子；优选的是，所述CmBBX19互作因子为ABF3尤其是CmABF3；和/或所述下游因子选自由RAB18、RD29B、ERD7和LTI65组成的组，尤其是选自由CmRAB18、CmRD29B、CmERD7和CmLTI65组成的组；(3)阻断所述CmBBX19与CmABF3的蛋白互作。
本发明在第四方面提供了一种调节植物ABA依赖途径相关因子表达的方法，所述方法通过调控CmBBX19因子的表达来实现；所述ABA依赖途径相关因子为ABA信号通路相关因子。优选的是，所述ABA信号通路相关因子为CmBBX19相关因子。更优选的是，所述CmBBX19相关因子包括CmBBX19互作因子或该互作因子的下游因子。进一步优选的是，所述CmBBX19互作因子为ABF3尤其是CmABF3；和/或所述下游因子选自由RAB18、RD29B、ERD7和LTI65组成的组，尤其是选自由CmRAB18、CmRD29B、CmERD7和CmLTI65组成的组。
相对于现有技术，本发明具有如下技术效果：
(1)明确了CmBBX19基因在植物干旱胁迫耐性的功能和作用，从而通过调节其在植物中的表达来调节植物的干旱胁迫耐性。
(2)明确了CmBBX19在ABA依赖途径中的作用，从而可以通过ABA处理来调控CmBBX19的表达或者进而调控ABA途径中位于CmBBX19互作因子的下游的基因的表达，从而实现对CmBBX19互作因子及其在ABA途径中下游基因的功能的调节，从而改变例如减弱或促进植物干旱胁迫耐性。
(3)明确了CmBBX19与CmABF3之间的蛋白互作对植物干旱胁迫耐性的影响，从而可以通过增强或阻断它们之间的蛋白互作来影响植物的干旱胁迫耐性。
附图说明
图1为CmBBX19在菊花中的表达。a.基于实时定量(QRT)-PCR分析的CmBBX19在不同菊花器官中的转录水平。L，叶；F，花；S，茎和R，根。取样时间为开始接受光照3小时(ZT3)b.CmBBX19在干旱处理中的菊花叶片中转录水平。取样时的土壤相对含水量分别为75％(良好浇水)、55％(轻度干旱)、25％(中度干旱)、10％(重度干旱)和75％(重新浇水1天)c.菊花经100μM的ABA处理后的CmBBX19转录水平。ABA处理1小时后收获样品。进行了三个独立的实验重复，内参基因是CmUBI，误差条表示标准偏差(SD)。经Duncan‘s多重范围检验，差异有统计学意义(P<0.05)。
图2为CmBBX19的亚细胞定位和反式激活。a.通过共聚焦激光扫描显微镜观察CmBBX19-GFP融合蛋白在菊花原生质体中的亚细胞定位，GFP为绿色荧光蛋白。左图为显示绿色荧光的暗场，中图为显示细胞形态的亮场，右图为显示组合的合并图。比例尺为10μm。b.烟草叶片中CmBBX19蛋白的反式激活活性分析。将双LUC/REN报告基因和由PBD-CmBBX19-VP16、PBD-VP16或PBD组成的效应子的质粒组合共转化到烟草叶片中。渗透3天后测定LUC和REN活性。当照片显示萤火虫荧光素酶荧光信号时，相应的效应子被转入到烟草叶片中。进行了三个独立的实验重复，误差条表示标准偏差。
图3为CmBBX19过表达(CmBBX19-OX)或CmBBX19沉默(CmBBX19-RNAi)菊花转基因植株对干旱胁迫的耐性。a.通过实时定量(QRT)-PCR检测CmBBX19在野生型(WT)和转基因植物中的表达，取样时间为ZT3。。b.干旱胁迫条件下CmBBX19-OX或CmBBX19-RNAi植物的表型与WT植物的比较。。c.在干旱胁迫条件下生长的CmBBX19-OX，CmBBX19-RNAi和WT植物的存活率。d.CmBBX19转基因株系和WT植株叶片的水分散失速率。e-g.CmBBX19转基因株系和WT植株在正常生长和干旱胁迫条件下的蒸腾速率(c)、气孔导度(d)和光合速率(e)。
图4为脱落酸(ABA)依赖或非依赖途径相关基因在CmBBX19-OX和CmBBX19-RNAi菊花植物中的表达。进行实时定量(QRT)-PCR分析以评估每个基因的表达。以CmUBI为内参基因。进行了三个独立的实验重复，误差条表示标准偏差。根据Duncan‘s多重范围检验，字母表示有显著性差异(P<0.05)。
图5为使用酵母双杂交分析和双分子荧光互补(BiFC)，CmBBX19与脱落酸(ABA)信号成分CmABF3的相互作用。a.酵母双杂交筛选CmBBX19和CmABFs蛋白。通过酵母转化获得含有诱饵BD-CmBBX19和AD-ABFs的酵母细胞。用生理盐水调OD600为0.1，并在缺Leu和Trp的非选择性培养基(左图)和缺Leu，Trp，His和Ade的选择性培养基(右图)上观察。阴性对照包含空AD或BD载体。b.CmABF3中的结构域分析和截短的CmABF3的示意图。c.酵母双杂交分析CmBBX19和截短的CmABF3之间的互作。d.BiFC试验中CmBBX19和CmABF3的互作。烟草叶片与CmBBX19-YFPN和CmABF3-YFPC构建体共侵染，侵染3天后通过共聚焦显微镜观察。CmBBX19-YFPN+YFPC和YFPN+CmABF3-YFPC作为阴性对照。比例尺为40μm。
图6为CmABF3独立于CmBBX19与CmRAB18启动子的结合。a.445bp CmRAB18启动子的示意图。三角形对应假设的Abre基序，而矩形对应假设的GT1一致基序。启动子下面的线表示电泳迁移率改变分析(EMSA)中使用的片段(-388/-339)。b.在酵母单杂交系统中分析CmABF3和CmBBX19与CmRAB18启动子的结合。用空的载体(AD)作为阴性对照。c.使用EMSA分析CmABF3与CmRAB18启动子的结合。将纯化的CmABF3蛋白(3μg)与50nm生物素标记的探针孵育。对于竞争检测，在上述实验中加入100，1000，3000或5000倍浓度的冷探针。
图7为CmBBX19与CmABF3相互作用进而抑制CmRAB18的转录。a.基于电泳迁移率实验分析(EMSA)CmABF3和CmBBX19与CmRAB18启动子的结合。将纯化的蛋白(3μg)与50nm生物素标记的探针孵育。对于竞争检测，将纯化的CmBBX19蛋白以1或10倍浓度添加到上述实验中。b.双荧光素酶报告试验中使用的双报告质粒和效应质粒的示意图。c.CmABF3或CmBBX19与CmRAB18启动子的相互作用，如双荧光素酶(LUC)报告系统所示。使用445bp的CmRAB18启动子片段。LUC载体含有海肾素荧光素酶(Renilla luciferase，REN)基因，在35S启动子的驱动下作为阳性对照。将样品侵染到烟草叶片，侵染3天后测定LUC和REN活性。当相应的效应物和报告子被转入烟草叶片中时，照片显示了萤火虫荧光素酶荧光信号。进行了三个独立的实验重复，误差条表示标准偏差。
图8为CaLCuV-amiR-ABF3侵染后的WT和CmBBX19-RNAi植株的干旱胁迫耐性。a.CaLCuV-amiR-ABF3侵染后的WT和CmBBX19-RNAi植株中CmABF3的表达。b.20天干旱胁迫下，沉默CmABF3的WT和CmBBX19-RNAi植株的干旱表型。c-e.CaLCuV-amiR-ABF3侵染的WT和CmBBX19-RNAi植株在正常生长和干旱胁迫下的蒸腾速率(c)、气孔导度(d)和光合速率(e)。
图9为CmBBX19的氨基酸序列分析。
图10为CmBBX19与BBX家族亚群IV的其他成员在CmBBX19-RNAi和野生型(WT)菊花中表达的比较。
图11为CmBBX19转基因和WT植株叶片中的ABA含量
图12为CmBBX19-OX或CmBBX19-RNAi菊花植物中脱落酸(ABA)信号传导途径和赤霉素(GA)生物合成相关基因的表达。
图13为CmBBX19-RNAi植株中上调的LEA蛋白基因启动子中ABRE和G-box基序的分布。
图14为CmABF序列分析。
图15为拟南芥中BBX19与ABF的互作分析。
图16为CaLCuV-amiR-ABF3侵染后WT和CmBBX19-RNAi植株中ABA依赖途径基因的表达。
图17CmBBX19参与干旱胁迫反应的示意图，主要通过脱落酸(ABA)依赖性途径。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
下文将通过实施例对本发明进行进一步的说明，但是应当理解的是，本发明的保护范围不限于这些实施例。
材料与方法
植物材料与处理
本研究中使用的菊花为地被菊品种(Chrysanthemum morifolium,cv.FallColor)。将40天苗龄的组培苗移植到直径9cm的含有1：1(v/v)草炭：蛭石混合物的盆中，并在控制温度的培养室中生长，温度为23±1℃，相对湿度为40％，日光灯照明为100μmol m-2s-1，光周期为16h光照/8h黑暗。
菊花植株在长日照(16h光照/8h黑暗)条件下生长6个月后分析CmBBX19在不同器官中的表达。
60天苗龄的植株生长在特定环境中(23±1℃，40％相对湿度，16h光照/8h黑暗)用于不同程度的干旱胁迫处理。植株在干旱胁迫处理开始时给予足够的水并称重(初始重量)，然后在整个处理期间定期进行称重。土壤相对含水量计算为(最终鲜重-干重)/(初始重-干重)×100％。
对于ABA处理，将40天苗龄组培苗的根浸泡在100μM ABA溶液中。以相应的水溶液作为对照。
RNA提取和qRT-PCR
用TRIzol试剂(Takara)从样品中提取总RNA并根据反转录酶使用说明书(Vazyme)合成第一链cDNA。使用ABI StepOnePlus Real-time PCR系统(Applied Biossystems，Foster City，USA)进行QRT-PCR反应。用CmUBI基因(GenBank登录号EU862325)作为内参对照。通过使用比较ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen，2001年)将目标基因拷贝数归一化从而参考CmUBI基因来量化表达。另外，以所示cDNA为模板，以SEQ ID NO.42和43所示的引物对克隆出如SEQ ID NO.44所示的CmBBX19基因；以SEQ ID NO.45和46所示的引物对克隆出如SEQ ID NO.47所示的CmABF3基因；以SEQ ID NO.48和49所示的引物对克隆出如SEQ IDNO.50所示的CmRAB18基因。
亚细胞定位
将不含终止密码子的CmBBX19的ORF序列克隆到Super启动子驱动的pSuper1300(GFP-C)载体中。根据Yoo等人(2007年)的方法从40天苗龄的菊花获取叶肉原生质体，并将使用OMEGA质粒Maxi Kit制备的10μg的pSuper：CmBBX19-GFP质粒转入到如Higuchi等人(2013年)所述的使用聚乙二醇(PEG)的约2×104原生质体中。转化后的叶肉原生质体在22℃培养16～20h，然后用OLYMPUS FV1000共聚焦激光扫描显微镜观察。共聚焦显微镜在488nm激发和525nm发射的情况下获得GFP图像。
菊花的遗传转化
为了构建过表达载体，将CmBBX19的ORF区域扩增并克隆到pBI121载体的XbaI和SacI位点(Chen et al.，2003)。构建RNAi载体时，扩增含有XhoI/ClaI和XbaI/KpnI位点的CmBBX19的319bp的正义和反义片段，克隆到pHANNIBAL载体Pdk内含子的两侧，形成包含‘发卡’RNA(ihpRNA)的内含子。ihpRNA的启动子和终止子被克隆到pART27载体中(Wesley etal.，2001)。将过表达质粒和RNAi质粒分别导入农杆菌EHA105株，经农杆菌介导转化到菊花中(Hong et al.,2006)，得到CmBBX19-OX、CmBBX19-RNAi株系。
干旱胁迫处理
干旱处理是将CmBBX19-OX、CmBBX19-RNAi和WT植物移栽到550克包含草炭和蛭石混合物的25厘米的营养钵中(装有550克1:1混合的草炭和蛭石)，每盆每个株系各3株。正常浇水而后干旱处理30d，之后复水5d。处理前后土壤相对含水量分别为75％(处理前)、8％(干旱30d)、75％(复水5d)。在处理结束后记录存活率和萎蔫指数，并拍照记录其表型。萎蔫指数按照如下标准评价：0级，植株株型整齐，自然外展；1级，最上层叶片抱合，下层叶片开始下垂；2级，最上层叶片抱合，下层叶片叶柄下垂呈水平；3级，整株叶片皱缩,下层叶片下垂,叶柄水平朝下30～60度；4级，最上层叶片抱合弯曲，下层叶片叶柄近水平朝下近90度；5级，整株叶片重度皱缩，萎蔫下垂；6级，植株完全枯萎(Zhang et al.,2005)。
取植物根系周围8.0±0.2g的土壤(此时重量W1)用于测定土壤相对含水量(RWC)。65℃烘干24h，测定重量为W2。RWC的计算公式如下:RWC(％)＝(W1-W2)/W1。
双荧光素酶报告分析
为了分析CmBBX19的反式激活活性，将不含终止密码子的CmBBX19的ORF序列克隆到35S启动子驱动的pBD-VP16载体中(Han et al.,2016)。将携带CmBBX19与含有报告载体的农杆菌株GV3101按1/5体积混合(Han et al.2016)，共同侵染到烟草叶片中。
为了研究CmBBX19/CmABF3与CmRAB18启动子在植物体内的相互作用，将CmRAB18启动子克隆到pGreenII 0800-LUC载体中，将CmBBX19和CmABF3的ORF序列克隆到pGreenII0029 62-SK载体中(Hellens et al.,2005)。将含有CmBBX19和CmABF3的农杆菌株GV3101与含有CmRAB18启动子驱动LUC的农杆菌按1：5的体积混合，共同侵染到烟草叶片中。
双荧光素酶报告系统检测采用Promega公司的试剂盒(Gao et al.,2019)进行。LUC图像是使用ikon-L936成像系统(Andor)拍摄的。用GloMax 20/20发光剂(Promega)测定LUC和REN活性。
酵母双杂交分析
将CmBBX19的ORF序列扩增并克隆到pGBKT7载体的EcoRI/SalI位点(Louvet etal.，1997)。将CmABF/AREB的ORF或片段扩增并克隆到pGADT7载体的EcoRI/SalI位点(Chienet al.，1991)。分别将pGADT7和pGBKT7融合构建物组合转化为酵母Y2HGold菌株。用MatchmakerTM GAL4双杂交体系(BD Clontech)进行酵母双杂交试验。转化后的酵母先在SD/-Trp-Leu的培养基上生长，然后在SD/-Trp-Leu–His-Ade板上进行斑点检测。
双分子互补分析
将表达CmBBX19-YFPN或CmABF3-YFPC的载体或对照载体分别转入农杆菌株GV3101，过夜培养，调整OD600＝1.0。组合共同侵染烟草叶片。采用Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜，对60h后的黄色荧光蛋白(YFP)的荧光进行成像。YFP的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
酵母单杂交分析
从菊花基因组DNA中扩增出CmRAB18的启动子片段，克隆到pAbAi载体(Clontech)的EcoRI/SalI位点，然后将CmABF3的ORF序列扩增并克隆到pGADT7载体(Clontech)的EcoRI/SalI位点。用MatchmakerTM GAL4单杂交体系(BD Clontech)进行酵母单杂交试验。转化后的酵母先在SD/-Ura的培养基上生长，然后在SD/-Ura-Leu板上进行斑点检测。
蛋白表达和凝胶阻滞分析
凝胶阻滞分析使用生物素标记探针和EMSA试剂盒(Thermo Scientific)进行的(Dai et al.，2012)。首先将CmRAB18的启动子片段作为探针，冷探针为相同序列的没有标记的DNA片段。GST-CmBBX19和GST-CmABF3融合蛋白的表达通过大肠杆菌菌株Rosetta诱导，16℃孵育10h。通过谷胱甘肽琼脂糖树脂用于重组蛋白的提取和纯化。
表1.实施例中使用到的引物
结果与分析
CmBBX19的表达受到干旱和ABA的下调
在之前的研究中，我们在菊花响应失水的转录组数据库中鉴定了四个编码BBX家族IV亚族蛋白的基因(Xu et al.,2013)。其中，UN68402的预测开放阅读框(ORF)为639bp，失水处理后表达下调。BLASTP结果预测该多肽含有BBX组IV蛋白的结构特征：N末端有一个高度保守的双B-box结构域，但C末端没有CCT结构域(图9a)。系统发育分析表明，预测的蛋白与拟南芥的BBX第IV组为同源物，并且是AtBBX18和AtBBX19的同源物(图9b)。因此，我们按照Khanna et al(2009)建议的命名系统将基因命名为CmBBX19。
我们检测了所有菊花器官中CmBBX19的表达，其中叶、花和茎中的表达量相对较高，而在根中的表达量较低(图1a)。为了确定CmBBX19对干旱胁迫的响应，我们使用荧光定量PCR(qRT)-PCR测定了干旱条件下WT植株成熟叶片中CmBBX19的表达水平。相对于浇水充足的条件，CmBBX19的转录水平在严重干旱下显著下降(2倍)，然后在重新浇水1天后恢复到基础水平(图1b)。
由于内源ABA水平在干旱胁迫下迅速增加，接下来我们测试了ABA是否在干旱胁迫期间影响CmBBX19的转录。如图1c所示，外源ABA处理1小时后CmBBX19表达下降0.4倍，表明CmBBX19可能是干旱胁迫下ABA信号传导途径的一个组成部分。
为了检测CmBBX19是否是是转录因子，我们在菊花原生质体中瞬时表达了CmBBX19-绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白。融合蛋白主要定位于细胞核，但也在细胞质中检测到，而GFP蛋白存在于整个细胞中(图2a)。
序列分析表明，CmBBX19在其C-末端含有一个典型的EAR基序，表明CmBBX19可能作为一个转录抑制子发挥功能(Wang et al.,2014)。为了研究CmBBX19是否具有转录抑制活性，我们进行了双荧光素酶反式激活试验。如图2b所示，表达CmBBX19-VP16的烟草叶片与单独使用VP16的对照相比，表现出更低的相对荧光素酶活性，表明CmBBX19确实是一个转录抑制因子。
2.CmBBX19通过调节ABA信号调节干旱胁迫耐性
为了确定CmBBX19是否参与调控干旱胁迫耐性，我们获得了19个CmBBX19过表达的菊花株系(CmBBX19-OX)和30个CmBBX19沉默株系(CmBBX19-RNAi)。将CmBBX19-OX和CmBBX19-RNAi两种株系与野生型(WT)植株进行比较，通过qRT-PCR检测CmBBX19在转基因植株中的表达水平(图3a)。我们还检测了转基因株系中菊花BBX组IV中其他成员在CmBBX19-RNAi系中的表达，证实只有CmBBX19被沉默(图10)。
为了验证CmBBX19的表达对干旱胁迫的影响，我们将WT、过表达和沉默株系植于正常灌溉条件的土壤中，7天后，干旱处理25天，接着复水5天，然后计算存活率。与CmBBX19-RNAi相比，CmBBX19-OX植株和WT表现出更严重的干旱危害(图3c)。在一次实验中，经历5天的复水后，WT存活率为67％，CmBBX19-RNAi植株存活率为100％，并且其顶端枝条继续生长，而CmBBX19-OX植株的存活率仅为33％(图3b)，几乎所有幸存的植物仅表现出侧枝或基部枝条的微弱生长。结果表明，CmBBX19参与了菊花抗旱性调控的机制。
为了进一步了解CmBBX19影响的抗旱性生理机制，我们比较了转基因株系和WT植株在干旱/失水条件下的蒸腾速率、气孔导度、水分损失和光合速率。在干旱/失水条件下，CmBBX19-RNAi植株的蒸腾速率、气孔导度和光合速率显著高于WT植株，而CmBBX19-RNAi植株的失水速率显著低于WT(图3d-g)，而CmBBX19-OX则表现出相反的效果。这些结果与上述的CmBBX19影响了菊花耐旱性的结果是一致的。
由于外源ABA处理也会下调CmBBX19的表达，我们探究了CmBBX19响应干旱胁迫是否与ABA信号途径有关。具体来说，我们使用RNA测序(RNA-seq)，对CmBBX19-RNAi、CmBBX19-OX植株和WT植株叶片间的差异表达基因(DEGs)进行了大规模筛选。
我们首先关注了正常生长条件下的转基因植株与WT植株中ABA依赖和不依赖途径中差异表达基因。与WT相比，CmRAB18、CmRD29B、CmERD7、CmLTI65等ABA依赖途径基因在CmBBX19-OX植株中表达下调，而在CmBBX19-RNAi植株中表达上调，其中CmDREB2、CmDREB5等ABA不依赖途径的基因在CmBBX19-OX和CmBBX19-RNAi植株中表达均未发生变化(图4)。
然后，我们为了研究CmBBX19调控的耐旱性是否与ABA生物合成有关，检测了相关基因表达和叶片中的ABA含量。在转基因株系和WT中，我们发现ABA含量和ABA生物合成相关基因(如CmNCED和CmABA2)的表达没有显著差异(图11；图12)。我们还检验了CmBBX19对耐旱性的影响是否通过关键ABA信号元件和下游响应基因的转录调控。在转基因株系和WT中，我们发现ABA受体基因、CmPYR/PYL/RCAR或核心ABA信号基因如CmSnRK2、CmABI3、CmABI4、CmABI5、CmABF3的表达没有显著差异(图12)。然而，我们检测到编码LEA类保护蛋白的基因如CmRAB18和CmRD29B的下游ABA信号通路相关基因的表达存在显著差异(图12)。
最近的一项研究表面，在拟南芥中过表达另一种菊花BBX基因家族成员CmBBX22可以通过延缓叶片衰老来提高抗旱性(Liu et al.，2019)。因此我们在转基因植株和WT植株中检测了与叶片衰老相关的基因，如CmNYC1和CmNYE1的表达，结果表明CmBBX19并不影响叶片衰老相关基因的表达(图12a)。这说明CmBBX19与CmBBX22通过不同的调控机制发挥抗旱功能。
由此，我们得出结论，CmBBX19对耐旱性的影响主要是通过调控ABA依赖途径中保护性蛋白的积累，而不是通过改变ABA的生物合成和转录水平上的关键ABA信号组分。
3.CmRAB18的表达不受CmBBX19直接调控，而是由CmABF3调控的
为了研究CmBBX19是怎样影响下游基因的表达的，我们分析了与保护蛋白相关的菊花基因的启动子。我们发现，在LEA蛋白基因的启动子中，ABRE顺式元件得到了富集(图13)。然而，在CmBBX19转基因株系中，ABRE结合因子,CmABFs/AREBs的表达并没有受到影响(图4,S4)，因此我们研究了是否CmBBX19是在转录后水平上影响关键ABA信号元件的。基于序列相似性和系统发育分析，我们鉴定了5个CmABF/AREB基因(CmABF1、CmABF2a、CmABF2b、CmABF3和CmABI5)(图14)。在酵母双杂交分析中，我们以CmBBX19作为诱饵，并将5个AREB-LIKE蛋白融合到Gal4激活域。只有表达CmBBX19和CmABF3的酵母在选择培养基上正常生长，表明CmBBX19特异性地与CmABF3物理性互作，而与CmABF1、CmABF2a、CmABF2b或CmABI5不互作(图5a)(CmABF3的GenBank/EMBL登录号为MN885646)。
为了验证CmBBX19与CmABF3在体内的互作，我们进行了双分子荧光互补(BiFC)分析，观察到烟草叶细胞中CmBBX19-YFPN(CmBBX19与YFP的N端融合)与CmABF3-YFPC(CmABF3与YFP的C端融合)短暂共表达的强黄色荧光蛋白(YFP)信号(图5d)。与之相反，在阴性对照中，CmBBX19-YFPN和YFPC,YFPN和CmABF3-YFPC，在烟草叶片中没有产生任何可检测到的YFP信号。这些结果表明CmBBX19在体内可以与CmABF3互作。
根据以往的研究，ABF/AREB蛋白包含保守区1(C1)、保守区2(C2)、保守区3(C3)、保守区4(C4)和bZIP结构域(Jakoby et al.,2002；Fujita et al.,2005；Zhao et al.,2019)。为了确定哪一个保守的CmABF3结构域与CmBBX19相互作用，我们生成了多个截断形式的CmABF3(图5b)，在酵母双杂交实验中发现只有C1结构域与CmBBX19相互作用。之前的研究表明，AREB1的C1结构域具有反式激活活性(Fujita et al.,2005)，其中包含一个保守的RXXS/T位点，SnRK2蛋白激酶可以以依赖于ABA的方式磷酸化这个RXXS/T位点(Uno et al.,2000；Furihata et al.,2006)。CmBBX19与CmABF3的互作结果表明，CmBBX19可能通过抑制CmABF3的反式激活活性而影响ABA信号，而不是通过干扰CmABF3的启动子结合活性。
我们还从拟南芥中分离出CmBBX19和CmABF3同源基因，以测试BBX19和ABF3相互作用在其他物种中的保存情况。酵母双杂交和BiFC分析结果显示，CmBBX19和AtBBX19均未与AtABF3发生相互作用(图15)，说明在菊花中的BBX19和ABF3的相互作用机制在拟南芥中并不保守。
为了了解CmBBX19如何改变ABA信号基因的表达，我们从CmRAB18起始密码子上游分离出基因组455bp DNA序列。序列分析表明，CmRAB18启动子包含三个ABRE基序(图6a)，在酵母单杂交实验中，是CmABF3，而不是CmBBX19直接与CmRAB18启动子结合。我们用含有两个ABRE基序的CmRAB18启动子-388到-339位的50bp片段作为电泳迁移率变化分析(EMSA)的探针，观察到CmRAB18启动子中ABRE顺式元件直接与CmABF3结合，但不与CmBBX19结合(图6c,7a)。我们还用EMSA检测了CmBBX19是否干扰了CmABF3对其靶基因启动子结合的亲和力。我们发现，即使在反应中增加CmBBX19蛋白的量，CmBBX19对CmABF3与CmRAB18启动子片段结合的亲和力没有影响。
4.CmBBX19抑制了CmABF3对CmRAB18的激活
为了研究CmBBX19是否是通过抑制ABF3的反式激活活性来调控ABA响应基因，我们进行了双荧光素酶报告实验。我们将CmRAB18启动子融合到萤火虫荧光素酶中来构建了一个报告子，并以35S:CmABF3、35S:CmBBX19和35S:CmBBX19-mut(在B-box1区域内用Cys-25取代Ser)作为效应子(图7b)。将35S:CmABF3和proCmRAB18:LUC共转化到烟草叶片中，我们观察到此时的LUC活性显著高于空载体和proCmRAB18:LUC共转化时的LUC活性。当我们共转化35S:CmABF3,35S:CmBBX19,proCmRAB18:LUC时，LUC活性显著降低。然而用突变后的CmBBX19取代CmBBX19时，LUC活性再度恢复(图7c)。表明了CmBBX19抑制了CmABF3对CmRAB18的激活。
为了在遗传学水平上进一步验证CmBBX19与CmABF3的这种作用机制，我们在WT和CmBBX19-RNAi株系的背景下，用含有人工microRNA-ABF3(CaLCuV-amiR-ABF3)的改良甘蓝卷曲叶双病毒载体(CaLCuV)沉默了CmABF3(图8a)。在WT和CmBBX19-RNAi的背景下，干旱胁迫处理20天后，CmABF3的沉默株系均表现出更严重的萎蔫症状，并且植株的蒸腾速率、气孔导度和净光合速率更低(图8b-e)。沉默CmABF3显著抑制了CmBBX19-RNAi诱导的非生物应激反应基因的上调，尤其是LEA蛋白基因CmRAB18、CmRD29B、CmERD7和CmLTI65(图16)。这些结果表明，CmABF3介导了CmBBX19对菊花耐旱性的影响。图17显示了CmBBX19参与干旱胁迫反应的示意图，从中可以看出CmBBX19主要通过脱落酸(ABA)依赖性途径。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 菊花锌指蛋白BBX19及其相关因子在调节干旱胁迫耐性上的应用
<130> GY20100190
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