具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

一种以纤维素为底物制备昆布二糖的方法，包括：

以无定型纤维素为底物采用三酶级联反应合成昆布二糖；

其中，三酶联反应液包括：纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶。

在一些实施例中，所述无定型纤维素为采用磷酸处理后纤维素。

在一些实施例中，所述无定型纤维素的浓度为8～12mg/mL，优选地，为10mg/mL。

在一些实施例中，所述纤维二糖水解酶的浓度为：60～80μg/mL，优选地，为70μg/mL。

在一些实施例中，所述纤维二糖磷酸化酶的浓度为：15～25μg/mL，优选地，为20μg/mL。

在一些实施例中，所述昆布二糖磷酸化酶的浓度为：15～25μg/mL，优选地，为20μg/mL。

在一些实施例中，所述三酶联反应液还包括：MKH₂PO₄、Mg²⁺和柠檬酸缓冲液。

在一些实施例中，所述三酶级联反应的条件为40～50℃反应18～30h，优选地，45℃反应24h。

实验所需溶液配制：

(1)麸皮固体培养基：称取10％(w/v)麸皮，加自来水煮沸，小火煮30min，用纱布过滤得麸皮汁，分装，加琼脂粉2％(w/v)，121℃灭菌30min。

(2)种子培养基(50mL)：(NH₄)₂SO₄：0.1g，KH₂PO₄：0.15g，MgSO₄：0.025g，CaCO₃：0.25g，蛋白胨：0.5g，微晶纤维素：0.5g。加水定容至50mL。

(3)产酶培养基(100mL)：(NH₄)₂SO₄：0.2g，KH₂PO₄：0.3g，MgSO₄：0.05g，CaCO₃：0.5g，蛋白胨：1g，微晶纤维素：1g，尿素：0.1，NaNO₃：0.2g，吐温-80：0.2g，微量元素1：100μL，微量元素2：100μL。加水定容至100mL。

(4)洗孢子液(100mL)：NaCl：0.9g，吐温-80：50μL，ddH₂O定容至100mL，高压蒸汽灭菌后使用。

(5)菌种保存液：甘油：50％(m/v)，用ddH₂O配制。

(6)高效液相色谱流动相溶液：5mM H₂SO₄溶液，用ddH₂O配制。

(7)8％SDS-PAG分离胶(10mL)：Tris-HCl(1.5M,pH 8.8)：2.6mL，丙烯酰胺溶液(30％)：2.6mL，SDS(10％)：0.1mL，APS(10％)：0.1mL，TEMED：6μL，ddH₂O：4.6mL。

(8)5％SDS-PAG浓缩胶(4mL)：Tris-HCl(1.5M,pH 8.8)：0.5mL，丙烯酰胺溶液(30％)：0.67mL，SDS(10％)：40μL，APS(10％)：40μL，TEMED：4μL，ddH₂O：2.7mL。

(9)5×SDS电泳缓冲液(1L)：Tris-HCl：15.1g，Glycine：94g，SDS：5g，ddH₂O定容至1L。

(10)蛋白胶染色液(1L)：无水乙醇：450mL，冰醋酸：100mL，考马斯亮蓝：5g，ddH₂O：450mL。

(11)蛋白胶脱色液(1L)：无水乙醇：50mL，冰醋酸：100mL，ddH₂O：850mL。

(12)蛋白质纯化PBS缓冲液(1L)：NaH₂PO₄ ^.2H₂O：2.46g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O：12.24g，NaCl：1.922g，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(13)柠檬酸缓冲液(1L)：柠檬酸三钠(C₆H₅Na₃O₇ ^.2H₂O)：7.94g，柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)：4.83g，加ddH₂O约800mL溶解，用NaOH调pH到4.8后定容至1L，4℃保存备用。

(14)0.05M HAc-NaAc(1L)：NaAc：4.105g，加ddH₂O约800mL溶解，用冰醋酸调节pH到4.8，定容至1L。

(15)pNPC溶液：pNPC：10mg，d-葡萄糖酸-δ-内酯：10mg，加10mL 0.05M HAc-NaAc(pH 4.8)溶解，4℃避光保存备用。

(16)LB培养基：称取10g/L蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母粉(Yeast extract)，10g/L氯化钠(NaCl)，使用ddH₂O配制。高压蒸汽灭菌后备用。在实验中，如有需要，向培养基中加入50mg/L的硫酸卡那霉素作为选择抗性。

(17)卡那霉素溶液(100mg/mL)：称取硫酸卡那霉素10g，溶于100mL ddH₂O中。完全溶解后，分装到1.5mL离心管中，冷冻保存备用。

(18)IPTG溶液(1M)：称取IPTG 28.3g，溶于100mL ddH₂O中。完全溶解后，分装到1.5mL离心管中，冷冻保存备用。

(19)柠檬酸缓冲液：7.94g柠檬酸三钠(C₆H₅Na₃O₇ ^.2H₂O)，4.83g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，加ddH₂O约800mL溶解，用NaOH调pH到4.8后使用ddH₂O定容至1L，4℃保存备用。

(20)50mM Tris-HCl缓冲液：称取6.06g Tris，使用800mL ddH₂O溶解后，用HCl调节至所需pH，定容至1L。

(21)50mM HEPES缓冲液：称取11.92g HEPES，使用800mL ddH₂O溶解后，调节至所需pH，定容至1L。

(22)PBS缓冲液(无咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24g Na₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(23)PBS缓冲液(20mM咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24gNa₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，1.36g咪唑，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(24)PBS缓冲液(40mM咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24gNa₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，2.72g咪唑，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(25)PBS缓冲液(250mM咪唑)：2.46g NaH₂PO₄ ^.2H₂O，12.24gNa₂HPO₄ ^.12H₂O，11.688gNaCl，17g咪唑，加ddH₂O约800mL溶解，调节pH至7.4后加ddH₂O定容至1L。

(26)菌种保存液：甘油：50％(m/v)，用ddH₂O配制，高温灭菌后备用。

(27)10×SDS-PAGE缓冲液：30g/L Tris，144g/L甘氨酸，10g/L SDS，使用ddH₂O配制。

(28)钼酸铵试剂：溶液中乙酸锌终浓度为0.1M，钼酸铵终浓度为15mM，配制时将乙酸锌和钼酸铵分别加一定量蒸馏水完全溶解后(钼酸铵可加热溶解)，再混合到一起，最后使用HCl调节pH至5.0。

(29)抗坏血酸溶液(10％)：称取5g抗环血酸，加入约30mL ddH₂O溶解，使用NaOH调节pH至5.0后，定容至50mL，避光保持。

以下实施例中，CBHI的表达菌株为里氏木霉QM6a(TrichdermareeseiQM6a)。CBP和LBP的表达菌株为大肠杆菌(E.coli K12),CBP的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，LBP的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1里氏木霉表达CBHI及酶的纯化、酶活检测

I.利用实验室已有的里氏木霉QM6a菌株，进行产酶培养

接种里氏木霉QM6a菌株于麸皮平板上，培养4～5天待生孢后，接种于50mL种子培养基，30℃，200rpm培养48小时，用移液器吸取10mL种子液接种于100mL的产酶培养基，30℃，200rpm培养7天，离心收集酶液。

II.蛋白浓缩及纯化

用10KDa的超滤管将酶液浓缩10倍，后通过AKTA Avent机器利用分子筛进行蛋白纯化，获得纯化后的CBHI。

III.蛋白浓度检测和pNPC酶活检测

使用Bradford方法进行胞外蛋白含量的测定，在酶标条中加入200μL Bradford，后加入20μL蛋白，在吸光值OD595处进行测量。然后在1.5ml的离心管中，加入50μL的pNPC，实验组加入100μL纤维素酶酶液，吹打混匀，50℃水浴反应30min，对照组加入100μL纤维素酶酶液。接下来加入150μL 10％NaCO₃将反应终止，使用分光光度计测量OD420时的吸光值并进行酶活换算，测定结果为CBHI酶活0.40±0.01U/mg protein。

实施例2利用大肠杆菌表达系统表达CBP、LBP。

CBP基因来自于clostridium thermocellum，LBP基因来自于Paenibacillus sp.

I.引物设计

选择PET-28a质粒，利用Snapgene软件将CBP、LBP基因插入PET-28a质粒中，进行引物设计，设计引物如下表所示。

表1扩增CBP和LBP基因的引物

II.细菌基因组的提取

取clostridium thermocellum和Paenibacillus sp.菌液各5毫升，分别置于15mL离心管中，13000×g的离心力下室温离心2min，弃上清，用1mL无菌水重悬菌体，转移至1.5ml离心管中，13000×g的离心力下室温离心1min，弃上清，加入500μL抽提缓冲液，及1g石英砂，旋涡剧烈震荡3min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃水浴30min，将液体转移到新的1.5ml离心管。加入500μL三氯甲烷，旋涡剧烈震荡30s，在13000×g的离心力下室温离心10min。转移300μL上清液到另一无菌1.5ml离心管，加入0.1倍体积的3M NaAc(pH4.8)溶液，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，4℃下在13000×g的离心力下离心10min，去上清。加入700μL的70％乙醇，洗涤2次(在13000×g的离心力下，2min)后倒掉，离心5min，待乙醇完全挥发后，用20μL ddH₂O溶解基因组

III.CBP和LBP基因扩增以及与质粒连接

用高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以CBP-F/CBP-R为引物，clostridium thermocellum基因组为模板扩增带有15bp PET-28a同源臂的CBP片段，以PET28a-CBP-F/PET28a-CBP-R为引物，以PET28a空质粒为模板扩增带有15bp CBP同源臂的PET-28a片段。以LBP-F/LBP-R为引物，Paenibacillus sp.基因组为模板扩增带有15bpPET-28a同源臂的LBP片段，以PET28a-LBP-F/PET28a-LBP-R为引物，以PET28a空质粒为模板扩增带有15bp LBP同源臂的PET-28a片段。PCR反应扩增结束后，用胶回收试剂盒回收每个片段，保证每个DNA片段的浓度较高以保证后续试验的成功。然后用MultiF SeamlessAssembly Mix试剂盒进行质粒和片段的连接，获得PET28a-CBP质粒和PET28a-CBP质粒。

其中，PCR反应体系如下:

IV.PET28a-CBP和PET28a-CBP质粒的转化

Rosetta(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5min后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25min。42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2min，晃动会降低转化效率。向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min。5000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含卡那霉素抗性的LB培养基上。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

V.菌落验证

对过夜培养的平板挑取单菌落，置于1.5mL带有卡那霉素抗性的LB液体培养基的EP管中，37℃，200rpm培养3h至浑浊，进行菌液PCR。PCR进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否能获得与CBP和LBP基因相同大小的条带，若有，则说明片段和质粒连接成功且质粒导入成功，可以进行下一步蛋白表达。

VI.CBP和LBP的表达和纯化

(1)配置LB液体培养基，高温蒸汽灭菌30min。温度选择121℃。

(2)待上述溶液冷却后，取出﹣20℃保存的菌株和100mg/mL的卡那霉素溶液，待其完全溶化后摇匀，先向300mL锥形瓶中加入50μL卡那霉素溶液，摇匀；加入50μL菌种保藏液，摇匀。37℃，200rpm过夜活化至OD600＝1。活化后可见颜色明显变为不透明的蛋黄色。

(3)先从2L的锥形瓶中取出约5mL液体，作为后续吸光度测定的参比。向2L的锥形瓶中每个加入1mL卡那霉素溶液，摇匀后，各加入10mL已活化的大肠杆菌培养液。37℃，200rpm培养。

(4)约4-5小时后，从一瓶培养液中取约3mL液体，600nm测吸光度。如果OD值不在0.4-0.6之间，则继续培养一段时间，再次测量，直至OD值到达0.4-0.6时，每个锥形瓶加入250μL完全融化后的1M浓度的IPTG溶液，并将摇床温度降至16℃，200rpm培养约16h(或者过夜)。

(5)将大肠杆菌培养液倒入1L的离心杯中，四个离心杯配平后，4000×g离心10min(4℃)。离心结束，直接倒出上清，沉淀倒入50mL离心管，加少量含有20mM咪唑的PBS溶液(含有10％甘油)，涡旋振荡重悬细胞，此时可以﹣20℃保存。

(6)菌液倒入100mL烧杯中，加入千分之一体积的PMSF溶，混匀。利用超声破碎仪进行细胞破碎。破碎后，超速离心，13000×g，4℃离心50min。

(7)利用AKTA和Ni柱对蛋白进行纯化，纯化后脱盐，获得较纯的CBP和LBP。

实施例3以纤维素为底物三酶级联催化合成昆布二糖

I.无定型纤维素的制备

将约0.2g的微晶纤维素添加到50mL离心管中，并添加0.6mL蒸馏水以润湿纤维素粉末，从而形成纤维素悬浮浆液。在剧烈搅拌下，将10mL冰冷的86.2％H₃PO₄缓慢加入到浆液中，使最终磷酸浓度约为83.2％。在加入最后2mL磷酸之前，必须将纤维素悬浮液均匀混合。纤维素混合物在几分钟内变成透明，并在冰上放置约一个小时。以每次添加约10mL的速率添加约40mL的冰冷的水，会产生白色浑浊沉淀，所以在每次添加之间剧烈搅拌下。将沉淀的纤维素在约4000×g和4℃下离心20min。将沉淀物用冰冷的水悬浮，然后离心除去含磷酸的上清液四次。加入大约0.5mL的2M Na₂CO₃中和残留的磷酸，然后，使用45mL的冰冷蒸馏水悬浮纤维素颗粒。离心后，将沉淀物用蒸馏水悬浮，离心两次或直至pH 5-7。可以将磷酸处理纤维素浆液长时间保持在约4℃。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

II.一锅法合成昆布二糖

以磷酸处理纤维素为底物通过三酶级联反应合成昆布二糖。反应条件如下：10mg/mL无定型纤维素，30mMKH₂PO₄，5mM Mg²⁺，70μgCBHI，20μgCBP，20μgLBP，柠檬酸缓冲液(pH4.8)补充至1mL，45℃反应24h。同时做不加酶对照，只加CBHI对照以及加CBHI和CBP对照。利用TLC进行检测。

表2本实施例中所涉及的酶

三酶联反应TLC检测图如图1所示。对反应条件进行了优化，最终获得2.53mg/mL昆布二糖，转化率达到25.3％。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种以纤维素为底物制备昆布二糖的方法

<130> 2021.08.11

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 807

<212> PRT

<213> 人工合成/蛋白

<400> 1

Met Lys Phe Gly Phe Phe Asp Asp Ala Asn Lys Glu Tyr Val Ile Thr

1 5 10 15

Val Pro Arg Thr Pro Tyr Pro Trp Ile Asn Tyr Leu Gly Thr Glu Asn

20 25 30

Phe Phe Ser Leu Ile Ser Asn Thr Ala Gly Gly Tyr Cys Phe Tyr Arg

35 40 45

Asp Ala Arg Leu Arg Arg Ile Thr Arg Tyr Arg Tyr Asn Asn Val Pro

50 55 60

Ile Asp Met Gly Gly Arg Tyr Phe Tyr Ile Tyr Asp Asn Gly Asp Phe

65 70 75 80

Trp Ser Pro Gly Trp Ser Pro Val Lys Arg Glu Leu Glu Ser Tyr Glu

85 90 95

Cys Arg His Gly Leu Gly Tyr Thr Lys Ile Ala Gly Lys Arg Asn Gly

100 105 110

Ile Lys Ala Glu Val Thr Phe Phe Val Pro Leu Asn Tyr Asn Gly Glu

115 120 125

Val Gln Lys Leu Ile Leu Lys Asn Glu Gly Gln Asp Lys Lys Lys Ile

130 135 140

Thr Leu Phe Ser Phe Ile Glu Phe Cys Leu Trp Asn Ala Tyr Asp Asp

145 150 155 160

Met Thr Asn Phe Gln Arg Asn Phe Ser Thr Gly Glu Val Glu Ile Glu

165 170 175

Gly Ser Val Ile Tyr His Lys Thr Glu Tyr Arg Glu Arg Arg Asn His

180 185 190

Tyr Ala Phe Tyr Ser Val Asn Ala Lys Ile Ser Gly Phe Asp Ser Asp

195 200 205

Arg Asp Ser Phe Ile Gly Leu Tyr Asn Gly Phe Asp Ala Pro Gln Ala

210 215 220

Val Val Asn Gly Lys Ser Asn Asn Ser Val Ala Asp Gly Trp Ala Pro

225 230 235 240

Ile Ala Ser His Ser Ile Glu Ile Glu Leu Asn Pro Gly Glu Gln Lys

245 250 255

Glu Tyr Val Phe Ile Ile Gly Tyr Val Glu Asn Lys Asp Glu Glu Lys

260 265 270

Trp Glu Ser Lys Gly Val Ile Asn Lys Lys Lys Ala Tyr Glu Met Ile

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Thr Val Glu Lys Val Asp Lys Ala Phe Glu Glu Leu

290 295 300

Lys Ser Tyr Trp Asn Ala Leu Leu Ser Lys Tyr Phe Leu Glu Ser His

305 310 315 320

Asp Glu Lys Leu Asn Arg Met Val Asn Ile Trp Asn Gln Tyr Gln Cys

325 330 335

Met Val Thr Phe Asn Met Ser Arg Ser Ala Ser Tyr Phe Glu Ser Gly

340 345 350

Ile Gly Arg Gly Met Gly Phe Arg Asp Ser Asn Gln Asp Leu Leu Gly

355 360 365

Phe Val His Gln Ile Pro Ala Arg Ala Arg Glu Arg Leu Leu Asp Leu

370 375 380

Ala Ala Thr Gln Leu Glu Asp Gly Gly Ala Tyr His Gln Tyr Gln Pro

385 390 395 400

Leu Thr Lys Lys Gly Asn Asn Glu Ile Gly Ser Asn Phe Asn Asp Asp

405 410 415

Pro Leu Trp Leu Ile Leu Ala Thr Ala Ala Tyr Ile Lys Glu Thr Gly

420 425 430

Asp Tyr Ser Ile Leu Lys Glu Gln Val Pro Phe Asn Asn Asp Pro Ser

435 440 445

Lys Ala Asp Thr Met Phe Glu His Leu Thr Arg Ser Phe Tyr His Val

450 455 460

Val Asn Asn Leu Gly Pro His Gly Leu Pro Leu Ile Gly Arg Ala Asp

465 470 475 480

Trp Asn Asp Cys Leu Asn Leu Asn Cys Phe Ser Thr Val Pro Asp Glu

485 490 495

Ser Phe Gln Thr Thr Thr Ser Lys Asp Gly Lys Val Ala Glu Ser Val

500 505 510

Met Ile Ala Gly Met Phe Val Phe Ile Gly Lys Asp Tyr Val Lys Leu

515 520 525

Cys Glu Tyr Met Gly Leu Glu Glu Glu Ala Arg Lys Ala Gln Gln His

530 535 540

Ile Asp Ala Met Lys Glu Ala Ile Leu Lys Tyr Gly Tyr Asp Gly Glu

545 550 555 560

Trp Phe Leu Arg Ala Tyr Asp Asp Phe Gly Arg Lys Val Gly Ser Lys

565 570 575

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Met Ala Glu Ile Gly Leu Glu Asp Gly Lys Ala Leu Lys Ala Leu Asp

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Pro Pro Gly Tyr Lys Glu Asn Ala Gly Ile Phe Cys His Asn Asn Ala

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805

<210> 2

<211> 911

<212> PRT

<213> 人工合成/蛋白

<400> 2

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1 5 10 15

Leu Glu Gln Pro Glu His Asn Ser Tyr Leu Tyr Phe Pro Leu Val Asn

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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130 135 140

Val Thr Leu Thr Asn Thr Gly Asn Ala Pro Leu Lys Leu Thr Pro Thr

145 150 155 160

Ala Ala Ile Pro Leu Tyr Gly Arg Ser Ala Asp Asp Leu Arg Asp His

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Arg His Val Thr Ser Leu Leu His Arg Ile Phe Thr Ser Glu Tyr Gly

180 185 190

Ile Glu Val Gln Pro Ala Leu Ser Phe Asp Glu Arg Gly His Arg Val

195 200 205

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210 215 220

Pro Ala Gly Phe Phe Pro Val Thr Glu Asp Phe Ile Gly Glu Gly Gly

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245 250 255

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260 265 270

Phe Ala Pro Val Glu Leu Ala Pro Gly Lys Ser Val Ser Tyr Val Val

275 280 285

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500 505 510

Glu His Gly Asn Ile Lys Leu Glu Gly Ala Asp Trp Asn Asp Gly Leu

515 520 525

Asp Leu Ala Pro Glu Arg Gly Glu Ser Val Ala Phe Thr Ala Phe Tyr

530 535 540

Ala Ser Asn Leu Met Glu Leu Ser Glu Leu Leu Leu Glu Leu Gln Lys

545 550 555 560

Arg Thr Gly Lys Asp Ser Leu Asp Ile Ala Glu Glu Met Ala Leu Leu

565 570 575

Leu Asp Thr Leu Gly Lys Pro Ile Ser Tyr Asp Ser Ile Gln Glu Lys

580 585 590

Arg Ser Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Asp Ala Val Thr Pro Arg Val Ser

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Gly Lys Lys Leu Leu Leu Asp Ile Arg Lys Val Ala Glu Asp Leu Lys

610 615 620

Arg Lys Ala Asp Trp Ala Val Ala His Leu Arg Gly Ser Glu Trp Ile

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Gln Ser Lys Glu Gly Tyr Ala Trp Phe Asn Gly Tyr Tyr Asn Asn Asp

645 650 655

Gly Glu Arg Val Glu Gly Asp His Pro Asp Gly Val Arg Met Thr Leu

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Thr Gly Gln Val Phe Ala Ile Met Gly Gly Val Ala Thr Asp Glu Gln

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Thr Glu Lys Ile Ser Gln Ala Val Asn Arg Tyr Leu Lys Asp Glu Arg

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Ile Gly Tyr Arg Leu Asn Ser Arg Phe Gly Gly Ile Gln Gln Asn Leu

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Gly Arg Ala Phe Gly Phe Ala Phe Gly His Lys Glu Asn Gly Ala Met

725 730 735

Phe Ser His Met Thr Val Met Tyr Ala Asn Ala Leu Tyr Lys Arg Gly

740 745 750

Phe Val Gln Glu Gly Phe Glu Val Leu Asp Ser Ile Tyr Arg Leu Ser

755 760 765

Ala Asp Phe Glu Asn Ser Arg Ile Tyr Pro Gly Val Pro Glu Tyr Ile

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Asn Glu Arg Gly Arg Gly Met Tyr Thr Tyr Leu Thr Gly Ser Ala Ser

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Trp Leu Leu Leu Thr Gln Leu Thr Glu Val Tyr Gly Val Lys Gly Arg

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Phe Gly Asp Leu Arg Leu Glu Pro Lys Leu Val Gln Ala Gln Phe Asp

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Gly Ser Gly Glu Ala Ala Val Glu Thr Leu Phe Ala Gly Arg Met Leu

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Gly Ala Gly Cys Leu Ile Gly Arg Ser Leu Ile Glu Ala Leu Pro Ala

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Asp Gly Val His Glu Leu Ile Val Thr Leu Gly Arg Asn Ile Ser

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