阅读说明：本技术 一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法 (Method for synthesizing propyl gallate through tannic acid biocatalysis ) 是由 张基明 杨长满 张洪滔 胡敬 黄泽琦 周婷婷 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于没食子酸丙酯合成技术领域,具体涉及一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法,以单宁酸为反应单体,以羧甲基纤维素钠固化单宁酶为催化剂,协同微波在有机溶剂中催化反应后,经减压蒸馏、冷却结晶、真空干燥,即得,本发明方法解决了生物催化法生产时间长、产率偏低的问题,并且本申请中没食子酸丙酯,并且操作简单易行,无大量废水废渣产生,且产物活性高,尤其是具有较好的抗氧化性能。(The invention belongs to the technical field of propyl gallate synthesis, and particularly relates to a method for synthesizing propyl gallate by tannic acid through biocatalysis.)

一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法

技术领域

本发明属于没食子酸丙酯合成技术领域，具体涉及一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法。

背景技术

没食子酸丙酯((Propyl g allate,PG)为白色至浅褐色结晶粉末或微乳白色针状结晶，化学名称为3,4,5-三羟基苯甲酸丙酯,具有良好的抗氧性能，抗氧化性能较叔丁基羟基茴香醚和2,6-二叔丁基对甲酚强，耐热性好，主要用于油脂或油食品的抗氧化、水果及蔬菜的保鲜，可作为生物柴油及某些材料的抗氧化稳定剂或抗老化剂。没食子酸酯类化合物还具有显著的药理活性和生物活性，能有效消除自由基，用于抗氧化和抗微生物等，因而,在药物、化妆品、饲料等领域也有着广泛的用途，还在治疗心脑血管疾病、抗血小板聚集、增强纤维蛋白和血栓溶解、扩张血管、增强冠动脉血流量等方面具有明显的作用。

目前生产没食子酸丙酯的方法有化学催化和生物转化，化学催化能耗大、污染环境、制备时间长、副反应产物多，且严重腐蚀设备；生物转化反应时间长，收率偏低。更重要的是传统生产中通常以没食子酸作为原料酯化制备没食子酸丙酯，如《黑曲霉全细胞生物催化制备没食子酸丙酯的研究》(裴建军等)利用黑曲霉细胞作为全细胞生物催化剂，催化没食子酸生产没食子酸丙酯，又如专利号CN200410068174.8公开的微生物法在有机相中合成模式在算丙酯的方法，亦四利用黑曲霉催化没食子酸合成没食子酸丙酯，但事实上没食子酸比没食子酸丙酯昂贵，这无疑提高了制作成本。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出了一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法。

具体是通过以下技术方案来实现的：

一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法，是以单宁酸为反应单体，以羧甲基纤维素钠固化单宁酶为催化剂，协同微波在有机溶剂中催化反应后，经减压蒸馏、冷却结晶、真空干燥，即得。

所述没食子酸丙酯，其合成过程中反应单体、有机溶剂、催化剂的质量比为1：(2-5)：(0.8-1.3)。

所述有机溶剂为正丁醇。

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶，其制备方法为：将单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠在25-35℃条件下恒温混合振荡。

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶中单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠的体积质量比为1：(0.3-0.6)。

所述单宁酶溶液是将市售单宁酶与水配制成质量浓度为50-70％的溶液后，再用柠檬酸-柠檬酸钠溶液调节pH值为6.3-6.7。

所述单宁酶溶液，其浓度为2000-3000U/mL。

进一步地，一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法，包括如下步骤：

1)将单宁酸溶液水中，制成质量浓度为60-80％的单宁酸溶液后，与催化剂超声分散5-10min；

2)向步骤1)所得物中加入有机溶剂，超声分散10-15min后，升温至40-45℃，保温反应16-20h，过滤回收催化剂；

3)将滤液转入微波釜中，于120-260W条件下微波辐照处理3-5min后，再经减压蒸馏回收正丙醇，经冷却结晶、真空干燥，即得没食子酸丙酯。

所述超声分散，其功率为50-100W。

进一步地，作为优选方案，本发明催化剂还能够优选为磺酸树脂/羧甲基纤维素钠固化单宁酶，所述磺酸树脂/羧甲基纤维素钠是将羧甲基纤维素钠与磺酸树脂按质量比1：(0.2-0.4)混合均匀，然后在烘箱中控温75℃脱泡2h。

有益效果：

本发明方法解决了生物催化法生产时间长、产率偏低的问题，并且本申请中没食子酸丙酯，并且操作简单易行，无大量废水废渣产生，且产物活性高，尤其是具有较好的抗氧化性能。

单宁酶是一种处于游离状态的酶，环境敏感性高，在强酸、强碱、高温、高离子浓度和部分有机溶剂中不稳定，导致酶蛋白变性，从而降低甚至丧失其催化活性，并且，其完成催化后不易从底物和产物中分离出来；本发明以羧甲基纤维素钠为载体固化单宁酶，能够提高酶的活性稳定性和扩展耐热范围，保证酶活性，并且使得单宁酶能够循环利用，使得单宁酶具有较低的激活能。并且由于羧甲基纤维素钠不溶于有机溶剂，进而有利于反应体系的稳定性。利用羧甲基纤维素钠，还具有宽泛的吸波频率，能够吸收超声处理所发出的波长，进而有助于吸附杂质物质，降低对原料准备中单宁酸和正丙醇的纯度要求，提高产品的抗氧化性能。

作为优选方案，利用磺酸树脂/羧甲基纤维素钠固化单宁酶，不仅能够提高反应效率、缩短反应时间，还能够加强对单宁酶的固化能力，有效避免了酶在循环利用过程中容易从载体上泄漏或脱落。

本发明采用市售单宁酶，其原料来源方便，无须利用黑曲霉等发酵，大大缩短了生产时间。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法，包括如下步骤：

1)将单宁酸溶液水中，制成质量浓度为70％的单宁酸溶液后，与磺酸树脂/羧甲基纤维素钠固化单宁酶在功率为70W条件下超声分散7min；

2)向步骤1)所得物中加入正丁醇，在功率为70W条件下超声分散12min后，升温至43℃，保温反应18h，过滤回收催化剂；

3)将滤液转入微波釜中，于200W条件下微波辐照处理4min后，再经减压蒸馏回收正丙醇，经冷却结晶、真空干燥，即得没食子酸丙酯；

所述没食子酸丙酯，其合成过程中反应单体、有机溶剂、催化剂的质量比1：3：1；

所述磺酸树脂/羧甲基纤维素钠固化单宁酶，其制备方法为：将单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠在30℃条件下恒温混合振荡；

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶中单宁酶溶液与磺酸树脂/羧甲基纤维素钠的体积质量比为1：0.4；

所述磺酸树脂/羧甲基纤维素钠是将羧甲基纤维素钠与磺酸树脂按质量比1：0.3混合均匀，然后在烘箱中控温75℃脱泡2h；

所述单宁酶溶液是将市售单宁酶与水配制成质量浓度为60％的溶液后，再用柠檬酸-柠檬酸钠溶液调节pH值为6.5，其单宁酶溶液的浓度为2500U/mL。

实施例2

一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法，包括如下步骤：

1)将单宁酸溶液水中，制成质量浓度为60％的单宁酸溶液后，与羧甲基纤维素钠固化单宁酶在功率为50W条件下超声分散5min；

2)向步骤1)所得物中加入正丁醇，在功率为50W条件下超声分散10min后，升温至40℃，保温反应16h，过滤回收催化剂；

3)将滤液转入微波釜中，于120W条件下微波辐照处理3min后，再经减压蒸馏回收正丙醇，经冷却结晶、真空干燥，即得没食子酸丙酯；

所述没食子酸丙酯，其合成过程中反应单体、有机溶剂、催化剂的质量比1：2：0.8；

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶，其制备方法为：将单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠在25℃条件下恒温混合振荡；

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶中单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠的体积质量比为1：0.3；

所述单宁酶溶液是将市售单宁酶与水配制成质量浓度为50％的溶液后，再用柠檬酸-柠檬酸钠溶液调节pH值为6.3，其单宁酶溶液的浓度为2000U/mL。

实施例3

一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法，包括如下步骤：

1)将单宁酸溶液水中，制成质量浓度为80％的单宁酸溶液后，与羧甲基纤维素钠固化单宁酶在功率为100W条件下超声分散5min；

2)向步骤1)所得物中加入正丁醇，在功率为100W条件下超声分散10min后，升温至45℃，保温反应20h，过滤回收催化剂；

3)将滤液转入微波釜中，于260W条件下微波辐照处理5min后，再经减压蒸馏回收正丙醇，经冷却结晶、真空干燥，即得没食子酸丙酯；

所述没食子酸丙酯，其合成过程中反应单体、有机溶剂、催化剂的质量比1：5：1.3；

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶，其制备方法为：将单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠在35℃条件下恒温混合振荡；

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶中单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠的体积质量比为1：0.6；

所述单宁酶溶液是将市售单宁酶与水配制成质量浓度为70％的溶液后，再用柠檬酸-柠檬酸钠溶液调节pH值为6.7，其单宁酶溶液的浓度为3000U/mL。

实施例4

一种单宁酸生物催化合成没食子酸丙酯的方法，包括如下步骤：

1)将单宁酸溶液水中，制成质量浓度为63％的单宁酸溶液后，与羧甲基纤维素钠固化单宁酶在功率为80W条件下超声分散9min；

2)向步骤1)所得物中加入正丁醇，在功率为80W条件下超声分散11min后，升温至44℃，保温反应17h，过滤回收催化剂；

3)将滤液转入微波釜中，于250W条件下微波辐照处理4min后，再经减压蒸馏回收正丙醇，经冷却结晶、真空干燥，即得没食子酸丙酯；

所述没食子酸丙酯，其合成过程中反应单体、有机溶剂、催化剂的质量比1：4：0.9；

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶，其制备方法为：将单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠在32℃条件下恒温混合振荡；

所述羧甲基纤维素钠固化单宁酶中单宁酶溶液与羧甲基纤维素钠的体积质量比为1：0.4；

所述单宁酶溶液是将市售单宁酶与水配制成质量浓度为67％的溶液后，再用柠檬酸-柠檬酸钠溶液调节pH值为6.6，其单宁酶溶液的浓度为2500U/mL。

试验例1对本发明的固化单宁酶进行性能检测；

第一部分试验方法

试验组1：采用实施例1的方法制备固化单宁酶；

试验组2：将实施例1中的羧甲基纤维素钠替换为壳聚糖；

试验组3：将实施例1中的羧甲基纤维素钠替换为β-环糊精；

试验组4：将实施例1中的羧甲基纤维素钠替换为二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂；

试验组5：将实施例1中羧甲基纤维素钠替换为纤维素。

第二部分检测方法：

1.酶活力和酶活力回收率测定

在40℃的条件下,1mL游离单宁酶液或1g固定化单宁酶每分钟使PG溶液在波长270nm处吸光度减少0.001,定义为1个酶活力单位(U),按式(1)计算酶活力

式(1)X＝A×n/(0.001×t)；式中:X为样品的酶活力/(U/mL)(或U/g)；A为样品在波长270nm处的吸光度；t为样品的反应时间/min；n为酶液稀释倍数。

酶活力回收率/％＝100×固定化酶总活力/(酶液总活力-残酶液的活力)；式中：固定化酶总活力(U)＝固定化酶活力(U/g)×固定化酶质量(g)；酶液总活力(U)＝酶液活力(U/mL)×酶液体积(mL)；残酶液活力(U)＝滤出固定化酶后的酶液活力(U/mL)×残酶液体积(mL)。

2.固定化单宁酶的保藏稳定性

将各组固定化单宁酶在4℃下保藏45d，然后进行酶活测定，考察固定化单宁酶活力残留率。

酶活力残留率/％＝100×保藏45d后酶液总活力/初始酶液总活力

3.固定化单宁酶的循环使用次数

用0.2g固定化单宁酶水解50mL PG标准液20min，每次水解后将固定化单宁酶滤出、清洗并测定酶活力，然后再投入PG标准液中进行下一次水解，直至酶活力降至初始酶活力的70％，以此考察固定化单宁酶的循环使用次数。

4.数据处理

各试验均平行3次，结果用“均值±标准偏差”表示。用SAS 9.4(SAS InstituteInc,Cary,NC,USA)软件进行数据拟合、模型构建以及回归分析。

第三部分结果分析

1.酶活力回收率测定结果如表1所示：

表1

2.酶保藏稳定性测定结果如表2所示：

表2

3.固定化单宁酶的循环使用次数结果如表3所示：

表3

项目	试验组1	试验组2	试验组3	试验组4	试验组5
						次数	10	5	7	4	5

以上数据显示：采用本发明方法制备的固化单宁酶具有较好的稳定性和循环利用率。

试验例2没食子酸丙酯含量的测定

第一部分实验方法

试验组1-4：实施例1-实施例4；

试验组5：在实施例4的基础上，将羧甲基纤维素钠固化单宁酶替换为单宁酶；

试验组6：在实施例2的基础上，步骤1)和步骤2)均未经超声分散；

试验组7：在实施例3的技术上，步骤2)的保温温度为47℃；

试验组8：在实施例1的基础上，步骤3)未经微波处理；

第二部分检测方法

1.没食子酸丙酯产率检测

用高效液相色谱法对没食子酸丙酯进行检测。检测条件如下：C18柱，流动相为甲醇－0.5％乙酸水缓冲液(65：35)，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长280nm，进样量10μL。取适量没食子酸丙酯或样品，缓冲液为溶剂配制成0.01mg/mL标准溶液或样品溶液，检测后按式(2)计算没食子酸丙酯的产率：

式(2):没食子酸丙酯产率/％＝100×C×V×D/m；式中：C为没食子酸丙酯的质量浓度/(mg/mL)；D为待测液稀释倍数；V为待测液体积/L；m为样品中单宁酸质量/mg。

2.DPPH自由基清除能力

称取0.0197g的DPPH，用甲醇定容到100mL，浓度为500μmol/L；取10mL，用甲醇定容到100mL，加入0.1mL的抗氧化剂与3.9mL的DPPH溶液，在37℃条件下反应30min。在波长517nm处测量吸光度值。以0.1mL的甲醇+3.9mL的DPPH为对照组测定吸光度值。样品溶液浓度为8μmol/L。DPPH自由基的清除能力计算如式(3)；

式(3)：DPPH自由基清除能力/％＝100×(A_样品-A_对照)/A_对照；式中：A_样品表示样品组在波长517nm处的吸光度值；A_对照表示对照组在波长517nm处的吸光度值；

3.ABTS自由基清除能力

将7mmol/L的ABTS储备溶液与2.45mmol/L的过硫酸钾储备溶液等体积在室温下避光反应16h，即得ABTS储备液。用体积分数为95％的乙醇或去离子水稀释该储备液，在30℃条件下下保温6min，在波长734nm处测定吸光度值为0.7±0.02即为ABTS工作液，记下此时的空白组吸光度值。将3mL的ABTS工作液与20μL的样液(8μmol/L)混合，在30℃条件下反应6min得样品溶液。将3mL的ABTS工作液与20μL体积分数为95％的乙醇混合，在30℃条件下反应6min得空白溶液。在波长734nm处测定吸光度值。ABTS自由基的清除能力如式(4)所示；

式(4):ABST自由基清除率/％＝100×(A_E-A_B)/A_B；式中：A_E表示样品组在波长734nm处的吸光度值；A_B表示空白组在波长734nm处的吸光度值；

第三部分结果分析兙俥

1.各组没食子酸丙酯产率结果如表4所示：

表4

由此说明：采用本发明的方法具有较好的产率，这可能因为羧甲基纤维素钠具有吸湿性，能够促进酯化的正向移动，利用微波处理，能够使得反应达到饱和，而当温度高于45℃时，可能由于酶不耐热的问题，导致催化能力下降。

2.各组没食子酸丙酯的DPPH自由基清除能力如表5所示：

表5

项目	试验组1	试验组2	试验组3	试验组4
					清除率/％	92.3	90.9	91.5	92.1
项目	试验组5	试验组6	试验组7	试验组8
					清除率/％	75.9	79.5	64.6	70.6

3.各组没食子酸丙酯的ABST自由基清除能力如表6所示：

表6

项目	试验组1	试验组2	试验组3	试验组4
					清除率/％	95.2	93.4	92.3	92.6
项目	试验组5	试验组6	试验组7	试验组8
					清除率/％	76.7	85.3	62.1	72.8

由此可看出：本发明的没食子酸丙酯表现出较强的抗氧化能力。