阅读说明：本技术 一种发酵生产十六碳二元酸的方法、十六碳二元酸及其制备方法 (Method for producing hexadecanedioic acid by fermentation, hexadecanedioic acid and preparation method thereof ) 是由 鲍家伟 赵宏图 徐敏 刘修才 于 2019-04-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种发酵生产十六碳二元酸的方法、十六碳二元酸及其制备方法。其中该发酵生产十六碳二元酸的方法,包括如下步骤：对热带假丝酵母或者清酒假丝酵母进行扩大培养,直至得到的种子液在稀释30倍时的光密度值OD<Sub>620</Sub>达到0.5以上；将种子液接入发酵培养基中进行发酵,在发酵过程中以0.05％～1.00％的比例向发酵液中添加吐温,且在发酵液稀释30倍时的光密度值OD<Sub>620</Sub>达到0.6以上时开始加入正十六烷；在上述发酵过程中,维持发酵液的pH值在7以下,得到十六碳二元酸。本发明提供的发酵生产十六碳二元酸的方法,能够提高十六碳二元酸的产率,降低耗碱量。(The invention provides a method for producing hexadecanedioic acid by fermentation, the hexadecanedioic acid and a preparation method thereof. The method for producing the hexadecanedioic acid by fermentation comprises the following steps: performing amplification culture on Candida tropicalis or Candida sake until the optical density value OD of the obtained seed solution is 30 times diluted 620 Up to over 0.5; inoculating the seed liquid into a fermentation culture medium for fermentation, adding tween into the fermentation liquid in a proportion of 0.05-1.00% in the fermentation process, and diluting the fermentation liquid by 30 times to obtain an optical density value OD 620 When the reaction temperature reaches more than 0.6, adding n-hexadecane; during the fermentation process, the pH value of the fermentation liquor is maintained at 7Next, hexadecanedioic acid was obtained. The method for producing the hexadecanedioic acid by fermentation can improve the yield of the hexadecanedioic acid and reduce the alkali consumption.)

一种发酵生产十六碳二元酸的方法、十六碳二元酸及其制备 方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产十六碳二元酸的方法、十六碳二元酸及其制备方法，尤其涉及一种在酸性条件下生物发酵生产十六碳二元酸的工艺方法。

背景技术

长链二元酸(又称长碳链二元酸)是碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸，分子通式为C_nH_2n-2O₄，n≥10。长链二元酸是一类用途较为广泛的精细化工产品，以长链二元酸或其衍生单体为原料，可以合成特级尼龙、耐寒增塑剂、高档热熔胶、粉末涂料、香料等。特别是十六碳二元酸(α,ω-二羧基长链二元酸，简称DC₁₆)，可用于合成名贵香料，比如采用十六碳二元酸为原料合成的环十五酮和麝香酮，是高级麝香香料，可代替天然麝香配制多种中成药，疗效显著。

已有研究表明，十六碳二元酸在自然界不单独存在，目前多采用化学合成法或生物发酵法合成。但是化学合成法的合成路线较长，设备要求较高，且制备过程存在高耗能、高污染的缺点。生物发酵法是以正十六烷为底物，通过微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别氧化正十六烷分子链两端的甲基，生成十六碳二元酸。相较于化学合成法，生物发酵法合成工艺较为简单，十六碳二元酸的产量也较高，是目前较为常用的合成思路。

现阶段的生物发酵法中，十六碳二元酸主要是在碱性条件下进行发酵生产的，如专利CN102115768A和CN 1067725C中记载的方案，微生物转化过程中pH值高于7.0。而为了将发酵体系维持在弱碱性，往往需要持续加入氢氧化钠等碱性物质，不仅耗碱量大，而且极易造成下游污染，污水处理成本也较高。针对此现状，专利US 6569670 B2中报道了在弱酸性条件下生产十六碳二元酸的工艺，但是在低pH值条件下，P450酶的活力较低，代谢缓慢，生产效率低，再加上正十六烷原料的价格昂贵，导致十六碳二元酸的成本过高，因此该工艺难以适合工业化生产。

有鉴于此，开发出一种新的生产工艺，在显著提高十六碳二元酸产率的同时，还有效降低耗碱量、减少下游污染，具有非常实际的意义。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明提供一种发酵生产十六碳二元酸的的方法，不仅能够显著提高十六碳二元酸的产率，而且能够有效降低耗碱量、减少下游污染。

本发明提供一种十六碳二元酸的制备方法，包括前述发酵生产十六碳二元酸的方法，该制备方法能够显著提高十六碳二元酸的产率、降低耗碱量，并获得高纯度十六碳二元酸。

本发明提供一种十六碳二元酸，是采用前述制备方法制得。

为实现上述目的，本发明提供一种发酵十六碳二元酸的方法，包括如下步骤：

对热带假丝酵母或者清酒假丝酵母进行扩大培养，直至得到的种子液在稀释30倍时的光密度值OD₆₂₀达到0.5以上；

将种子液接入发酵培养基中进行发酵，在发酵进行至少15小时后以0.05％～1.00％的比例向发酵液中添加吐温，且在发酵液稀释30倍时的OD₆₂₀值达到0.6以上时开始加入正十六烷；在上述发酵过程中，维持发酵液的pH值在7以下，得到十六碳二元酸发酵液。

吐温是一种亲水性的表面活性剂，同时也是一种乳化剂，能够使不相容的烷烃和水两相乳化形成较稳定的乳状液再进入细胞。由于烷烃不溶于水，因此可通过添加合适浓度的吐温促进长链烷烃的乳化，利于烷烃进入细胞，促进长链烷烃的发酵。但是研究表明，吐温具有很强的破裂细胞膜的作用，其次吐温中的亲脂成分包括不饱和脂肪酸，而这些不饱和脂肪酸容易发生氧化降解而产生有毒物质，故在采用生物发酵法合成长链二元酸的过程中，若吐温过量，则会抑制菌体生长，进而影响长链二元酸的产率。

而根据本发明的技术方案，通过在发酵过程中合适时机加入适量的吐温，并将发酵液的pH值控制在7.0以下，以尽量降低吐温对十六碳二元酸所带来的不利影响并发挥吐温对长链烷烃的乳化作用，将产物十六碳二元酸及时从胞内转至胞外，防止胞内积累过多的二元酸会发生β-氧化，从而提高十六碳二元酸的产率，降低十六碳二元酸的成本。

并且，相较于现阶段生物发酵法中通过加入氢氧化钠等碱性化合物以将发酵液稳定在碱性条件下的传统工艺，采用本发明的技术方案，由于发酵过程中发酵液的pH值控制在7.0以下，因此无需加入大量的碱性化合物，从而显著降低了碱单耗，也就有效避免了下游污染，降低了污水处理成本，也进一步降低了十六碳二元酸的生产成本，这在实际工业生产中具有非常重要的意义。

本发明对于所用的热带假丝酵母(Candida tropicalis)以及清酒假丝酵母(Candidasake)均不作特别限定，可商购或自行制备。在本发明优选的实施方案中，所采用的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)CAT H1614，保藏编号为CCTCC M 2015303；所采用的清酒假丝酵母(Candidasake)CAT H4014，保藏编号为CCTCC M2011487。

具体的，上述发酵可以在发酵罐中完成，所用的发酵培养基也可以包括碳源、氮源、无机盐、营养因子等，还可以包括消泡剂。在本发明具体的实施方案中，发酵培养基至少含有以下成分：葡萄糖1.0％～5.0％、酵母膏0～0.5％、玉米浆0～0.8％、硫酸铵0.1％～0.5％、硝酸钾0.1％～0.5％、磷酸二氢钾0.1％～0.8％、硫酸镁0.1％～0.3％以及消泡剂0.02％～0.10％(w/v)。采用具有上述组分的发酵培养基，能够确保热带假丝酵母或者清酒假丝酵母在发酵前期迅速繁殖，并在吐温的配合下，将正十六烷有效转化为十六碳二元酸。合理控制发酵培养基的组分配比，有利于进一步促进正十六烷的转化。在本发明优选的实施方案中，发酵培养基中各组分的含量分别为：葡萄糖1.0％～5.0％、酵母膏0.1％～0.5％、玉米浆0.1～0.8％、硫酸铵0.1％～0.5％、硝酸钾0.1％～0.5％、磷酸二氢钾0.3％～0.8％、硫酸镁0.1％～0.3％以及消泡剂0.02％～0.10％(w/v)。上述成分均可通过商购获得，不赘述。

优选的，种子液的接种量一般可控制在10％～30％(v/v)，即种子液与发酵培养基之间的体积比为10～30：100。

优选的，在发酵过程中，可控制发酵温度为28～32℃；和/或，风量为0.3～0.7vvm；和/或，压力为0.05～0.15MPa；和/或，pH值为5.0～7.0。具体的，在发酵过程中，可通过加入少量氢氧化钠等碱性化合物的方式使发酵液的pH值维持在一个较为稳定的范围。在本发明具体实施过程中，通常将发酵液的pH值恒定在5.0～6.8，比如将发酵液的pH值控制在6.0～6.8。

在发酵前期，菌体快速生长，经过大约15小时后，菌体OD₆₂₀值即可达到0.6(稀释30倍)以上，通常可达到0.6～1.0左右，开始向发酵液中加入正十六烷，菌体进入转化期后开始大量产十六碳二元酸。

具体的，正十六烷可以采用批次补加或连续流加的方式，以使发酵液中正十六烷的含量控制在1.5％～5％，并在发酵结束前20h～30h停止补加正十六烷，控制发酵周期在150h以内。

如前所述，本发明在发酵过程中合适时间段加入了合适量的吐温，以有效降低吐温对十六碳二元酸所带来的不利影响并发挥吐温对长链烷烃的乳化作用。一般可在发酵进行15h～90h加入吐温，优选的，是在发酵进行20h～90h加入吐温，更优选的，在发酵30h～50h加入吐温。

在本发明优选的实施例中，吐温的添加量一般为0.05％～0.50％，更优选为0.05％～0.20％。

本发明对于吐温的具体种类不做特别限定，可以是目前生产十六碳二元酸过程中所常用的吐温，比如可以是吐温-60、吐温-80。

可以理解，在发酵进行过程中，为确保菌体有足够的能量，还可向发酵罐中补加一次碳源。一次碳源的加入方式可以为批次补加或连续流加。

本发明的制备方法中，所述发酵过程可以补加糖水溶液作为一次碳源，糖可以为常见的蔗糖和/或葡萄糖，补加糖水溶液的浓度可以为30％～70％(w/v)。通过补加糖水溶液，控制发酵转化体系的糖浓度为0.1％～5％(w/v)。

在本发明优选的实施方式中，是在发酵前期过程中开始补加一次碳源，通常是在发酵6h以后，比如发酵进行6h～12h内补加糖水溶液。

本发明还提供十六碳二元酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

按照如前所述的发酵生产十六碳二元酸的方法，得到十六碳二元酸发酵液；对十六碳二元酸发酵液进行分离纯化，得到十六碳二元酸。

在本发明具体实施过程中，对十六碳二元酸的分离纯化，可包括如下步骤：

(1)对十六碳二元酸发酵液进行酸化结晶，取固形物，得到十六碳二元酸粗产品；

(2)将十六碳二元酸粗产品溶于有机溶剂中进行脱色处理，再经结晶，取晶体进行洗涤、干燥，得十六碳二元酸产品。

通过对十六碳二元酸发酵液进行上述步骤(1)和(2)的分离纯化，能够获得高纯度的十六碳二元酸(DC₁₆)产品，其纯度可达到99.5％以上。

其中，上述步骤(1)的酸化结晶，以去除发酵液中的菌体、残烃以及影响下游聚合的代谢杂质，如十六碳脂肪酸和十六碳羟基脂肪酸等；具体上述酸化可调整pH值至2.5～5，优选2.5～5。比如可通过向十六碳二元酸发酵液中加入硫酸等酸性化合物的方式调节pH值。然后将析出的固形物通过离心或过滤等固液分离手段进行分离，得到十六碳二元酸粗产品。

上述步骤(2)的脱色处理可在脱色罐中完成，具体可将十六碳二元酸粗产品放入脱色罐中，再加入有机溶解进行溶解，获得脱色体系，然后对脱色体系进行脱色，再经分离得清液。

该有机溶剂可以是醇类化合物、有机酸类化合物、酯类化合物和酮类化合物中的至少一种。其中醇类化合物比如可以是甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇等中的一种或多种；有机酸化合物比如可以是乙酸；酮类化合物比如可以是丙酮；酯类化合物比如可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯等中的至少一种。在本发明具体实施过程中，是将十六碳二元酸粗产品溶于乙酸中，且十六碳二元酸粗产品与乙酸的比例控制在1：(2～4)。

上述脱色具体可以选择活性炭脱色，其中活性炭的加入量不超过脱色体系体积的5％，一般为1～5％；脱色温度一般可控制在85～105℃，脱色时间可根据活性炭的加入量和脱色温度合理设定，一般可控制在15～165min。脱色完成后，可采用板框压滤机过滤等方式进行固液分离，并取清液。

步骤(2)中所述的结晶，具体可以是降温结晶，比如可将得到的清液放入结晶罐内，控制清液的温度为65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，析出晶体后经离心等固液分离，收集得到的晶体；最后对得到的晶体进行溶剂洗涤、水洗涤，干燥处理，得到十六碳二元酸产品。

本发明还提供如上所述的制备方法制得的十六碳二元酸。采用该制备方法，不仅能够使十六碳二元酸具有非常高的产品和较低的生产成本，而且所获得的十六碳二元酸具有非常高的品质，其纯度可达到99.5％以上。

本发明所提供的发酵生产十六碳二元酸(DC₁₆)的方法，通过将发酵体系的pH值控制在7以下(比如弱酸性)，并在发酵进行的合适时机加入适量的吐温，能够使十六碳二元酸的产率达到170g/L以上，产酸质量转化率在85％以上，甚至可达到90％以上，此外还大大缩短了生产周期，发酵时间可控制在150h以内，因而提高了十六碳二元酸生产效率，降低了十六碳二元酸的生产成本。

尤其是，采用本发明的发酵方法，由于无需像传统工艺中需维持发酵体系为碱性，因此显著降低了耗碱量，碱单耗在0.150g/g左右，相当于传统工艺中碱单耗的12％左右，碱用量明显降低。所以，采用本发明的发酵生产十六碳二元酸的方法，不仅节省了原料成本，而且更重要的是，能够有效降低下游污染，也就显著降低了污水处理成本，因而进一步降低了十六碳二元酸的生产成本。

并且，本发明提供的发酵生产十六碳二元酸的方法，在放大至吨级或者百吨级生产规模时，十六碳二元酸的产率、产酸质量转化率、生产周期以及碱单耗等均基本保持在上述较高水平，因此非常适合实际工业的规模化生产和应用。

本发明提供的十六碳二元酸的制备方法，包括前述发酵生产十六碳二元酸的方法，因此同样能够提高十六碳二元酸的生产效率、降低生产成本，还能够有效降低下游污染以及污水处理成本。此外，采用该制备方法，还能够获得高纯度十六碳二元酸，其纯度可达到99.5％以上。

本发明提供的十六碳二元酸，是采用前述制备方法得到。该十六碳二元酸具有较高的品质，其纯度可达到99.5％以上。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，所用的热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614，保藏编号为CCTCC M 2015303；所用的清酒假丝酵母(Candidasake)CAT H4014，保藏编号为CCTCCM2011487。

本发明对于热带假丝酵母(Candida Tropicalis)以及清酒假丝酵母(Candidasake)的扩培方式不做特别限定，可以采用常规的斜面菌种-摇瓶活化，再进行种子培养(种子罐)的方式。

在本发明一些示例中，是首先将热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)在摇瓶中进行活化培养，待摇瓶种子在稀释30倍时的光密度值OD₆₂₀达到0.5以上时，然后在装有种子培养基的种子罐中接入所述摇瓶种子并进行培养，直至得到的种子液在稀释30倍时的光密度值OD₆₂₀达到0.5以上。

具体的，可首先将10波美度的麦芽汁的pH值调节至5.4左右，然后取80mL置于500mL的锥形瓶中，在121℃下灭菌20min，随后接入事先于-80℃冰箱中保藏的2mL甘油管中的热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)的种子1支，在旋转摇床上活化培养，当菌体稀释30倍时的OD₆₂₀值达到0.5以上，活化培养结束。在装有种子培养基的种子罐中接入上述摇瓶种子并进行培养，直至得到的种子液在稀释30倍时的光密度值OD₆₂₀达到0.5以上，扩大培养结束。

上述活化培养的条件具体可以为：温度为28～32℃，摇床转速为200～300rpm。经过大约40～44h，菌体稀释30倍时的OD₆₂₀值可达到0.5以上，活化培养结束。

上述种子培养过程中所使用的种子培养基，具体可以包括碳源、氮源、无机盐、营养因子等，此外还可以包括消泡剂。其中，碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等；氮源包括但不限于硫酸铵、玉米浆、尿素、酵母粉、酵母膏、硝酸钾等；无机盐包括但不限于硝酸钾、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、硫酸镁等；营养因子包括但不限于维生素C、生物素、维生素B1、维生素B2等。

在本发明优选的实施方案中，种子培养基包括以下成分：蔗糖1.1％～3.1％、酵母膏0.1％～0.5％、玉米浆0.1％～0.6％、尿素0.1％～0.6％、磷酸二氢钾0.4％～1.2％和消泡剂0.02％～0.10％。上述成分均可通过商购获得，比如在本发明具体实施过程中，所使用的玉米浆购自凯赛(金乡)生物材料有限公司，总氮含量为2.5％。

如无特别说明，本发明中用于表征组分含量的百分比均参照发酵领域的一般约定，百分比代表质量体积比(w/v)，即％表示g/100mL，比如蔗糖含量为1.1％～3.1％表示蔗糖含量为1.1g/100mL～3.1g/100mL。

优选的，在种子培养过程中，控制种子罐内的温度为28～32℃、风量为0.3～0.7vvm、压力为0.05～0.15MPa。一般情况下，摇瓶种子的接种量为1.0％～1.5％，进一步为1.3％～1.4％。在上述条件下进行种子培养，经过大约20～24h，种子液的OD₆₂₀值(稀释30倍时测得)即可达到0.5以上，然后将种子液接入发酵培养基中进行发酵转化过程。

以下实施例和对比例中，发酵液中十六碳二元酸的含量，是通过气相色谱法GC测定，具体是将发酵液经过一系列处理后，进入毛细管柱内进行分离，根据不同化合物的出峰时间不同，确定发酵液中十六碳二元酸的含量。

实施例1～12

实施例1～12各自提供一种发酵生产十六碳二元酸的方法，是在10L发酵罐中采用清酒假丝酵母(Candidasake)CAT H4014，且发酵开始30～50h时添加0.05％～0.20％吐温-60，具体包括如下步骤：

1、首先将10波美度的麦芽汁的pH值调节至5.4左右，然后取80mL置于500mL的锥形瓶中，在121℃灭菌20min，随后接入事先于-80℃冰箱中保藏的2mL甘油管中的清酒假丝酵母(Candidasake)的种子1支，在温度为29℃、转速为250rpm的旋转摇床上活化培养40～44h，菌体OD₆₂₀值达到0.5(稀释30倍)以上，活化培养结束。

2、在装有种子培养基的种子罐中接入上述步骤1所获得的摇瓶种子并进行培养，接种量为1.33％，并控制培养过程中的温度为29℃、风量为0.3vvm、压力为0.10MPa，直至得到的种子液在稀释30倍时的OD₆₂₀值达到0.5以上。

其中，种子培养基的成分为：蔗糖2.1％、玉米浆0.3％(凯赛(金乡)生物材料有限公司购买，总氮含量为2.5％，下同)、磷酸二氢钾0.8％、酵母膏0.4％、尿素0.3％以及消泡剂0.05％。

3、在装有发酵培养基的发酵罐中接入上述步骤2中获得的种子液并进行发酵，接种量为10％(v/v)，发酵温度为29℃，发酵过程中pH值控制在6.5～6.7，进气流量控制为0.3vvm，发酵过程中压力控制为0.08MPa～0.11MPa，发酵过程中溶氧维持在20％～40％。

其中，10L发酵罐中发酵培养基的成分为：葡萄糖3.3％、硫酸铵0.2％、酵母膏0.3％、磷酸二氢钾0.6％、玉米浆0.8％、硝酸钾0.4％、硫酸镁0.3％以及消泡剂0.05％(w/v)。

将种子液接入发酵罐后，在发酵开始至15h内菌体开始快速生长繁殖，当菌体OD₆₂₀值达到0.6～1.0(稀释30倍)时，将pH值调至6.5～6.7，向发酵罐中批次加入正十六烷进行发酵转化，确保发酵体系中正十六烷的含量控制在1.5％～5％，在发酵不同时间段30～50h向发酵培养基中添加适量浓度0.05％～0.20％的吐温-60，并在发酵结束前20h～30h停止补加正十六烷，当烷烃完全耗完时停止发酵，正十六烷的添加量19％～22％。

对比例1

本对比例提供一种在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATH4014发酵生产十六碳二元酸的方法，除了在步骤3中未加入吐温-60以外，其它工艺条件与实施例1完全一致。

在添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，乳化层较少，不太显著。镜检发酵过程中的菌体形态，发现大部分菌体形态较规则。

对比例2

本对比例提供一种在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATH4014发酵生产十六碳二元酸的方法，除了在步骤3中吐温-60的加入量为0.01％以外，其它工艺条件与实施例1完全一致。

在添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，乳化层较少，不显著。镜检发酵过程中的菌体形态，发现大部分菌体形态较规则。

对比例3

本对比例提供一种在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATH4014发酵生产十六碳二元酸的方法，除了在步骤3中吐温-60的加入量为1.50％以外，其它工艺条件与实施例1完全一致。

在添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，乳化层较多。镜检发酵过程中的菌体形态，发现大部分菌体裂解破损，形态不规则。

对比例4

本对比例采用传统工艺，在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H4014发酵生产十六碳二元酸，其具体制备工艺与实施例1基本一致，区别在于步骤3：

将种子液接入发酵罐后，在发酵开始至15h内菌体开始快速生长繁殖，当菌体OD₆₂₀值达到0.8～1.0(稀释30倍)时，将pH调至6.5，同时向发酵罐中批次加入正十六烷进行发酵转化，每8h补加一次正十六烷，确保发酵液中正十六烷的含量控制在1.5％～5.0％。发酵48～72h将pH值用氢氧化钠溶液调至7.0，72～120h将pH值调至7.5，124h后将pH值调至8.0，直至发酵结束。并在发酵结束前15h～30h停止补加正十六烷，当正十六烷完全耗完时停止发酵，控制烷烃添加量18％～22％。

具体实施例1～12和对比例1～4中吐温-60的加入时机、加入量，以及发酵时间、产酸量、转化率和碱单耗情况如表1所示。其中，转化率为烷烃转换为二元酸的重量百分比(w/w)；碱单耗为耗碱量与单罐产酸量的比值(g/g)。

由表1可知，本发明实施例1～12中，采用清酒假丝酵母(Candidasake)在酸性条件下(pH＜7)发酵，在发酵接种后30～50h添加0.05％～0.20％的吐温-60，十六烷烃转化率能达到90％以上、产酸量能达到170g/L以上，碱单耗在0.150g/g左右。

表1

对比例1和对比例2中，吐温-60的加入量较小(分别为0和0.01％)，十六烷烃的转化率仅为81％左右，产酸量不足170g/L，十六烷的转化率及产酸量均明显低于实施例1～12；并且对比例1～2的碱单耗分别为0.215g/g和0.213g/g，明显高于0.150g/g；此外对比例1～2的发酵时间均明显高于实施例1～12。

对比例3中，吐温-60的加入量较高(为1.50％)，产酸量、十六烷转化率均明显低于实施例1～12，而碱单耗明显高于0.150g/g；此外发酵时间远高于实施例1～12。

与传统碱性条件下实施发酵工艺的对比例4相比，实施例1～12的碱用量明显降低，碱单耗约为对比例4的12％，且产酸量和十六烷转化率也明显高于对比例4，此外发酵时间也明显短于对比例4。

实施例13～24

实施例13～24各自提供一种发酵生产十六碳二元酸的方法，是在10L发酵罐中采用热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614，且发酵开始30～50h时添加0.05～0.20％吐温-80，具体包括如下步骤：

1、首先将10波美度的麦芽汁的pH值调节至5.4左右，然后取80mL置于500mL的锥形瓶中，在121℃灭菌20min，随后接入事先于-80℃冰箱中保藏的2mL甘油管中的热带假丝酵母(Candida Tropicalis)的种子1支，在温度为29℃、转速为250rpm的旋转摇床上活化培养40～44h，菌体OD₆₂₀值达到0.5(稀释30倍)以上，活化培养结束。

2、在装有种子培养基的种子罐中接入上述步骤1所获得的摇瓶种子并进行培养，接种量为1.33％，并控制培养过程中的温度为29℃、风量为0.3vvm、压力为0.10MPa，直至得到的种子液在稀释30倍时的OD₆₂₀值达到0.5以上。

其中，种子液培养基的成分为：蔗糖2.1％、玉米浆0.3％、磷酸二氢钾0.8％、酵母粉0.4％、尿素0.3％以及消泡剂0.05％。

3、在装有发酵培养基的发酵罐中接入上述步骤2中获得的种子液并进行发酵，接种量为10％(v/v)，发酵温度为29℃，发酵过程中pH值控制为6.5～6.7，进气流量控制为0.3vvm，发酵过程中压力控制为0.08MPa～0.11MPa，发酵过程中溶氧维持在20％～40％。

其中，发酵培养基的成分为：葡萄糖3.3％、硫酸铵0.2％、酵母膏0.3％、磷酸二氢钾0.6％、玉米浆0.8％、硝酸钾0.4％、硫酸镁0.3％以及消泡剂0.05％(w/v)。

将种子液接入发酵罐后，菌体开始快速生长繁殖，当菌体OD₆₂₀值达到0.6～1.0(稀释30倍)时，将pH值调至6.5～6.7，向发酵罐中批次加入正十六烷进行发酵转化，确保发酵体系中正十六烷的含量控制在1.5％～5％，在发酵接种后30～50h向发酵培养基中添加适量浓度0.05％～0.20％的吐温-60，并在发酵结束前20h～30h停止补加正十六烷，当烷烃完全耗完时停止发酵，烷烃添加量19％～22％。

对比例5

本对比例提供一种在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATH1614发酵生产十六碳二元酸的方法，除了在步骤3中未加入吐温-60以外，其它工艺条件与实施例1完全一致。

在添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，乳化层较少，不太显著。镜检发酵过程中的菌体形态，发现大部分菌体形态较规则。

对比例6

本对比例提供一种在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATH1614发酵生产十六碳二元酸的方法，除了在步骤3中加入吐温-60的量为0.02％以外，其它工艺条件与实施例1完全一致。

在添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，乳化层较少，不太显著。镜检发酵过程中的菌体形态，发现大部分菌体形态较规则。

对比例7

本对比例提供一种在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATH1614发酵生产十六碳二元酸的方法，除了在步骤3中加入吐温-60的量为1.60％以外，其它工艺条件与实施例1完全一致。

在添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，乳化层较多。镜检发酵过程中的菌体形态，发现大部分菌体裂解破损，形态不规则。

对比例8

本对比例采用传统工艺，在10L发酵罐中以热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614发酵生产十六碳二元酸，其具体制备工艺与实施例1基本一致，区别在于步骤3：

将种子液接入发酵罐后，在发酵开始至15h内菌体开始快速生长繁殖，当菌体OD₆₂₀值达到0.8～1.0(稀释30倍)时，将pH调至6.5，同时向发酵罐中批次加入正十六烷进行发酵转化，每8h补加一次正十六烷，确保发酵液中正十六烷的含量控制在1.5％～5.0％。发酵48～72h将pH值用氢氧化钠溶液调至7.0，72～120h将pH值调至7.5，124h后将pH值调至8.0，直至发酵结束。并在发酵结束前15h～30h停止补加正十六烷，当正十六烷完全耗完时停止发酵，控制烷烃添加量18％～22％。

具体实施例13～24以及对比例5～8中吐温-80的加入时机、加入量，以及发酵时间、产酸量、转化率和碱单耗情况如表2所示。

表2

由表2可知，本发明实施例中，采用热带假丝酵母(Candida Tropicalis)在酸性条件下(pH＜7)发酵，在发酵接种后30～50h添加0.05％～0.20％的吐温-80，十六烷烃的转化率能达到90％以上、产酸量能达到170g/L以上，碱单耗在0.150g/g左右。

对比例5和对比例8中，吐温-80的加入量较小(分别为0和0.02％)，十六烷的转化率仅为81％左右，产酸量不足170g/L，十六烷的转化率及产酸量均明显低于实施例13～24；并且对比例5～6的碱单耗分别为0.214g/g和0.213g/g，明显高于0.150g/g；此外对比例5～6的发酵时间均明显高于实施例13～24。

对比例7中，吐温-80的加入量较高(为1.50％)，产酸量、十六烷转化率均明显低于实施例13～24，而碱单耗明显高于0.150g/g；此外发酵时间远高于实施例13～24。

与传统碱性条件下实施发酵工艺的对比例8相比，实施例13～24的碱用量明显降低，碱单耗约为对比例8的12％，且产酸量和十六烷转化率也明显高于对比例8，此外发酵时间也明显短于对比例8。

并且，由实施例1～12和实施例13～24的结果可知，添加吐温-80与吐温-60效果差别不大。

实施例25

实施例25提供一种发酵生产十六碳二元酸的方法，是在200立方米发酵罐中采用清酒假丝酵母(Candidasake)CAT H4014，除了是在发酵40h添加0.10％的吐温-60以外，其它工艺条件与实施例1一致。

当发酵液中加入0.10％的吐温-60时，在添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，发现在加入吐温-60后发酵液中的乳化层较多。

发酵停止后，发酵周期为136h，对发酵液进行检测，发酵液中的十六碳二元酸含量为178.3g/L，转化率为88.5％。

实施例26

实施例26提供一种十六碳二元酸的发酵方法，是在450立方米发酵罐中采用热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614，除了是在发酵40h添加0.10％的吐温-80以外，其它工艺条件与实施例1一致。

当发酵40h加入0.10％的吐温-80，添加正十六烷进行发酵转化过程中，通过取样观察发酵液中的乳化层，发现在加入吐温-60后发酵液中的乳化层较多。

发酵周期为137h。对发酵液进行检测，发酵液中的十六碳二元酸含量为178.5g/L，转化率为88.6％。

实施例27

对以上实施例1～26中获得的发酵液进行分离纯化，具体为：

(1)向发酵液中加入硫酸调节pH至3～4，进行酸化结晶，分离得固形物，即十六碳二元酸的粗产品。该步骤有效的去除发酵液中的菌体、残烃以及影响下游聚合的代谢杂质，如十六碳脂肪酸和十六碳羟基脂肪酸等。

(2)将前述十六碳二元酸粗产品放入脱色罐，加入乙酸，得到脱色体系，其中十六碳二元酸粗产品与乙酸的比例控制在1：2～4。向脱色罐中加入活性炭，活性炭添加量为脱色体系的1％左右，将上述物料升温加热到85～105℃，脱色15～165min，经板框压滤机过滤得十六碳二元酸清液；将得到的清液放入结晶罐内，在65～80℃下保温1～2小时后，再降温至25～35℃，析出晶体后经离心机进行固液分离，并对得到的晶体进行溶剂洗涤、水洗涤，干燥处理，得到十六碳二元酸产品。

经进一步测试，该十六碳二元酸产品中，十六碳二元酸(DC₁₆)的含量为99.5％以上。以实施例4中所获得的发酵液进行上述分离纯化为例，得到的十六碳二元酸产品中，十六碳二元酸(DC₁₆)含量为99.8％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。