阅读说明：本技术 一种检测羊棘球蚴抗体用抗原及琼脂扩散板的制备方法 (Preparation method of antigen for detecting echinococcus ovis antibody and agar diffusion plate ) 是由 赵扬扬 赖茂林 王盼举 伏刚 冉智光 吕航 古静 殷远滔 杨元礼 于 2020-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测羊棘球蚴抗体用抗原及琼脂扩散板的制备方法,属于生物检测技术领域。抗原的制备方法为：将羊棘球蚴EG95蛋白核酸序列进行酶切连接,构建到质粒载体上；然后转化入大肠杆菌,构建表达菌株,经IPTG诱导表达后破碎得包涵体,经洗涤,裂解,离心,纯化,透析,浓缩,冻干,PBS稀释,即可。琼脂扩散板的制备方法为：向琼脂糖中加入水和PBS,加热,然后加入聚乙二醇6000、MES和氯化钠,冷却,打孔,封底,即可。本发明提供的抗原和琼脂扩散板,具有灵敏度高,特异性强,通用性强的优点,且具有良好生物安全性,易于规模化生产,特别适合于基层兽医人员对羊血清的临床检测,具有广泛的推广应用价值。(The invention discloses an antigen for detecting an echinococcus ovis antibody and a preparation method of an agar diffusion plate, belonging to the technical field of biological detection. The preparation method of the antigen comprises the following steps: carrying out enzyme digestion connection on the echinococcus ovis EG95 protein nucleic acid sequence, and constructing a plasmid vector; then transforming into escherichia coli, constructing an expression strain, carrying out IPTG induced expression, crushing to obtain an inclusion body, washing, cracking, centrifuging, purifying, dialyzing, concentrating, freeze-drying, and diluting with PBS. The preparation method of the agar diffusion plate comprises the following steps: adding water and PBS into agarose, heating, adding polyethylene glycol 6000, MES and sodium chloride, cooling, perforating, and sealing. The antigen and agar diffusion plate provided by the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity and strong universality, has good biological safety, is easy for large-scale production, is particularly suitable for clinical detection of sheep serum by basic veterinarians, and has wide popularization and application values.)

一种检测羊棘球蚴抗体用抗原及琼脂扩散板的制备方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测羊棘球蚴抗体用抗原及琼脂扩散板的制备方法。

背景技术

绵羊的棘球蚴病俗称包虫病(Hydatidosis)，是由棘球属的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)幼虫感染绵羊所引起一种***共患病。它是由细粒棘球绦虫的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害健康的人畜共患寄生虫病，是中国***门规划防治的五大寄生虫病之一。包虫病主要流行于我国西部农牧区的350个县，受威胁人口约5000万，高原地区人群包虫病平均患病率为1.20％，局部高达12％以上。据农业部门推算，全国每年患包虫病的家畜在5000万头以上，因家畜死亡和脏器废弃造成的直接经济损失逾30亿元。因此，对包虫病自然感染进行快速检测，成为广泛关注的问题。琼脂扩散方法是临床血清检测的重要方法，相比ELISA等方法，操作简单经济适用，特别适合基层兽医人员。

自然抗原(如包囊液)较早被用于包虫病血清检测。但其存在严重的生物安全问题，来源不可靠，生产不稳定，因此难以规模化。而Eg95是一种分子量为24.5k Da的天然六钩蚴抗原，具有良好的免疫原性。1996年Lightowler等研制成功基因工程重组抗原疫苗-Eg95疫苗，经过多年的发展，Eg95重组蛋白疫苗作为目前控制棘球蚴病唯一的疫苗，完全能够用于动物的免疫预防，且已实现商品化生产。疫苗的规模化应用需要对疫苗免疫效力进行评价。Eg95基因工程抗原安全可靠，便于生产，已被用作羊棘球蚴病ELISA诊断，对自然感染血清和免疫血清进行检测。

但Eg95抗原表达纯化及琼脂扩散方法，还存在许多具体的工艺问题。如包涵体变性后需使用0.22μm膜孔径滤器过滤。变性液使用高速离心等方法处理，滤器依然耗费严重(过0.2mL滤液即完全堵塞)。发酵抗原纯化后浓度不足，且含有尿素及咪唑等，需要浓缩和脱盐。但脱尿素后，也失去了高浓度尿素对细菌和蛋白酶的抑制，保存期不足。普通琼脂扩散板配方，使用单抗原检测敏感性不如包囊液等符合抗原，需要提高敏感性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测羊棘球蚴抗体用抗原及琼脂扩散板的制备方法。

经研究，本发明采用以下技术方案：

1、一种检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，包括以下步骤：

1)通过PCR扩增EG95基因片段，得到如SEQ ID NO：1所示的核酸序列；

2)将核酸序列采用EcoR I和Xho I同时酶切，连接到pET32a质粒载体上，构建表达质粒；

3)将表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达菌株，将表达菌株培养并进行IPTG诱导表达，得发酵菌液；

4)将发酵菌液经超声破碎后得包涵体；

5)将包涵体洗涤，裂解，离心，取上清液，经Ni²⁺-NTA亲和层析系统纯化；

6)将纯化后的产物进行透析，浓缩，冻干，磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释，即可。

优选的，所述步骤3)中，构建表达菌株具体为：将甘油菌种，按体积百分含量为2％比例接入含Amp的LB液体培养基中，于37℃条件下，振荡培养，得初级发酵菌液；将初级发酵菌液按2％比例转接入含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，用终浓度为1mM的IPTG诱导表达，即可。其中，终浓度为IPTG在LB培养基中的浓度。

更优选的，所述步骤3)中，构建表达菌株具体为：将甘油菌种，按2％比例(V/V)接入200mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，于37℃条件下，150r/min振荡培养至OD600nm达到0.5左右，得初级发酵菌液；将初级发酵菌液按2％比例转接入5L含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，150r/min，37℃振荡扩大培养，培养液OD600nm达0.8左右时，用终浓度为1mM的IPTG诱导表达6h，即可。

优选的，所述步骤4)中，超声破碎的功率为300W，方式为工作5s，间歇7s，超声时间为40min。

优选的，所述步骤5)中，包涵体洗涤所用洗涤液的制备：取NaCl和1M pH8.0 Tris-HCL(三(羟甲基)氨基甲烷)，加水定容，即可；

所用裂解液的制备：取NaCl、尿素、咪唑和1M pH8.0 Tris-HCL，加水定容，即可。

更优选的，所述步骤5)中，包涵体洗涤所用洗涤液的制备方法为：取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCL 20mL，加水定容至1000mL，即可；

包涵体裂解所用裂解液即Buffer A的制备方法为：取NaCl 29.22g、尿素480.48g、咪唑0.34g和1M pH8.0 Tris-HCL 20mL，加水定容至1000mL，即可。

优选的，所述步骤5)中，Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用洗脱缓冲液B的制备：取NaCl、尿素、咪唑和1M pH8.0 Tris-HCL，加水定容，即可。

更优选的，所述步骤5)中，Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用洗脱缓冲液B，即Buffer B包括3种浓度，具体为，10mmol/L咪唑Buffer B的制备方法为：取NaCl 29.22g、尿素480.48g、咪唑0.68g和1M pH8.0 Tris-HCL 20mL，加水定容至1000mL，即可；

20mmol/L咪唑Buffer B的制备方法为：取NaCl 29.22g、尿素480.48g、咪唑1.36g和1M pH8.0 Tris-HCL 20mL，加水定容至1000mL，即可；

50mmol/L咪唑Buffer B的制备方法为：取NaCl 29.22g、尿素480.48g、咪唑3.4g和1M pH8.0 Tris-HCL 20mL，加水定容至1000mL，即可。

优选的，所述步骤5)中，Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用洗脱缓冲液C的制备：取NaCl、尿素、咪唑和1M pH8.0 Tris-HCL，加水定容，即可。

更优选的，所述步骤5)中，Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用洗脱缓冲液C，即Buffer C的制备方法为：取NaCl 29.22g、尿素480.48g、咪唑34g和1M pH8.0 Tris-HCL 50mL，加水定容至1000mL，即可。

优选的，所述步骤5)中，具体为：用洗涤液洗涤包涵体，然后加入包涵体裂解液中，搅拌过夜，离心，取上清液即为融合蛋白的包涵体变性液；将包涵体变性液先过DS0130亲和层析柱初滤，再用0.22μm滤器过滤，即得蛋白粗滤液；采用Ni2+-NTA亲和层析系统对蛋白粗滤液进行纯化，即可。

更优选的，所述步骤5)中，具体为：用洗涤液洗涤包涵体，洗涤后的包涵体按1:10(w/v)的比例加入至包涵体裂解液中，4℃磁力搅拌过夜；然后，在4℃、12000r/min离心30min，取上清即为融合蛋白的包涵体变性液；将包涵体变性液先过DS0130亲和层析柱初滤，即在亲和层析柱空柱中加入变性液，使变性液在重力作用下流出，收集变性液，并用洗脱缓冲液洗脱，再用0.22μm滤器过滤，即得蛋白粗滤液；采用Ni2+-NTA亲和层析系统对蛋白粗滤液进行纯化，即取填料，装柱，用去离子水清洗柱子，用Buffer A平衡柱子，蛋白初滤液上样，当穿透峰出现时，开始循环上样；当紫外吸收峰达到最高值后15min停止上样；然后，采用分别含10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L咪唑的Buffer B梯度洗脱杂蛋白，当紫外吸收峰达到最低值后，继续洗脱20min；最后，用Buffer C洗脱目的蛋白，当Buffer C洗脱峰出现时开始收集样品，直到洗脱峰收集完毕。

优选的，所述步骤6)中，透析采用10KD透析袋，在4℃下透析16h，透析液为1mMPBS。

优选的，所述步骤6)中，将纯化后的产物进行透析，浓缩，冻干，磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释的具体操作为：将纯化蛋白经10KD透析袋透析，透析液为1mM PBS，4℃透析16h，每隔4h换一次透析液，透析液需4℃预冷；透析后的蛋白，用聚乙二醇PEG20000浓缩，经真空冻干法进行冻干，分装蛋白溶液1mL于10mL西林瓶中，-40℃下真空冻干48h；冻干浓缩的干粉，-20℃冷冻保存；干粉加入0.01mM pH7.4磷酸缓冲液稀释为1.0mg/mL，即为检测羊棘球蚴抗体用抗原。

2、上述制备方法制得的检测羊棘球蚴抗体用的抗原。

3、检测上述抗原用的琼脂扩散板的制备方法，包括以下步骤：

向琼脂糖中加入去离子水和0.1mM PBS，加热至琼脂糖完全融化，然后加入聚乙二醇6000、MES和氯化钠，搅拌至完全溶化，冷却至45～60℃倒入平皿中，打孔，挑出孔内琼脂，将板底部烘烤封底，即可。

优选的，所述琼脂糖、水、0.1mM PBS、聚乙二醇6000、MES和氯化钠按g:mL:mL:g:g:g计为0.8:90:10:1:1:0.8。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供检测羊棘球蚴抗体用的抗原通用性强，既能检测自然感染血清，又能检测免疫血清，既能检测山羊，又能检测绵羊，且抗原成分明确，纯度高，避免了使用包虫病包囊液等天然抗原带来的生物安全问题；

2)本发明提供的检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，生产工艺稳定，安全可靠，易于大规模生产，变性液先过亲和层析柱空柱粗滤，再过0.22μm滤膜过滤，有效降低滤膜堵塞，节约滤膜成本和人工成本；抗原采用PEG20000透析浓缩及冻干处理工艺，保质期长；

3)本发明提供的检测抗原用的琼脂扩散板，采用琼脂糖做琼脂扩散板，透明度和硬度良好，不易破碎，容易打孔，在琼脂扩散板中加入PEG6000和MES，灵敏度高，沉淀线清晰，不会出现多条沉淀线。检测方法操作简易，经济适用，适合于基层人员检测；

4)本发明提供的羊棘球蚴(包虫)抗体检测用抗原和琼脂扩散板，为实现对羊棘球蚴(包虫)自然感染及EG95疫苗免疫血清的检测，建立了一种具有良好生物安全性、工艺稳定性好、易于规模化生产的基因工程表达抗原生产工艺，利用表达抗原建立一种具有灵敏度高，特异性强，通用性强的琼脂扩散方法，使得该方法具有经济简易的优点，特别适合于基层兽医人员对羊血清的临床检测，具有广泛的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中，PCR扩增的鉴定图；

图2为本发明实施例1中，酶切的鉴定图；

图3为本发明实施例1中，细菌诱导前后目的蛋白表达图；

图4为本发明实施例1中，纯化前后蛋白SDS-PAGE电泳分析结果图；

图5为本发明实施例1中制得的检测羊棘球蚴抗体用抗原的Western-Blot鉴定结果图；

图6为本发明实施例3中，不同琼脂糖比例对沉淀线影响的结果图；

图7为本发明实施例3中，AGP检测反应时间对比结果图；

图8为本发明实施例3中，检测羊棘球蚴抗体用抗原稀释度的检测结果图；

图9为本发明实施例3中，棘球蚴EG95抗体阳性血清稀释度的检测结果度；

图10为本发明实施例3中，AGP检测方法的特异性结果图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例中检测羊棘球蚴抗体用抗原的制备方法，包括以下步骤：

1)通过PCR扩增EG95基因片段，得到如SEQ ID NO：1所示的核酸序列；

2)将核酸序列采用EcoR I和Xho I同时酶切，连接到pET32a质粒载体上，构建表达质粒；

3)将表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达菌株，将表达菌株培养并进行IPTG诱导表达，得发酵菌液；具体为：将甘油菌种，按2％比例(V/V)接入200mL含Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中，于37℃条件下，150r/min振荡培养至OD600nm达到0.5左右，得初级发酵菌液；将初级发酵菌液按2％比例转接入5L含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，150r/min，37℃振荡扩大培养至OD600nm达到0.8左右，用终浓度为1mM的IPTG诱导表达6h，即得发酵菌液；

4)将发酵菌液在超声功率为300W，超声方式为工作5s，间歇7s，超声破碎40min后，得包涵体；

5)将包涵体洗涤，洗涤后的包涵体按1:10(w/v)的比例加入至包涵体裂解液中，4℃磁力搅拌过夜；然后，在4℃、12000r/min离心30min，取上清即为融合蛋白的包涵体变性液；将包涵体变性液先过DS0130亲和层析柱初滤，即在亲和层析柱空柱中加入变性液，使变性液在重力作用下流出，收集变性液，并用洗脱缓冲液洗脱，再用0.22μm滤器过滤，即得蛋白粗滤液；采用Ni2+-NTA亲和层析系统对蛋白粗滤液进行纯化，即取填料，装柱，用去离子水清洗柱子，用Buffer A平衡柱子,蛋白粗滤液上样，当穿透峰出现时，开始循环上样；当紫外吸收峰达到最高值后15min停止上样。然后，采用分别含10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L咪唑的Buffer B冲洗柱子，洗脱杂蛋白，当紫外吸收峰达到最低值后，继续洗脱20min。最后，用Buffer C洗脱目标融合蛋白，当Buffer C洗脱峰出现时开始收集样品。

6)将纯化后的蛋白产物经10KD透析袋透析，透析液为1mM PBS，4℃透析16h，每隔4h换一次透析液，透析液需4℃预冷；透析后的蛋白，用聚乙二醇PEG20000浓缩，经真空冻干法进行冻干，分装蛋白溶液1mL于10mL西林瓶中，-40℃下真空冻干48h；冻干浓缩的干粉，-20℃冷冻保存；干粉加入0.01mM pH7.4磷酸缓冲液稀释为1.0mg/mL，即得检测羊棘球蚴抗体用抗原。

相关检测分析

1、利用TaKaRa MiniBEST质粒试剂盒抽提质粒pET-32a-EG95，对实施例1中PCR扩增及酶切(XhoⅠ+EcoRⅠ)鉴定，结果如图1和图2所示。

从图1和图2中分析可知，琼脂糖凝胶电泳显示，PCR扩增产物和双酶切均在468bp处出现明显条带，从而证明了目的片段已成功***载体质粒。质粒送基因公司测序鉴定，与标准序列完全一致。

2、将实施例1步骤3)中，诱导前后的菌液样品在10000r/min条件下，离心2min，弃上清后，用0.1ml PBS重悬，加入等体积2×SDS上样缓冲液煮沸10min，取10μL进行SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，结果如图3所示。

图3中，M：蛋白Marker；1：诱导前；2：诱导后；3：诱导前；4：诱导后，从图3中分析可知，诱导前未出现目的蛋白，诱导后在32.9kD位置有明显的表达目的蛋白。

3、将实施例1步骤5)中，纯化前后蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示。

图4中，M：蛋白Marker；1、2：纯化前蛋白；3、4：纯化后蛋白未洗涤包涵体。从图4中分析可知，纯化前杂蛋白含量高，而纯化后目的蛋白纯度高。

4、利用Western-Blot对实施例1中制得的检测羊棘球蚴抗体用抗原进行鉴定，结果如图5所示。

从图5中分析可知，重组蛋白能和羊包虫病阳性血清反应产生特异性条带，可鉴定为重组目的蛋白。

5、本实施例中检测羊棘球蚴抗体用抗原经过检测其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。

实施例2

本实施例中检测羊棘球蚴抗体用抗原的琼脂扩散板的制备方法，包括以下步骤：向0.8g琼脂糖中加入去离子水90mL和0.1mM PBS 10mL，在磁力搅拌器上加热至琼脂糖完全融化，停止加热，然后加入聚乙二醇6000 1g、MES 1g和氯化钠0.8g，不断搅拌至完全溶化，冷却至45～60℃倒入平皿中，板厚度3.5mm左右。用六角形打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径约5mm、孔距为3mm，用注射器针头挑出孔内琼脂；打孔完毕，将板底部在酒精灯上烘烤封底，使底部琼脂微融化，即可。

实施例3

琼脂扩散方法的建立

1、实验血清的制备：

阳性对照血清：选用来自非疫区、非免疫的2～4月龄健康山羊和绵羊各3头，将羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗按照说明书以专用稀释液稀释后经颈部皮下注射免疫羔羊，1头份/只，28日后按相同剂量和途径加强免疫1次。二免后14日，经颈静脉无菌采血，常规分离血清，-20℃保存备用；

阴性对照血清：选用来自非疫区、非免疫的2～4月龄健康山羊和绵羊各3头，经颈静脉无菌采血，常规分离血清，-20℃保存备用。其余特异性实验血清均按正常免疫途径制备。

2、琼脂扩散板配方的确定

1)不同pH值和不同缓冲液分别配制的琼脂扩散板用于检测棘球蚴EG95抗体阳性血清，检测结果如表1所示。

表1不同缓冲液对棘球蚴EG95抗体阳性血清琼扩效价的结果

从表1中分析可知，当pH值为7.4，缓冲液为PBS时，琼扩效价为1:4。

2)不同比例的促沉淀剂配制的琼脂扩散板用于检测棘球蚴EG95抗体阳性血清，检测结果如表2所示。

表2促沉淀剂棘球蚴EG95抗体阳性血清琼扩效价的结果

从表2中分析可知，当PEG6000和MES加入量均为1g，加入总量为2g时，琼扩效价最高。

3)不同比例琼脂对沉淀线明暗程度的影响，结果如图6所示。

图6中，0.8％、1.0％和1.2％分别为琼脂糖的浓度，从图6中分析可知，不同比例琼脂糖对沉淀线的明暗程度有影响，而琼脂糖浓度为0.8％时沉淀线最明显。

3、反应时间的确定

具体为：琼脂糖扩散板加样后置于37℃反应，在不同时间下观察沉淀线，根据沉淀线出现的明暗程度确定反应时间，结果如图7所示。

图7中，从左到右分别为在24h、48h、72h的观察结果，从图7中分析可知，琼脂扩散板加样后48h出现的沉淀线最明显，因此，选择48h为观察的反应时间。

4、抗原工作浓度的确定

具体为：将棘球蚴EG95抗体阳性血清加于中间孔，周围孔加不同浓度的EG95蛋白，确定抗原工作浓度，结果如图8所示。

图8中，孔1～5分别是EG95蛋白浓度为0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL和1.4mg/mL，孔6为阴性对照。从图8中分析可知，当EG95蛋白浓度为1.0mg/mL时，出现的沉淀线最为清晰，为节约抗原，确定EG95蛋白工作浓度为1.0mg/mL。

5、血清稀释度的确定

具体为：将棘球蚴EG95抗体阳性血清，以第1-5孔依次为1:1～1:5倍比稀释，第6孔阴性血清，结果如图9所示。

从图9中分析可知，阳性血清以1:2～1:4倍比稀释后仍可出现沉淀线，但以原液(1:1稀释)出现的沉淀线致密清晰，而阴性血清原液及各个稀释度皆不出现沉淀线。据此，以血清原液做定性检测。

6、交叉反应性

具体为：利用AGP检测国家规定羊强制免疫疫苗抗体阳性血清，中间孔加入EG95蛋白，周围孔1～4分别加棘球蚴EG95抗体阳性血清、***病毒O型抗体阳性血清、PPRV抗体阳性血清和布氏菌抗体阳性血清，孔5和6为棘球蚴EG95抗体阴性血清。结果如图10所示。

从图10中分析可知，棘球蚴EG95抗体阳性血清出现沉淀线，其余血清均无沉淀线，从而证明了，建立的AGP检测方法不与上述强免血清发生交叉反应，特异性好。

7、AGP检测灵敏度

具体为：取5份棘球蚴EG95抗体阳性血清稀释后进行检测，结果如表3所示。

从表3中分析可知，检测的最大血清稀释度为1:4，即血清的检测极限为1:4稀释。

表3棘球蚴EG95抗体阳性血清AGP检测极限

8、临床血清样品检测

具体为：利用建立的AGP检测方法对90份疫苗免疫前后采集的血清进行检测，结果如表4所示。

表4 90份临床血清样品的检测

注:“-”表琼扩抗体试验阴性。

从表4中分析可知，免疫前血清100％(30/30)阴性；一免后28天血清阳性率90％(27/30)，且只有血清原液出现沉淀线；二免后14天血清100％(30/30)阳性，且抗体效价介于1:2～1:4之间，从而证明了，该琼脂扩散板的检测方法具有良好的适用性。

当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 重庆澳龙生物制品有限公司

<120> 一种检测羊棘球蚴抗体用抗原及琼脂扩散板的制备方法

<160> 2

<210> 1

<211> 468

<212> RNA

<213> EG95核酸

<400> 1

ATGGCATTCC AGTTATGTCT CATTTTGTTT GCGACTTCAG TTTTGGCTCA GGAATACAAA 60

GGAATGGGCG TAGAGACAAG GACAACAGAG ACTCCGCTCC GTAAACACTT CAATTTGACT 120

CCTGTGGGTT CTCAGGGCAT TCGCTTAAGT TGGGAAGTCC AACACTTGTC TGACCTCAAA 180

GGAACAGATA TTTCTCTAAA AGCGGTGAAT CCTTCTGACC CGTTAGTCTA CAAAAGACAA 240

ACTGCAAAAT TCTCAGATGG ACAACTCACT ATCGGCGAAC TGAAGCCCTC CACATTATAC 300

AAAATGACTG TGGAAGCAGT GAAAGCGAAA AAGACCATTT TGGGATTCAC CGTAGACATT 360

GAGACACCGC GCGCTGGCAA GAAGGAAAGC ACTGTAATGA CTAGTGGATC CGCCTTAACA 420

TCCGCAATCG CTGGTTTTGT ATTCAGCTGC ATAGTGGTTG TCCTTACT 468

<210> 2

<211> 156

<212> 氨基酸

<213> EG95蛋白

<400> 2

Met Ala Phe Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala

1 5 10 15

Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro

20 25 30

Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg

35 40 45

Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile

50 55 60

Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln

65 70 75 80

Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro

85 90 95

Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr

100 105 110

Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys

115 120 125

Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala

130 135 140

Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr

145 150 155 156