阅读说明：本技术 一种吖啶酯抗体标记方法及其应用 (Acridinium ester antibody labeling method and application thereof ) 是由 胡文波 于 2020-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种吖啶酯抗体标记方法及其应用；所述方法为：1)量取标记缓冲溶液于离心管中；2)加入髓过氧化物酶检测抗体,充分混匀；3)加入吖啶酯溶液,充分混匀,室温避光震荡反应；4)加入适量封闭液,室温避光振荡反应；5)加入适量的标记缓冲液定量,2～8℃密封保存。该方法可以得到灵敏度更高、线性范围广、也便于实现自动化的MPO检查产品。(The invention discloses an acridinium ester antibody labeling method and application thereof; the method comprises the following steps: 1) measuring a marking buffer solution in a centrifuge tube; 2) adding myeloperoxidase detection antibody, and mixing; 3) adding the acridinium ester solution, fully and uniformly mixing, and carrying out vibration reaction at room temperature in a dark place; 4) adding a proper amount of confining liquid, and carrying out shaking reaction at room temperature in a dark place; 5) adding a proper amount of a labeling buffer solution for quantification, and sealing and storing at 2-8 ℃. The method can obtain MPO inspection products with higher sensitivity, wide linear range and convenient realization of automation.)

一种吖啶酯抗体标记方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种化学发光法检测试剂盒制备过程中吖啶酯抗体标记的方法。

背景技术

心血管疾病是我国慢性病之首，其死亡占疾病死亡构成40％以上，高居首位，致残率也近40％，严重威胁个人的生命健康，给家庭、社会带来巨大的经济负担和精神痛苦。而且，近年来该病的年轻化趋势越来越明显，三四十岁心源性猝死的情况屡见不鲜。如此高的致死、致残率主要是因其发病急、进展快，很多患者无法得到及时有效的救治。因此，早发现、早治疗是避免严重不良后果发生的有力措施。

大量临床研究资料表明，髓过氧化物酶(MPO)水平在不良心血管事件发生前的几个月就有明显升高，且其含量水平与冠脉病变具有显著相关性，监测血液中MPO水平可以评估表征健康人群发生CAD、以及ACS患者复发心血管意外事件的风险，其漏诊率只有 9.3％，对于风险人群或轻微症状人群检测MPO有利于急重症的及时发现，从而使避免恶性事件发生成为可能。但目前MPO的检查方法多为酶联免疫、比浊法及胶体金法，由于方法学的限制，检测的灵敏度、稳定性、线性范围等都难以满足临床的需求，影响MPO 在及时诊断尽早治疗方面作用的发挥。

因此，急需一种检测方便快捷的同时，结果更加准确的MPO检测手段，如化学发光法。化学发光(ChemiLuminescence，简称为CL)法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。化学发光分析法具有灵敏度高、设备简单、操作方便、线性范围广、分析快、也便于实现自动化等优点。吖啶酯是化学发光法常用的发光剂，吖啶酯标记抗体的工艺直接影响发光效率，即影响检测结果的灵敏度及准确性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种化学发光法检测髓过氧化物酶时吖啶酯的抗体标记方法，以实现效率更高、结果更准确的MPO检测。具体技术方案如下：

本发明所述吖啶酯抗体标记的方法，包括以下步骤：

1)量取标记缓冲溶液于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液，充分混匀，室温避光震荡反应；

4)加入适量封闭液，室温避光振荡反应；

5)加入适量的标记缓冲液定量，2～8℃密封保存。

上述步骤1)的缓冲溶液为PB缓冲液(磷酸缓冲液)。该环节可用缓冲液比较多，如PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)、CB缓冲液(碳酸盐缓冲液)等，不同的缓冲液体系及其浓度和pH都会影响吖啶酯的反光强度。本发明的标记缓冲液优选为0.1mol/L，pH7.6 的PB缓冲液。步骤5)的缓冲液同步骤1)。

本发明所述方法的吖啶酯与髓过氧化物酶抗体加入量的比值为2:(4-6)，该比值为重量比。实现对不同抗体的检测，吖啶酯与抗体的用量比差异非常大，不适当的配比会出现发光信号弱或非特异性结合等情况，导致检测灵敏度低或结果不准确。所以针对 MPO抗体的检测，吖啶酯与抗体用量关系是需要付出创造性劳动获得的。

在一优选实施例中，本发明所述吖啶酯与髓过氧化物酶抗体加入量的比值为2:5。

上述步骤3)抗体与吖啶酯室温避光震荡反应的时间为110-130分钟。通常该反应时间的长短会影响抗体偶联程度，发光信号强度，但随着时间延长，会出现假阳现象，因此，需要考察两者的最佳结合点。

所述步骤4)的封闭液为10％浓度的BSA(牛血清白蛋白)溶液，该封闭液的溶解度更好。进一步的，封闭液的反应时间为25-35分钟。

在另一优选实施例中，本发明所述的方法包括以下步骤：

1)量取0.1mol/L，pH7.6的PB缓冲溶液3mL于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体250μg，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液(1mg/mL)100μL，充分混匀，室温避光震荡2小时；

4)加入适量封闭液至BSA浓度为1％，室温避光振荡反应30分钟；

5)加入适量的标记缓冲液至6mL，2～8℃密封保存。

其中，步骤4)是指，向吖啶酯标记抗体溶液中加入适量10％的BSA溶液，使BSA 的浓度降为1％。

本发明还提供上述方法得到的标记吖啶酯在制备化学发光法检测髓过氧化物酶的试剂盒中的应用。本发明所述方法制得的MPO检检测试剂盒，其检测特异性和发光信号均很强，灵敏度高。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明所述方法吖啶酯与抗体偶联充分、发光信号强，且无非特异性结合及假阳性现象，该标记方法简单，重复性好，便于大规模应用。以该方法可以得到灵敏度更高、线性范围广、也便于实现自动化的MPO检查产品。

具体实施方式

实施例1(以50次测试/批为例，下同)

一种吖啶酯抗体标记的方法，该方法包括以下步骤：

1)量取0.1mol/L，pH7.6的PB缓冲溶液3mL于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体250μg，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液(1mg/mL)100μL，充分混匀，室温避光震荡2小时；

4)加入10％的BSA溶液345μL，混匀，室温避光振荡反应30分钟；

5)加入适量的标记缓冲液至6mL，2～8℃密封保存。

实施例2

一种吖啶酯抗体标记的方法，该方法包括以下步骤：

1)量取0.1mol/L，pH7.4的PB缓冲溶液3mL于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体200μg，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液(1mg/mL)100μL，充分混匀，室温避光震荡110分钟；

4)加入10％的BSA溶液345μL，室温避光振荡反应30分钟；

5)加入适量的标记缓冲液至6mL，2～8℃密封保存。

实施例3

一种吖啶酯抗体标记的方法，该方法包括以下步骤：

1)量取0.1mol/L，pH7.6的PB缓冲溶液3mL于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体200μg，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液(1mg/mL)100μL，充分混匀，室温避光震荡130分钟；

4)加入10％的BSA溶液345μL，室温避光振荡反应25分钟；

5)加入适量的标记缓冲液至6mL，2～8℃密封保存。

实施例4

一种吖啶酯抗体标记的方法，该方法包括以下步骤：

1)量取0.1mol/L，pH7.6的PB缓冲溶液3mL于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体300μg，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液(1mg/mL)100μL，充分混匀，室温避光震荡130分钟；

4)加入10％的BSA溶液345μL，室温避光振荡反应25分钟；

5)加入适量的标记缓冲液至6mL，2～8℃密封保存。

实施例5

一种吖啶酯抗体标记的方法，该方法包括以下步骤：

1)量取0.1mol/L，pH7.4的PB缓冲溶液3mL于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体250μg，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液(1mg/mL)100μL，充分混匀，室温避光震荡130分钟；

4)加入10％的BSA溶液345μL，室温避光振荡反应35分钟；

5)加入适量的标记缓冲液至6mL，2～8℃密封保存。

实施例6

一种吖啶酯抗体标记的方法，该方法包括以下步骤：

1)量取0.1mol/L，pH7.4的PB缓冲溶液3mL于离心管中；

2)加入髓过氧化物酶检测抗体300μg，充分混匀；

3)加入吖啶酯溶液(1mg/mL)100μL，充分混匀，室温避光震荡120分钟；

4)加入10％的BSA溶液345μL，室温避光振荡反应25分钟；

5)加入适量的标记缓冲液至6mL，2～8℃密封保存。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。