阅读说明：本技术 生物杀虫剂 (Biological insecticide ) 是由 本·雷蒙德 尼尔·克里克莫尔 于 2018-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株,所述菌株在表型上是稳定的并且与野生型菌株相比具有增加的毒力,其中,所述增加的毒力通过在一次或多次传代期间将菌株暴露于诱变剂中而获得。这样的菌株特别适合用作生物杀虫剂。还描述了增加微生物杀虫剂中毒力的方法。(The present invention relates to a Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis) strain which is phenotypically stable and has increased virulence compared to a wild-type strain, wherein the increased virulence is obtained by exposing the strain to a mutagen during one or more passages. Such strains are particularly suitable for use as biopesticides. Methods of increasing the toxicity of microbial pesticides are also described.)

生物杀虫剂

技术领域

本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株及其用途，特别是其作为杀虫剂的用途。本发明还涉及包含苏云金芽孢杆菌菌株的组合物。此外，本发明涉及使用在宿主害虫种群中进行选择来使微生物杀虫剂传代以增加微生物杀虫剂的毒性的方法。

背景技术

现有的害虫防治技术具有局限性。微生物杀虫剂和遗传修饰(GM)作物的功效与它们的化学或合成对应物一样不断受到抗性演化的威胁。在选择之前，一些重要的害虫对现有的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的易感性相对较低，而响应于微生物Bt杀虫剂的使用，鳞翅目的数个物种，尤其是小菜蛾(Plutella xylostella)已经产生了抗性。在某些情况下与田间防治失败有关的对GM作物的抗性增加也开始出现(1，2)。

应对抗性的一种策略是依靠发现新毒素。已经分离并表征了具有非常多样化的Cry毒素的大量Bt菌株。然而，尽管已知有许多毒素，但是很少有可以与一种特定类别(Cry1群组)的效力和广泛宿主相配的良好毒素。大多数的田间抗性响应于这些毒素而形成；Cry1毒素是对GM植物进行工程化的毒素的最常见类型(2)。如果这类的效力败给抗性，那么几乎没有类似的有效替代品。因此，可供选择的方法是尝试和修饰现有的充分表征的蛋白质以提高对抗性或耐受性害虫的毒性(3，4)。修饰当前利用的蛋白质的商业上重要的第二个益处是，与全新产品相比，其许可往往更容易且更便宜。

为了响应这种对修饰毒素的偏爱，有几家公司已使用随机毒素诱变(“定向演化”)作为发现具有所需特性的毒素变体的手段。筛选突变体库的旧方法依赖于繁琐的生物测定和测序的组合。最近，一种成功方法对“噬菌体展示”方法进行了改进，开发对诱变的Cry蛋白的合成物体外筛选(5)。然而，这种体外方法确实具有产生对昆虫幼虫肠道蛋白酶敏感的Cry蛋白(5)的局限性。这也是受缚于单个蛋白质-蛋白质相互作用的过程，然而通常，基于蛋白质工程的方法只能应用于基于修饰蛋白质的转基因表达的生物防治方法。Bt原始且仍非常成功的应用是作为基于孢子和毒素的微生物产品。在生物体水平上改良生物防治产品的人工选择方法对于传统生物防治领域的菌株改良仍然可能是有价值的。

微生物实验演化虽然仍是一个小领域，但对演化生物学产生了重大影响，并解决了基本的共演化、生态学和种群遗传学问题(6-9)。许多微生物，包括Bt，可以在实验室条件下迅速获得大量有益的突变(8，10，11)。实验演化为克服抗虫性提供了一种无机制的解决方案，并且可能适用于许多虫害和多种病原体。

昆虫病毒的实验传代已成功用于增加生物防治剂的毒力以及用于鉴定具有改善的针对抗性宿主的作用的基因型(12)。病毒的高突变率使其成为通过选择进行改良的合适靶标。提高细菌病原体(例如Bt)适应抗性或耐受性宿主的速度的一种方法是提高其突变率。在不断发展的细菌种群中，高突变的菌株或“增变体”(13)(校对基因有缺陷)与大部分新的有益突变相关。突变率提高会赋予抗性宿主以增加的适应率的理论得到了广泛支持。例如，增变体通常通过强选择(14，15)和共演化军备竞赛(coevolutionary arms races)(16)而受到青睐。与野生型菌株相比，增变体在模型昆虫宿主中演化出更高的毒力(17)。在艰难的选择下，即当生物的表型必须超过某个临界值以使其繁殖时，增变体可能更能赋予增强的适应性。在病原体中，这种类型的选择可能是普遍的，病原体可能必须表达某一阈值水平的毒力因子以便进入宿主(18，19)。在突变供应有限的小种群中，高突变率有望带来更多益处(18，19)。在每一轮侵染中，Bt都经历非常窄的种群瓶颈(20，21)，因此有效的种群大小可能是小的。增变体具有较高的重组率(22)，这可以促进大规模的遗传变化。虽然增变体可以获得有害突变，并预期会通过长期选择而被淘汰，但实验演化表明，它们可以在种群中持续数千代，而不会通过逆转或重组而被淘汰(19)。

在理解微生物毒力方面，最近的一项重要进展是“社会演化”理论的应用，即与维持合作或利他性状有关的观念(7，24，25)。微生物以被称为公共物品生产的协同行为的形式参与。从经济角度讲，公共物品是使整个社区受益但对个人而言代价高昂的物品或服务。在细菌中，这种公共可用性是通过将代谢物长距离分泌到胞外空间而发生的。细菌公共物品包括生物膜、子实体的非孢子成分、毒力因子和对养分获取很重要的酶(25-28)。至关重要的是，这包括由Bt产生的Cry毒素，并且在一定程度上包括受群体感应调节的一系列营养产生因子(21，28)，这些因子对于使这些细菌能够入侵昆虫宿主至关重要。两个关键因素对于维持协同毒力很重要：高度相关性(或群组内的多样性低)和促进群组之间的竞争的种群结构(7)。关联性至关重要，因为通过多样化侵染，基因型之间的竞争将有利于“欺骗者(cheater)”突变体，这些突变体为有利于快速生长已经使昂贵的毒力产生无效。种群结构是将种群划分为一致的群组，这有助于对有利于群组而非个体的性状进行群组水平的选择。

本发明的目的是克服与当前害虫防治有关的一个或多个问题。另一个目的是提供一种改进的害虫防治。优选地，害虫防治将利用诸如苏云金芽孢杆菌的微生物，并且菌株将具有更高的毒力特征。希望开发出能够使苏云金芽孢杆菌演化出多样化菌株并能够从多样化的池中选择最有效/毒力最强的菌株并改善毒力的方法。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株在表型上是稳定的并且与野生型菌株相比具有增加的毒力，其中，通过在一次或多次传代中将菌株暴露于诱变剂中实现增加的毒力。

根据本发明的另一方面，提供了一种苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株包括苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis kurstaki)NCTC17080301或苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC 17080302或其突变体或衍生菌株。

优选地，苏云金芽孢杆菌菌株相对于其祖先具有增加的毒力。苏云金芽孢杆菌菌株毒力的增加可以是其祖先毒力的至少10倍。更优选地，苏云金芽孢杆菌菌株毒力的增加可以是其祖先的毒力的至少100倍。

诱变剂可包括甲磺酸乙酯(EMS)。

苏云金芽孢杆菌菌株可以用作杀虫剂。优选地，苏云金芽孢杆菌菌株相对于其祖先对害虫具有增加的毒力。

已经发现本发明的菌株有利地具有增强的针对目标害虫的杀灭能力，所述害虫包括具有至少一定程度的杀虫剂抗性的那些害虫。

苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治害虫，所述害虫包括昆虫、螨虫、线虫和腹足。苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治以下中的一种或多种：鳞翅目、双翅目、鞘翅目和线虫。

苏云金芽孢杆菌优选可用于防治以下中的一种或多种：蚜虫、其他半翅目害虫、蓟马、鳞翅目幼虫、双翅目幼虫、鞘翅目幼虫、叶螨、蝗虫、蟋蟀、蚂蚁、蟑螂、苍蝇、黄蜂、白蚁木虫、木蚁、蛀书虫、蠹虫、皮蠹、衣蛾吉普赛蛾、恙螨、疥螨(Sarcoptes scabiei)、扁虱、螨虫、虱子、跳蚤、臭虫、蚊子、采采蝇、猎蝽、根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯胞囊线虫、蛞蝓和蜗牛。

苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治昆虫。优选地，将苏云金芽孢杆菌菌株用于防治鳞翅目类。苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治小菜蛾(Plutella xylostella)及其幼虫。

苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治包括农作物在内的植物的害虫。优选地，苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治十字花科(Brassicaceae)植物的害虫。具体而言，苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治十字花科植物的害虫。苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治以下植物的害虫：辣根、陆生水芹(land cress)、埃塞俄比亚芥末、羽衣甘蓝、绿衣甘蓝、芥兰、卷心菜、皱叶甘蓝、球芽甘蓝、球茎甘蓝、西兰花、球花甘蓝、罗马花椰菜、花椰菜、野生西兰花、白菜、小松菜、日本芜菁、西洋菜台、菜心、大白菜、芜菁根、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、西伯利亚羽衣甘蓝、油菜/油菜籽、包心芥菜、芥菜籽、白芥菜籽、黑芥末籽(black mustard seed)、白菜心、野生芝麻菜、芝麻菜、田间椒草、玛卡、独行菜、西洋菜(watercress)、小萝卜(radish)、大根萝卜(daikon)和山葵。

苏云金芽孢杆菌菌株可施用于植物的土壤、土壤附近或土壤中。苏云金芽孢杆菌菌株可以施用于植物的叶、茎、花和/或根。

苏云金芽孢杆菌菌株对Cry易感昆虫具有与其祖先相似的效力水平。因此，针对Cry易感昆虫的有效施用率可以为每cm²作物表面积0.01mg至0.1mg苏云金芽孢杆菌菌株或每cm²作物表面积10,000到100,000个苏云金芽孢杆菌孢子。虽然对Cry1A抗性昆虫的有效施用率将取决于苏云金芽孢杆菌菌株对该基因型的确切抗性水平和功效，但是可以为每cm²作物表面积0.01mg至0.5mg苏云金芽孢杆菌菌株或每cm²作物表面积10,000到500,000个苏云金芽孢杆菌孢子。

优选地，苏云金芽孢杆菌菌株可包括苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种(Bacillusthuringiensis entomocidus)、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensisaizawai)或苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种。

根据本发明的另一方面，提供了一种苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或与这些序列具有95％或更高同源性的相关序列。

苏云金芽孢杆菌菌株可以是苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株。

如果苏云金芽孢杆菌菌株包含相关序列，优选的是，相关序列与SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4具有高达96％或以上的同源性，更优选地，相关序列与SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4具有97％或以上的同源性。甚至更优选地，相关序列与SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4具有98％或以上的同源性。最优选地，相关序列与SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4具有99％或更高的同源性。

对于本领域技术人员显而易见的是，结合本发明的某些方面所描述的任何特征、整体、特性或化合物，除非不兼容，否则都可以等同地应用于本发明的其他方面。

根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，该组合物包含苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株包括苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC17080301或苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC 17080302或其突变体或衍生菌株。

根据本发明的另一个相关方面，提供了一种组合物，该组合物包含苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或与这些序列具有95％或更高同源性的相关序列。

苏云金芽孢杆菌菌株可以以孢子或晶体的形式添加到所述组合物中。

该组合物可以是固体或液体的形式。

该组合物可以进一步包含以下成分中的一种或多种：润湿剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂和表面活性剂。该组合物可以包含分散介质，例如水或食用油。

该组合物可以用于杀虫剂或被用作杀虫剂。

该组合物可以施用于植物和/或土壤表面(或附近)。可供选择地，可将组合物掺入土壤本身中。该组合物可以通过喷雾、铺开或喷洒施用于植物和/或土壤。该组合物可以施用于植物的叶、茎、花和/或根。

在本发明的另一方面，提供了一种改善微生物杀虫剂的毒力的方法，所述方法包括：

(a)将害虫种群划分为亚群；

(b)使害虫亚群接触一种或多种微生物杀虫剂；

(c)从死亡率最高的亚群中选择害虫尸体；

(d)用害虫尸体接种孢子形成培养基，以便为随后的侵染提供足够的易于定量的接种物；

(e)从选择的尸体中纯化微生物孢子并对微生物孢子进行定量，以鉴定具有改善的毒力的微生物杀虫剂；并且

其中微生物杀虫剂暴露于诱变剂。

该方法可以进一步包括使用来自步骤(e)的微生物孢子侵染一个或多个第二害虫种群。

可以通过使用步骤(e)中纯化的微生物孢子侵染一种或多种害虫种群来重复步骤(a)至(e)。步骤(a)至(e)可以被定义为传代，并且所得的微生物可以被定义为经传代的微生物。任选地或优选地，微生物杀虫剂在每次传代时反复暴露于诱变剂。可供选择地，微生物杀虫剂可以在交替的传代或仅在初次传代期间暴露于诱变剂。来自步骤(e)的纯化的孢子可用于侵染至少2个害虫种群。优选地，步骤(a)至(e)至少重复一次。步骤(a)至(e)可以重复至少5次。

在步骤(c)期间可以基于害虫种群的总死亡率达到20％至40％来选择尸体。优选地，在步骤(c)期间基于害虫种群的总死亡率达到25％至30％来选择尸体。

上述方法提供了昆虫集合种群中死亡率的群组水平竞争，有利地，这意味着病原体仅选自具有高死亡率水平的群组以进一步传代。

一个或多个害虫种群可以包括遗传变异种群。这使病原体能够适应难以杀灭的宿主。害虫种群可以包括对微生物杀虫剂或由微生物杀虫剂产生的一种或多种有毒化合物的不同水平的抗性。害虫种群可以包括对微生物杀虫剂或由微生物杀虫剂产生的一种或多种有毒化合物的中等水平的抗性。

该方法可以用于提供微生物杀虫剂库。在本发明的某些实施方式中，提供了通过上述方法生产的微生物杀虫剂库。该库可以由毒力与野生型微生物杀虫剂的毒力相比增加的多种微生物杀虫剂形成。

诱变剂可包含甲磺酸乙酯(EMS)。在该方法中，可以将微生物杀虫剂与0.05％至1.0％EMS一起孵育。可以将微生物杀虫剂与0.1％至0.5％EMS、0.1％至0.4％EMS、0.1％至0.3％EMS、0.1％至0.2％EMS一起孵育。最优选地，将微生物杀虫剂与约0.2％EMS一起孵育。

诱变剂优选在接种孢子形成培养基之前与选择的害虫尸体一起孵育。还优选地，在接种孢子形成培养基之前基本上除去诱变剂。可以通过多种方法除去，例如离心。

来自步骤(e)的纯化的微生物孢子可以用作杀虫剂。

微生物可以是杀虫剂。微生物可以是具有确定的致病性的杀虫剂。微生物杀虫剂可以包括细菌。优选地，该细菌包括苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌菌株可以是苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种或苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种。优选地，苏云金芽孢杆菌菌株包括苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(B.thuringiensis tenebrionis)、苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensis israelensis)或任何其他昆虫或线虫病原性苏云金芽孢杆菌菌株。

该害虫可以是昆虫、螨虫、线虫或腹足。优选地，该害虫为蚜虫、其他半翅目害虫、蓟马、鳞翅目幼虫、双翅目幼虫、鞘翅目幼虫、叶螨、蝗虫、蟋蟀、蚂蚁、蟑螂、苍蝇、黄蜂、白蚁木虫、木蚁、蛀书虫、蠹虫、皮蠹、衣蛾吉普赛蛾、恙螨、疥螨(Sarcoptes scabiei)、扁虱、螨虫、虱子、跳蚤、臭虫、蚊子、采采蝇、猎蝽、根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯胞囊线虫、蛞蝓和蜗牛。

优选地，害虫是鳞翅目类。害虫可能是小菜蛾(Plutella xylostella)及其幼虫。

微生物可能是突变的。微生物可以通过化学诱变而突变。优选地，微生物是通过使mutS基因失活而突变的细菌。有利地，高突变体或“增变体”与高比例的新的有益突变相关，并且增加的突变率可以赋予增加的对抗性宿主的适应率。增变体还具有较高的重组率，这可以促进大规模的遗传变化。

在本发明的另一方面，提供了一种用于筛选微生物中改善的毒力的方法，包括：

使纯化的微生物杀虫剂孢子生长；

侵染害虫种群；和

记录害虫死亡数。

可以用至少1个剂量的微生物杀虫剂孢子来侵染害虫种群。优选地，用至少3个剂量的微生物杀虫剂孢子来侵染害虫种群。每微升可存在10¹至1.2×10⁵个孢子。

在本发明的另一方面，提供了通过使用以上方法生产或鉴定的微生物和/或生物杀虫剂。

具体实施方式

现在仅以举例的方式描述本发明的实施方式，其中：

图1是示出根据群组选择和池选择方法用细菌孢子侵染昆虫种群的步骤的示意图。

图2是条形图，示出了暴露于祖先苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(wt anc)、未演化的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种和演化处理的Cry1Ac抗性小菜蛾幼虫的早期幼虫死亡率。数据是在2次重复生物测定(每次以3种剂量处理4个重复谱系)上池化的平均值和SE；

图3是6个图表的组，示出了暴露于祖先苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(wt anc)、未演化的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种和演化处理的Cry1Ac抗性小菜蛾幼虫的总死亡率。数据是每剂量的死亡比例(n＝50至60只幼虫)，用不同符号表示处理中的重复谱系。线是针对每个谱系和每个生物测定而拟合的拟合统计模型(反变换成为概率)。线类型表示(虚线或实线)独立的生物测定。剂量是每微升活孢子；

图4是2个图表，示出了表现最佳的野生型克隆(p3c2)与其祖先和用于针对抗性幼虫的替代性商业化Bt分离株(XenTari)相比对抗苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种抗性和易感的小菜蛾的功效。数据是来自生物测定的5天原始死亡率(每剂量n＝60只幼虫)；

图5是2个图表，示出了毒力增加的选择的演化克隆p3c1(苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC 17080301)和p3c2(苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC17080302)相对于祖先在初始频率的范围内的相对适应度。数据基于估计的马尔萨斯参数的比率；虚线表示拟合的线性模型，其中SE为灰色。每种处理N＝40至50只幼虫；

图6是2个图表，示出了抗Cry1Ac抗性和易感幼虫的数据。

图7是示出了Cry1Ac易感幼虫的交替背景克隆生物测定的图表。

图8是3个图表，示出了对共演化的幼虫、Cry1Ac抗性幼虫和Cry1Ac易感幼虫的抗性和共演化传代处理的生物测定；和

图9是示出了在毒素库选择实验中评估初始混合物、HCO和HCO+EMS的毒素类别的生物测定结果的图表。

实施例

第一个实验试图增加苏云金芽孢杆菌肠杆菌库斯塔克亚种对小菜蛾(DBM；Plutella xylostella)的昆虫宿主基因型的毒力，该昆虫宿主基因型对侵染具有高抗性(LC50≈10⁵个孢子)。突变的供应由演化的野生型和增变体(mut)细菌控制。此外，以两种方式施加群组水平选择：第一种处理是在每一轮侵染中使亚群中的幼虫池化，这是应根据昆虫内部高细菌种群大小进行选择的方案以及以前使毒力适度增加的方案(11)。第二种选择处理在死亡率上，在集合种群(meta-population)中施加群组水平竞争：在每轮选择中，病原体仅由高死亡水平的群组传播。在第二种选择实验中，演化出Bt生物杀虫分离株(苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种i(B.t entomocidus i))，该分离株在小菜蛾中已经具有相当有效的毒力(LC50≈10²个孢子)。在本实验中，我们使用诱变剂(EMS)以提供另外的突变来代替增变体菌株，并改变用于对毒力施加选择的昆虫遗传背景，以便改善毒力的演化或产生能够以更高的功效侵染多于一种基因型的突变体。

使用和构建的菌株

野生型苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株通过用包含赋予红霉素抗性的ermB基因的pHT315-gfp质粒转化7.1.o菌株而获得(21)。用10ug/mL红霉素进行体外供养。在昆虫尸体中生长时，使用300μg/mL的红霉素来抑制革兰氏阴性细菌的生长。通过在7.1.o中使mutS基因失活而获得mut(增变体)菌株。合成了包含cat基因***序列的mutS编码序列片段，并将其克隆到热敏载体pRN1501的BamHI位点内(29)。在42℃下生长后，通过针对氯霉素(Cm)抗性和丧失红霉素抗性进行筛选，获得断裂的mutS序列重组到染色体仲的克隆。通过PCR和mutS基因座测序确认***序列。通过波动试验确认所得到的mut菌株的增变体表型，该波动试验表明与wt菌株相比突变率增加了40倍。mut菌株在5ug/mL Cm存在下生长。传代实验2中的苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种的菌株从商业芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus Genetic Stock Centre；BGSC4I4)获得并用上述包含ermB基因的pHT315-gfp质粒转化。

传代实验1；竞争规模和突变供应

将用于选择的小菜蛾幼虫在无补充抗生素的高压灭菌人工饮食中饲养(30)，直到第三龄期。用于选择实验的Bt菌株首先从单个菌落进入100mL含适当抗生素的孢子形成培养基(HCO)中生长，然后进行巴氏灭菌(65℃，20分钟)。然后，每种处理使用4个重复谱系进行选择。用于实验的小菜蛾的Cry1Ac抗性品系来自NOQA-GE(来自David Heckel，MaxPlanck，Jena)与饮食适应性易感品系Vero Beach(来自Oxitec UK)的杂交，选择该品系是为了抵抗Cry1Ac，该品系表示为“VL-FR”。建立了使用亲本种群的抗性等位基因进行PCR筛选来使抗性固定的种群(31)。由F2后代建立了具有相似遗传背景的昆虫菌株(源自NOQA-GEX Vero Beach)，但在这种情况下该昆虫菌株由于Cry1Ac易感性而被固定，该品系表示为“VL-SS”。

为了进行侵染，将无菌饮食在55mL的培养皿中分成四等份，用90uL含5×10⁴至10⁵个孢子/μL的孢子悬浮液接种每一等份(选择以在2至4周内使抗性小菜蛾产生25％至30％的死亡率)，并干燥。然后每个55mL培养皿中添加10只第三龄期幼虫。从侵染两天后起，记录昆虫的死亡。当总死亡率达到25％至30％时，将最早的尸体转移到带有无菌牙签的微型离心管中。处于室温下两天(20℃至22℃)后，将0.85％NaCl溶液(盐水)添加到试管中。用研棒将尸体匀浆，然后将试管短暂涡旋，并将悬浮液转移至24孔生长板中的含1mL孢子形成培养基的孔中，以进行体外孢子扩增。孢子形成培养基是含有多粘菌素(100IU/mL)(Oxoid)和另外的相关抗生素的HCO(32)：对于含有pHT315:gfp的wt谱系为300μg/mL红霉素，或对于含有染色体cat标记物的mut谱系为5μg/mL氯霉素。在同一品系进行选择的接种孔的行与空行交替，以防止和控制行之间的污染。然后用胶带密封板以限制蒸发，并在30℃下以150rpm搅拌放置三天。

尸体的选择和接种到孢子形成培养基中取决于实验处理方法(如图1所示)。该实验通过对昆虫宿主种群间的亚种群之间的死亡率施加群组水平竞争(群组选择)或对尸体池中病原体的有效复制进行选择(池选择)，比较了毒力的选择功效。对于群组选择处理，将每个谱系分为12个单独维持的种群。选择了幼虫死亡率最高的6个种群；丢弃其他6个种群。如果对几个种群观察到相同的死亡率，则选择最早观察到死亡的种群。将选择的种群的尸体转移到单独的试管中(共6个)。在每个管中添加50μL盐水，并将来自每个管的悬浮液接种到单独的孔中。对孢子进行纯化后(如下所述)，在下一轮选择中，用来自每个孔的孢子接种2个种群。对于池化选择处理，将每个谱系分为6个种群，在每轮选择中使它们一起池化。在池化处理中，将来自6个种群的所有尸体转移到同一离心管中。然后添加300μL盐水，并将悬浮液分配到6个孔中进行接种。为了在接种时，在不同处理之间保持相当的种群大小，仅从在选择时死亡率超过30％的重复谱系中选择了一部分尸体。

生长3天后，将200μL孢子等分试样转移到带有密封铝膜的96孔PCR板中用于定量、下次侵染和保存。将板以3000g离心15分钟，除去上清液，并将孢子重悬于100μL的0.85％NaCl中。将用于下一侵染步骤的含有孢子的板进行巴氏灭菌(20分钟，65℃)，并保持在10℃下直至使用，其余的则在-20℃下保存。通过将10μL孢子稀释到90μL盐水中并在96孔酶标仪(96-well microplate reader)中测量OD600nm来估算孢子密度。将一部分样品适当稀释，铺在LBA板上，以目测检查污染并校准OD600nm测量值。

菌株的表型和基因型表征

生物测定

经过五轮选择，将演化后的谱系在-80℃下(LB 20％甘油)冷冻，无需巴氏灭菌。这些冷冻原种用于接种孢子形成培养基，以对整个种群进行测定。通过划线3次从种群样本中分离出克隆(在补充有20μg/mL红霉素(wt克隆)或5μg/mL氯霉素(mut克隆)的LB琼脂平板上连续的单菌落)。

对于生物测定，将混合的种群或克隆接种到1mL HCO(不含抗生素)中，并在30℃，150rpm搅拌下生长3天。巴氏灭菌后通过在LBA上铺板来测量孢子浓度。

使用独立的孢子原种进行了两次谱系水平测定。每个测定以至少3个剂量进行，每个剂量50至60只昆虫。克隆水平变异的初始筛选在每个谱系检查了6个克隆；在两个剂量下每个剂量使用15至30只昆虫。显示的数据是5天后的死亡数。在传代实验1中，在有活力的孢子(按照LBA上的菌落形成单位计算)方面以及在相对于纯化的孢子原种的接种物稀释因子方面(由于一些克隆在LBA上显示出不同的发芽率)，对克隆筛选进行了分析。在其他生物测定中，采用沿袭谱系测定的方法对目标克隆进行进一步表征，将这些测定重复至少两次。

基因型和表型表征

选择了从野生型和增变体背景演化的10个克隆以及其各自的祖先，在IlluminaHiSeq 2500上在单次多路运行中通过150bp配对末端测序在最小30x覆盖下进行全基因组测序。适当裂解***后，使用Qiagen基因组提取试剂盒提取DNA。使用Velvet组装基因组(33)，并使用PAGIT将基因组映射到祖先的草图组装集和苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD-1的完整组装集中(34)。使用标记的7.1.o野生型祖先菌株测量昆虫内部的相对适应度，该标记的7.1.o野生型祖先菌株用含有赋予四环素抗性的tetR基因的pHT315-rfp质粒转化(21)。因此，该标记的祖先具有主链与演化的野生型菌株相似的质粒，但是基于其独特的抗生素抗性而可辨别。根据对每种昆虫内的两个基因型的相对繁殖率的估计来计算相对适应度，如先前所述(21)。

结果-传代实验1

观察到，经过五轮选择，相对于祖先的野生型，选择处理(池化和群组)之间以及两种遗传背景(野生型和mut)之间的毒力差异明显。图2示出了暴露于祖先苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(wt anc)、未演化的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种和演化处理的Cry1Ac抗性小菜蛾幼虫的早期幼虫死亡率变化。对于早期死亡率，群组水平选择(F_1,44＝6.54，P＝0.014)和增变体背景都提高了演化的Bt品系在杀灭抗性昆虫中的效力(F_1,45＝4.10,P＝0.049)(见图2)。总体(第5天)死亡率数据广泛证实了这些简单的结论。增变体的表现明显优于野生型演化菌株-低至25,000个孢子的剂量通常可产生超过75％的死亡率，而150,000个孢子的祖先无法可靠地产生这种死亡水平。群组选择也比池化选择更有效，尽管野生型谱系的增益要弱于增变体(如图3所示)。由于与生物测定剂量的相互作用的遗传背景和选择处理的影响，对总死亡率的全面分析更为复杂。但是，池化尸体作为选择处理显然不如群组选择(通用线性混合模型(glmm)，z＝-2.37，P＝0.0178)，而增变体在杀灭昆虫方面更有效，因为死亡率更快速地响应剂量(glmm，z＝-10.67，P＜0.0001)(见图3)。图3示出了暴露于祖先苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(wt anc)、未演化的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种和演化处理的Cry1Ac抗性小菜蛾幼虫的总体变化。

然而，重要的是要注意，用演化谱系进行的测定可能是多样化的细菌集合体，并且毒力增强的谱系可能包含克隆变体，这些变体获得对先前的抗性昆虫实质上更高的杀伤力。为了研究这种克隆水平变异，对来自第5代的每个演化谱系的6个克隆以及来自在第3代显示出毒力增强的野生型群组选择谱系的亚群的6个克隆进行划线并表征。对第5代克隆的分析广泛证实了谱系水平测定，因为增变体和群组选择处理鉴定出更多的推定毒力提高的克隆(如下表1所示)。该分析还显示，演化的谱系(尤其是在池化处理中)包含大量相对于祖先毒力降低的克隆(如表1所示)。

处理	毒力提高的克隆	毒力降低的克隆
			mut群组	14	5
mut池	8	6
			野生型群组	9	9
野生型池	3	15

表1(第5代的克隆水平终点分析。在两次剂量区分测定中，每个独立谱系的六个克隆(总共48个)针对毒力相对于其祖先提高或降低进行筛选。这些数据表明在具有二项式误差的逻辑回归模型中，毒力有显著变化(P<0.05)的演化克隆数。

对大量的这些低毒力克隆的测序证实它们是Cry毒素“欺骗者”，这些菌株已经丧失了一种或两种编码大多数Cry毒素基因的大型细菌质粒(如下表2所示)。

表2(演化克隆的基因表征(通过短读全基因组测序)显示了苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种携带Cry毒素的质粒的丢失的不同模式。通过PCR筛选了每种处理群组的24个克隆。)

除了广泛表征大量克隆外，下表3更详细地表征了目标克隆的子集。应注意的是，鉴定出几种突变体的杀伤力增加大于一个数量级(即LC50降低)。对于某些增变体(mgd6)，实际上对于图4中的谱系数据，测定之间的毒力存在很大差异，这很可能与增变体基因型不稳定有关。图5示出了表现最佳的野生型克隆(p3c2)与其祖先和用于针对抗性幼虫的替代性商业化Bt分离株(XenTari)相比对抗苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种抗性和易感小菜蛾的功效。数据是来自生物测定的5天原始死亡率(每剂量n＝60只幼虫)。对表现最佳的克隆p3c2的详细分析表明，它对Bt易感品系VL-SS的毒力有所降低。但是，它的表现与目前用于针对Cry1Ac抗性小菜蛾的Bt菌株(XenTari)一样好，甚至更好(参加图4)。

表3.详细的克隆水平毒力变化(LC50)-对相对于其祖先而言毒力增加的高性能克隆选择，测量根据log₁₀转换的孢子剂量/菌落形成单位μl^-1。

除了测序外，还研究了两个高毒力克隆的演化祖先(p3c1和p3c2(分别为苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC(临时登录号)17080301和苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC(临时登录号)17080302))的相对适应度。由于群体选择有可能增加对个体来说代价高昂的性状发生频率，因此可以预期，该方案可能允许鉴定出比其祖先更有效地杀灭宿主但降低了昆虫竞争适应度的克隆，因为它们已经在毒力因子生产方面演化出更高水平的投入。如所预测的，就竞争适应度而言，克隆p3c2的适应度相对于其祖先大大降低(t＝-4.2，P<0.0001)；而两个克隆都显示出适应度随着其初始频率的增加而降低(t＝-2.3，P＝0.022)(参见图5)，这种模式与社交互动以及苏云金芽孢杆菌产生分泌型毒力因子的成本一致(21，28)。图5示出了选择的毒力增加的演化克隆相对于祖先在初始频率的范围内的相对适应度。数据基于估计的马尔萨斯参数的比率。

传代实验2

第二次传代实验有几个其它目的。首先，重复具有不同细菌基因型(此处为苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种)的群组选择实验方案，其次，测试是否可以提高病原体针对相对易感宿主的毒力。我们选择了苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种(芽孢杆菌遗传保藏中心菌株4I4)作为目标，因为它对Cry 1Ac小菜蛾幼虫是同样有效的(LC50≈490cfu/μl)(图6)，尽管致病性不如苏云金芽孢杆菌肠杆菌库斯塔克亚种。对Cry1Ac的抗性也为该苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种提供了一些交叉抗性(赋予LC50 7900cfu/μl)。在此，我们还着手测试诱变剂(0.02％甲磺酸乙酯(EMS))是否可以用于在选择中代替增变体菌株提供另外的遗传变异以供选择起作用(参见下文)。最后，我们有两个特定的演化假设可以评估：我们测试了选择品系中宿主基因型的多样性是否可以用来普遍提高针对多种昆虫基因型的毒力；这通过在Cry1Ac易感和抗性群体中使Bt谱系交替传代来测试。最后，另外的处理测试了对选择的反应性是否可以通过昆虫宿主和细菌病原体共演化而不是针对具有恒定遗传背景的宿主进行病原体演化来提高。

因此，在此选择实验中有4种处理，全部都使用化学诱变剂：

1.选择Cry1Ac易感幼虫；

2.选择Cry1Ac抗性幼虫；

3.易感和抗性幼虫的交替选择；

4.共演化处理，此处使用对Cry1Ac抗性等位基因(初始频率为10％)异质的幼虫种群来启动传代。在每个独立的重复中，在选择下将从Bt侵染中幸存的幼虫(每个重复约400只)饲养到成年阶段，以为下一次传代提供幼虫。

该选择实验的总体结构遵循实验1中的群组选择设计(图1)。对于每轮传代，都有4种处理，每种处理有10个亚群的4个重复样。一旦死亡率达到>20％，保留死亡率最高/最早的5个亚群的尸体，并从尸体中回收孢子用于下一轮传代。在每轮之间，调整孢子接种以尝试维持约20％的死亡率。

诱变方案

该方案与以前的方案不同，因为在培养基中的生长阶段添加了化学诱变剂，目的是增加变异性以进行选择。实际上，将选择的尸体捣碎并在100μL的LB中在30℃下孵育3小时，接着添加0.2％甲磺酸乙酯(EMS)并再孵育3小时。然后通过离心和重悬去除EMS诱变剂，并通过将重悬体添加到每个亚群1ml HCO中(带有选择性红霉素)并在30℃下孵育6天来产生孢子。EMS的初步起作用确定了产生最大数量的利福平抗性突变体而没有明显细胞死亡的浓度，然后如上所述使用所选的0.2％的浓度。

在最后一轮(第5轮)选择后，在一定范围的孢子稀释液下，针对每个抗性和易感幼虫(以及随后产生的用于抗性和共演化处理的共演化幼虫)对每个重复样中每个选定亚群的孢子进行生物测定。孢子稀释液根据处理和生物测定中的幼虫而变化，以覆盖0％至100％的死亡率，并且在第二轮生物测定中对稀释液进行了精制以更好地实现这一目标。所有分析中都包括祖先的苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种菌株以进行比较。对于所有终点生物测定，孢子均在HCO中生长。

结果-传代实验2

在此，我们研究了使用诱变剂是否还会导致毒力的显著增加；通过选择交替的昆虫基因型中的病原体是否可以抵消对一种Cry1Ac抗性昆虫基因型的专门适应，以及最终地，共演化的昆虫和病原体是否可以加速抗性的演化。

易感幼虫中的苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种和交替处理显着增加了对Cry1Ac抗性和易感宿主的毒力(混合模型二项式误差，χ²＝6.67，df＝2，P＝0.036)(图6)。但是，毒力的增加往往相对较小，仅导致LC50减半；但是除了交替处理中的重复样3(图6中的阴影三角形)外，易感昆虫的LC50降低了10倍(LC50＝53.7cfu/μl)(图6)。相对于其祖先，来自该谱系的多个个体克隆在Cry1Ac易感幼虫中共享相似的毒力增加(图7)。虽然这表明使用化学诱变剂可以促进毒力提高，但交替暴露于不同的遗传背景并不能避免权衡取舍：针对Cry1Ac易感幼虫的毒力增加会伴随对Cry1Ac抗性幼虫的毒力降低。(图6；抗性昆虫中重复样3的LC50为26,900cfu/μl)。注意，其他演化品系显示抗性和易感幼虫的LC50一致减半。

还选择苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种以增加针对Cry1Ac恒定抗性昆虫遗传背景的毒力，并且在共演化的昆虫背景中，随着对毒力选择的进行，抗性增加。这两种选择处理产生的细菌都比其祖先明显更有毒性(图8：抗性幼虫处理-估计值＝1.36，SE＝0.40，t＝3.44，P＝0.00787；共演化的幼虫处理-估计值＝1.23，SE＝0.41，t＝2.99，P＝0.0034)。但是，这两种选择方案在毒力方面均产生了相似的增长(图8)，因此在该实验中，幼虫与病原体共演化不会获得额外的好处。应注意的是，在实验结束时，共演化的幼虫对苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种的抗性水平与Cry1Ac抗性幼虫相似(估计值为0.3，SE＝0.26，t＝1.18，P＝0.24)。在具有抗性和共演化的幼虫的选择处理中，杀灭这些遗传背景的改善似乎并未导致权衡取舍；演化的谱系在Cry1Ac敏感幼虫中未获得降低的毒力(图8)。

毒素库选择实验

在此，我们开始测试群组选择是否可以从Bt毒素Cry1Ac中具有预先存在变异的克隆库中分离出高毒力突变体。以来自毒素变体库的16个克隆的混合物开始选择；每种变体在Cry1Ac中包含1至7个氨基酸变化。每个变体存在于包含赋予红霉素抗性的ermB基因的pHT315质粒中，并在Bt 407Cry-背景中转化。用10ug/mL红霉素在体外供养维持质粒。在从昆虫尸体中生长时，使用300μg/mL的红霉素来抑制革兰氏阴性细菌的生长。

传代实验是根据传代实验1(图1)中所述的群组选择方案进行的，其中使用了Cry1Ac易感的VL-SS昆虫菌株，侵染剂量约为30个孢子/μL(选择以在2至4周内使抗性小菜蛾产生25％至30％的死亡率)。在该实验中，我们采用了两种处理，其中一种是按照传代实验1在HCO培养基中产生孢子，而第二种处理是按照传代实验2(HCO+EMS)所述的方法使用额外的化学诱变。我们进行了三轮选择。选择后，从尸体中分离出来自每个选择重复样的12个克隆，并使用PCR和桑格测序鉴定出Cry变体(每种处理共48个克隆)。

结果-毒素库选择实验

最初的生物测定表明，6个突变体的毒力与阴性对照没有区别，即这些基因型是没有Cry1Ac活性的无效突变体(N135Q；EP8；EP26；EP23；EP14；EP15)。另外，由于氨基酸的变化，3个突变体的毒力有所缓和：EP13(LC50 52个孢子/μl)；EP27(32.7个孢子/μl)和EP24(23个孢子/μl)；这些突变体分别被分类为具有极低、低和中等毒力(参见图9中的阴影)。所有其他突变体的氨基酸变化似乎都不会影响死亡率-这些被分类为“高”毒力，LC50为12孢子/μl。在两种选择处理中，三轮群组选择降低了Cry1Ac无效突变体代表。但是，仅HCO处理也增加了高毒力突变体代表，而在HCO+EMS(诱变剂)处理中，低毒力和中毒力的突变体增加了频率，却以高毒力突变体为代价。

讨论

这些实验证明了许多新颖有效的步骤可用于改进基于苏云金芽孢杆菌或其他昆虫病原体的生物杀虫剂。首先，它证明了对死亡率进行体内选择和对在侵染材料上进行体外堆积的组合可用于使毒力表型产生快速变化。每一轮侵染和孢子形成都花费了不到两周的时间，因此经验丰富的研究人员可以在不到三个月的时间内进行五轮选择。考虑到不同的应用，这些方法对于不同的细菌遗传背景似乎是可重复的。应注意的是，实验可以持续提高在高抗性和中抗性昆虫中的毒力，然而在苏云金芽孢杆菌杀虫亚种传代实验的交替选择方案中有一个重复样确实增加了对易感昆虫的毒力。

重要的是，选择方案的细节对于产生良好的结果至关重要。尽管先前在Bt和其他病原体中进行的选择实验表明，池化细菌群组并对高种群大小进行选择和有效利用资源可以维持对毒力的投入，并生产出死亡时间更短的菌株(7，11)，但此处表明，集合种群中的群组水平竞争产生了毒力增加更大的谱系(见图2，3；表1)，并且在维持Cry毒素的产生方面更有效(见表2)。修改选择设计以在昆虫目标中包括多样化的遗传物质的后果不是很清楚。尽管如此，5/8的重复样在传代实验2中交替和共演化处理中的改进表明，这些修改可以进一步完善选择过程。在这些实验中，目标昆虫与病原体共演化并没有改善对毒力选择的响应。但是，这可能是因为在这些实验中对Cry1Ac(在NA-QAGE来源的昆虫中)的抗性是单基因的，并且在很大程度上是隐性的。对抗性杂合的个体可能不具有可以促进病原体适应的中等水平的抗性，并且可能只是在选择实验中短暂地出现。抗性模式更复杂的目标宿主中的共演化机制可能证明是更加成功的。具有高毒力的演化克隆的表征尚未揭示Cry毒素序列的任何变化；演化后的克隆的毒力水平(见表3)和在昆虫中的繁殖率(如图5所示)也有所变化，表明通过多种机制已实现了改善。

另外，已经表明，群组选择可以促进具有改进的生物防治潜力的克隆的分离，但是这会遭受一些个体水平的成本损失，即，在与祖先竞争中它们的适应性降低(参见图5)。因此，该选择方案具有创建并鉴定出在常规连续传代实验中不会升高至高频的突变体的能力。由于对毒力因子和次生代谢产物的投入预计会导致对于多种病原体(不仅仅是Bt)来说是昂贵的，因此基于群组选择的方案可能具有改善生物防治剂的毒力的广泛潜力。也投入于用于增强毒力的各种次生代谢产物中的其他昆虫病原微生物(例如真菌)也可能对群体水平选择技术有所响应。先前的研究表明，欺骗和冲突可能是昆虫病原线虫类(另一组重要的生物防治剂)中毒力动态变化的原因(35)。与Bt一样，这些生物及其共生体分泌多种基于蛋白质的毒力因子，这些因子对入侵、杀灭和消化其昆虫宿主具有重要意义。而且，该选择实验表明，对欺骗机会和宿主竞争内限制的处理在保持毒力方面更好。此外，在该研究中，基于使尸体中的繁殖率最大化的群体竞争并未导致更好地维持毒力，因为在毒力和使宿主后代产量最大化之间似乎进行了权衡取舍(35)。

虽然在此介绍的方法为对特定昆虫宿主的毒力的一般提高提供了框架，但体内和体外选择的组合也可应用于具有良好毒力特性的适应于更便宜或替代生长培养基的菌株，同时保持杀虫功效。我们已经表明，依赖于通过固定的较高突变率或通过化学诱导的诱变产生遗传变异的方案可以促进针对增加的毒力的选择。在这两种方案中，使用化学诱变剂有两个优点：首先，它不需要使用遗传修饰菌株，其次，选择过程中产生的任何克隆在表型上都更稳定。

我们还证明了概念验证：将这些选择技术应用于具有预先存在的遗传变异的突变体池，在此预先存在的遗传变异的突变体池来源于已经诱变了目标蛋白质的克隆库。应注意的是，在该实验中，在选择实验过程中用诱变剂补充突变源没有益处。

前述实施方式并非旨在限制权利要求所提供的保护范围，而是旨在描述可如何将本发明付诸实践的示例。

生物保藏

本申请涉及以下指明的生物保藏材料，包括两(2)种保藏物：

名称：欧洲细胞培养物保藏中心

地址：英国波顿唐公共卫生，

国家标准培养物保藏中心

PHE培养物保存，微生物服务，

波顿唐

索尔兹伯里，

SP4 0JG

英国

日期：2017年8月3日

登录号：NCTC 17080301(临时号)

描述：苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(p3c1)

保***：埃克塞特大学

-和-

日期：2017年8月3日

登录号：NCTC 17080302(临时号)

描述：苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(p3c2)

保***：埃克塞特大学

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