阅读说明：本技术 苯甲酸半抗原、苯甲酸完全抗原及其制备方法与试剂条 (Benzoic acid hapten, benzoic acid complete antigen, preparation method thereof and reagent strip ) 是由 张吉 张伟涛 张金超 宁波 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种苯甲酸半抗原、苯甲酸完全抗原及其制备方法与试剂条。该苯甲酸完全抗原中,其苯甲酸分子的抗原决定簇能充分暴露,且具有较完整的空间构象,因此,本发明提供的苯甲酸完全抗原具有较好的免疫原性,可用于免疫分析。(The invention discloses a benzoic acid hapten, a benzoic acid complete antigen, a preparation method thereof and a reagent strip. In the benzoic acid complete antigen, the antigenic determinant of the benzoic acid molecule can be fully exposed and has complete spatial conformation, so that the benzoic acid complete antigen provided by the invention has better immunogenicity and can be used for immunoassay.)

苯甲酸半抗原、苯甲酸完全抗原及其制备方法与试剂条

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种苯甲酸半抗原、苯甲酸完全抗原 及其制备方法与试剂条。

背景技术

免疫分析是以抗原与抗体之间特异性识别和可逆性结合反应为基础的痕量 分析方法，其不仅适用于大分子化合物(如蛋白质、核酸、细菌)的检测，也 适用于小分子化合物(如激素、药物)的测定。建立小分子化合物的免疫分析 方法的关键是能够制备出对小分子化合物具有高亲和力和高选择性的抗体。由 于大多数小分子化合物的分子量小于1000，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表 位而无法直接诱导动物机体等产生特异性抗体。然而，小分子化合物可以通过 适当的化学修饰方法，与大分子载体结合，生成小分子化合物-大分子载体的偶 联物，此偶联物即为完全抗原，它可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增 殖及分化，产生特异性抗体。

苯甲酸(Melatonin,MLT)是一种小分子物质，化学名为N-乙酰-5-甲氧 基色胺，分子量仅为232.28D，不具有免疫原性，用于免疫，必须先与蛋白质大 分子载体结合，形成苯甲酸-蛋白质载体偶联的完全抗原后才具免疫原性。然而， 制备苯甲酸-蛋白质载体偶联的完全抗原不能影响苯甲酸的空间构象，而且需要 保持苯甲酸抗原决定簇(如5-甲氧基、N-烷基侧链)的有效性，才能获得效价 高、特异性强的苯甲酸抗体。因此，如何制备具有良好免疫原性的完全抗原是 建立测定苯甲酸的免疫分析方法的难点。

发明内容

本发明提供了一种苯甲酸半抗原，旨在解决上述问题。

根据本申请实施例的第一方面，提供了一种苯甲酸半抗原，其结构式为：

根据本申请实施例的第二方面，提供了一种苯甲酸完全抗原的制备方法， 包括以下步骤：

提供苯甲酸；

将所述苯甲酸溶于适量蒸馏水中，并将PH调至1～2，在4℃环境下冰浴搅 拌10分钟，得到反应液；

将预冷的1M亚硝酸钠溶液缓慢加到反应液中，在4℃环境下继续反应30分 钟，得到如权利要求1所述的苯甲酸半抗原。

根据本申请实施例的第三方面，提供了一种苯甲酸完全抗原，其结构式为：

结构式中，R为载体蛋白，n为5_～20的自然数。

根据本申请实施例的第四方面，提供了一种苯甲酸完全抗原的制备方法， 包括以下步骤：

将如权利要求1所述的苯甲酸半抗原在0～4℃保存，以得到第一反应液；

配置载体蛋白的磷酸盐缓冲液；

将所述第一反应液逐滴加入到所述载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，在0～4℃环 境下搅拌，得到含苯甲酸完全抗原的混合溶液；

将所述混合溶液进行透析后离心，得到含苯甲酸完全抗原的上清溶液。

根据本申请实施例的第四方面，提供了一种检测苯甲酸的胶体金免疫层析 试剂条，包括背板、样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫，其中所述样品垫、金 标垫、反应垫和吸水垫依次设置于所述背板上；所述反应垫上具有检测线和质 控线，所述检测线包被有苯甲酸完全抗原，所述质控线包被有抗苯甲酸抗体金 标复合物的抗体，所述金标垫上喷有苯甲酸抗体金标复合物，所述苯甲酸完全 抗原的结构式为

本申请实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：发明提供的苯甲酸 完全抗原包括苯甲酸分子和载体蛋白，苯甲酸分子和载体蛋白通过连接臂进行 连接，在所述苯甲酸完全抗原中，其苯甲酸分子的抗原决定簇能充分暴露，且 具有较完整的空间构象，因此，本发明提供的苯甲酸完全抗原具有较好的免疫 原性。

本发明提供的检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂条能用于对苯甲酸进行的 免疫检测，大大提高了其检测灵敏度，通过该胶体金试剂盒可快速筛选出苯甲 酸所有阳性样本。

本发明提供的检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂条检测时间短；不需要任何 特殊仪器；操作简便，操作人员无需培训，检测成本低。采用的试纸为常规试 纸，采用的抗体可以按照本发明提供的方法进行制备，可以进行大规模生产， 且生产成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要 使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例制得检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂条的结构示意 图。

标号说明:

10、背板；20、样品垫；30、金标垫；40、反应垫；41、检测线；42、质控线； 50、吸水垫。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部 的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳 动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施 例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使 用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个” 及“该”意在包括复数形式。

下述实施例中试剂和生物材料如无特殊说明，均可从商业渠道获得。

本发明公开了一种苯甲酸半抗原及其制备方法，其中苯甲酸半抗原的结构 式为

该苯甲酸半抗原的制备方法，包括步骤S101-S103。

S101、提供苯甲酸。具体地，该苯甲酸的结构式为

S102、将所述苯甲酸溶于适量蒸馏水中，并将pH调至1～2，在4℃低温冰 浴搅拌10分钟，得到反应液。

S103、将预冷的1M亚硝酸钠溶液缓慢加到反应液A中颜色立即变为淡黄色， 在4℃条件下继续反应30分钟，得到苯甲酸半抗原。

在一个可选的实施例中，本发明公开了一种苯甲酸完全抗原，其结构式为：

结构式中，R为载体蛋白，n为5～20的自然数。

本发明还公开了一种苯甲酸完全抗原的制备方法，包括步骤S201-S204。

S201、将苯甲酸半抗原在0～4℃环境下保存备用，以得到第一反应液。

S202、配置载体蛋白的磷酸盐缓冲液。

具体地，载体蛋白的摩尔浓度为1Ⅹ10^-3mol/L，所述磷酸盐的摩尔浓度为0.01mol/L。

S203、将所述的第一反应液逐滴加入到所述载体蛋白的磷酸盐缓冲液中， 在0～4℃下搅拌反应，得到含苯甲酸完全抗原的混合溶液。

S204、将所述含苯甲酸完全抗原的混合溶液进行透析后离心，得到含苯甲 酸完全抗原的上清溶液。

苯甲酸完全抗原(MLT-BSA偶联物)的结构式为

R为载体蛋白，n为5-20的自然数。

在一个可选的实施例中，上述的载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵 清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维 蛋白原、兔丙种球蛋白和鸡丙种球蛋白中的任一种。

请参照图1所示，本发明还公开了一种检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂 条，其包括背板10、样品垫20、金标垫30、反应垫40和吸水垫50。其中样品 垫20、金标垫30、反应垫40和吸水垫50依次设置于背板10上，样品垫20和 吸水垫50分别设置于背板10的两个端部，反应垫40设置于背板10的中部， 金标垫30的靠近反应垫40的端部的下表面与反应垫40的上表面贴合，金标垫 30上靠近样品垫20的端部的上表面与样品垫20的下表面贴合。反应垫40远离 金标垫30的一端的上表面与吸水垫50的上表面贴合，通过此结构使得待测液 充分溢到反应垫40上，最后被吸水垫50吸收。反应垫40上设置有平行间隔设 置的检测线41和质控线42，检测线41包被有苯甲酸完全抗原，质控线42包被 有抗苯甲酸抗体金标复合物的抗体，金标垫上喷有苯甲酸抗体金标复合物，其 中苯甲酸完全抗原的结构式为

本发明还提供一种检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂条的制备方法，其包 括步骤S301-S303。

S301、苯甲酸抗体、胶体金和金标垫的制备。

具体地，苯甲酸抗体是以苯甲酸完全抗原为免疫原，采用常规方法制备苯 甲酸抗体。胶体金是采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金。

金标垫的制备包括以下步骤，玻璃纤维经过处理液浸渍处理，烘干后，将 苯甲酸抗体金标复合物以0.5～4μl/cm的用量喷涂在预处理的玻璃纤维上， 在25℃～30℃的环境温度下干燥后，得到金标垫，并且将金标垫置于2℃～8℃ 的环境下备用。上述的苯甲酸抗体金标复合物制备时，通过调节胶体金的PH值 至7.0-9.0，在搅拌条件下，按照每毫升胶体金溶液加入4～25μg蛋白的用量 缓慢加入所述苯甲酸抗体，静置10～30min，然后加入牛血清蛋白BSA至终浓度 0.5～5％，静置10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末 次用十分之一初始体积的重悬液将沉淀重悬，置4℃备用

S302、检测线和质控线的设置。

具体地，检测线的设置是取抗苯甲酸完全抗原，用包被膜缓冲液稀释将抗 苯甲酸完全抗原稀释至浓度为1.0～1.5mg/mL，取反应垫，然后用划膜仪以1～10 μl/cm的用量将抗苯甲酸完全抗原划在反应垫上，形成检测线。

质控线的设置包括用包被膜缓冲液稀释将羊抗鼠抗体稀释至浓度为0.8 ～1.5mg/mL，然后以1～10μl/cm的用量将羊抗鼠抗体划在反应垫上，形成质控 线，随后置放于37℃烘干备用。

S303、检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂条的组装。

具体地，取背板、样品垫、吸水垫、经过处理后的金标垫和经过处理后的 反应垫进行组装，得到检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂条，其中样品垫、金 标垫、反应垫和吸水垫依次设置于所述背板上，样品垫和吸水垫分别设置于背 板的两个端部，反应垫设置于背板的中部，金标垫的靠近反应垫的端部的下表 面与反应垫的上表面贴合，金标垫上靠近样品垫的端部的上表面与样品垫的下 表面贴合。反应垫远离金标垫的一端的上表面与吸水垫的上表面贴合，通过此 结构使得待测液充分溢到反应垫上，最后被吸水垫吸收。反应垫上设置有平行 间隔设置的检测线和质控线，检测线包被有苯甲酸完全抗原，质控线包被有抗苯甲酸抗体金标复合物的抗体，金标垫上喷有苯甲酸抗体金标复合物。

在一些可选的实施例中，可以将上述的试剂条安装在一个外壳内，反应垫 外露，使得用户可以在外部观察反应垫的反应，并且读取结果，样品垫对应处 的外壳也开设有开口，使得用户可以通过开口，将样品投入样品垫上。

在一个可选的实施例中，苯甲酸抗体金标复合物包括苯甲酸抗体和胶体金 纳米颗粒，苯甲酸抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。苯甲酸抗体金标复合物为 苯甲酸抗体和胶体金纳米颗粒通过静电结合的方式而形成。质控线上包被的抗 苯甲酸抗体金标复合物的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。上述的多克隆抗体 为鼠源、马源、羊源、兔源和豚鼠源中的任一种，所述单克隆抗体为鼠源或兔 源。

在一个可选的实施例中，苯甲酸抗体为苯甲酸抗体单克隆抗体，其制备方 法包括步骤S401-S404。

S401、动物免疫。

以上述的偶联物MLT-BSA为免疫抗原免疫Balb/c小鼠，100μg/kg体重。 首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射， 间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，继续三免、方法 剂量同二免，三免一周后尾部采血检测血清效价及抑制，待检测符合要求时腹 腔冲击免疫一次，3天后取脾细胞。

S401、细胞融合和克隆化。

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用 间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行 克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

S401、细胞冻存和复苏。

取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×l06个/ml的细胞悬液， 分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中 速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

S401、单克隆抗体的制备与纯化。

采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入弗氏不完全佐剂0.5ml/ 只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l06个/只，7天后采集腹水。用亲和层析柱 进行腹水纯化，紫外分光光度计测定蛋白浓度，-20℃保存备用。采用ELISA法 测定纯化抗体的效价1:128000，结果表明，纯化的抗体对苯甲酸表现出较高的 特异性和灵敏性。

在一个可选的实施例中，苯甲酸抗体为苯甲酸抗体多克隆抗体，其制备方 法包括步骤S501-S502。

S501、动物免疫。

以偶联物MLT-BSA为免疫抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠，1mg/kg体重。 首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射， 间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次， 总共免疫5次。

S502、抗血清的采集和多克隆抗体的纯化。

最后一次免疫7天后采血，测定血清抗体效价，腹动脉采全血收集血清， 经亲和层析柱分离得到纯化的多克隆抗体，采用ELISA法测定纯化抗体的效价 1:10000，纯化的抗体表现出对苯甲酸较高的特异性和灵敏性。

在一个可选的实施例中，胶体金的制备具体包括步骤S601-S602。

S601、将1g的氯金酸(HauCL4)溶于100g超纯水中制备成1％氯金酸溶液 4C放置待用；

S602、将1g的二水柠檬酸三钠溶于100g超纯水中制备成1％的二水柠檬酸 三钠溶液4C放置待用；

S603、洁净的三角瓶中加入100ml超纯水放于加热的磁力搅拌器上，搅拌 加热至沸腾，然后加入1ml 1％的氯金酸，待沸腾后迅速的加入1.7ml的1％的 二水柠檬酸三钠溶液，待颜色变成酒红色后继续加热搅拌15分钟，然后关闭加 热和搅拌。所制备的胶体金自然冷却待用；所述制备的胶体金颗粒大小为25nm， 最大吸收峰在521nm。

在一个可选的实施例中，苯甲酸抗体金标复合物的具体制备方法包括步骤 S701-S702。

S701、寻找胶体金标记最适合的蛋白质浓度。

取8条聚苯乙烯微量反应管一条，各孔中先加30ul三蒸水，再向第一孔中 加入30ul的实施例四制备的苯甲酸抗体，倍比稀释至最后一孔，向各空中加入 125ul Ph8.0的胶体金溶液，室温静止15min，向各孔中加入125ul 10％的NaCl 溶液，观察各孔变化，以不变色的一孔为最小蛋白浓度(5ug/ml-10ug/ml)。

S702、调节胶体金pH8.0，搅拌条件下，按每毫升胶体金溶液加入4～25μg 蛋白的用量缓慢加入所述苯甲酸抗体，静置30min，然后加入牛血清蛋白BSA至 终浓度1％，静置30min，4℃，12000转离心30min，弃上清，将沉淀用洗涤液 洗涤2次，末次用十分之一初始体积的重悬液将沉淀重悬，得到苯甲酸抗体金 标复合物，置4℃备用。

其中所述重悬液也即保存液为含0.2～1％大分子蛋白的硼酸盐，碳酸盐， 磷酸盐，Tris-HCl或Tris-磷酸盐，醋酸盐，巴比妥，等等，大分子蛋白可以 为牛血清白蛋白、PEG20000、酪蛋白等，缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，更优选 为0.5％BSA pH7.4磷酸盐缓冲液。

此外，本实施例提供的检测苯甲酸的胶体金免疫层析试剂条的制备方法仅 仅是应用本发明提供的苯甲酸完全抗原、苯甲酸抗体金标复合物、抗苯甲酸抗 体金标复合物的抗体的方式之一。其他应用，尤其是对苯甲酸的免疫分析应用， 都应看成是本发明实施例的保护范围；此外，还可以对本发明提供的检测苯甲 酸的胶体金免疫层析试剂条进行包装，包括下述步骤：将1份已切好的试纸组 装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸的样品垫，结果显示窗对应检测区和 控制区。再与一包干燥剂、说明书、样品加样器封装在外包袋里，于4～25℃避 光保存。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。