具体实施方式

接下来，为了便于具有本发明所属技术领域之一般知识的人员可以轻易地实施本发明，将参阅附图对本发明的实施例进行详细的说明。但是，本发明可以通过多种不同的形态实现，并不限定于在此进行说明的实施例以及附图。

适用本发明的皮肤状态改善用化妆品组合物作为有效成分包含银耳(Tremellafuciformis)培养液提取物。

适用本发明的银耳培养液提取物的细胞毒性较低，而且具有保湿因子生成量增加、胶原蛋白和胶原蛋白纤维生成量增加以及细胞内活性氧抑制效果，可以作为源自于天然物质的皮肤保湿、抗皱纹或抗氧化功能性化妆品组合物使用。

银耳分为菌丝体以及子实体。菌丝体作为蘑菇的营养机构，相当于一般植物中的根、茎、叶部分，是白色的绒毛或线丝状的蘑菇主体部分，蘑菇一生中的大部分时间是以菌丝状态寄生或浮生生活。子实体作为蘑菇的繁殖机构，相当于一般植物的花朵，在菌丝蓄积充分的养分之后，将在满足气候条件的情况下瞬间长成肉眼可见的子实体。构成蘑菇的菌丝体以及子实体的糖和氨基酸互不相同(Lee et al.,1999,"Characteristics ofpolysaccharide isolated from the fruit body and cul tured mycelia ofPhellinus linteus IY001."The Korean Journal of Mycology 27.6(1999):424-429)。

其中，考虑到效果方面，上述银耳培养液为银耳的菌丝体培养液为宜，但是并不因此而受到限定。

此时，上述银耳培养液可以包含源自于上述菌丝体培养液的多糖体，上述多糖体中的甘露糖(mannose)的含量较佳地可以是20至60重量％，更较佳地可以是30至50重量％。

此外，上述银耳培养液可以是培养6至48小时，较佳地可以是培养12至36小时，但是并不因此而受到限定。

当上述培养时间不足6小时时，可能会因为菌丝体的培养不充分而导致有效成分的含量以及收率较低的问题，而当上述培养时间超过48小时时，可能会导致菌丝体的培养效率下降或菌丝体发生变形的问题。

此外，上述银耳培养液可以是在15至35℃的温度下进行培养，较佳地可以是在20至30℃的温度下进行培养，但是并不因此而受到限定。

当上述培养温度不足15℃时，可能会因为菌丝体的培养不充分而导致有效成分的含量以及收率较低的问题，而当上述培养温度超过35℃时，可能会导致菌丝体的培养效率下降或菌丝体发生变形的问题。

此外，上述提取物可以是源自于银耳培养液的多糖体，上述多糖体属于高粘性多糖类，因此可以提升前胶原合成性能并借助于与明胶类似的特性提升皮肤的保湿能力而有效地改善皮肤皱纹，而且抗炎效果、抗老化效果、美白效果以及胶原蛋白合成促进效果等非常优秀。此外，在因为外部有害物质而发生pH变化时也可以维持稳定的状态，因此还具有舒缓皮肤刺激的效果。

此外，上述提取物可以为了适用于皮肤状态改善目的而利用水、C₁至C₄的低级醇或上述之混合溶剂进行提取。上述低级醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇，虽然上述混合溶剂并不受到特殊限定，但是较佳地可以是20至80体积％的甲醇、乙醇、丙醇或丁醇水溶液，更较佳地可以是60至80体积％的乙醇水溶液。

此外，适用本发明之另一方面的皮肤状态改善用食品组合物作为有效成分包含银耳(Tremella fuciformis)培养液提取物。

银耳培养液提取物的细胞毒性较低，而且具有保湿因子生成量增加、胶原蛋白和胶原蛋白纤维生成量增加以及细胞内活性氧抑制效果，可以作为天然皮肤保湿、抗皱纹或抗氧化功能性食品组合物使用。

接下来，将结合具体的实施例对本发明进行更为详细的说明。下述实施例只是用于对本发明进行例示，本发明并不因为下述实施例而受到限定。

实施例1.银耳菌丝体培养液提取物的制造

利用乙醇对银耳菌丝体的培养液进行提取，从而制造出银耳菌丝培养液提取物。具体来讲，从银耳分离出菌丝体并将所分离出的菌丝体在300mL的蘑菇完全培养基(MCM，Mushroom Complete Medium)、25℃、180rpm的条件下进行24小时的培养。通过对所培养出的菌丝体进行离心分离而获得上清液。对所分离出的上清液以及乙醇进行混合(所分离出的上清液:乙醇＝1:3(体积比))，接下来在4℃下进行搅拌的同时进行整夜(overnight)培养。对所培养出的混合物进行离心分离(12,000rpm)，从而获取沉淀物即源自于银耳菌丝体培养液的多糖体。利用纯净水对所获取到的源自于银耳菌丝体培养液的多糖体进行稀释(多糖体:纯净水＝1:99(体积比))以及过滤，从而制造出银耳菌丝体培养液。

试验例1.源自于银耳菌丝体培养液的提取物的糖分析

1-1.源自于银耳菌丝体培养液的提取物的多糖体含量分析

1-1-1.中性糖的水解

将100μg的源自于银耳菌丝体培养液的多糖体以及400μl的2M的三氟乙酸(TFA，Trifluoroacetic acid)分别投入到微量离心管(Microcentrifuge tube)中并在100℃条件下进行4小时的水解。在室温条件下进行冷却并利用真空离心浓缩机进行干燥处理，接下来将源自于银耳菌丝体培养液的多糖体溶解到2ml的三蒸水中并利用02.Um过滤器(filter)进行过滤。

1-1-2.葡萄糖醛酸(Glucuronic acid)的水解

将100μg的源自于银耳菌丝体培养液的多糖体以及400μl的2M的三氟乙酸(TFA，Trifluoroacetic acid)分别投入到微量离心管(Microcentrifuge tube)中并在100℃条件下进行6小时的水解。在室温条件下进行冷却并利用真空离心浓缩机进行干燥处理，接下来将试料溶解到1ml的三蒸水中并利用02.Um过滤器(filter)进行过滤。

1-1-3.利用高效阴离子交换色谱(HPAEC，High-Performance Anion-ExchangeChromatography)的糖分析

利用高效阴离子交换色谱(HPAEC)对在上述试验例1-1-1以及试验例1-1-2中水解的糖进行分析。具体的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析条件如下述表1所示，而糖分析结果如图1以及表2所示。

【表1】

【表2】

如表2所示，可以确认源自于银耳菌丝体培养液的多糖体中的葡萄糖(Glucose)含量小于源自于银耳子实体的多糖体。而与此相反，可以确认源自于银耳菌丝体培养液的多糖体中的甘露糖(mannose)的含量比源自于银耳子实体培养液的多糖体高约8倍。α-甘露聚糖(α-mannan)所属的甘露糖(mannose)是通过与存在于细胞膜中的树突状细胞相关C型凝集素-2受体(Dectin-2 receptor)结合而诱导皮肤免疫以及肠道免疫的多糖体。

1-2.源自于银耳菌丝体培养液的提取物的多糖体分子量分析

在高效液相色谱-多角度光散射(MALS，Multi-angle light scattering)系统(Wyatt Technology，Santa Babara，CA)中利用空间排阻色谱(SEC)柱(TSK-gel-GMPWXL，30cm×7.8mm，13μm，Tosoh)对源自于银耳菌丝体培养液的多糖体的平均分子量进行分析。将源自于银耳菌丝体培养液的多糖体以3mg/mL的浓度溶解到磷酸盐缓冲液(pH 7.3～7.5)中而制备出分析试料。将分析试料以高性能液相色谱流量为0.5mL/min、进样体积为流动相磷酸缓冲生理食盐水(pH 7.3～7.5)、检测器为DAWN HELEOS II，OptilabrEX的条件进行分析。分子量计算时的dn/dc值(折光指数增量，specific refractiveindex increment)是在参考文献的前提下确定为0.15mL/g。在对源自于银耳菌丝体培养液的多糖体平均分子量进行计算时使用了ASTRA 6软件(software)(Wyatt Technology)。源自于银耳菌丝体培养液的多糖体的高效液相色谱-多角度光散射(MALS)结果如图2所示。

通过图2可以确认，源自于银耳菌丝体培养液的多糖体的平均分子量为1.79×10⁶(±0.721％)。

试验例2.皮肤细胞的培养

2-1.皮肤角质形成细胞的培养

作为皮肤角质形成细胞的人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)是从Cell LineService GmbH.(Germany)购买使用。利用包含1％青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)以及10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco's Modified Eagle's Medium)在37℃、5％CO₂的恒温器中进行培养，并以2至3天为间隔执行继代培养。

2-2.皮肤成纤维细胞的培养

作为皮肤成纤维细胞的正常人类皮肤成纤维细胞(Normal Human DermalFibroblasts，NHDF)是从Lonza(Lonza Walkersville,Inc)购买并利用包含0.1％的人成纤维细胞生长因子-B(hFGF-B)、胰岛素、GA-1000以及2％胎牛血清的成纤维细胞基础培养基(FBM，Fibroblast Basal Medium)在37℃、5％CO₂的恒温器中进行培养，并以3至5天为间隔执行继代培养。

试验例3.银耳菌丝体培养液提取物的细胞毒性评估

Ez-cytox试验(assay)是利用水溶性四唑盐(water solution tetrazoliumsalt，WST)与活性细胞的脱氢酶(Dehydrogenase)发生反应而生成朱黄色的水溶性甲腊(formazan)的原理对细胞活性进行测定的代表性的细胞毒性评估方法。

3-1.对皮肤角质形成细胞的细胞毒性评估

为了对在细胞中的毒性进行确认，将人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)以5×10⁴cells/mL的浓度分株到96孔板中并在37℃、5％CO₂条件下进行18小时的培养。在将所培养出的细胞更换成无血清(serum-free)培养基之后利用在上述实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物以不同的浓度(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0v/v％)进行处理。接下来将EZ-cytox添加到各个孔中并在37℃、5％CO₂条件下进行30分钟的反应。利用酶标仪对各个孔在450nm下的吸光度进行测定。计算出各个试料组的平均吸光度值，并通过将上述之与对照组的吸光度值进行比较而对细胞活性进行评估。对皮肤角质形成细胞的银耳菌丝体培养液提取物的细胞毒性评估结果如下述表3所示。

【表3】

如上述表3所示，可以确认银耳菌丝体培养液的提取物对皮肤角质形成细胞的细胞毒性较低。

3-2.对皮肤成纤维细胞的细胞毒性评估

将作为皮肤成纤维细胞的正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF，Normal Human DermalFibroblasts)以1×10⁴cells/mL的浓度分株到96孔板中。通过上述试验例2-1的EZ-cytox试验(assay)对正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF)的银耳菌丝体培养液提取物的细胞毒性进行评估。对皮肤成纤维细胞的银耳菌丝体培养液提取物的细胞毒性评估结果如下述表4所示。

【表4】

如上述表4所示，可以确认银耳菌丝体培养液的提取物对皮肤成纤维细胞的细胞毒性较低。

试验例4.银耳菌丝体培养液提取物的保湿效果确认

4-1.银耳菌丝体培养液提取物的保湿因子即透明质酸(Hyaluronic acid，HA)生成量增加效果确认

将人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)以1.0×10⁵cells/mL的浓度分株到24孔板中并在37℃、5％CO₂条件下进行18小时的培养。在将所培养出的细胞的培养基更换成无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)之后利用在上述实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物分别以0.1、0.5、1.0v/v％的浓度进行处理并进行24小时的培养。接下来对各个试验组的培养液提取物的透明质酸生成量进行测定。作为对照组，利用视黄酸(retinoicacid，RA)以10μM的浓度进行处理。上述透明质酸的生成量测定是利用HA-ELISA kit(Cusabio Biotechnology Co.,Ltd)执行，且按照制造企业所提供的方法执行试验。利用银耳菌丝体培养液提取物进行处理时的透明质酸生成量测定结果如图3所示。

通过图3可以确认，银耳菌丝体培养液的提取物可以浓度依赖性地增加保湿因子即透明质酸的生成。此外，可以确认银耳菌丝体培养液可以生成与对照组即视黄酸类似水准的透明质酸。

4-2.银耳菌丝体培养液提取物的保湿因子即水通道蛋白3(aquaporin 3，AQP3)生成量增加效果确认

将人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)以1.0×10⁵cells/mL的浓度分株到24孔板中并在37℃、5％CO₂条件下进行18小时的培养。在将所培养出的细胞的培养基更换成无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)之后利用在上述实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物分别以0.1、0.5、1.0v/v％的浓度进行处理并进行24小时的培养。接下来，在对各个试验组的细胞进行溶解之后提取蛋白质并对培养液提取物中的水通道蛋白3的生成量进行测定。作为对照组，利用视黄酸(retinoic acid，RA)以10μM的浓度进行处理。上述水通道蛋白3的生成量测定是利用AQP3-ELISA kit(Cusabio Biotechnology Co.,Ltd)执行，且按照制造企业所提供的方法执行试验。利用银耳菌丝体培养液提取物进行处理时的水通道蛋白3生成量测定结果如图4所示。

通过图4可以确认，银耳菌丝体培养液的提取物可以浓度依赖性地增加保湿因子即水通道蛋白3的生成。

通过上述试验结果可以确认，在实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物可以增加透明质酸以及水通道蛋白3的生成。之所以出现上述结果，估计是因为银耳菌丝体培养液的提取物包含高浓度的甘露糖。借此，可以确认银耳菌丝体培养液提取物可以有效地作为天然保湿原材料进行使用。

试验例5.银耳菌丝体培养液提取物的抗皱纹活性确认

5-1.银耳菌丝体培养液提取物的I型前胶原肽(procollagen type I peptide,PIP)生成效果确认

将作为皮肤成纤维细胞的正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF)以2×10⁴cells/mL的浓度分株到24孔板中之后在细胞培养条件下进行24小时的培养。在完成培养之后更换成无血清成纤维细胞基础培养基(FBM)，接下来利用在上述实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物分别以0.1、0.5、1.0v/v％的浓度进行处理并进行24小时的培养。在完成培养之后提取各个组的上清液，并对培养基中游离的前胶原(procollagen)的量进行测定。作为对照组，利用抗坏血酸(ascorbic acid)替代提取物并以10μg/ml的浓度进行处理。在对上述前胶原的量进行测定时使用了Procollagen type I peptide(PIP)EIA kit(TakaraBiomedical Co.)，按照制造企业的手册对在450nm波长下的吸光度进行测定并对胶原蛋白的量进行定量。对利用银耳菌丝体培养液提取物进行处理时的I型前胶原肽的生成量进行定量的结果如图5所示。

通过图5可以确认，银耳菌丝体培养液的提取物可以浓度依赖性地增加胶原蛋白的合成。

5-2.银耳菌丝体培养液提取物的胶原蛋白纤维生成效果确认

将作为皮肤成纤维细胞的正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF)以2×10⁴cells/mL的浓度分株到24孔板中之后在细胞培养条件下进行24小时的培养。在完成培养之后更换成无血清成纤维细胞基础培养基(FBM)，接下来利用在上述实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物分别以0.1、0.5、1.0v/v％的浓度进行处理并进行24小时的培养。在完成培养之后利用羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液(HEPES-BSS，HEPES Buffered Saline Solution)对细胞进行洗涤，接下来按照免疫荧光染色法对细胞内的胶原蛋白纤维进行染色。利用荧光显微镜对所染色的细胞的荧光表达程度进行测定。利用银耳菌丝体培养液提取物进行处理时的胶原蛋白纤维生成确认结果如图6所示。

通过图6可以确认，银耳菌丝体培养液的提取物可以浓度依赖性地增加皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白纤维的生成。

通过上述试验结果可以确认，在实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物可以增加胶原蛋白的合成以及胶原蛋白纤维的生成，因此可以有效地作为抗皱纹原材料进行使用。

试验例6.银耳菌丝体培养液提取物的抗氧化效果确认

6-1.细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的抑制效果测定

为了对细胞内活性氧变化进行测定，在将人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)以1.0×10⁵cells/well的浓度接种到24孔板中并进行24小时的培养之后，利用在上述实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液提取物进行24小时的前处理。在利用磷酸盐缓冲溶液(PBS，phosphate buffered saline)对经过前处理的细胞进行洗涤之后，利用IntracellularROS assay kit(Green Fluorescence)按照制造企业的手册执行试验。对细胞内活性氧抑制效果进行测定的结果如图7所示。

通过图7可以确认，银耳菌丝体培养液的提取物可以浓度依赖性地提升自由基清除活性。尤其是，可以确认在利用2.0v/v％浓度的银耳菌丝体培养液的提取物进行处理的试验组中，清除了约40％以上的自由基。

6-2.通过成像的细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的抑制效果测定

为了对细胞内活性氧(ROS)变化进行视觉化，在作为皮肤角质形成细胞的人皮肤表皮角质形成细胞(HaCaT)以1.0×10⁵cells/well的浓度接种到24孔板中并进行24小时的培养之后，利用在实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液提取物以不同的浓度(0.1、0.5、1.0、2.0v/v％)进行处理之后再进行24小时的前处理。在利用磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffered saline，PBS)对所培养出的细胞进行洗涤之后，利用H₂O₂以300μM的浓度进行处理并执行3小时的追加培养。作为对细胞内活性氧进行测定的染料，以50μM的浓度添加二氯荧光乙酰乙酸盐(DCF-DA，dichlorofluorescein diacetate)并进行1小时的培养。在利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)对所培养出的细胞进行洗涤之后，利用荧光显微镜对经过洗涤的细胞的荧光表达程度进行测定。银耳菌丝体培养液提取物的细胞内活性氧测定结果如图8所示。

通过图8可以确认，银耳菌丝体培养液的提取物可以浓度依赖性地抑制细胞内活性氧的生成。尤其是，可以确认在利用0.5、1.0以及2.0v/v％浓度的银耳菌丝体培养液的提取物进行处理的试验组中，细胞内活性氧的抑制活性优秀。

通过上述试验结果可以确认，在实施例1中制造出的银耳菌丝体培养液的提取物的细胞内活性氧抑制效果非常显著，因此可以有效地作为抗氧化原材料进行使用。

总而言之，本发明人制造出了银耳培养液的提取物，并确认了上述提取物的细胞毒性较低，而且具有保湿因子生成量增加、胶原蛋白和胶原蛋白纤维生成量增加以及细胞内活性氧抑制效果。这表示本发明的银耳培养液的提取物可以作为天然保湿、抗皱纹以及抗氧化功能性原材料进行使用，本发明的银耳培养液的提取物可以广泛地适用于改善皮肤状态的美容以及食品领域。

接下来，将结合制造例对本发明进行更为详细的说明。制造例只是用于对本发明进行例示，本发明的范围并不应该解释为因为制造例而受到限定。

制造例1.皮肤状态改善用化妆品组合物的制造

1-1.柔肤水(皮肤润肤液)的制造

银耳培养液的提取物 0.5重量％

Β-1,3-葡聚糖 1.0重量％

丁二醇 2.0重量％

丙二醇 2.0重量％

羧基乙烯聚合物 0.1重量％

聚乙二醇-12任烷基酚聚乙二醇醚 0.2重量％

聚山梨酯80 0.4重量％

乙醇 10.0重量％

三乙醇胺 0.1重量％

防腐剂、色素、香料 适量

添加纯净水至100重量％

1-2.营养水(牛奶润肤露)的制造

银耳培养液的提取物 0.5重量％

Β-1,3-葡聚糖 1.0重量％

蜂蜡 4.0重量％

聚山梨酯60 1.5重量％

倍半油酸山梨坦 1.5重量％

液状石蜡 0.5重量％

辛酸/癸酸甘油三酯 5.0重量％

甘油 3.0重量％

丁二醇 3.0重量％

丙二醇 3.0重量％

羧基乙烯聚合物 0.1重量％

三乙醇胺 0.2重量％

防腐剂、色素、香料 适量

添加纯净水至100重量％

1-3.营养霜的制造

银耳培养液的提取物 1.0重量％

Β-1,3-葡聚糖 5.0重量％

蜂蜡10.0重量％

聚山梨酯60 1.5重量％

聚乙二醇60硬化蓖麻油 2.0重量％

倍半油酸山梨坦 0.5重量％

液状石蜡 10.0重量％

角鲨烷 5.0重量％

辛酸/癸酸甘油三酯 5.0重量％

甘油 5.0重量％

丁二醇 3.0重量％

丙二醇 3.0重量％

三乙醇胺 0.2重量％

防腐剂、色素、香料 适量

添加纯净水至100重量％

制造例2.皮肤状态改善用食品制剂的制造

2-1.健康食品的制造

银耳培养液提取物 100mg

维生素混合物 适量

维生素A乙酸酯 70g

维生素E 1.0mg

维生素B1 0.13mg

维生素B2 0.15mg

维生素B6 0.5mg

维生素B12 0.2g

维生素C 10mg

生物素 10g

烟酰胺 1.7mg

叶酸 50g

泛酸钙 0.5mg

无机质混合物 适量

硫酸亚铁 1.75mg

氧化锌 0.82mg

碳酸镁 25.3mg

磷酸二氢钾 15mg

磷酸氢二钾 55mg

枸橼酸钾 90mg

碳酸钙 100mg

氯化镁 24.8mg

上述维生素以及矿物质混合物的组成比是按照比较适合于健康食品成分的较佳实施例进行混合，可以对上述混合比进行任意变形实施，可以按照一般的健康食品制造方法对上述成分进行混合制造出颗粒，并按照一般的方法用于健康食品组合物的制造。

2-2.健康饮料的制造

银耳培养液提取物 100mg

维生素C 15g

维生素E(粉末) 100g

乳酸铁 19.75g

氧化锌 3.5g

烟酰胺 3.5g

维生素A 0.2g

维生素B1 0.25g

维生素B2 0.3g

添加水进行定量

在按照一般的健康饮料制造方法对上述成分进行混合之后在85℃下进行约1小时的搅拌以及加热，接下来对所制成的溶液进行过滤并装入到经过灭菌处理的2L容器中进行密封灭菌，然后进行冷藏保管并用于本发明的健康饮料组合物的制造。

上述组成比是按照比较适合于受欢迎的饮料成分的较佳实施例进行混合，但是也可以根据消费阶层、消费国家、使用用途等地区性、民族性嗜好程度对上述混合比进行任意变形实施。

上述内容只是对本发明进行的示例性说明，具有本发明所属技术领域之一般知识的人员应可以理解，本发明可以在不脱离本发明之本质特性的范围内以变形的形态实现。因此，所公开的实施例以及试验例只是说明性内容而非限定。本发明的范围应通过权利要求书做出定义而非上述说明内容，与其同等范围内的所有差异点均应解释为包含在本发明的范围之内。