阅读说明：本技术 一种提高鱼抗应激反应天然组合物及其应用 (Natural composition for improving fish anti-stress response and application thereof ) 是由 李华涛 袁佳 杜文浩 吴敏 敬晓琴 罗朋 龙娇 刘思妙 冯敏 袁志 李绮绮 周 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高鱼抗应激反应天然组合物,包括天然复合抗应激剂I和/或天然复合抗应激剂II；所述天然复合抗应激剂I包括丹参有机溶剂提取物、紫苏叶有机溶剂提取物和当归有机溶剂提取物中的两种或两种以上；所述天然复合抗应激剂II包括丹参水提取物、银杏叶水提取物和桑叶水提取物中的两种或两种以上。本发明提供的天然组合物用于制备鱼抗缺氧再复氧应激反应添加剂或饲料,为天然植物提取物,基础饲料原料没有人为添加其他物质。此天然功能性饲料能提高养殖中鱼对缺氧的耐受力和复氧成活率,无残留、无毒副作用、不污染环境。(The invention discloses a natural composition for improving fish anti-stress response, which comprises a natural compound anti-stress agent I and/or a natural compound anti-stress agent II; the natural compound anti-stress agent I comprises two or more than two of salvia miltiorrhiza organic solvent extract, perilla leaf organic solvent extract and angelica sinensis organic solvent extract; the natural compound anti-stress agent II comprises two or more of water extract of Saviae Miltiorrhizae radix, water extract of folium Ginkgo and water extract of folium Mori. The natural composition provided by the invention is used for preparing the anti-hypoxia reoxygenation stress response additive or feed for the fish, is a natural plant extract, and other substances are not artificially added into the basic feed raw materials. The natural functional feed can improve the tolerance of the cultured fish to oxygen deficiency and the reoxygenation survival rate, and has no residue, no toxic or side effect and no environmental pollution.)

一种提高鱼抗应激反应天然组合物及其应用

技术领域

本发明涉及淡水鱼养殖技术领域，具体涉及一种提高鱼抗应激反应天然组合物及其应用。

背景技术

目前水产养殖的现状主要是自然水体养殖，淡水养殖主要为池塘养殖。养殖鱼类的生长依赖于水体中的溶解氧含量。然而自然水体养殖存在的弊端是水体溶氧受环境因素影响极大。自然水体中的溶解氧含量受昼夜、天气和季节变化的影响。在阳光充足的白天水体中绿色植物的光合作用非常活跃，此时水体溶解氧含量可能会达到过饱和状态；在夜间由于植物光合作用的停滞，水体溶氧会被大大降低。天气变化会影响光照和植物的光合作用，从而影响水体溶氧。季节变化不但会影响光照，而且会影响水温。在鱼的生理温度范围内，水温每提高10℃鱼体耗氧量将提高2-3倍。已有报道显示，自然水体溶氧的高低起伏会使鱼体遭受缺氧和再复氧应激，从而导致鱼的生产成绩降低。

“高密度、集约化”是当前水产养殖的重要特征。但高密度养殖模式使水体载鱼量提高；使鱼类在水体中的相对生活空间缩小，不同个体之间的竞争和干扰加剧，从而使鱼的活动量提高，这些因素不同程度地提高了鱼体的需氧量。高密度养殖使饲料投喂量提高，水体中养殖废物增多，水体物质转化加剧，这些因素使水体中的耗氧量提高。以上情况进一步加剧了养殖鱼类的缺氧应激。目前增氧机的使用能大大缓解高密度养殖水体的缺氧状态，但也加剧了鱼体遭受再复氧应激的可能。由于水体溶氧变化造成的翻塘死鱼现象仍然时常发生。缺氧和复氧应激反应能使鱼的免疫力降低，提高鱼的发病率和死亡率，从而提高了养殖中抗生素和化学药物的使用量，使鱼肉药物残留升高。自然水体养殖和高密度养殖存在的缺陷使市场急需一种能提高鱼抗缺氧和再复氧应激能力而无残留，无毒副作用，不污染环境的饲料，用于改善养殖效益，降低药物残留和提高鱼肉品质。

高密度集约化养殖需要使用全价配合饲料。在配合饲料中添加抗氧化剂、防霉剂、促生长剂、诱食剂等已是普遍现象。目前使用较多的抗氧化剂主要是合成抗氧化剂，包括乙氧基喹啉(EQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等。鱼粉和油脂是重要的饲料原料，在鱼粉加工过程中合成抗氧化剂的添加量能达到0.1％；饲料级的油脂中也会添加合成抗氧化剂。但已有报道显示，合成抗氧化剂对动物具有致癌和遗传毒性，而且会导致其在鱼肉制品内的残留和富集，造成食品安全隐患和危及人体健康。2017年2月，欧盟发布2017年第G/SPS/EU/190公告：停止在动物饲料中添加使用EQ。同时有报道显示，在动物饲料中添加BHT和BHA的致癌风险高于EQ。也有报道显示化学合成的防霉剂、促生长剂、诱食剂等添加剂对动物也具有潜在毒性，且可能造成在鱼肉中的残留。因此配合饲料存在的弊端将导致市场对天然产物配合饲料的需求提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：高密度和自然水体养殖使鱼遭受缺氧再复氧应激加剧，现有的一些饲料添加剂对动物有毒副作用、甚至致癌作用，且可能造成在鱼肉中的残留造成食品安全隐患和危及人体健康，本发明提供了解决上述问题的一种提高鱼抗应激反应天然组合物及其应用。是基于药食同源中草药制备天然的复合物，用作鱼抗缺氧再复氧应激反应添加剂和制备天然功能性饲料，无毒副作用，对于提高其经济和社会效益，具有重要意义。

本发明通过下述技术方案实现：

一种提高鱼抗应激反应天然组合物，包括天然复合抗应激剂I和/或天然复合抗应激剂II；所述天然复合抗应激剂I包括丹参有机溶剂提取物、紫苏叶有机溶剂提取物和当归有机溶剂提取物中的两种或两种以上；所述天然复合抗应激剂II包括丹参水提取物、银杏叶水提取物和桑叶水提取物中的两种或两种以上。

本发明提供的鱼抗应激反应复合物，为天然植物提取物，没有人为添加其他物质。以此为活性物质配制的天然功能性饲料能提高养殖中鱼对缺氧的耐受力和复氧成活率，无残留、无毒副作用、不污染环境。

进一步优选，所述丹参有机溶剂提取物为丹参乙酸乙酯提取物，紫苏叶有机溶剂提取物为紫苏叶乙酸乙酯提取物，所述当归有机溶剂提取物为当归乙酸乙酯提取物。

进一步优选，所述丹参乙酸乙酯提取物中，黄酮类物质的含量为82.53mg/g-97.60mg/g；所述紫苏叶乙酸乙酯提取物中，黄酮类物质的含量为64.45mg/g-70.28mg/g；所述当归乙酸乙酯提取物中，多酚类物质的含量为46.76mg/g-55.31mg/g。

丹参乙酸乙酯提取物是经分析级乙酸乙酯提取获得，为棕红色浸膏，其中黄酮类物质含量为82.53mg/g-97.60mg/g。紫苏叶乙酸乙酯提取物是经分析级乙酸乙酯提取获得，提取物为深褐色浸膏，其中黄酮类物质含量为64.45mg/g-70.28mg/g。当归乙酸乙酯提取物是经分析级乙酸乙酯提取获得，提取物为棕红色浸膏，其中多酚类物质含量为46.76mg/g-55.31mg/g。

进一步优选，所述丹参水提取物中，粗蛋白的质量百分含量为14.23％-16.08％，可溶性糖的质量百分含量为38.89％-46.30％；所述银杏叶水提取物中，粗蛋白的质量百分含量为5.76％-7.14％，可溶性糖的质量百分含量为51.32％-58.29％；所述桑叶水提取物中，粗蛋白的质量百分含量为13.07％-15.64％，总糖的质量百分含量为35.67％-42.54％。

丹参水提取物经蒸馏水提取获得，为棕红色粉末，粗蛋白的质量百分含量为14.23％-16.08％，可溶性糖的质量百分含量为38.89％-46.30％。桑叶水提取物经蒸馏水提取获得，为深褐色粉末，粗蛋白的质量百分含量为13.07％-15.64％，总糖的质量百分含量为35.67％-42.54％。银杏叶水提取物经蒸馏水提取获得，为浅棕褐色粉末，粗蛋白的质量百分含量为5.76％-7.14％，可溶性糖的质量百分含量为51.32％-58.29％。

进一步优选，所述天然复合抗应激剂I包括丹参有机溶剂提取物、紫苏叶有机溶剂提取物和当归有机溶剂提取物三种，且丹参有机溶剂提取物、紫苏叶有机溶剂提取物和当归有机溶剂提取物的质量比为2:1:1或1:2:1或1:1:2或2:2:1或1:2:2或2:1:2。

进一步优选，所述天然复合抗应激剂II包括丹参水提取物、银杏叶水提取物和桑叶水提取物三种，且所述天然复合抗应激剂II包括丹参水提取物、银杏叶水提取物和桑叶水提取物的质量比为2:1:1或1:2:1或1:1:2或2:2:1或1:2:2或2:1:2。

进一步优选，所述天然复合抗应激剂I和天然复合抗应激剂II的质量配比为0.3-5。

上述一种提高鱼抗应激反应天然组合物的应用，用于制备淡水鱼抗应激反应添加剂或饲料中；所述应激反应包括缺氧再复氧应激反应。此处的饲料优选天然功能性饲料。

一种鱼饲料，包括基础饲料和上述的一种提高鱼抗应激反应天然组合物。

进一步优选，所述天然复合抗应激剂I加入量为基础饲料重量0.3％-0.5％；所述天然复合抗应激剂II加入量为基础饲料重量0.5％-1.0％。

进一步优选，所述基础饲料重量份组分包括：鱼粉15-19份，豆粕20-25份，花生粕15-17份，棉粕3-7份，DL-蛋氨酸0.3-0.7份，小麦粉32-36份，菜籽油1.0-1.5份，维生素复合物0.5-1.0份和矿物质复合物0.5-1.0份。优选，基础饲料重量份组分包括：鱼粉17份，豆粕23份，花生粕16份，棉粕5份，DL-蛋氨酸0.5份，小麦粉35份，菜籽油1.5份，维生素复合物1份和矿物质复合物1份。

上述抗鱼缺氧再复氧饲料其主要原料均为天然产物，没有人为添加其他物质；其添加剂成分符合国标NY/T 471-2018的要求；其功能成分均为天然植物提取物，具有一定的抗饲料氧化和防霉的功能。此天然功能性饲料能提高养殖中鱼对缺氧的耐受力和复氧成活率。

上述的一种鱼饲料的制备方法，将天然复合抗应激剂I溶于油脂中混合，再加入基础饲料中混合；和/或将天然复合抗应激剂II溶于水中混合，再加入基础饲料中混合。

如在制备包含天然复合抗应激剂I和天然复合抗应激剂II饲料时：先根据饲料配方计算出单位质量基础饲料所需油的质量，将基础饲料重量0.3％-0.5％的天然复合抗应激剂I加入到油中再均匀混入到基础饲料中；再将基础饲料重量0.5％-1.0％的天然复合抗应激剂II溶解到可饮用水中再均匀混入基础饲料中，制成颗粒饲料，用于抑制淡水鱼缺氧再复氧应激反应。

本发明具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供的鱼抗应激反应复合物，为天然植物提取物，没有人为添加其他物质。以此为活性物质配制的天然功能性饲料能提高养殖中鱼对缺氧的耐受力和复氧成活率，无残留、无毒副作用、不污染环境。

2、本发明采用药食同源性天然植物的提取物作为饲料添加剂，去除了大部分的无效成分使活性增强，药用植物经过提取其综合功能被分解，特定功能被集中，从而提高了其某一功能的效果。植物提取物相对于中草药本身体积被缩小，便于保存、运输和交易。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为投喂复合酯提取物的饲料对鲫耐缺氧持续时间的影响；图中，数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)；

图2为投喂复合酯提取物的饲料对鲫缺氧侧翻后复氧恢复的影响；图中，数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)；

图3为投喂复合水提取物的饲料对鲫耐缺氧持续时间的影响；图中，数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)；

图4为投喂复合水提取物的饲料对鲫缺氧侧翻后复氧恢复的影响；图中，数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)；

图5为投喂复合抗应激剂的饲料对鲫耐缺氧持续时间的影响；图中，数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)；

图6为投喂复合抗应激剂的饲料对鲫缺氧侧翻后复氧恢复的影响；图中，数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例

本实施例提供了一种提高鱼抗应激反应天然组合物及其应用。

一、提高鱼抗应激反应天然组合物

1)有机溶剂酯提取物

丹参乙酸乙酯提取物是经分析级乙酸乙酯提取获得，为棕红色浸膏，其中黄酮类物质含量为82.53mg/g-97.60mg/g。

紫苏叶乙酸乙酯是经分析级乙酸乙酯提取获得，为深褐色浸膏，其中黄酮类物质含量为64.45mg/g-70.28mg/g。

当归乙酸乙酯是经分析级乙酸乙酯提取获得，为棕红色浸膏，其中多酚类物质含量为46.76mg/g-55.31mg/g。

桑叶乙酸乙酯提取物是经分析级乙酸乙酯提取获得，为深褐色浸膏，多酚类物质含量为71.62mg/g-76.20mg/g。

银杏叶乙酸乙酯提取物是经分析级乙酸乙酯提取获得，为黄褐色浸膏，黄酮类含量为67.43g/kg-72.71g/kg。

2)水提取物

丹参水提取物经蒸馏水提取获得，为棕红色粉末，粗蛋白的质量百分含量为14.23％-16.08％，总糖的质量百分含量为38.89％-46.30％。

紫苏叶水提取物经蒸馏水提取获得，为深褐色粉末，粗蛋白的质量百分含量为15.52％-17.90％，总糖的质量百分含量为31.36％-35.49％。

当归水提取物经蒸馏水提取获得，为淡红黄色粉末，粗蛋白的质量百分含量为19.05％-22.56％，总糖的质量百分含量为31.64％-35.15％。

桑叶水提取物经蒸馏水提取获得，为深褐色粉末，粗蛋白的质量百分含量为13.07％-15.64％，总糖的质量百分含量为35.67％-42.54％。

银杏叶水提取物经蒸馏水提取获得，为浅棕褐色粉末，粗蛋白的质量百分含量为5.76％-7.14％，总糖的质量百分含量为51.32％-58.29％。

二、基础饲料

所用原料来源：鱼粉、豆粕、花生粕、棉粕、小麦粉、菜籽油均为自制，除含有本身具有的营养素外，没有人为添加其他物质。具体配方如表1所示：

表1基础饲料配方

备注：

¹鱼粉含有干物质89.88％、粗蛋白51.70％、粗脂肪15.01％和粗灰分18.63％，由廉价的鲢、鲫和草鱼组成的杂鱼经80℃鼓风干燥制得。

²豆粕含有干物质89.13％、粗蛋白46.92％、粗脂肪1.53％和粗灰分5.46％，为大豆经加热、粉碎、提取油脂、挥发干溶剂后的副产物。

³花生粕含有干物质88.21％、粗蛋白47.54％、粗脂肪1.42％和粗灰分5.33％，为花生仁经加热、粉碎、提取油脂、挥发干溶剂后的副产物。

⁴棉粕含有干物质89.46％、粗蛋白44.37％、粗脂肪0.54％和粗灰分5.82％，为棉籽仁经加热、粉碎、提取油脂、挥发干溶剂后的副产物。

⁵DL-蛋氨酸符合NY/T 471-2018的要求。

⁶小麦粉由小麦粉碎后制得，含有干物质87.60％、粗蛋白13.32％、粗脂肪2.03％和粗灰分1.84％。

⁷菜籽油含有干物质99.03％、粗蛋白0.00％、粗脂肪98.00％和粗灰分0.53％，由油菜籽经压榨制得。

⁸每千克维生素添加剂包含：维生素A乙酸酯500,000IU、维生素D3240,000IU、DL-α-生育酚20.00g、维生素K3 0.10g、维生素B1 0.10g、核黄素0.50g、盐酸吡哆醇0.92g、氰钴胺0.001g、D-泛酸钙2.46g、烟酸2.80g、D-生物素0.10g、肌醇51.81g和叶酸0.50g，载体为脱脂米糠。各成分符合NY/T 471-2018的要求。

⁹每千克矿物质添加剂包含：FeSO₄ 37.90g、蛋氨酸铜1.69g、蛋氨酸锌23.71g、蛋氨酸锰7.15g、蛋氨酸硒0.06g和KI 0.134g，稀释剂为石灰石粉。各成分符合NY/T 471-2018的要求。

三、抗应激组合的筛选

1、天然复合抗应激剂I

根据基础饲料配方，按下表将5种提取物分别以1g/kg的浓度添加到基础饲料的油脂中，制成相应的6种颗粒饲料。实验设计如表2所示。

表2有机溶剂提取物抗鱼应激试验设计

备注：以不添加任何提取物的基础饲料标记为“空白”，以添加所有5种提取物的饲料标记为“对照”，与“对照”相比逐一扣除丹参乙酸乙酯提取物、紫苏叶乙酸乙酯提取物、当归乙酸乙酯提取物、桑叶乙酸乙酯提取物、银杏叶乙酸乙酯提取物分别标记为“1”、“2”、“3”、“4”和“5”。

从四川省内江市市中区永安镇购得鲫鱼苗后，在养殖室内暂养一周。选择体重相当(差异不超过1％)鲫鱼苗420尾随机分为7个处理组，每组3个鱼缸。每个鱼缸的形态、大小和颜色相同，尺寸都为30×30×40cm并内置800L/h流量增氧机一台。鱼缸内的水以可饮用自来水为水源、缸内水体积为30L。控制养殖室温度为22±1℃，增氧机持续供氧。给7个处理组分别投喂标记为“空白”、“对照”、“1”、“2”、“3”、“4”和“5”的饲料，每天饱食投喂4次。7天后测定鲫的耐缺氧能力。

测定方法：无空气密闭法，分别从每个鱼缸选择各处理组体重相当的鲫鱼13尾，每g鱼体重配备30mL饱和溶氧水，无空气密闭于塑料瓶中。记录和计算其中10尾鱼由正常到失去平衡(侧翻)所持续的时间和氧消耗率。将10尾侧翻的鲫鱼迅速转入饱和溶氧水体，记录2小时内恢复正常游泳姿态鱼的尾数。试验结果见表2和图1和2。

如表2、以及图1和图2所示，结果表明，与空白组相比，投喂复合提取物不同程度提高了鱼的耐缺氧持续时间。耐缺氧持续时间顺序：4＝5＞对照＝2＞3＝1，分别为14.02h、13.18h、12.04h、11.75h、10.55h、10.51h。缺氧侧翻后复氧恢复鱼尾数顺序：对照＝4＝5＞2＝1＝3，分别为8.00尾、8.00尾、7.67尾、6.33尾、6.00尾、6.00尾。可见，在复合提取物组分中，桑叶乙酸乙酯提取物、银杏叶乙酸乙酯提取物对复合提取物的其他成分的抗应激作用起到了抑制作用；而紫苏乙酸乙酯提取物、丹参乙酸乙酯提取物和当归乙酸乙酯提取物对其起到了促进作用。因此初步筛选复合提取物的组成成分为丹参乙酸乙酯提取物、当归乙酸乙酯提取物和紫苏乙酸乙酯提取物，标记为天然复合抗应激剂I。

表2投喂复合酯提取物对鲫耐缺氧能力的影响

备注：数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。氧消耗率＝(水末溶氧-水初溶氧)×水体积/鱼体重/持续时间。

2、天然复合抗应激剂II

根据基础饲料配方，按下表将5种提取物分别以2g/kg的浓度通过溶于可饮用水添加到基础饲料中，制成相应的6种颗粒饲料。实验设计如下表3所示。

表3复合水提取物抗鱼应激试验设计

添加物

空白

对照

1

2

3

4

5

丹参水提取物

×

○

×

○

○

○

○

紫苏叶水提取物

×

○

○

×

○

○

○

当归水提取物

×

○

○

○

×

○

○

桑叶水提取物

×

○

○

○

○

×

○

银杏叶水提取物

×

○

○

○

○

○

×

备注：以不添加任何提取物的基础饲料标记为“空白”，以添加所有5种提取物的饲料标记为“对照”，与“对照”相比逐一扣除丹参水提取物、紫苏叶水提取物、当归水提取物、桑叶水提取物和银杏叶水提取物的饲料分别标记为“1”、“2”、“3”、“4”和“5”。

从四川省内江市市中区永安镇购得鲫鱼苗后，在养殖室内暂养一周。选择体重相当(差异不超过1％)鲫鱼苗420尾随机分为7个处理组，每组3个鱼缸。每个鱼缸的形态、大小和颜色相同，尺寸都为30×30×40cm并内置800L/h流量增氧机一台。鱼缸内的水以可饮用自来水为水源、缸内水体积为30L。控制养殖室温度为22±1℃，增氧机持续供氧。给7个处理组分别投喂标记为“空白”、“对照”、“1”、“2”、“3”、“4”和“5”的饲料，每天饱食投喂4次。7天后测定鲫的耐缺氧能力。

测定方法：无空气密闭法，分别从每个鱼缸选择各处理组体重相当的鲫鱼13尾，每g鱼体重配备30mL饱和溶氧水，无空气密闭于塑料瓶中。记录和计算其中10尾鱼由正常到失去平衡(侧翻)所持续的时间和氧消耗率。将10尾侧翻的鲫鱼迅速转入饱和溶氧水体，记录2小时内恢复正常游泳姿态鱼的尾数。试验结果见表4和图3和4。

如表4、以及附图3和4所示，结果表明，与空白组相比，投喂复合提取物不同程度提高了鱼的耐缺氧持续时间。耐缺氧持续时间顺序：3＞2＝对照＞5＝1＞4，分别为12.23h、11.31h、11.24h、10.26h、10.21h、9.27h。缺氧侧翻后复氧恢复鱼尾数顺序：3＝对照＞2＞1＝5＞4，分别为8.00尾、7.67尾、7.33尾、6.33尾、6.33尾、6.00尾。可见，在复合提取物组分中，紫苏叶水提取物、当归水提取物对复合提取物的其他成分的抗应激作用起到了抑制作用；而丹参水提取物、桑叶水提取物和银杏叶水提取物对其起到了促进作用。因此初步筛选复合水提取物的组成成分为丹参水提取物、桑叶水提取物和银杏叶水提取物，标记为复合抗应激剂II。

表4投喂复合水提取物对鲫耐缺氧能力的影响

备注：数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。氧消耗率＝(水末溶氧-水初溶氧)×水体积/鱼体重/持续时间。

3、复合抗应激剂的复合与验证

为了验证其抗应激效果，将复合抗应激剂I(简称“I”)添加到基础饲料中，在以上相同养殖环境和条件下与组分筛选试验I中效果最好的4号饲料(简称“对照I”)进行比较。将复合抗应激剂II(简称“II”)添加到基础饲料中，在以上相同养殖环境和条件下与组分筛选试验中效果最好的3号饲料(简称“对照II”)进行比较。将含复合抗应激剂I(含量为0.3％)的饲料和含复合抗应激剂II(含量为0.6％)的饲料等量混合(平均含量为0.45％)(简称“(I+II)/2”)，在以上相同养殖环境和条件下与含复合抗应激剂I的饲料和含复合抗应激剂II的饲料进行比较。空白组同样投喂基础饲料。实验设计如表5所示。

表5复合抗应激剂试验设计

在以上相同养殖环境和条件下投喂鲫鱼，按以上相同的方法测定鲫的耐缺氧能力。实验结果(如表6、以及图5和图6所示)表明，与空白组相比，投喂复合提取物不同程度提高了鱼的耐缺氧持续时间。耐缺氧持续时间顺序：I＞对照I；II＞对照II；(I+II)/2＞I＝II；缺氧侧翻后复氧恢复鱼尾数顺序：I＝对照I；II＞对照II；(I+II)/2＞II＞I。可见，复合抗应激剂II的抗应激效果高于其对照，二者混合的效果更好。

表6投喂复合抗应激剂对鲫耐缺氧能力的影响

注：数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。氧消耗率＝(水末溶氧-水初溶氧)×水体积/鱼体重/持续时间。

4、复合抗应激剂的抗红细胞凋亡能力的验证

(1)验证方法：

从以上(复合抗应激剂的复合与验证)未参与耐缺氧测定的鱼中，每个处理组随机选择15尾鱼，平均分给3个鱼缸(每缸5尾鱼)；在每个鱼缸水体中溶入0.6mg Cu/L的硫酸铜。给每个鱼缸分别投喂标上述的“天然复合抗应激剂I”、“天然复合抗应激剂I”和“复合抗应激剂”，每天饱食投喂4次。

从以上(复合抗应激剂的复合与验证)未参与耐缺氧测定的鱼中，每个处理组再随机选择15尾鱼，平均分给3个鱼缸(每缸5尾鱼)；在每个鱼缸水体中溶入2.2mg/L的敌百虫。给每个鱼缸分别投喂标上述的“天然复合抗应激剂I”、“天然复合抗应激剂I”和“复合抗应激剂”，每天饱食投喂4次。

3天后对每条鱼进行尾静脉取血，分离红细胞，利用Annexin V-FITC试剂盒和流式细胞仪测定红细胞凋亡率。

(2)验证结果：

如表7所示，结果表明，投喂复合提取物抑制了硫酸铜或敌百虫诱导的鲫鱼红细胞凋亡；复合抗应激剂(I+II)/2的抗红细胞凋亡的效果高于I和II。

注：数据以3个重复的平均数±标准差表示，每个重复5尾鱼；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。