一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺及其应用
阅读说明：本技术 一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺及其应用 (Preparation process and application of sanguinarine extract gel ) 是由 傅建 吴静澜 杨姗 张永萍 徐剑 于 2021-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺及其应用。本发明工艺步骤包括：(1)取卡波姆940撒于甘油中,加入去离子水溶胀,水浴加热搅拌溶解,加入透明质酸钠、尿囊素和氮酮,搅拌至呈胶状,取下后冷却至室温,得A相；(2)取血人参提取物粉末,用10mL60％乙醇溶解,加入丙二醇和尼泊金甲酯,搅拌溶解,得B相；(3)将B相缓慢加入A相中,搅拌均匀,加三乙醇胺调节pH,再加去离子水,搅匀,得血人参提取物凝胶剂。本发明制备的血人参提取物凝胶剂,无颗粒感,透明度好,黏稠度适中,易于涂展,pH为6.30,为一款血红色凝胶剂。本发明提出的血人参提取物凝胶剂有很好的美白祛斑作用。(The invention discloses a preparation process and application of a sanguinea root extract gel. The process comprises the following steps: (1) scattering carbomer 940 in glycerol, adding deionized water for swelling, heating in water bath, stirring for dissolving, adding sodium hyaluronate, allantoin and azone, stirring to obtain colloid, taking off, and cooling to room temperature to obtain phase A; (2) dissolving the blood ginseng extract powder with 10mL of 60% ethanol, adding propylene glycol and methyl paraben, and stirring for dissolving to obtain phase B; (3) slowly adding phase B into phase A, stirring, adding triethanolamine to adjust pH, adding deionized water, and stirring to obtain XUERENSHEN extract gel. The sanguinarine extract gel prepared by the invention has no granular sensation, good transparency, moderate viscosity and easy spreading, and the pH value is 6.30, so that the sanguinarine gel is a sanguine gel. The sanguinea root extract gel provided by the invention has good whitening and freckle removing effects.)
技术领域
本发明涉及应用血人参
技术领域
，特别是一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺及其应用。背景技术
血人参，中药名。为豆科木蓝属植物茸毛木蓝(Indigofera stachyoides Lindl.)的干燥根。具有清热解表，化痰，利湿，活血止痛之功效。
血人参的黄酮类成分主要有表儿茶素、儿茶素、原儿茶醛、原儿茶酸、没食子酸等成分。在血人参的总黄酮提取工艺研究中发现其总黄酮在生药中的含量较低，其纯度只有4.33％，不利于活性成分的药效发挥。且目前对于血人参的开发应用，仅停留在将其作为中药材利用其传统功效上，未见对其开发出其他应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺及其应用。本发明制备的血人参提取物凝胶剂，无颗粒感，透明度好，黏稠度适中，易于涂展，pH为6.30，为一款血红色凝胶剂。本发明还提出了血人参提取物分离提纯的方法，得到高纯度的血人参提取物粉末作为原料保障血人参提取物凝胶剂的效果。本发明提出的血人参提取物凝胶剂有很好的美白祛斑作用。
本发明的技术方案：一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺及其应用，包括如下步骤：
(1)取卡波姆940撒于甘油中，加入去离子水溶胀，水浴加热搅拌溶解，加入透明质酸钠、尿囊素和氮酮，搅拌至呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取血人参提取物粉末，用乙醇溶解，加入丙二醇和尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加三乙醇胺调节pH，再加去离子水，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
前述的血人参提取物凝胶剂的制备工艺中，包括如下步骤：
(1)按重量份计，取0.38-0.42份卡波姆940撒于18-19份甘油中，加入45-55份去离子水溶胀22-26h，80-90℃水浴加热搅拌溶解，加入0.8-0.12份透明质酸钠、0.12-0.18份尿囊素和0.8-1.2份氮酮，搅拌0.8-1.2h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取4.8-5.2份血人参提取物粉末，用8-12份50％-70％乙醇溶解，加入4-6份丙二醇和0.08-0.12份尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.27-0.31份三乙醇胺调节pH，再加去离子水95-105份，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
前述的血人参提取物凝胶剂的制备工艺中，包括如下步骤：
(1)按重量份计，取0.4份卡波姆940撒于18.35份甘油中，加入50份去离子水溶胀24h，85℃水浴加热搅拌溶解，加入0.1份透明质酸钠、0.15份尿囊素和1份氮酮，搅拌1h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取5份血人参提取物粉末，用10份60％乙醇溶解，加入5份丙二醇和0.1份尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.29份三乙醇胺调节pH，再加去离子水100份，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
前述的血人参提取物凝胶剂的制备工艺中，所述步骤(2)中的血人参提取物粉末的制备方法，包括如下步骤：
(1)取血人参粉，用50-70％乙醇提取3次，每次1.5-2.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中40-50℃减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加0.8-1.5倍水稀释后，取0.8-1.2倍体积的石油醚萃取1-2次，弃去石油醚层，水层继续加0.8-1.2倍体积的乙酸乙酯萃取5-7次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用2-5％盐酸溶液和2-5％NaOH溶液浸泡2.5-3.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5-5.5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取8-12g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为3.5-4.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液65-75mL4.7BV，以0.8-1.2mL/min的体积流量上样，待吸附2.5-3.5h后，纯水除杂，用110-130mL8BV的65-75％乙醇以2.5-3.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
前述的血人参提取物凝胶剂的制备工艺中，所述步骤(2)中的血人参提取物粉末的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取血人参粉，用60％乙醇提取3次，每次2h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中45℃减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1倍水稀释后，取相同体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加相同体积的乙酸乙酯萃取6次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加适量蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.38mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：精密称取10.0g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，柱尺寸15mm×300mm，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4的步骤(4)得到的血人参提取物溶液70mL4.7BV，以1mL/min的体积流量上样，待吸附3h后，纯水除杂，用120mL8BV的70％乙醇以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺的应用，所述血人参提取物凝胶剂的制备工艺制得的血人参提取物凝胶剂用于美白祛斑。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明通过大量实验，确定了最优血人参提取物凝胶剂的制备工艺，根据优选的最佳处方，称取0.4份卡波姆940撒于18.35份甘油中，加入50份去离子水溶胀24h，85℃水浴加热搅拌溶解，加入0.1份透明质酸钠，0.15份尿囊素和1份氮酮，搅拌1h使之呈胶状，取下待冷却，作为A相备用；称取5份血人参提取物粉末，用适量溶剂溶解，加入5份丙二醇和0.1份尼泊金甲酯，搅拌溶解，作为B相备用。将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加三乙醇胺0.29份调节pH，加去离子水至100份，搅匀即得血人参提取物凝胶剂，制备的凝胶剂细腻无颗粒感，透明度好，黏稠度适中，易于涂展，pH为6.30，为一款血红色凝胶剂。
2、本发明所提出的血人参提取物凝胶剂制备工艺简单，处方稳定可行，方法可靠。
3、制备血人参提取物凝胶剂需要用到血人参提取物粉，现有技术所得到的血人参提取物纯度只有4.33％的基础上，在本发明提出了AB-8型大孔吸附树脂为纯化血人参提取物的最佳大孔吸附树脂型号。最佳纯化条件为：上样体积为70mL(4.7BV)，上样浓度为5.38mg/mL，上样液流量体积为1mL/min，洗脱剂体积流量为3mL/min，洗脱剂为70％乙醇，洗脱剂体积为120mL(8BV)，能够将血人参提取物中总黄酮的纯度从29.20％上升至46.01％。本发明通过高纯度的人参总黄酮粉保障血人参提取物凝胶剂的品质。
4、本发明制得的血人参提取物凝胶剂制备工艺有很好的美白祛斑功效。此功效的提出源于本发明的研究(1)血人参提取物对酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性均有抑制作用，能有效抑制酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性，且抑制率随着总黄酮质量浓度的增大而升高，IC50分别为88.78mg/L和34.46mg/L。通过对酪氨酸酶抑制动力学参数分析结果显示，由米氏方程可知Vmax随血人参提取物质量浓度的增大而减小，Km值随血人参提取物质量浓度的增大保持不变，因此可判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型为可逆非竞争性抑制，其抑制常数Ki为15.25mg/L。所以，血人参提取物对酪氨酸酶具有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性，抑制类型为可逆的非竞争性抑制，本发明为血人参作为酪氨酸酶抑制剂的开发应用提供了一定的理论依据。(2)血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑素合成均具有一定的抑制作用。细胞形态学结果显示，当血人参提取物浓度小于5mg/L时，细胞形态和数量变化不明显，当细胞达到50mg/L时，细胞几乎全部死亡。血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞的增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑色素合成的抑制作用均呈浓度和时间依赖关系。说明血人参提取物能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶活性以及黑色素合成。
综上所述：本发明制备的血人参提取物凝胶剂，无颗粒感，透明度好，黏稠度适中，易于涂展，pH为6.30，为一款血红色凝胶剂。本发明还提出了血人参提取物分离提纯的方法，能够得到血人参总黄酮在纯度46％以上的高纯度的血人参提取物粉末作为原料保障血人参提取物凝胶剂的效果。本发明提出的血人参提取物凝胶剂有很好的美白祛斑作用。
附图说明
图1是紫外全波长扫描图；
图2是表儿茶素对照品标准曲线图；
图3是静态吸附曲线图；
图4是静态解析曲线图；
图5是泄露曲线图；
图6是不同浓度对血人参提取物吸附率的影响图；
图7是不同上样体积流量对血人参提取物吸附率的影响图；
图8是不同洗脱体积流量对总黄酮解析率的影响图；
图9是洗脱剂不同体积分数对总黄酮解析率的影响图；
图10是洗脱溶剂体积的考察图；
图11是血人参提取物对单酚酶的作用进程曲线图；
图12是血人参提取物对酪氨酸单酚酶的抑制作用图；
图13是血人参提取物对酪氨酸二酚酶的作用进程曲线图；
图14是血人参提取物对酪氨酸二酚酶的抑制作用图；
图15是不同质量浓度血人参提取物下酪氨酸酶浓度与酶活力的关系图；
图16是血人参提取物对酪氨酸酶催化氧化L-DOPA抑制作用的Lineweaver-Burk图；
图17是不同浓度血人参提取物对酪氨酸二酚酶的Dixon曲线图；
图18是血人参提取物提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态观察图一；
图19是血人参提取物提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态观察图二；
图20是血人参提取物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响图；
图21是血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响图；
图22是血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内黑色素形成抑制率的影响图；
图23是卡波姆940用量对血人参提取物凝胶剂黏度的影响图；
图24是透明质酸钠用量对血人参提取物凝胶剂黏度的影响图；
图25是甘油用量对血人参提取物凝胶剂黏度的影响图；
图26是三乙醇胺用量对血人参提取物凝胶剂黏度的影响图；
图27是丙二醇用量对血人参提取物凝胶剂黏度的影响图；
图28是卡波姆与甘油交互作用响应面分析结果图；
图29是卡波姆与三乙醇胺交互作用响应面分析结果图；
图30是甘油与三乙醇胺交互作用响应面分析结果图；
图31是本发明血人参提取物凝胶剂的验证性试验图。
附图说明
：图18-图19中，A：对照组；B：2.5μg/mL总黄酮组；C：5μg/mL总黄酮组；D：10μg/mL总黄酮组；E：15μg/mL总黄酮组；F：20μg/mL总黄酮组；G：30μg/mL总黄酮组；H：40μg/mL总黄酮组；I：50μg/mL总黄酮组；图1中，A为对照品，B为样品。具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)取4kg血人参粉，用50％乙醇提取3次，每次1.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中40℃减压回收乙醇至无醇味，得到4L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加0.8倍水稀释后，取0.8倍体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加0.8倍体积的乙酸乙酯萃取5次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用2％盐酸溶液和2％NaOH溶液浸泡2.55h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取8g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为3.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液65mL4.7BV，以0.8mL/min的体积流量上样，待吸附2.5h后，纯水除杂，用1108BV的65％乙醇以2.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.38g卡波姆940撒于18g甘油中，加入45mL去离子水溶胀22h，80℃水浴加热搅拌溶解，加入0.8g透明质酸钠、0.12g尿囊素和0.8g氮酮，搅拌0.8h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取4.8g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入4.8g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.27mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水95g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例2。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)取6kg血人参粉，用70％乙醇提取3次，每次2.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中50℃减压回收乙醇至无醇味，得到6L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1.5倍水稀释后，取1.2倍体积的石油醚萃取2次，弃去石油醚层，水层继续加1.2倍体积的乙酸乙酯萃取7次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取12g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液75mL4.7BV，以1.2mL/min的体积流量上样，待吸附3.5h后，纯水除杂，用130mL8BV的75％乙醇以3.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.38g卡波姆940撒于18g甘油中，加入45mL去离子水溶胀22h，80℃水浴加热搅拌溶解，加入0.8g透明质酸钠、0.12g尿囊素和0.8g氮酮，搅拌0.8h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取4.8g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入4.8g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.27mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水95g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例3。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)称取5kg血人参粉，用60％乙醇提取3次，每次2h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中45℃减压回收乙醇至无醇味，得到5L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1倍水稀释后，取相同体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加相同体积的乙酸乙酯萃取6次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加适量蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.38mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：精密称取10.0g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，柱尺寸15mm×300mm，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4的步骤(4)得到的血人参提取物溶液70mL4.7BV，以1mL/min的体积流量上样，待吸附3h后，纯水除杂，用120mL8BV的70％乙醇以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.38g卡波姆940撒于18g甘油中，加入45mL去离子水溶胀22h，80℃水浴加热搅拌溶解，加入0.8g透明质酸钠、0.12g尿囊素和0.8g氮酮，搅拌0.8h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取4.8g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入4.8g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.27mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水95g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例4。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)取4kg血人参粉，用50％乙醇提取3次，每次1.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中40℃减压回收乙醇至无醇味，得到4L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加0.8倍水稀释后，取0.8倍体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加0.8倍体积的乙酸乙酯萃取5次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用2％盐酸溶液和2％NaOH溶液浸泡2.55h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取8g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为3.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液65mL4.7BV，以0.8mL/min的体积流量上样，待吸附2.5h后，纯水除杂，用1108BV的65％乙醇以2.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.42g卡波姆940撒于19g甘油中，加入55mL去离子水溶胀26h，90℃水浴加热搅拌溶解，加入0.12g透明质酸钠、0.18g尿囊素和1.2g氮酮，搅拌1.2h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取5.2g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入5.2g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.31mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水105g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例5。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)取6kg血人参粉，用70％乙醇提取3次，每次2.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中50℃减压回收乙醇至无醇味，得到6L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1.5倍水稀释后，取1.2倍体积的石油醚萃取2次，弃去石油醚层，水层继续加1.2倍体积的乙酸乙酯萃取7次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取12g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液75mL4.7BV，以1.2mL/min的体积流量上样，待吸附3.5h后，纯水除杂，用130mL8BV的75％乙醇以3.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.42g卡波姆940撒于19g甘油中，加入55mL去离子水溶胀26h，90℃水浴加热搅拌溶解，加入0.12g透明质酸钠、0.18g尿囊素和1.2g氮酮，搅拌1.2h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取5.2g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入5.2g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.31mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水105g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例6。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)称取5kg血人参粉，用60％乙醇提取3次，每次2h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中45℃减压回收乙醇至无醇味，得到5L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1倍水稀释后，取相同体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加相同体积的乙酸乙酯萃取6次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加适量蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.38mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：精密称取10.0g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，柱尺寸15mm×300mm，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4的步骤(4)得到的血人参提取物溶液70mL4.7BV，以1mL/min的体积流量上样，待吸附3h后，纯水除杂，用120mL8BV的70％乙醇以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.42g卡波姆940撒于19g甘油中，加入55mL去离子水溶胀26h，90℃水浴加热搅拌溶解，加入0.12g透明质酸钠、0.18g尿囊素和1.2g氮酮，搅拌1.2h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取5.2g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入5.2g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.31mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水105g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例7。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)取4kg血人参粉，用50％乙醇提取3次，每次1.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中40℃减压回收乙醇至无醇味，得到4L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加0.8倍水稀释后，取0.8倍体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加0.8倍体积的乙酸乙酯萃取5次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用2％盐酸溶液和2％NaOH溶液浸泡2.55h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取8g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为3.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液65mL4.7BV，以0.8mL/min的体积流量上样，待吸附2.5h后，纯水除杂，用1108BV的65％乙醇以2.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.4g卡波姆940撒于18.35g甘油中，加入50mL去离子水溶胀24h，85℃水浴加热搅拌溶解，加入0.1g透明质酸钠、0.15g尿囊素和1g氮酮，搅拌1h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取5g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入5g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.29mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水100g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例8。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)取6kg血人参粉，用70％乙醇提取3次，每次2.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中50℃减压回收乙醇至无醇味，得到6L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1.5倍水稀释后，取1.2倍体积的石油醚萃取2次，弃去石油醚层，水层继续加1.2倍体积的乙酸乙酯萃取7次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取12g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液75mL4.7BV，以1.2mL/min的体积流量上样，待吸附3.5h后，纯水除杂，用130mL8BV的75％乙醇以3.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.4g卡波姆940撒于18.35g甘油中，加入50mL去离子水溶胀24h，85℃水浴加热搅拌溶解，加入0.1g透明质酸钠、0.15g尿囊素和1g氮酮，搅拌1h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取5g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入5g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.29mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水100g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
实施例9。一种血人参提取物凝胶剂的制备工艺，步骤为：
血人参提取物粉末的制备方法：
(1)称取5kg血人参粉，用60％乙醇提取3次，每次2h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中45℃减压回收乙醇至无醇味，得到5L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1倍水稀释后，取相同体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加相同体积的乙酸乙酯萃取6次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加适量蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.38mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：精密称取10.0g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，柱尺寸15mm×300mm，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4的步骤(4)得到的血人参提取物溶液70mL4.7BV，以1mL/min的体积流量上样，待吸附3h后，纯水除杂，用120mL8BV的70％乙醇以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得血人参提取物粉末。
血人参提取物凝胶剂的制备方法：(1)取0.4g卡波姆940撒于18.35g甘油中，加入50mL去离子水溶胀24h，85℃水浴加热搅拌溶解，加入0.1g透明质酸钠、0.15g尿囊素和1g氮酮，搅拌1h呈胶状，取下后冷却至室温，得A相；
(2)取5g血人参提取物粉末，用10mL60％乙醇溶解，加入5g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，得B相；
(3)将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加0.29mL三乙醇胺调节pH，再加去离子水100g，搅匀，得血人参提取物凝胶剂。
使用方法：取适量血人参提取物凝胶剂，每晚临睡前涂抹一次。
研究本发明方案的过程中，发明做了大量试验，部分试验记录如下：
试验例1。大孔吸附树脂分离纯化血人参提取物工艺研究
1背景
血人参的黄酮类成分主要有表儿茶素、儿茶素、原儿茶醛、原儿茶酸、没食子酸等成分。在血人参的总黄酮提取工艺研究中发现其总黄酮在生药中的含量较低，其纯度只有4.33％，不利于活性成分的药效发挥。前期研究中发现血人参黄酮类成分主要集中在乙酸乙酯部位，将血人参提取物初步用乙酸乙酯纯化后，血人参总黄酮纯度也只能达到29.20％。为提高血人参提取物的纯度，本实验以血人参乙酸乙酯部位提取物作为研究对象，利用大孔吸附树脂对其进行纯化处理，优化血人参提取物的纯化工艺，为血人参的进一步开发应用提供实验依据。
2方法
2.1 溶液的配制
2.1.1 标准溶液的配制
精密称取表儿茶素对照品适量，加入适量60％乙醇溶液超声溶解，冷却后定容至刻度线，配置成质量浓度为0.20mg/mL的表儿茶素对照品溶液。
2.1.2 血人参上柱前样品溶液的制备
称取5.0kg血人参药材粗粉，用30倍60％乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取液进行抽滤。将得到的滤液于45℃下减压回收乙醇，至药液无醇味，最终体积为5L。将浓缩液加一倍蒸馏水稀释后，取相同体积的石油醚萃取一次，再取相同体积的乙酸乙酯溶液萃取5～7次，回收乙酸乙酯，得到稠浸膏，于真空干燥箱中45℃下干燥成浸膏粉，总质量为228.05g。称取适量血人参乙酸乙酯部位浸膏粉，加水超声溶解，根据实验配制成所需溶度。
2.2 测定波长的选择
精密吸取适量表儿茶素对照品溶液和供试品溶液，利用经典黄酮显色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)进行显色处理后，于400～700nm内进行扫描，测定最大吸收波长。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的绘制
分别精密量取表儿茶素对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于10mL容量瓶中，各加60％乙醇补至5mL；精密加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入4％氢氧化钠溶液4mL，加60％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min，得系列质量浓度的对照品溶液，采用紫外分光光度法于503nm波长处测定表儿茶素吸光度，以对照品系列质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线。
2.3.2 精密度考察
精密量取表儿茶素对照品溶液0.4mL于10mL容量瓶中，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下连续测定6次，记录吸光度值，计算RSD值。
2.3.3 稳定性考察
精密量取适量样品溶液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长进行测定，每分钟测定一次，连续测定15min，记录吸光度值，计算RSD值。
2.3.4 重复性考察
精密称取10mg血人参乙酸乙酯部位浸膏粉6份于10mL容量瓶中，加蒸馏水超声溶解，分别取0.2mL于10mL容量瓶中，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，记录吸光度值A，计算RSD值。
2.3.5 加样回收率考察
精密称取9份约10mg的血人参乙酸乙酯部位浸膏粉9份分别于25mL容量瓶中，分别在1～3号中加入1.5mg表儿茶素对照品，在4～6号中加入3mg表儿茶素对照品，在7～9号加入4.5mg表儿茶素对照品，分别加蒸馏水溶解后，取0.2mL按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算回收率。
2.4 静态吸附-解析试验
2.4.1 大孔吸附树脂的预处理
先用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h，使其充分溶胀，过滤后反复用纯水清洗至无白色浑浊、无乙醇味后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3h，用纯水反复冲洗至中性，最后用纯水保鲜，密封储存备用。
2.4.2 大孔吸附树脂型号的筛选
2.4.2.1 不同型号大孔吸附树脂对血人参提取物吸附性能的考察
分别称取2.0g预处理好的AB-8、D-101、HPD-100、HP-20、D-301、H-103大孔吸附树脂至100mL具塞锥形瓶中，分别加入50mL上样溶液(1.78mg/mL)，室温下置于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)，过滤，得到吸附液，取样按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算其吸附量和吸附率。
静态吸附量(mg/g)＝(C0-C1)×V1/W
吸附率(％)＝(C0-C1)/C0×100％
注：C0为初始溶度(mg/mL)；C1为平衡液浓度(mg/mL)；V1为样品液体积(mL)；W为树脂重量(g)
2.4.2.2 不同型号大孔吸附树脂对血人参提取物解析性能的考察
将上述各锥形瓶中吸附饱和的大孔吸附树脂用适量纯水冲去树脂表面的溶液和杂质，精密加入50mL的50％乙醇解吸附，室温下置于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)使充分解吸附后取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，并计算解吸后总黄酮的含量及解析率。
解吸量(mg/g)＝C2×V2/W
解吸率(％)＝C2×V2/(C0-C1)×V1×100％
注：C2为解吸液质量浓度(mg/mL)；V2为解吸液体积；W为树脂重量(g)；V1为溶液体积(mL)
2.4.3 静态吸附动力学曲线
精密称取预处理过的理想树脂2.0g于100mL具塞锥形瓶中，加入50mL样品溶液，室温下于恒温振荡水槽中振摇12h(25℃，100rpm/min)，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h时取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，绘制浓度与时间的静态吸附动力学曲线。
2.4.4 静态解析动力学曲线
将上述吸附饱和的大孔吸附树脂用适量纯水冲去树脂表面的溶液和杂质，精密加入50mL的50％乙醇解吸附，室温下置于摇床中振摇12h(25℃，100rpm/min)，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h时取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，建立浓度与时间的静态解吸动力学曲线。
2.4.5 上样液pH值对吸附率和解析率的影响
分别称取2.0g预处理好的理想大孔吸附树脂至100mL具塞锥形瓶中，分别加入采用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液调节pH值分别为2、3、4、5、6、7、8的样品溶液50mL，室温下于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)，过滤，得到吸附液，取样按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算其吸附量和吸附率。将上述各瓶中吸附饱和的树脂用适量纯水冲去表面的溶液和杂质，精密加入50mL的50％乙醇解吸附，室温下置于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)使充分解吸附后取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，并计算解吸后总黄酮的含量及解析率，根据吸附率和解析率计算总黄酮回收率。
2.5 动态吸附-解析试验
2.5.1 泄露曲线的绘制
取3份预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g，精密称定，以湿法装柱缓慢装入层析柱中(15mm×300mm)，分别取250mL总黄酮浓度分别为1.73mg/mL、3.50mg/mL和5.38mg/mL的样品溶液，室温下pH值调为4，以1.0mL/min的体积流量加入树脂柱中，分段收集流出液，流出液每10mL收集1份，取每份流出液按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算总黄酮含量，并分别绘制泄露曲线，确定最佳上样体积。
2.5.2 上样液浓度的考察
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取浓度分别为1.96、5.38、9.45、12.83、14.31mg/mL的上样液70mL，调pH值为4，以1.0mL/min的流速上样，分别收集滤液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算各质量浓度下的吸附率，确定上样液质量浓度。
2.5.3 上样体积流量对动态吸附性能的影响
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取上样液70mL，调至pH值为4，分别以1.0、2.0、3.0、4.0mL/min的体积流量上样，分别收集滤液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算各体积流量下的吸附率，确定上样体积流量。
2.5.4 洗脱体积流量对洗脱效果的影响
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取上样液70mL，将pH值调至4，以1.0mL/min的流速上样，特吸附饱和后，用70％乙醇50mL分别以1.0、2.0、3.0、4.0mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算洗脱率，确定最佳洗脱体积流量。
2.5.5 洗脱溶剂对AB-8大孔树脂洗脱血人参提取物效果的影响
精密称取10份预处理的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取上样液70mL，将pH值调至4，以1.0mL/min的流速上样，特吸附饱和后，依次用超纯水及10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％乙醇溶液各120mL洗脱，分别收集洗脱液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，确定最佳洗脱溶剂。
2.5.6 洗脱溶剂用量对洗脱效果的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10.0g，按上述方法上样除杂，再用70％乙醇溶液(200mL)以3mL/min体积流量梯度洗脱，分别收集洗脱液，每10mL一份，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算每份洗脱液中的总黄酮含量，绘制洗脱曲线，确定最佳洗脱剂体积。
3结果
3.1 测定波长的选择
如图1所示，对照品和样品均在503nm处有最大吸收，因此确定503nm为最大吸收波长。
3.2 方法学考察结果
3.2.1 标准曲线的绘制
以对照品系列质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，得线性回归方程：Y＝39.754X+0.0361，相关系数r＝1，说明表儿茶素对照品在4.00～24.00mg/L内线性关系良好，如图2所示。
3.2.2 精密度试验
精密度试验结果如表3.1所示，计算得RSD为0.31％，说明仪器精密度良好。
表3.1精密度试验结果
3.2.3 稳定性试验
稳定性结果如表3.2所示，计算得RSD为1.39％，说明样品溶液在15min内稳定性良好。
表3.2稳定性结果
时间(min)
吸光度
时间(min)
吸光度
0
0.7847
8
0.7685
1
0.7840
9
0.7669
2
0.7845
10
0.7658
3
0.7826
11
0.7618
4
0.7807
12
0.7604
5
0.7735
13
0.7563
6
0.7719
14
0.7570
7
0.7698
15
0.7540
3.2.4 重复性试验
6批样品重复性试验结果如表3.3所示，计算得RSD为0.91％，说明该方法重复性良好。
表3.3重复性试验结果
3.2.5 加样回收率试验
加样回收试验结果如表3.4所示，平均回收率为98.68％，处于95～105％之间，RSD为2.04％，说明本方法的回收率良好。
表3.4加样回收试验结果
3.3 静态吸附-解析试验结果
3.3.1 大孔吸附树脂型号的筛选结果
大孔吸附树脂的理化性质能显著影响目标成分的吸附、分离纯化效果，其主要是与其孔径和比表面积等因素有关，其中其孔径大小影响被吸附物质的扩散，比表面积大小影响吸附物质的量。本实验选择了6种不同型号的大孔吸附树脂通过静态吸附和静态解析试验进行比较，由表3.5可见，其吸附率由大到小分别是H-103＞AB-8＞D-101＞HPD-100＞HP-20＞D-301，解析率由大到小分别是HPD-100＞AB-8＞D-101＞HP-20＞H-103＞D-301，虽然H-103的吸附率比AB-8大，但解析率较其小，因此综合总黄酮回收率和成本问题，选择AB-8作为纯化血人参提取物的最佳树脂型号。
表3.5不同类型大孔吸附树脂对血人参提取物的吸附率、解析率、总回收率
3.3.2 静态吸附曲线的绘制
由图3可见，在0～6h以内，血人参提取物的吸附率明显增加，随着吸附时间的增加，6h后其吸附率增长缓慢，趋于平衡。因此，AB-8大孔吸附树脂在6h时对血人参提取物的吸附基本达到饱和。
3.3.3 静态解析曲线的绘制
由图4可见，AB-8大孔吸附树脂对血人参提取物的静态解析在1h时其解析率已达到83.20％，在3h内洗脱量较大，3h后其洗脱量增加缓慢，快速达到平衡，因此，血人参提取物的静态解析为快速平衡型。
3.3.4 上样液pH值的确定
通过比较样品溶液不同pH值对总黄酮的吸附率和解析率的影响，结果见表3.6，随着pH值得增大，其吸附率越来越小，pH值为2时最大，但当pH为2时其解析率最低，pH为4时其解析率最高，因此综合考虑总黄酮回收率，选择pH 4作为最佳上样液pH。
表3.6不同pH值下对血人参提取物的吸附率、解析率、总黄酮回收率
编号
吸附率(％)
解析率(％)
总黄酮回收率(％)
pH2
92.53
74.71
69.13
pH3
88.50
88.44
78.27
pH4
88.51
90.25
79.88
pH5
87.93
89.89
79.04
pH6
86.78
87.37
75.82
pH7
85.06
88.30
75.11
pH8
79.31
76.14
60.39
3.4 动态吸附-解析试验结果
3.4.1 泄露曲线的绘制
当流出液中总黄酮质量浓度达到上样液中总黄酮质量浓度的十分之一时，到达泄漏点，认为此时为最佳上样体积。本实验考察了3个不同浓度样品溶液的泄露曲线，如图5所示，当浓度为1.73mg/mL时，在第16份流出液开始泄露，上样体积为160mL(10.7BV)；当浓度为3.50mg/mL时，在第11份流出液开始泄露，上样体积为110mL(7.3BV)；当浓度为5.38mg/mL时，在第7份流出液开始泄露。为考虑上样量和上样时间，选择上样液浓度为5.38mg/mL，上样体积为70mL(4.6BV)。
3.4.2 上样液浓度的确定
如图6所示，当上样液浓度分别为1.96、5.38、9.45、12.83、14.31mg/mL时，其吸附率分别为99.97％、97.86％、94.04％、80.93％和78.61％，随着上样溶液浓度的增大吸附率减小，当浓度为1.96mg/mL时，吸附率接近100％，但浓度太低会加大上样量，会延长生产周期，而浓度太大，吸附率会降低，会导致样品和溶剂的浪费。浓度为5.38mg/mL时，吸附率为97.86％，较为理想，因此选择上样液浓度为5.38mg/mL。
3.4.3 上样液体积流量的确定
如图7所示，随着上样体积流量的增加，其吸附率下降，体积流量在1～3mL/min时，下降得比较明显，在3～4mL/min下降趋于平缓。体积流量为1mL/min时，吸附率最高，为97.86％，因此确定最佳上样体积流量为1mL/min。
3.4.4 洗脱溶剂体积流量的确定
如图8所示，洗脱溶剂在1～3mL/min时，随着体积流量的增大解析率增大，当体积流量为4mL/min时，解析率下降，3mL/min时的洗脱率为88.60％，因此选择3mL/min作为最佳洗脱溶剂体积流量。
3.4.5 洗脱溶剂的确定
通过对水和不同浓度乙醇洗脱剂的考察，如图9所示，结果表明水、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％乙醇对血人参提取物的洗脱率分别为5.85％、21.87％、40.05％、40.25％、56.08％、90.03％、93.65％、94.22％、92.23％和90.74％。由此可见，70％乙醇对总黄酮的洗脱率最大，故选70％作为最佳洗脱溶剂
3.4.6 洗脱剂洗脱体积曲线的绘制
如图10所示，血人参提取物的洗脱曲线峰型比较好，在第1份流出液中就有少量黄酮洗脱出来，第2份洗脱液的黄酮含量最高，当到达第12份时血人参提取物基本为洗脱完全，因此确定血人参提取物洗脱溶剂的用量为120mL(8BV)。
3.5 验证性试验
分别称取3份10.0g预处理过得AB-8型大孔树脂，湿法上柱，取3份70mL样品溶液，调pH为4，以1mL/min的体积流量上样，收集流出液，待吸附3h后，用纯水除杂，再用70％乙醇120mL(8BV)以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液，取洗脱液按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下测定吸光度，计算洗脱液中总黄酮含量，其余洗脱液于真空干燥箱中干燥成粉末。结果显示，其平均吸附率为97.48％(RSD％为0.32％)，平均解析率为91.97％(RSD％为2.77％)，纯度为46.01％(RSD％为2.23)。
表3.7验证性试验结果
编号
1
2
3
平均值
RSD(％)
总黄酮纯度(％)
44.83
46.52
46.68
46.01
2.23
4结论与讨论
血人参是贵州省少数民族常用药，广泛分布在贵阳、安顺、黔东南、黔西南等地。目前对血人参的研究主要是药理作用和化学成分的研究，对血人参提取物的纯化分离尚未见报道。在血人参提取物的提取工艺研究报道中发现总黄酮的含量较低，不利于活性成分药效的发挥。前期研究中发现血人参黄酮类成分主要集中在乙酸乙酯部位，因此采用乙酸乙酯对提取液进行初步纯化。为了更深入研究，在前期试验的基础上，采用大孔吸附树脂分离纯化技术对血人参提取物进行分离纯化。
大孔吸附树脂是一类没有可解离基团，具有多孔结构，不溶于水的固体高分子材料，是分离纯化黄酮类化合物的常用介质。不同型号的大孔吸附树脂由于其本身极性、比表面积、孔径等不同而使自身对于同一物质的吸附能力和解吸能力有所不同，从而产生不同的吸附效果。本实验综合吸附能力和解吸能力，对6种不同型号的大孔吸附树脂进行考察，确定AB-8型大孔吸附树脂为纯化血人参提取物的最佳大孔吸附树脂型号。最佳纯化条件为：上样体积为70mL(4.7BV)，上样浓度为5.38mg/mL，上样液流量体积为1mL/min，洗脱剂体积流量为3mL/min，洗脱剂为70％乙醇，洗脱剂体积为120mL(8BV)。通过验证性试验，结果显示血人参提取物中总黄酮的纯度从29.20％上升至46.01％。虽然纯化后的总黄酮纯度有所提高，但仍未达到50％，尝试了不同除杂方式以及聚酰胺纯化后其总黄酮纯度均未得到提高。
综上所述，通过大孔吸附树脂静态、动态吸附-解吸试验优化的血人参提取物纯化工艺稳定，可靠，可有效提高总黄酮的纯度，为血人参的开发利用提供了一定的参考。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
试验例2。血人参提取物对酪氨酸酶的抑制作用研究
1背景
酪氨酸酶，又称多酚氧化酶，是一种结构复杂的含铜金属酶，广泛存在人体、动植物以及微生物中。酪氨酸酶在黑色素形成过程中起关键作用，它能够催化L-酪氨酸羟基化成L-DOPA，并将L-DOPA氧化成多巴醌，再经过一系列复杂反应形成黑色素。酪氨酸酶的异常过量表达，会引起雀斑、黄褐斑、老年斑等皮肤色素沉着类疾病，因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以减少黑色素的合成，从而达到美白祛斑的作用。黄酮类化合物除具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等众多生理和药理活性，同时其还具有安全、高效的酪氨酸酶活性抑制能力。近年来，酪氨酸酶抑制剂作为美白祛斑剂在化妆品市场中得到广泛的应用，但一些传统的酪氨酸酶抑制剂会出现过敏性、不良反应等问题，使得探寻更加天然、安全、高效的酪氨酸酶抑制剂在美白祛斑化妆品中的开发具有很好的研究前景。本研究以血人参提取物为原料，研究其对酪氨酸单酚酶和二酚酶活性的抑制作用、对酪氨酸酶的抑制动力学以及抑制机理，为其在化妆品中的开发和应用提供参考。
2方法
2.1 试剂的配制
2.1.1 50mmol/L PBS缓冲液(pH 6.8)的配制
精密称取NaH2PO4 7.80 g，用去离子水溶解后定容至1000mL作为母液1备用；精密称取Na2HPO4 17.90 g，用去离子水溶解后定容至1000mL作为母液2备用。需用时分别量取51mL母液1和49mL母液2混匀，得到浓度为50mmol/L pH 6.8的PBS缓冲溶液。
2.1.2 L-酪氨酸溶液的配制
精密称取L-酪氨酸45.30mg，加pH 6.8PBS缓冲溶液(50mmol/L)溶解，定容至50mL，得到浓度为5mmol/L的L-酪氨酸溶液，4℃避光保存备用。
2.1.3 L-多巴溶液的配制
精密称取L-多巴(L-DOPA)49.33mg，置于50mL容量瓶中，加pH 6.8PBS缓冲溶液(50mmol/L)溶解，并定容至刻度，得到浓度为5mmol/L的L-DOPA溶液，4℃条件下避光保存备用。
2.1.4 酪氨酸酶(TYR)溶液的配制
精密称取酪氨酸酶1.0mg于10mL容量瓶中，用pH 6.8PBS缓冲溶液(50mmol/L)溶解，并定容至刻度，得到0.1mg/mL的酪氨酸酶溶液，4℃避光保存。
2.1.5 血人参提取物溶液的配制
精密称取血人参提取物适量，用去离子水超声溶解，配制成浓度为5.0mg/mL的样品溶液，再取不同体积样品溶液在容量瓶中，加去离子水分别稀释得到0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0mg/mL的样品溶液，备用。
2.2 不同浓度血人参提取物对酪氨酸单酚酶活性的抑制作用
参考刘衬等的方法并稍加调整，以L-酪氨酸(5mmol/L)为底物，分别测定不同质量浓度血人参提取物(终浓度分别为0、16.67、33.33、50.00、66.67、100.00、133.33和166.67mg/L)对酪氨酸单酚酶活性的影响，按表2.1分别吸取50mmol/L的pH 6.8PBS溶液、10μL不同浓度样品溶液或去离子水、40μL酪氨酸酶溶液于96孔酶标板中，置于酶标仪中30℃中孵育振摇10min后，再加入100μL L-酪氨酸溶液(5mmol/L)，于475nm下测定其吸光度值(每分钟读取记录一次数据，连续测10min)。按公式(1)计算血人参提取物对酪氨酸酶的抑制率，以酶相对抑制率对样品浓度作图并计算IC50。
抑制率(％)＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100％ (1)
表2.1酪氨酸单酚酶酶活性测定的反应液的组成与用量
2.3 不同浓度血人参提取物对酪氨酸二酚酶活性的抑制作用
参考刘衬等的方法并稍加调整，以L-DOPA(5mmol/L)为底物，分别测定不同浓度血人参提取物(终浓度分别为0、16.67、33.33、50.00、66.67、100.00、133.33和166.67mg/L)对酪氨酸二酚酶活性的影响，按表2.2分别吸取50mmol/L的pH 6.8PBS溶液、10μL不同浓度样品溶液或去离子水、20μL酪氨酸酶溶液于96孔酶标板中，置于酶标仪中30℃中孵育振摇10min后，再加入100μL L-DOPA溶液(5mmol/L)，于475nm下测定其吸光度值(每分钟读取记录一次数据，连续测10min)。按公式(1)计算血人参提取物对酪氨酸酶的抑制率，以酶相对抑制率对样品浓度作图并计算IC50。
表2.2酪氨酸二酚酶活性测定的反应液的组成与用量
2.4 血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用机理
在实验中，改变酪氨酸酶浓度(终浓度分别为0、0.8、1.6、2.4、3.2mg/L)，固定底物L-DOPA的浓度为5mmol/L，测定不同浓度血人参提取物(0、16.67、33.33、50.00、66.67mg/L)对酪氨酸酶活力的影响，以酶质量浓度和相对酶活力作图，判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制作用是可逆抑制还是不可逆抑制，当得到的是一组通过原点的直线，则属于可逆抑制；如果得到的是一组平行的直线，则属于不可逆抑制。
2.5 血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制动力学
在实验中，改变底物L-DOPA浓度(0.25、0.5、1、2、4mmol/L)，固定酪氨酸酶浓度为0.1mg/mL，加入不同质量浓度血人参提取物溶液(终浓度分别为0、16.67、33.33、50.00、66.67mg/L)，通过反应体系吸光度值随时间的变化，测定不同质量浓度血人参提取物对酪氨酸酶活力的影响。以Lineweaver-Burk双倒数作图法，以反应速率的倒数对底物L-DOPA浓度的倒数作图，判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型。在Lineweaver-Burk双倒数图中如果得到一组相交于Y轴的直线，则说明该反应的抑制类型为竞争性抑制，动力学参数表现为Vmax值保持不变，Km值增大；如果得到一组相交于X轴的直线，则属于非竞争性抑制，动力学参数表现为Vmax值减小，Km值保持不变；如果得到一组相交于第二象限的直线，则属于混合型抑制，动力学参数表现为Vmax值减小，Km值增大；如果得到一组平行的直线，则属于反竞争性抑制，动力学参数表现为Vmax值减小，Km值减小。使用Dixon作图法，以总黄酮浓度为横坐标，反应速率的倒数(1/V)为纵坐标进行二次作图，判断血人参提取物对酪氨酸二酚酶的抑制常数。
3结果
3.1 不同浓度血人参提取物对酪氨酸单酚酶活性的抑制作用结果
不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸单酚酶活力的作用进程曲线如图11，由图中可以看出，随着反应时间的增加，各反应体系的吸光度值随之升高，但在反应初期吸光度值上升较缓慢，存在一定的迟滞效应。在同一时间下随着血人参提取物质量浓度的增大，酶反应速率逐渐下降。说明血人参提取物能抑制酪氨酸单酚酶的酶促氧化反应。不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸单酚酶的相对抑制率如图12所示，血人参提取物对酪氨酸单酚酶有一定的抑制作用，其抑制作用跟血人参提取物的浓度呈正相关，即随着血人参提取物的质量浓度的增大，其对酪氨酸单酚酶活性的抑制率随之增大。当血人参提取物对酪氨酸单酚酶活性的抑制率达到50％时血人参提取物的浓度为88.78mg/L。
3.2 不同浓度血人参提取物对酪氨酸二酚酶活性的抑制作用结果
不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸二酚酶的作用进程曲线如图13所示，随着时间的增加，各反应体系的吸光度值逐渐增大。同一时间下随着血人参提取物质量浓度的增大，反应体系的吸光度值减小即酶的反应速率减小。说明血人参提取物能抑制L-DOPA的酶促氧化。不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸二酚酶的相对抑制率如图14所示，结果表明，血人参提取物对酪氨酸二酚酶有一定的抑制作用，其抑制作用跟血人参提取物的浓度呈正相关，即随着血人参提取物的质量浓度的增大，其对酪氨酸二酚酶活性的抑制率随之增大。当血人参提取物对酪氨酸二酚酶酶活性的抑制率达到50％时血人参提取物的浓度为36.46mg/L，即IC50为36.46mg/L。
3.3 血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用机理结果
不同质量浓度血人参提取物溶液下酪氨酸酶质量浓度与酶活力的关系如图15所示，酪氨酸酶质量浓度与酶活力作图后得到一组经过原点的直线，且直线斜率随着血人参提取物质量浓度的增大而逐渐减小，说明血人参提取物对酪氨酸酶的抑制属于可逆抑制，即血人参提取物是通过抑制酪氨酸酶活力而导致酶催化效率下降，而不是通过降低有效酶量所致。
3.4 血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制动力学结果
通过改变底物L-DOPA的浓度研究不同质量浓度血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型，Lineweaver-Burk双倒数图如图16所示，得到一组相交于第二象限横坐标轴上的直线，根据此图可以得到米氏方程，通过米氏方程可以得到Km值和Vmax值，结果见表3.1。随着血人参提取物浓度的增大，Km值不变，Vmax值逐渐减小，即只影响了酶催化反应的最大速率，对米氏常数没有明显影响，符合非竞争性抑制的动力学参数。说明血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型是可逆非竞争性抑制，抑制剂不与底物抢占酶的活性中心，而是通过与活性中心以外的必需基团结合抑制酶的活性。
表3.1血人参提取物对酪氨酸酶的抑制动力学参数结果
由Dixon曲线图(图17)所示，在不同浓度L-DOPA下，血人参提取物浓度对反应速率倒数(1/V)作图，得到一组相交于X轴的直线，交点横坐标的绝对值则为抑制常数Ki，其拟合方程抑制常数Ki如表3.2所示，Ki为15.25mg/L。
表3.2血人参提取物抑制酪氨酸酶作用的抑制常数
4结论与讨论
皮肤的颜色可由人体内4种发色团决定，即类胡萝卜素、血红蛋白、氧合血红蛋白和黑色素，其中黑色素是最主要的成分。黑色素的过量累积会导致许多皮肤病的出现，例如雀斑、老年斑、黄褐斑等，酪氨酸酶是黑素形成过程中主要的限速酶，酪氨酸酶抑制剂主要是通过抑制酪氨酸酶的活性从而影响黑色素生成，从而达到较好的美白祛斑效果。
实验结果表明，血人参提取物对酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性均有抑制作用，能有效抑制酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性，且抑制率随着总黄酮质量浓度的增大而升高，IC50分别为88.78mg/L和34.46mg/L。通过对酪氨酸酶抑制动力学参数分析结果显示，由米氏方程可知Vmax随血人参提取物质量浓度的增大而减小，Km值随血人参提取物质量浓度的增大保持不变，因此可判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型为可逆非竞争性抑制，其抑制常数Ki为15.25mg/L。综上所述，血人参提取物对酪氨酸酶具有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性，抑制类型为可逆的非竞争性抑制，该研究为血人参作为酪氨酸酶抑制剂的开发应用提供了一定的理论依据。
试验例3。血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞黑色素合成的影响及其机制研究
1背景
皮肤的颜色主要取决于人体产生的黑色素，当黑色素表达过量，不能及时被代谢时，会使皮肤出现色斑、黄褐斑等色素沉着症状。因此，抑制或阻断黑色素的生成对皮肤美白至关重要。小鼠B16黑色素瘤细胞是一种用于筛选能够抑制黑色素合成的药物的肿瘤细胞，其黑色素合成功能与人正常黑素细胞基本一致，由于人体原代皮肤黑色素瘤细胞培养非常困难，该细胞株被广泛作为美白祛斑剂功效测定的受试细胞。以血人参提取物为效应物，B16黑色素瘤细胞为研究对象，研究血人参提取物对B16黑色素瘤细胞增殖活力、细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响，以期为血人参提取物的美白祛斑作用提供一定的理论依据。
2方法
2.1 溶剂的配制
2.1.1 血人参提取物溶液的配制
精密称取血人参提取物，加RPMI-1640培养基超声溶解后，分别加培养基稀释得到浓度为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L的样品溶液。
2.1.2 MTT溶液的配制
精密称取MTT适量，用1×PBS溶液配制成5mg/mL的MTT溶液。
2.1.3 1％Triton X-100溶液的配制
精密称取Triton X-100适量，加1×PBS溶液(pH 7.4)配制成10％Triton X-100溶液，作为母液备用，需用时将母液用1×PBS溶液稀释成1％Triton X-100溶液。
2.2 细胞的培养
在无菌条件下将小鼠B16黑色素瘤细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃，5％CO2培养箱中恒温培养，1～2天换液1次。
2.3 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态的影响
取对数生长期的小鼠B16黑色素瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100μL接种于96孔板中，于培养箱中培养24h后弃去上清液，分别加入浓度为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L的血人参提取物溶液，空白对照组仅加相同体积的RPMI-1640培养液，每组设6个复孔，分别培养72h后，置于倒置显微镜下观察对照组和实验组的细胞大小、形态、生长密度、树突形态以及融合状态等，并拍照记录。
2.4 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响
取对数生长期的小鼠B16黑色素瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100μL接种于96孔板中，于培养箱中培养24h后弃上清液，分别加入浓度为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L的血人参提取物溶液，空白对照组仅加等体积的RPMI-1640培养基，每组设6个复孔，分别培养24h，48h，72h后，每孔加入20μL MTT溶液，于37℃，5％CO2细胞培养箱中恒温培养4h后弃上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡10min后，于酶标仪490nm处测定吸光度。
计算公式为：抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/空白对照组吸光度)]×100％
2.5 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响
取对数生长期的小鼠B16黑色素瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔100μL细胞悬液的接种于96孔板中，置于培养箱中培养24h后弃去上清液，分别加入不同浓度(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L)的血人参提取物溶液，空白对照组仅加等体积的RPMI-1640培养基，每组设6个复孔。置于37℃，5％CO2恒温培养箱中分别培养24h、48h、72h后弃去培养液，用PBS溶液洗涤3次后，加入1％Triton X-100溶液100μL后置于-80℃冰冻30min，室温融化后置于37℃恒温预热，再加入1mg/mL的L-DOPA溶液100μL，于37℃恒温反应2h后，于酶标仪475nm处测定吸光度。
计算公式为：抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/空白对照组吸光度)]×100％
2.6 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成抑制率的影响
选择对数生长期小鼠黑色素瘤细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液消化收集细胞，将细胞浓度调为1×105个/mL，接种于6孔细胞培养板中，每孔2mL，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h后弃去培养液，分别加入不同浓度(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L)血人参提取物溶液，空白对照组仅加等体积的RPMI-1640培养基，分别处理24、48、72h后用PBS溶液洗涤3次，消化收集细胞，将细胞悬液1200rpm/min离心10min后弃去上清液，加入1mL含10％DMSO的1mol/L NaOH溶液，在80℃下水浴1h使细胞裂解并溶解细胞内黑色素，分别取200μL上清液移到96孔细胞培养板，于酶标仪405nm处测定吸光度值。
计算公式为：抑制率(％)＝[1-样(品孔吸光度/空白对照组吸光度)]×100％
3结果
3.1 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态的影响结果
如图18-19可见，对照组细胞生长良好，形态正常。当加入不同质量浓度(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L)的血人参提取物溶液后，细胞形态和数量均出现不同程度的变化，当血人参提取物浓度小于5mg/L时，细胞形态和数量变化不明显；随着血人参提取物质量浓度的增大，细胞分布开始变稀疏，细胞树突减少或消失，不能相互融合形成网状结构；当血人参提取物浓度达到20mg/L时，细胞数量明显减少，细胞形态变化较明显；当血人参提取物浓度达到50mg/L时，细胞几乎全部死亡。由此可见，血人参提取物质量浓度在5mg/L以下时，细胞能正常生长。
3.2 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响结果
由表3.1和图20结果所示，用不同浓度的血人参提取物作用于小鼠B16黑色素瘤细胞后，跟对照组相比，血人参提取物对细胞的增殖具有抑制作用。分别对血人参提取物不同质量浓度同一时间下抑制率和同一质量浓度不同时间内对细胞增殖的抑制率进行比较分析。结果显示，同一质量浓度不同时间内，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的抑制率随时间的增加而增大；同一时间内不同质量浓度下，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的抑制率随质量浓度的增大而增大。实验结果表明，血人参提取物对B16黑色素瘤细胞的增殖具有较强的抑制能力，且随质量浓度的增大和时间的增加而升高。
表3.1血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响
总黄酮浓度(mg/L)
24h
48h
72h
2.5
3.20±1.26<sup>aA</sup>
12.60±0.10<sup>aB</sup>
20.94±0.51<sup>aC</sup>
5
5.59±0.76<sup>bA</sup>
25.03±0.57<sup>bB</sup>
43.04±0.37<sup>bC</sup>
10
17.62±0.18<sup>cA</sup>
41.02±1.75<sup>cB</sup>
58.82±1.12<sup>cC</sup>
15
30.65±0.46<sup>dA</sup>
45.26±1.04<sup>dB</sup>
70.80±0.16<sup>dC</sup>
20
40.41±0.53<sup>eA</sup>
54.53±0.94<sup>eB</sup>
73.09±1.35<sup>eC</sup>
30
46.53±0.90<sup>fA</sup>
62.84±0.20<sup>fB</sup>
75.29±1.44<sup>fC</sup>
40
50.09±0.78<sup>gA</sup>
69.61±0.69<sup>gB</sup>
77.08±0.77<sup>gC</sup>
50
56.63±1.01<sup>hA</sup>
71.94±1.20<sup>hB</sup>
78.13±1.11<sup>gC</sup>
注：a、b、c、d、e、f、g、h表示同一时间下不同样品浓度在之间的差异性，字母不同表示存在显著性差异；A、B、C表示同一样品浓度在不同时间下的差异性，字母不同表示存在显著性差异(P＜0.05)。
3.3 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响结果
如表3.2和图21所示，用不同质量浓度的血人参提取物作用于小鼠B16黑色素瘤细胞后，跟空白对照组相比，血人参提取物对细胞内的酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用。分别对不同质量浓度同一时间下抑制率和同一质量浓度不同时间内的抑制率进行比较分析。结果显示，同一质量浓度不同时间内，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的抑制率随时间的增加而增大；同一时间内不同质量浓度下，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内的酪氨酸酶活性的抑制率随质量浓度的增大而增大。实验结果表明，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性具有较强的抑制能力，且随质量浓度的增大和时间的增加而升高。
表3.2血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响
总黄酮浓度
24h
48h
72h
2.5
2.79±1.31<sup>aA</sup>
8.28±1.63<sup>aB</sup>
13.08±0.65<sup>aC</sup>
5
6.75±0.44<sup>bA</sup>
12.46±1.47<sup>bB</sup>
19.45±2.53<sup>bC</sup>
10
12.79±1.36<sup>cA</sup>
21.12±0.58<sup>cB</sup>
27.13±0.38<sup>cC</sup>
15
18.01±0.68<sup>dA</sup>
28.24±0.42<sup>dB</sup>
40.57±2.50<sup>dC</sup>
20
29.75±1.16<sup>eA</sup>
37.57±0.66<sup>eB</sup>
50.03±1.38<sup>eC</sup>
30
38.48±0.67<sup>fA</sup>
57.03±1.47<sup>fB</sup>
69.39±1.51<sup>fC</sup>
40
50.19±2.67<sup>gA</sup>
63.73±0.23<sup>gB</sup>
78.66±1.54<sup>gC</sup>
50
51.85±0.94<sup>gA</sup>
65.56±1.25<sup>hB</sup>
81.54±0.20<sup>hC</sup>
注：a、b、c、d、e、f、g、h表示同一时间下不同样品浓度在之间的差异性，字母不同表示存在显著性差异；A、B、C表示同一样品浓度在不同时间下的差异性，字母不同表示存在显著性差异(P＜0.05)
3.4 血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成抑制率的影响结果
由表3.3和图22可知，用不同质量浓度的血人参提取物作用于小鼠B16黑色素瘤细胞后，对B16黑色素瘤细胞内黑色素的形成有一定的抑制作用。分别对不同质量浓度同一时间下抑制率和同一质量浓度不同时间内的抑制率进行比较分析。结果显示，同一质量浓度不同时间内，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素形成的抑制率随时间的增加而增大；同一时间内不同质量浓度下，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素形成的抑制率随质量浓度的增大而增大。实验结果表明，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素的形成具有较强的抑制能力，且与时间和浓度呈正相关。
表3.3血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内黑色素形成抑制率的影响
总黄酮浓度
24h
48h
72h
2.5
3.93±1.96<sup>aA</sup>
8.74±1.37<sup>aB</sup>
12.20±2.38<sup>aB</sup>
5
5.90±1.44<sup>aA</sup>
13.11±0.62<sup>bB</sup>
18.50±1.14<sup>bC</sup>
10
15.73±1.05<sup>bA</sup>
21.43±1.13<sup>cB</sup>
27.85±0.92<sup>cC</sup>
15
21.10±0.47cA
28.65±1.93<sup>dB</sup>
36.24±1.67<sup>dC</sup>
20
28.96±1.97<sup>dA</sup>
37.33±0.50<sup>eB</sup>
45.26±0.73<sup>eC</sup>
30
43.51±0.52<sup>eA</sup>
49.77±0.88<sup>fB</sup>
57.49±1.08<sup>fC</sup>
40
47.84±0.66<sup>fA</sup>
57.26±0.94<sup>gB</sup>
67.72±0.54<sup>gC</sup>
50
49.54±0.26<sup>fA</sup>
62.13±0.19<sup>hB</sup>
72.15±0.58<sup>hC</sup>
注：a、b、c、d、e、f、g、h表示同一时间下不同样品浓度在之间的差异性，字母不同表示存在显著性差异；A、B、C表示同一样品浓度在不同时间下的差异性，字母不同表示存在显著性差异(P＜0.05)。
4结论与讨论
皮肤美白祛斑是现代人们关注的热点，对化妆品的要求也越来也高，追求更加天然、安全以及高效的化妆品成为目前的热潮。皮肤的颜色主要由皮肤色素(黑色素、胡萝卜素等)含量及分布决定，而黑色素是最主要的决定因素。因此抑制黑色素的形成是美白祛斑的主要途径之一。由于正常情况下体外培养的黑素细胞生产缓慢、增殖能力极为有限，容易被角质形成细胞和成纤维细胞污染，使得到的黑素细胞量少，限制了黑素细胞的临床应用。小鼠B16黑色素瘤细胞来源于高度转移能力的鼠类皮肤黑色素瘤，其基因组成与人表皮细胞有较高的相似性，且较人表皮黑素细胞更易培养，能够多次传代、生长快，是测试受试物对黑素细胞生物学功能影响的首选细胞模型。
实验结果表明，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑素合成均具有一定的抑制作用。细胞形态学结果显示，当血人参提取物浓度小于5mg/L时，细胞形态和数量变化不明显，当细胞达到50mg/L时，细胞几乎全部死亡。血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞的增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑色素合成的抑制作用均呈浓度和时间依赖关系。说明血人参提取物能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶活性以及黑色素合成。
试验例4。响应面法优化血人参提取物凝胶剂的成型工艺
1背景
凝胶剂是以水溶性高分子材料为主要基质，加入药物制成的外用制剂，属于经皮给药系统。凝胶剂具有载药量高、剂量准确和保湿性好、无致敏性与刺激性、使用方便和舒适等优点。血人参提取物成分能溶于水，其已知成分的分子量均小于400，本研究以血人参提取物为原料，将其制备成血人参提取物凝胶剂，采用响应面法对其制备工艺进行优化，确定血人参提取物最佳制备工艺。
2方法
2.1 血人参提取物凝胶剂基质前期筛选
选择水凝胶基质时，应选择适合于扩散和挤压的基质。凝胶基质粘度应适中，稳定性好，不与主药发生化学变化，不刺激皮肤，药物释放性能好。本实验对水凝胶基质卡波姆940，卡波姆934、卡波姆941、海藻酸钠、聚乙烯醇124(PVA-124)进行前期实验考察。聚乙烯醇(PVA-124)机械强度高，稠度高，放置后容易在基质表面易形成一层强弹力膜，涂抹后容易出现搓泥现象。海藻酸钠稠度高，涂抹后易成膜，出现搓泥现象，机械强度高，形成的凝胶稳定性差，搁置一段时间呈海绵状，易失水干燥，不适合制成易洗涤的凝胶制剂。卡波姆为具吸湿性的白色粉末，有轻微气味和酸性，易溶于水和甘油，分子中高含量羧基基团，溶于水后呈酸性，可用三乙醇胺进行中和，从而制成医药或化妆品领域的凝胶制剂。卡波姆934高粘度条件下稳定适用于浓稠的凝胶，而卡波姆941具长流变性，高清澈度，涂抹手背时粘度稍稀。卡波姆940短流变性，高粘度，中等清澈度，涂抹手背均匀细腻、黏度适中，无搓泥现象，放置一段时间无成膜现象，从初步筛选结果中可知，卡波姆940较为理想，因此选择卡波姆940作为基质。
2.2 防腐剂的选择
由于血人参提取物凝胶剂为水溶性凝胶剂，室温下长期放置容易出现霉变现象，因此需要加入适量的防腐剂。尼泊金甲酯作为一种常用的防腐剂，不与主药发生任何反应，无明显析出，对制剂成型无影响，且防腐效果显著。因此本实验选用0.1g尼泊金甲酯做为防腐剂。
2.3 血人参提取物凝胶剂制备
称取处方量卡波姆940，撒于适量甘油表面，加50mL去离子水搅拌均匀，常温溶胀24h后，置于85℃水浴加热搅拌溶解。依次称取适量透明质酸钠，尿囊素，氮酮搅拌溶解1h后取下冷却，作为A相。称取血人参提取物粉末，加入适量溶剂溶解，加入适量丙二醇，尼泊金甲酯，作为B相。
将B相缓慢加入A相中充分搅拌混匀后，加入适量三乙醇胺调节pH，补足去离子水至100g，搅拌均匀即得血人参提取物凝胶剂。
2.4 单因素试验考察
2.4.1 卡波姆940用量的考察
分别称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g卡波姆940于烧杯中，固定其他用量，按“2.3项下制备方法”进行制备，以外观性状、涂展性、黏度作为评价指标，考察卡波姆940用量对凝胶成型的影响。
分别称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g卡波姆940于烧杯中，固定其他用量，按“2.3项下制备方法”进行制备，以外观性状、涂展性、黏度作为评价指标，考察卡波姆940用量对凝胶成型的影响。
2.4.2 透明质酸钠用量的考察
固定其他用量，分别加入0.02、0.04、0.06、0.08和0.10g的透明质酸钠，按“2.3项下制备方法”进行制备，以外观性状、涂展性、黏度作为评价指标，考察透明质酸钠用量对凝胶成型的影响。
2.4.3 甘油用量的考察
分别称取5、10、15、20和25g甘油于烧杯中，固定其他用量不变，按“2.3项下制备方法”进行制备，以外观性状、涂展性、黏度作为评价指标，考察甘油用量对凝胶成型的影响。
2.4.4 三乙醇胺用量的考察
固定其他用量，分别加入0、0.1、0.2、0.3和0.4mL的三乙醇胺，按“2.3项下制备方法”进行制备，以外观性状、涂展性、黏度作为评价指标，考察三乙醇胺用量对凝胶成型的影响。
2.4.5 丙二醇用量的考察
固定其他用量，分别加入1、3、5、7、9g的丙二醇，按“2.3项下制备方法”进行制备，以外观性状、涂展性、黏度作为评价指标，考察丙二醇用量对凝胶成型的影响。
2.5 考察指标测定
2.5.1 外观性状测定
通过肉眼观察血人参提取物凝胶的光滑程度、透明度、色泽度、细腻度、有无气泡，对其进行外观评价。
2.5.2 涂展性测定
取所制得的血人参提取物凝胶0.2mL涂于手背皮肤4cm×4cm大小处，以凝胶的粘稠度、是否出现搓泥现象、是否易涂抹进行评价。
2.5.3 黏度测定
将制备好的血人参提取物凝胶恒温在25℃±2℃环境下，用NDJ-5S数试黏度计选择合适的转子，将凝胶侵入直径不小于80mm的直径烧杯中，将转子旋入螺杆中，放入凝胶剂中，使转子的刻度与液体表面齐平，开启仪器进行测定，记录所测黏度值。
2.6 响应面试验的设计
根据单因素试验结果可知，卡波姆用量、甘油用量及三乙醇胺用量对血人参提取物凝胶剂的成型影响较大，以该三因素设计响应面因素水平表，如表2.1所示。以黏度、涂展性和外观性状作为评价指标，评分表如表2.2所示，综合评分＝外观性状×30％+涂展性×30％+黏度×40％。采用Design Expert 8.0.6系统分析软件分析设计试验，优选凝胶面膜的最佳处方配比。
表2.1响应曲面因素水平表
表2.2血人参提取物凝胶剂考察指标评分
3结果
3.1 单因素试验结果
3.1.1 卡波姆940用量考察结果
随卡波姆940用量的增加凝胶黏度增加，如图23所示，但其色泽透明度、细腻度降低。当用量为0.1、0.2g时所制备的凝胶黏度过稀，不形成凝胶状；当用量为0.3、0.4g时，制备的凝胶黏稠度适中，能均匀涂布于手背，均匀细腻，无黏附感；当用量为0.5g时，凝胶过稠，不易涂布。由此可知，卡波姆适宜用量为0.3～0.4g之间。
3.1.2 透明质酸钠用量考察结果
如图24所示，随着透明质酸钠用量增多，对凝胶的黏度无明显影响，基本保持稳定。而随着用量的增加，凝胶的细腻度有所增加，用量为0.08～0.10g时，细腻度一样，因此确定透明质酸钠的用量为0.10g。
3.1.3 甘油用量考察结果
如图25所示，随着甘油用量增多对凝胶体系黏度和涂展性无显著影响。不同用量的甘油制备出来的凝胶色泽透明度具较明显影响，甘油用量为5.0、10.0g时，凝胶色泽较黄，无透明感，当用量为15.0、20.0g时，凝胶色泽血红透明，表面光滑。
3.1.4 三乙醇胺用量考察结果
如图26所示，三乙醇胺用量增加，体系黏度增大。当用量为0mL时、黏度较小，呈溶液状，不能形成凝胶；当用量为0.2mL时，可形成稀凝胶，色泽不透明。当用量为0.3mL、0.4mL时，体系黏度变化较小，凝胶色泽透明，黏度适中。
3.1.5 丙二醇用量考察结果
从图27可看出，凝胶黏度随丙二醇用量增加变化不大，丙二醇用量为1g、3g时，凝胶透明度较差，用量为5g、7g、9g时，透明度、涂展性良好，黏度适中，成型性好。考虑实验成本，可初步选择5g为最终用量。
3.2 模型建立与方差分析结果
响应面分析结果如表3.1所示，采用Design expert 8.0.6软件对表3.2数据进行分析，得到血人参提取物凝胶剂的3因素对综合评价得分影响的二次多项回归模型：Y＝9.11+0.33A+0.59B+0.019C－1.24AB－1.71AC－0.77BC－2.10A2－0.96B2－1.35C2。通过计算得到相关系数R2 Pred＝0.9142，调整决定系数R2 Adj＝0.9852，则该模型可以解释98.52％响应值的变化。从表4.6可知，血人参提取物凝胶剂的变化与所选因素卡波姆940、甘油及三乙醇胺存在一定的线性关系，可用该模型对不同条件下的凝胶剂进行分析。该模型P＝0.0001＜0.0100，说明该模型极为显著，失拟项P＝0.0616＞0.05(不显著)，说明实验结果与模型拟合度良好，试验误差小，能较好的反映出血人参提取物凝胶剂综合值与卡波姆940用量、甘油用量、三乙醇胺用量因素之间的关系，故可用该数学模型推测血人参提取物凝胶剂的最佳制备工艺。根据F值的大小可以推测影响本试验血人参提取物凝胶剂成型工艺的因素大小为B＞A＞C。
表3.1响应面设计及试验
表3.2响应曲面方差分析
方差来源
平方和
自由度
均方
F值
P值
显著性
模型
57.01
9
6.33
119.67
＜0.0001
高度显著
A
0.85
1
0.85
15.96
0.0052
显著
B
2.75
1
2.75
51.59
0.0002
显著
C
2.812E-003
1
2.812E-003
0.053
0.8243
AB
6.18
1
6.18
116.15
＜0.0001
AC
11.73
1
11.73
221.60
＜0.0001
BC
2.37
1
2.73
44.80
0.0003
A<sup>2</sup>
18.54
1
18.54
350.27
＜0.0001
B<sup>2</sup>
3.85
1
3.85
72.69
＜0.0001
C<sup>2</sup>
7.69
1
7.69
145.18
＜0.0001
残差
0.37
7
0.053
失拟项
0.30
3
0.10
5.78
0.0616
不显著
纯误差
0.069
4
0.017
总和
57.38
16
3.3 响应面结果分析
根据回归方程，依次固定卡波姆940(A)、甘油(B)、三乙醇胺(C)在原点，绘制其他两个因素与Y值的3D效应图和等高线图，预测血人参提取物凝胶剂的最优处方，得到各因素交互作用对血人参提取物凝胶剂综合评分影响(见图28-30)，等高线图中圈为椭圆形，则交互作用显著，若为圆形，则不显著。为更直观的分析两两交互因素对血人参提取物凝胶剂感官评价的影响，用Design-Expert 8.0.6软件根据回归方程建立响应面，响应面倾斜程度反映了交互因素对Y值的影响程度，也就是说，响应曲面倾斜的角度越大，曲面越弯，交互影响对综合值影响越大。从3D响应面弯曲程度和等高线图看出，项AB、AC、BC交互作用显著。通过分析，血人参提取物凝胶剂最优处方配比为卡波姆9400.4g，甘油18.35g，三乙醇胺0.29mL，处方下所制备的凝胶剂性能最优。
3.4 药物的加入
分别精密称取2.0g、5.0g和8.0g血人参提取物样品加适量溶剂溶解后，缓慢加入到空白凝胶剂基质中，搅拌均匀制成载药量为2％、5％和8％的含药凝胶。通过观察其外观性状和涂展性对其进行比较，确定最佳载药量。结果如表3.3所示，根据综合评价，确定最佳载药量为5％。
表3.3载药量考察结果
加药量(g)
外观性状
涂展性
2.0
外观呈棕红色，有光泽，但有少量气泡
黏度较适中，易涂抹
5.0
外观呈血红色，透明有光泽，表面光滑细腻
黏度适中，易涂抹
8.0
外观深红色，透明，光泽度一般，表面细腻光滑
黏度较稍稀，易涂抹
3.5 最优处方验证
根据优选的最佳处方，称取0.4g卡波姆940撒于18.35g甘油中，加入50mL去离子水溶胀24h，85℃水浴加热搅拌溶解，加入0.1g透明质酸钠，0.15g尿囊素和1g氮酮，搅拌1h使之呈胶状，取下待冷却，作为A相备用；称取5g血人参提取物粉末，用适量溶剂溶解，加入5g丙二醇和0.1g尼泊金甲酯，搅拌溶解，作为B相备用。将B相缓慢加入A相中，搅拌均匀，加三乙醇胺0.29mL调节pH，加去离子水至100g，搅匀即得血人参提取物凝胶剂，制备的凝胶剂细腻无颗粒感，透明度好，黏稠度适中，易于涂展，pH为6.30，为一款血红色凝胶剂。产品图见图31。
4结论与讨论
凝胶剂作为一种新型的外用制剂，可长时间于作用部位紧密黏附，使用舒适。凝胶除了可以加入单味药提取物，还可以制成复方凝胶剂，即将传统的复方提取物于凝胶制备技术结合，方便使用，易于接受，前景十分广阔。甘油作为增塑剂也有保湿作用，氮酮作为透皮促渗剂能提高疗效。本实验应用响应面分析软件优选卡波姆940、甘油、三乙醇胺用量，以外观性状、涂展性、黏度为综合评价指标，利用Design Expert 8.0.6软件分析得到最优处方为：卡波姆940 0.4g、甘油18.35g、三乙醇胺0.29mL。运用响应面法所优选的血人参提取物凝胶剂制备工艺简单，处方稳定可行，方法可靠。
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