具体实施方式

嵌合抗原受体(CAR)疗法是癌症治疗的有前景的方法。本文描述为v1.0的CAR构建体是表达合成肽RQR8的示例性抗CD19 CAR，所述合成肽充当安全开关。RQR8含有两种结合利妥昔单抗的模拟表位。在不良事件的情况下，患者可以用利妥昔单抗治疗以耗尽循环中的抗CD19 v1.0的水平。利妥昔单抗还用作一些非霍奇金淋巴瘤(NHL)适应症的标准治疗，并且以高剂量投予。归因于利妥昔单抗的长半衰期，无法向患者投予抗CD19 v1.0直到循环利妥昔单抗的水平已达到低浓度为止。抗利妥昔单抗CD19 CAR疗法将允许先前经利妥昔单抗治疗的患者立即接受CAR-T疗法，而不必等待利妥昔单抗水平降低且患者无需经受单采血液成分术。本文提供了对结合CD20的抗体利妥昔单抗具有抗性的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)。新颖CAR构建体被设计成在保留CAR表达和活性的同时消除利妥昔单抗结合。

I.嵌合抗原受体

如本文所使用，嵌合抗原受体(CAR)是特异性识别靶抗原(例如癌细胞上的靶抗原)的蛋白质。当结合到靶抗原时，CAR可活化免疫细胞以攻击和破坏携带所述抗原的细胞(例如癌细胞)。CAR还可并有共刺激或信号传导结构域以增加其效力。参见Krause等人,《实验医学杂志》,第188卷,第4期,1998(619-626)；Finney等人,《免疫学杂志(Journal ofImmunology)》,1998,161:2791-2797,Song等人,《血液(Blood)》119:696-706(2012)；Kalos等人,《科学·转化医学(Sci.Transl.Med.)》3:95(2011)；Porter等人,《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》365:725-33(2011),以及Gross等人,《药理学和毒理学年度综述(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.)》56:59-83(2016)；美国专利第7,741,465号和第6,319,494号。

本文所述的嵌合抗原受体包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含特异性结合到CD19的CD19抗原结合结构域。在一些实施例中，CD19特异性CAR从5'到3'包含以下元件：信号序列、CD19抗原结合结构域(例如来源于4G7的scFv)、铰链和跨膜区域以及一个或多个连续信号传导结构域。在一些实施例中，抗体结合结构域结合CD19以治疗与CD19的表达相关的血液癌。

用于同种异体抗CD19 CAR v1.0中的嵌合抗原受体(CAR)的scFv部分来源于小鼠抗人CD19抗体克隆4G7。4G7是识别CD19的CD19单克隆抗体。由4G7形成的单链可变片段(scFv)包含一些嵌合抗原受体(CAR)的靶向组分(参见WO2014184143A1)。在一些实施例中，来源于CD19单克隆抗体4G7的scFv包含通过柔性接头连接在一起的CD19单克隆抗体4G7免疫球蛋白γ1重链的一部分(基因库：CAD88275.1；SEQ ID NO:17)和CD19单克隆抗体4G7免疫球蛋白κ轻链的一部分(基因库：CAD88204.1；SEQ ID NO:35)。(Peipp M.,D.Saul等人,2004.《针对用于FACS应用的CD抗原的荧光scFv融合蛋白质的有效真核表达(Efficienteukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CDantigens for FACS applications.)》《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》285:265-280)。在一些实施例中，scFv包含通过柔性接头连接在一起的CD19单克隆抗体4G7免疫球蛋白γ1重链的可变片段和CD19单克隆抗体4G7免疫球蛋白κ轻链的可变片段。

CD19单克隆抗体4G7免疫球蛋白γ1重链(信号序列加下划线)

MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:17)

CD19单克隆抗体4G7免疫球蛋白κ轻链(信号序列加下划线)

MRCLAEFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:18)

在一些实施例中，scFv包含SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的一部分。在一些实施例中，scFv包含与SEQ ID NO:34和/或SEQ ID NO:35的氨基酸序列的可变区至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。本文公开抗原结合分子，包括特异性结合到来源于4G7的抗CD19 scFv的抗体，以及包含这些序列的分子和呈现此类分子的细胞。抗原结合分子的人源化形式还形成为本公开的方面。还公开这些抗原结合分子的应用和用途。

a.抗原结合结构域

如上文所论述，本文所述的CD19 CAR包含抗原结合结构域。如本文所使用，“抗原结合结构域”意指结合指定的靶抗原的任何多肽，指定的靶抗原例如可以是CD19蛋白或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域结合到肿瘤细胞上的CD19抗原。在一些实施例中，抗原结合结构域结合到涉及过度增殖性疾病的细胞上的CD19抗原。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含可变重链、可变轻链和/或一个或多个CDR。在一些实施例中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)，包含轻链CDR CDR1、CDR2和CDR3，和重链CDR CDR1、CDR2和CDR3。抗原结合结构域的变体(例如，CDR VH和/或VL的变体)也在本公开的范围内，例如各自与本文所述的抗原结合结构域序列的氨基酸序列具有至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或高于99％一致性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，此类分子包括至少一个重链和一个轻链，而在其它情况下，变体形式含有两个可变轻链和两个可变重链(或其子部分)。所属领域的技术人员将能够使用众所周知的技术确定如本文所示的抗原结合结构域的合适的变体。在某些实施例中，所属领域的技术人员可以鉴别分子的适合区域，其可以在不破坏活性的情况下通过靶向未被认为对活性重要的区域而改变。

在某些实施例中，抗原结合结构域的多肽结构基于抗体，分别包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体结合物”)和其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包含高亲合性多聚体(avimer)或由其组成。

当CD19抗原结合结构域与其结合到第二靶标相比更紧密地结合到一个靶标时，称其为“选择性的”。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域为scFv。

在一些实施例中，本公开涉及编码本文所描述的CD19嵌合抗原受体(CAR)中的任一种的经分离多核苷酸。在一些实施例中，本公开涉及编码表1中所描述的CD19 CAR的经分离多核苷酸。本文还提供包含多核苷酸的载体和其制备方法。

表1.靶向CAR的示例性CD19的多核苷酸序列

b.安全开关和单克隆抗体特异性-表位

安全开关

应了解，可以通过用除结合利妥昔单抗的表位外的自杀基因转导免疫细胞(含有一个或多个CAR)来使不良事件最小化。还可能需要将诱导型“开启”或“加速器”开关并入免疫细胞中。合适的技术包括在用本公开的CAR构建体转导细胞之前、之后或同时使用诱导型半胱天冬酶-9(美国申请案2011/0286980)或胸苷激酶。用于引入自杀基因和/或“开启”开关的其它方法包括TALENS、锌指、RNAi、siRNA、shRNA、反义技术以及所属领域已知的其它技术。

根据本公开，可将另外开-关类型或其它类型的控制开关技术并入本文中。这些技术可使用二聚结构域和此类结构域二聚的任选的活化剂。这些技术包括例如由Wu等人,《科学(Science)》2014 350(6258)描述的在某些细胞中利用FKBP/Rapalog二聚系统的那些技术，其内容以全文引用的方式并入本文中。其它二聚技术描述于例如Fegan等人,《化学综述(Chem.Rev.)》2010,110,3315-3336以及美国专利第5,830,462号；第5,834,266号；第5,869,337号；和第6,165,787号，其内容也以全文引用的方式并入本文中。其它二聚对可包括环孢灵-A/亲环蛋白、受体、雌激素/雌激素受体(任选地使用他莫昔芬)、糖皮质激素/糖皮质激素受体、四环素/四环素受体、维生素D/维生素D受体。二聚技术的其它实例可见于例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US2015/0266973、US2016/0046700、美国专利第8,486,693号、第US 2014/0171649号和第US 2012/0130076号，其内容以全文引用的方式进一步并入本文中。

在一些实施例中，本公开的CAR免疫细胞(例如CAR-T细胞)包含编码在利妥昔单抗结合方面有缺陷的自杀多肽的多核苷酸。在一些实施例中，自杀肽包含突变的RQR8序列。参见例如WO2013153391A，其以全文引用的方式并入本文中。在包含多核苷酸的CAR免疫细胞(例如CAR-T细胞)细胞中，自杀多肽在CAR免疫细胞(例如CAR-T细胞)的表面处表达。在一些实施例中，自杀多肽包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。

CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ IDNO:19)。

自杀多肽还可包含氨基端处的信号肽，例如MGTSLLCWMALCLLGADHADA(SEQ ID NO:20)。在一些实施例中，自杀多肽包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:20的信号序列。

MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ ID NO:21)。

在某些实施例中，自杀肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含减少或消除利妥昔单抗结合的一个或多个突变残基、插入残基或缺失残基。

当自杀多肽在CAR免疫细胞(例如CAR-T细胞)的表面处表达时，抗体与多肽的自杀基因表位的结合引起细胞裂解。CD19特异性CAR免疫细胞(例如CAR-T细胞)的缺失可在体内发生，例如通过向患者投予自杀剂。删除转移细胞的决定可能起因于患者中检测到的可归因于转移细胞的不合需要的影响，例如当检测到不可接受的毒性水平时。如本文所用，“自杀剂”是指结合到CAR免疫细胞并且引起表达CAR的免疫细胞的裂解的分子。

在一些实施例中，自杀多肽在细胞表面上表达。在一些实施例中，CAR构建体中包括自杀多肽。在一些实施例中，自杀多肽不是CD19CAR构建体的一部分。

在一些实施例中，本文中所公开的CD19特异性CAR中的任一种的胞外结构域可包含对单克隆抗体具有特异性(即，通过单克隆抗体特异性识别)的一个或多个表位。这些表位在本文中也被称为mAb特异性表位。示例性mAb特异性表位公开于国际专利公开案第WO2016/120216中，其以全文引用的方式并入本文中。在这些实施例中，CAR的胞外结构域包含特异性结合到CD19的抗原结合结构域和结合到一个或多个单克隆抗体(mAb)的一个或多个表位。包含mAb特异性表位的CAR可以是单链或多链。

在本文所述的CAR的胞外结构域中包括对单克隆抗体具有特异性的表位使得可分选和耗尽表达CAR的工程改造免疫细胞。在一些实施例中，这一特征还促进内源性表达CD19的细胞的恢复，所述内源性表达CD19的细胞通过投予表达CAR的工程改造免疫细胞耗尽。在一些实施例中，在有害影响的情况下，例如在向个体投予时，允许耗尽提供安全开关。

因此，在一些实施例中，本公开涉及一种用于分选和/或耗尽具有包含mAb特异性表位的CAR的工程改造免疫细胞的方法和一种用于促进内源性表达CD19的细胞的恢复的方法。

数种表位-单克隆抗体偶联可用于产生包含单克隆抗体特异性表位的CAR；确切地说，已批准用于医学用途或用于GMP生产的那些表位，如作为非限制性实例的CD34表位/QBEND-10。

本公开还涵盖用于分选具有表达mAb特异性表位的CD19特异性CAR的工程改造免疫细胞的方法，和治疗方法，其中具有这些CAR的工程改造免疫细胞的活化通过使用靶向所述CAR的配体结合结构域的抗体耗尽细胞来调节。表2提供了可插入本公开的CAR的胞外结构域中的示例性模拟表位序列。

表2：示例性模拟表位序列

在某些实施例中，CAR包含与表2中所示的表位或模拟表位氨基酸序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％一致的表位或模拟表位氨基酸序列。在某些实施例中，CAR包含表位或模拟表位氨基酸序列，所述表位或模拟表位氨基酸序列不为或不包含SEQ ID NO:22。在某些实施例中，CAR包含表位或模拟表位，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。

c.铰链结构域

本公开的CAR的胞外结构域可包含“铰链”结构域(或铰链区)。术语通常针对用以将CAR中的跨膜结构域连接到CAR中的胞外抗原结合结构域的任何多肽。确切地说，铰链域可用于提供胞外抗原结合结构域的更多灵活性和可接入性。

铰链结构域可包含至多300个氨基酸-在一些实施例中10到100个氨基酸或在一些实施例中，25到50个氨基酸。铰链结构域可来源于天然存在的分子的全部或部分，如来源于CD8、CD4、CD28、4-1BB或IgG的胞外区的全部或部分(确切地说，IgG的铰链区；应了解，铰链区可含有免疫球蛋白家族的成员中的一些或全部，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM或其片段)，或来源于抗体重链恒定区的全部或部分。或者，铰链结构域可为对应于天然产生的铰链序列的合成序列或可为整个合成的铰链序列。在一些实施例中，所述铰链结构域为人类CD8α链(例如，NP_001139345.1)的一部分。在另一特定实施例中，所述铰链和跨膜结构域包含人类CD8α链的一部分。在一些实施例中，本文所述的CAR的铰链结构域包含CD8α、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα的子序列，确切地说，CD8α、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα中的任一者的铰链区。在一些实施例中，铰链结构域包含人类CD8α铰链、人类IgG1铰链、人类IgG4、人类PD-1或人类FcγRIIIα铰链。在一些实施例中，本文所公开的CAR包含scFv、CD8α人类铰链和跨膜结构域、CD3ζ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。表3提供了本文所提供的示例性铰链的氨基酸序列。

表3：示例性铰链

在某些实施例中，铰链区包含与表3中所示的铰链结构域氨基酸序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％一致的氨基酸序列。

d.跨膜结构域

本公开的CAR设计为具有与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。其可类似地与CAR的胞内结构域融合。在一些情况下，跨膜结构域可通过氨基酸取代来选择或修饰的，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。在一些实施例中，短接头可在CAR的胞外、跨膜和胞内结构域中的任一者或一些之间形成键联。在一些实施例中，接头包含甘氨酸重复序列。在一些实施例中，接头包含(GGGGS)n，其中n是1、2、3、4或5(SEQ ID NO:41)。

本文所公开的CAR的合适的跨膜结构域具有以下能力：(a)在表面上表达免疫细胞，例如但不限于淋巴细胞，如T辅助细胞(T_h)细胞、细胞毒性T(T_c)细胞、T调节(T_reg)细胞或自然杀伤细胞(NK)细胞，和/或(b)与胞外抗原结合结构域和胞内信号传导结构域相互作用，以引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答。

跨膜结构域可来源于天然或合成来源。当来源是天然的时，所述结构域可来源于任何膜结合或跨膜蛋白。

本公开中特定用途的跨膜区可来源于(包含或对应于)CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、D3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC 1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，与CD83特异性结合的配体，或其任何组合。

作为非限制性实例，跨膜区可来源于或为T细胞受体的一部分(如α、β、γ或δ)、构成CD3复合物、IL-2受体p55(a链)、p75(β链)或γ链的多肽、Fc受体(确切地说，Fcγ受体III)的亚单位链或CD蛋白质。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域来源于人类CD8α链(例如NP_001139345.1)。

在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域为CD8α跨膜结构域。在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域为包含氨基酸序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:35)的CD8α跨膜结构域。在一些实施例中，CD8α跨膜结构域包含编码SEQ ID NO:35的跨膜氨基酸序列的核酸序列。在一些实施例中，本公开的CAR中的铰链和跨膜结构域是包含氨基酸序列TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ IDNO:36)的CD8α铰链和跨膜结构域。

e.胞内结构域

本公开的CAR的胞内(细胞质)结构域可提供包含CAR的免疫细胞的正常效应功能的至少一者的活化。例如，T细胞的效应功能可指细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

在一些实施例中，供用于CAR中的活化胞内信号传导结构域可为例如(但不限于)T细胞受体和在抗原受体结合后协调作用以发起信号转导的共受体的细胞质序列，以及这些序列和具有相同功能性能力的任何合成序列的任何衍生物或变体。

应了解，合适的(例如活化)胞内结构域包括(但不限于)来源于(或对应于)以下的信号传导结构域：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、D3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGH、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC 1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，与CD83特异性结合的配体，或其任何组合。

本公开的CAR的胞内结构域除了上述活化结构域之外，还可并入共刺激信号传导结构域(在本文中可互换地称为共刺激分子)以增加其效力。共刺激结构域可提供除如本文所述的活化分子所提供的初级信号之外的信号。

应了解，本公开的范围内的合适的共刺激结构域可来源于(或对应于)例如，CD28、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC I类分子、TNFR、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1-1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1-1a、LFA-1、ITGAM、CD1-1b、ITGAX、CD1-1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配体，或片段或其组合。应了解，上文未列出的额外共刺激分子或其片段在本公开的范围内。

在一些实施例中，CAR的胞内/细胞质结构域可设计成自身包含41BB/CD137结构域或与适用于本公开的CAR的情形的任何其它所需胞内结构域组合。41BB/CD137的完整天然氨基酸序列描述于NCBI参考序列：NP_001552.2中。完整的天然41BB/CD137核酸序列描述于NCBI参考序列：NM_001561.5中。

在一些实施例中，CAR的胞内/细胞质结构域可设计成自身包含CD28结构域或与适用于本公开的CAR的情形的任何其它所需胞内结构域组合。CD28的完整天然氨基酸序列描述于NCBI参考序列：NP_006130.1。完整的天然CD28核酸序列描述于NCBI参考序列：NM_006139.1。

在一些实施例中，CAR的胞内/细胞质结构域可设计成自身包含CD3ζ结构域或与适用于本公开的CAR的情形的任何其它所需胞内结构域组合。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域可包含CD3ζ信号传导结构域，其具有与SEQ.ID NO:38中所示的氨基酸序列具有至少约70％、至少80％、至少90％、95％、97％或99％序列一致性的氨基酸序列。例如，CAR的胞内结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导分子的一部分。本公开的CAR的胞内信号传导部分内的胞内信号传导序列可随机或以指定顺序彼此连接。在一些实施例中，胞内结构域设计成包含CD3ζ的活化结构域和CD28的信号传导结构域。

在一些实施例中，胞内结构域设计成包含CD3ζ的活化结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些实施例中，4-1BB(胞内结构域)包含氨基酸序列

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:37)。

CD3ζ氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:38。

LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:38)。

在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激分子的结构域。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含选自由41BB(基因库：AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)的片段组成的群组的共刺激分子的一部分。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含氨基酸序列，其包含与SEQ ID NO:37和SEQID NO:38中所示的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％或99％序列一致性。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含氨基酸序列，其包含与SEQID NO:37中所示的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％或99％序列一致性和/或与SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％或99％序列一致性。

在示例性实施例中，本公开的CAR从N末端到C末端包含：CD8α信号序列、CD19scFv、CD8-铰链和跨膜区、41BB细胞质信号传导结构域和CD3ζ细胞质信号传导结构域。

III.包含CAR的免疫细胞

a.免疫细胞

本文提供表达本公开的CAR的工程改造免疫细胞(例如，CAR-T细胞)。

在一些实施例中，工程改造免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含不同的胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含相同的胞外抗原结合结构域。

工程改造免疫细胞可以是同种异体或自体的。

在一些实施例中，工程改造免疫细胞为T细胞(例如发炎性T淋巴细胞细胞毒性T淋巴细胞、调节T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、NK细胞、NK-T细胞、TCR表达细胞、树突状细胞、杀手树突状细胞、肥大细胞或B细胞。在一些实施例中，细胞可来源于由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的群组。在一些示例性实施例中，工程改造免疫细胞为T细胞。在一些示例性实施例中，工程改造免疫细胞为γδT细胞。在一些示例性实施例中，工程改造免疫细胞为巨噬细胞。

在一些实施例中，工程改造免疫细胞可来源于例如(但不限于)干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人类胚胎干细胞、更确切地说，非人类干细胞、脐血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

在一些实施例中，细胞获自外周血或由其制备。在一些实施例中，细胞获自外周血单核细胞(PBMC)或由其制备。在一些实施例中，细胞获自骨髓或由其制备。在一些实施例中，细胞获自脐血或由其制备。在一些实施例中，细胞是人类细胞。在一些实施例中，细胞由核酸载体使用选自由以下组成的群组的方法转染或转导：电穿孔、声致穿孔、基因枪(例如，基因枪(Gene Gun))、脂质转染、聚合物转染、纳米粒子、病毒转染(例如，逆转录病毒、慢病毒、AAV)或聚合复合物。

在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达本公开的CD19特异性CAR的工程改造免疫细胞包含大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的干细胞记忆和中央记忆细胞的百分比。在一些实施例中，在其细胞表面膜处表达本公开的CD19特异性CAR的工程改造免疫细胞包含约10％到约100％、约10％到约90％、约10％到约80％、约10％到约70％、约10％到约60％、约10％到约50％、约10％到约40％、约10％到约30％、约10％到约20％、约15％到约100％、约15％到约90％、约15％到约80％、约15％到约70％、约15％到约60％、约15％到约50％、约15％到约40％、约15％到约30％、约20％到约100％、约20％到约90％、约20％到约80％、约20％到约70％、约20％到约60％、约20％到约50％、约20％到约40％、约20％到约30％、约30％到约100％、约30％到约90％、约30％到约80％、约30％到约70％、约30％到约60％、约30％到约50％、约30％到约40％、约40％到约100％、约40％到约90％、约40％到约80％、约40％到约70％、约40％到约60％、约40％到约50％、约50％到约100％、约50％到约90％、约50％到约80％、约50％到约70％、约50％到约60％、约60％到约100％、约60％到约90％、约60％到约80％、约60％到约70％、约70％到约90％、约70％到约80％、约80％到约100％、约80％到约90％、约90％到约100％、约25％到约50％、约75％到约100％，或约50％到约75％的干细胞记忆和中央记忆细胞的百分比。

在一些实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的发炎性T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的调节T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞为表达本文所述的CAR中的任一种的辅助T淋巴细胞。

在扩增和基因修饰之前，可以通过多种非限制性方法从个体获得细胞来源。细胞可从多个非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、干细胞或iPSC来源的T细胞或NK细胞、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可使用任何数目的所属领域的技术人员可获得的并已知的T细胞系。在一些实施例中，细胞可以来源于健康供体、来源于诊断患有癌症的患者或来源于诊断患有感染的患者。在一些实施例中，细胞可为展现不同表型特征的混合细胞群体的部分。

本文还提供根据上述方法中的任一种由转化的免疫细胞(例如，T细胞)获得的细胞系。本文还提供对免疫抑制治疗具有抗性的修饰细胞。在一些实施例中，根据本公开的分离细胞包含编码CAR的多核苷酸。

可以在免疫细胞的基因修饰之前或之后，使用如通常已知的方法活化和扩增本公开的免疫细胞。通常，可例如通过与刺激T细胞表面上的CD3 TCR复合物和共刺激分子以形成T细胞的活化信号的试剂接触来扩增本公开的工程改造免疫细胞。例如，如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有丝分裂凝集素样植物血凝素(PHA)的化学物质可用于产生T细胞的活化信号。

在一些实施例中，可通过与例如固定于表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD28抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触来体外刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，T细胞群体可与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。抗CD3抗体和抗CD28抗体可安置于珠粒或板或其它衬底上。适合于T细胞培养的条件包括可含有增殖和存活力所需的因子的适宜培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(龙沙(Lonza)))，所述因子包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ和TNF或熟练技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括(但不限于)表面活性剂、血浆蛋白剂(plasmanate)和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、优化剂(Optimizer)以及添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或限定组的激素，和/或足够用于T细胞生长和扩增的量的一种或多种细胞因子(例如，IL-7和/或IL-15)。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包括于实验培养物中，不包括于待输注到个体中的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO₂)。已暴露于不同刺激时间的T细胞可展现不同特征。

在一些实施例中，本公开的细胞可通过与组织或细胞共培养来扩增。在将细胞投予个体之后，细胞还可以在体内，例如在个体的血液中扩增。

在一些实施例中，根据本公开的工程改造免疫细胞可包含一种或多种破坏或失活的基因。在一些实施例中，根据本公开的工程改造免疫细胞包含一种破坏或失活的基因，其选自由以下组成的群组：CD52、CD19、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα和TCRβ；和/或表达CAR、多链CAR和/或pTα转基因。在一些实施例中，分离细胞包含编码包含多链CAR的多肽的多核苷酸。在一些实施例中，根据本公开的分离细胞包含两个破坏或失活的基因，所述基因选自由以下组成的群组：CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、CD19和CD52、CD19和TCRα、CD19和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ、PD-1和TCRα、PD-1和TCRβ、CTLA-4和TCRα、CTLA-4和TCRβ、LAG3和TCRα、LAG3和TCRβ、TIM3和TCRα、Tim3和TCRβ、BTLA和TCRα、BTLA和TCRβ、BY55和TCRα、BY55和TCRβ、TIGIT和TCRα、TIGIT和TCRβ、B7H5和TCRα、B7H5和TCRβ、LAIR1和TCRα、LAIR1和TCRβ、SIGLEC10和TCRα、SIGLEC10和TCRβ、2B4和TCRα、2B4和TCRβ；和/或表达CAR、多链CAR和pTα转基因。在一些实施例中，所述方法包含通过将能够通过选择性DNA裂解使基因选择性地失活的核酸内切酶引入细胞中而使一种或多种基因破坏或失活。在一些实施例中，核酸内切酶可以是例如锌指核酸酶(ZFN)、megaTAL核酸酶、大范围核酸酶(TALE-核酸酶)转录活化剂样效应核酸酶(TALE-核酸酶)，或CRIPR(例如，Cas9)核酸内切酶。

在一些实施例中，通过使TCRα基因和/或TCRβ基因破坏或失活，使TCR在根据本公开的细胞中呈现为非功能性的。在一些实施例中，提供一种获得来源于个体的修饰细胞的方法，其中所述细胞可不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)信号传导路径增殖。易于通过这一方法获得的可不依赖于MHC信号传导路径增殖的修饰细胞涵盖于本公开的范围中。本文所公开的修饰细胞可用于治疗需要对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主疾病(GvHD)的患者；因此，在本公开的范围内，是一种治疗需要对抗宿主抗移植物(HvG)排斥反应和移植物抗宿主疾病(GvHD)的患者的方法，其包含通过将有效量的修饰细胞投予所述患者来治疗所述患者，所述修饰细胞包含破坏或失活的TCRα和/或TCRβ基因。

在一些实施例中，免疫细胞被工程改造而对一种或多种化疗药物具有抗性。所述化疗药物可为例如，嘌呤核苷酸类似物(PNA)，由此使得免疫细胞适用于进行结合过继免疫治疗和化疗的癌症治疗。示例性PNA包括例如氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺及阿糖胞苷，其呈单独或组合形式。PNA是通过脱氧胞苷激酶(dCK)代谢成单、二和三磷酸酯PNA。其三磷酸酯形式与ATP竞争DNA合成，充当促细胞凋亡剂，并为参与三核苷酸生产的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效抑制剂。本文提供了包含断裂或失活的dCK基因的CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施例中，通过例如mRNA的电穿孔，使用编码针对dCK基因的特异性TAL-核酸酶的多核苷酸，通过转染T细胞来得到dCK基因敲除细胞。dCK基因敲除CD19特异性CAR-T细胞对PNA，包括例如氯法拉滨和/或氟达拉滨，具有抗性，并维持T细胞对表达CD19的细胞的细胞毒活性。

在一些实施例中，本公开的分离细胞或细胞系可包含pTα或其功能变体。在一些实施例中，分离细胞或细胞系可通过使TCRα基因破坏或失活而进一步进行基因修饰。

本公开还提供包含本文所述的CAR多核苷酸中的任一种的工程改造免疫细胞。

c.制造方法

本文提供了制备本公开的CAR和含CAR的免疫细胞的方法。多种已知技术可用于制备根据本公开的多核苷酸、多肽、载体、抗原结合结构域、免疫细胞、组合物等。

多核苷酸和载体

在一些实施例中，可经由质粒载体将CAR引入免疫细胞中作为转基因。在一些实施例中，质粒载体也可含有例如选择标记，其提供对接受载体的细胞的鉴别和/或选择。

在将编码CAR多肽的多核苷酸引入细胞中之后，可在细胞中原位合成CAR多肽。或者，CAR多肽可以在细胞外产生，并随后将其引入细胞中。将多核苷酸构建体引入细胞中的方法为所属领域中已知的。在一些实施例中，稳定转化方法(例如使用慢病毒载体)可用于将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其它实施例中，可使用瞬时转化方法来瞬时表达多核苷酸构建体和未整合到细胞的基因组中的多核苷酸构建体。在其它实施例中，可使用病毒介导方法。可通过任何合适手段，如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将多核苷酸引入细胞中。瞬时转化方法包括例如(但不限于)微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可包括于载体中，例如质粒载体或病毒载体中。

在一些实施例中，提供分离核酸，其包含可操作地连接到编码CD19抗原结合结构域的第一多核苷酸的启动子、至少一种共刺激分子和活化结构域。在一些实施例中，核酸构建体含于病毒载体内。在一些实施例中，病毒载体选自由以下组成的群组：逆转录病毒载体、鼠类白血病病毒载体、SFG载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺病毒相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体和牛痘病毒载体。在一些实施例中，核酸含于质粒内。

在一个方面，本公开提供了包含启动子的多核苷酸序列，所述启动子能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因。在一些实施例中，启动子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动伸长因子-1复合物的α亚基的表达，其负责氨基酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已显示有效地从克隆到慢病毒载体中的转基因驱动CAR表达。参见例如Milone等人，《分子治疗(Mol.Ther.)》17(8)：1453-1464(2009)。在一些实施例中，EF1a启动子包含作为SEQ ID NO:15提供的序列。

上文所示的EF1a启动子序列包含EF1a基因的第一外显子(粗体)和第一内含子(加下划线，SEQ ID NO:39)，其后为第二外显子的N末端部分。在一些实施例中，本文提供的多核苷酸包含短EF1a启动子。在一些实施例中，本文提供的多核苷酸包含EF1a启动子，其短于SEQ ID NO:15的核酸序列。在一些实施例中，本文提供的多核苷酸包含EF1a启动子，其不包含EF1a基因的第一内含子。在一些实施例中，本文提供的多核苷酸包含EF1a启动子，其不包含SEQ ID NO:39的核酸序列。

在一些实施例中，启动子包含作为SEQ ID NO:16提供的序列。

GCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG(SEQ ID NO:16)

在对本文所述的免疫细胞进行体外操纵或基因修饰之前，可从个体获得细胞。表达CD19 CAR的细胞可来源于同种异体或自体过程。

源材料

在一些实施例中，免疫细胞包含T细胞。T细胞可从多个来源获得，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可使用技术人员已知的任何数目的技术，如FICOLL^TM分离，从1个单位收集于个体的血液中获得T细胞。

可通过单采血液成分术从个人的循环血液获得细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在某些实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆成分，并且将其放入适当的缓冲液或培养基中以用于后续加工。

在某些实施例中，例如，使用经由PERCOLL^TM梯度的离心，通过裂解红细胞和消耗单核细胞，从PBMC中分离T细胞。T细胞的特定亚群，(例如CD28+、CD4+、CDS+、CD45RA-和CD45RO+T细胞或CD28+、CD4+、CDS+、CD45RA-、CD45RO+和CD62L+T细胞)可通过所属领域中已知的阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，T细胞群体通过阴性选择的富集可用针对对于阴性选择的细胞独特的表面标记的抗体的组合实现。本文使用的方法之一是通过负磁免疫粘附或流式细胞测量术进行细胞分选和/或选择，所述负磁免疫粘附或流式细胞测量术使用针对在阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择针对CD4+细胞富集，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。流式细胞测量术和细胞分选还可用于分离用于本公开中的所关注的细胞群体。

PBMC可直接用于使用如本文所述的方法用免疫细胞(例如CAR或TCR)进行基因修饰。在某些实施例中，在分离PBMC之后，可进一步分离T淋巴细胞，并且在基因修饰和/或扩增之前或之后，可将细胞毒性和辅助T淋巴细胞两者分选为原生、记忆和效应T细胞亚群。

在一些实施例中，CD8+细胞通过鉴别与那些类型的CD8+细胞中的每一种缔合的细胞表面抗原而进一步分选成原生、干细胞记忆、中央记忆和效应细胞。在一些实施例中，中央记忆T细胞的表型标记的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127并且对于粒酶B是阴性的。在一些实施例中，干细胞记忆T细胞为CD45RO-、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施例中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施例中，效应T细胞对于CD62L、CCR7、CD28和CD127是阴性的，并且对于颗粒酶B和穿孔素是阳性的。在某些实施例中，CD4+T细胞进一步分选成亚群。例如，CD4+T辅助细胞可通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群体而分选到原生、中央记忆和效应细胞中。

干细胞来源的免疫细胞

在一些实施例中，免疫细胞可来源于胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。适合的HSC、ES细胞、iPS细胞和其它干细胞可以为经培育的永生细胞线或直接从患者分离。用于分离、产生和/或培育干细胞的各种方法为所属领域中已知的并且可用于实践本发明。

在一些实施例中，免疫细胞为来源于再程序化T细胞的诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施例中，源材料可以是来源于T细胞或非T细胞的诱导多能干细胞(iPSC)。源材料可以是胚胎干细胞。源材料可以是B细胞，或来自外周血单核细胞分离物、造血祖细胞、造血干细胞、间叶干细胞、脂肪干细胞或任何其它体细胞类型的任何其它细胞。

分离细胞的基因修饰

免疫细胞，如T细胞可在分离之后使用已知方法进行基因修饰，或免疫细胞可在经基因修饰之前在体外被活化和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在一些实施例中，将分离免疫细胞进行基因修饰以减少或消除内源性TCRα和/或CD52的表达。在一些实施例中，细胞使用基因编辑技术(例如，CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、MegaTAL、大范围核酸酶)进行基因修饰以减少或消除内源性蛋白质(例如，TCRα和/或CD52)的表达。在另一实施例中，免疫细胞(如T细胞)用本文所述的嵌合抗原受体(例如，用包含编码CAR的一个或多个核苷酸序列的病毒载体转导)进行基因修饰，并且随后在体外活化和/或扩增。用于活化和扩增T细胞的方法是本领域已知的，并且例如描述于美国专利第6,905,874号；美国专利第6,867,041号；美国专利第6,797,514号；以及PCT WO2012/079000中，所述专利的内容特此以全文引用的方式并入本文中。通常，此类方法包括使PBMC或分离T细胞与通常附接到珠粒或其它表面的刺激分子和共刺激分子(如抗CD3和抗CD28抗体)在具有适当细胞因子(如IL-2)的培养基中接触。附接到同一珠粒的抗CD3和抗CD28抗体充当“替代”抗原呈现细胞(APC)。一个实例为针对人类T细胞的生理活化的系统，CD3/CD28活化剂/刺激剂系统。在其它实施例中，可使用如美国专利第6,040,177号；美国专利第5,827,642号；以及WO2012129514中描述的那些方法用饲养细胞和适当抗体以及细胞因子活化并且刺激T细胞以增殖，所述专利的内容特此以全文引用的方式并入本文中。

用于制备本公开的构建体和工程改造免疫细胞的某些方法描述于PCT申请案PCT/US15/14520中，所述PCT申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。

应了解，PBMC还可包括其它细胞毒性淋巴细胞，如NK细胞或NKT细胞。可将携带如本文所公开的嵌合受体的编码序列的表达载体引入人类供体T细胞、NK细胞或NKT细胞的群体中。可使用流式细胞测量术将携带表达载体的成功转导的T细胞分选以分离CD3阳性T细胞，并且接着进一步增殖以增加除使用抗CD3抗体和IL-2或所属领域中已知的如本文中其它地方所述的其它方法的细胞活化之外的这些CAR表达T细胞的数目。标准程序用于冷冻保存表达CAR的T细胞，以储存和/或制备用于人类个体。在一个实施例中，在不存在非人类动物衍生产物，如胎牛血清(fetal calf serum/fetal bovine serum)的情况下进行T细胞的体外转导、培养和/或扩增。

为了克隆多核苷酸，可将载体引入宿主细胞(分离宿主细胞)以允许载体本身的复制，并且由此扩增其中所含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可以含有序列组分，通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和可选标记。这些元件可以由所属领域的普通技术人员酌情选择。例如，可以选择复制起点以促进载体在宿主细胞中的自主复制。

在某些实施例中，本公开提供含有本文所提供的载体的分离的宿主细胞。含有载体的宿主细胞可用于载体中所含的多核苷酸的表达或克隆。合适的宿主细胞可以包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或较高真核细胞，例如哺乳动物细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括(但不限于)真细菌，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。

载体可使用所属领域中已知的任何合适的方法引入到宿主细胞，包括(但不限于)DEAE-葡聚糖介导的递送、磷酸钙沉淀方法、阳离子脂质介导的递送、脂质体介导的转染、电穿孔、基因枪法、受体介导的基因递送、由聚赖氨酸、组蛋白、壳聚糖和肽介导的递送。用于转染和转化用于表达所关注的载体的细胞的标准方法在所属领域中是众所周知的。在另一实施例中，不同表达载体的混合物可用于基因修饰免疫效应细胞的供体群体，其中每个载体编码如本文所公开的不同CAR。所得转导免疫效应细胞形成工程改造细胞的混合群体，其中一定比例的工程改造细胞表达超过一个不同CAR。

在一些实施例中，载体包含慢病毒载体。可以将包含CAR编码序列的慢病毒载体引入慢病毒包装细胞系中，并且由包装细胞系产生的慢病毒可用于T细胞的转导以产生CAR-T细胞。为了制备编码CAR的慢病毒，在第0天时，可将HEK-293T细胞以40万个细胞/mL在补充有10％FBS(Hyclone或JR Scientific)的6孔板的每孔的2mL DMEM(Gibco)中铺板。在第1天，慢病毒可通过将慢病毒包装载体1.5ug psPAX2、0.5ug pMD2G与6孔板的每孔250uLOpti-MEM(Gibco)中的0.5ug适当转移CAR载体(“DNA混合物”)混合在一起制备。250uLOpti-MEM中的10uL脂染胺2000(英杰公司(Invitrogen))可在室温下培育5分钟，并且接着添加到DNA混合物中。混合物可在室温下培育20分钟，并且将500uL的总体积缓慢添加到含有HEK-293T的孔的侧面。含CAR的慢病毒产生和转导的一般方法是本领域中普遍已知的，例如，参见Milone等人，《白血病(Leukemia)》，2018，32：1529-1541；Sanber等人，用于临床lendiviol载体产生的稳定包装细胞系的构建(Construction of stable packing celllines for clinical lendiviol vector production)，《自然(Nature)》2015，DOI：10.1038；Roddie等人，《细胞疗法(Cytotherapy)》2019，21：327-340，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文。在一个实施例中，本公开提供一种储存表达CAR或TCR的基因工程改造细胞的方法，所述CAR或TCR靶向CD19蛋白。这涉及冷冻保存免疫细胞，使得细胞在解冻后保持存活。可通过所属领域中已知的方法冷冻保存表达CAR的免疫细胞的一部分，以提供此类细胞的永久性来源，用于将来治疗患有恶性肿瘤的患者。需要时，冷冻保存的转化免疫细胞可解冻、生长和扩增以得到更多此类细胞。

在一些实施例中，细胞通过首先从其培养基收集细胞，并且随后洗涤并且浓缩适合于以治疗有效量投予的培养基和容器系统(“药学上可接受的”载剂)中的细胞来调配。合适的输注介质可以是任何等渗培养基制剂，通常是生理盐水Normosol^TMR(雅培)或Plasma-Lyte^TMA(巴克斯特)，但也可以使用5％的右旋糖水溶液或林格乳酸盐(Ringer's lactate)。输注介质可补充有人类血清白蛋白。

同种异体CAR T细胞

用于制造同种异体CAR T疗法或AlloCARs^TM的方法涉及从健康供体收集健康、选定、筛选和测试的T细胞。接着，对T细胞进行工程改造以表达CAR，所述CAR识别在血液或实体瘤中表达的某些细胞表面蛋白质(例如CD19)。同种异体T细胞是基因编辑的，以降低移植物抗宿主病(GvHD)的风险并防止同种异体排斥。敲除T细胞受体基因(例如，TCRα、TCRβ)以避免GvHD。可敲除CD52基因以使得CAR T产品对抗CD52抗体治疗具有抗性。因此抗CD52抗体治疗可用于抑制宿主免疫系统，并且允许CAR T保持植入以实现完全治疗作用。工程改造的T细胞随后进行纯化步骤，并且最终在小瓶中冷冻保存以递送到患者。

自体CAR T细胞

自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法涉及收集患者自身的细胞(例如，白细胞，包括T细胞)和对T细胞进行基因工程改造，以表达识别在一种或多种特定癌细胞的细胞表面上表达的靶的CAR并杀死癌细胞。然后冷冻保存工程改造细胞，并且随后投予患者。

IV.治疗方法

本公开包含用于治疗或预防与患者中的非所要和/或升高的CD19水平相关的病状的方法，其包含向有需要的患者投予有效量的至少一种CAR或包含本文所公开的CAR的免疫细胞。

提供用于治疗包括癌症的疾病或病症的方法。在一些实施例中，本公开涉及在个体中产生T细胞介导的免疫反应，其包含向所述个体投予有效量的本申请的工程改造免疫细胞。在一些实施例中，T细胞介导的免疫反应针对靶细胞或细胞。在一些实施例中，工程改造免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些方面，本公开包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包含向有需要的个体投予有效量的至少一种本文所述的分离抗原结合结构域。在一些方面，本公开包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包含向有需要的个体投予有效量的至少一种免疫细胞，其中所述免疫细胞包含至少一种如本文所述的嵌合抗原受体、T细胞受体和/或分离抗原结合结构域。

本公开的含CAR的免疫细胞可用于治疗涉及CD19异常表达的恶性肿瘤。在一些实施例中，本公开的含CAR的免疫细胞可用于治疗癌症。如本文所用，术语“癌症”包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语“癌症”指皮肤组织、器官、血液和血管的疾病，包括但不限于膀胱癌、骨癌或血液癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、胸部癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头癌、肾癌、肝癌、淋巴结癌、肺癌、口腔癌、颈部癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌和子宫癌。特异性癌症包括但不限于：晚期恶性肿瘤、淀粉样变性、神经母细胞瘤、脑膜瘤、血管周细胞瘤、多发性脑转移、多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforms)、胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、不良预后恶性脑肿瘤、恶性胶质瘤、复发性恶性胶质瘤(recurrent malignant giolma)、间变性星形细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤、神经内分泌肿瘤、直肠腺癌、Dukes C&D结肠直肠癌、不可切除的结直肠癌、转移性肝细胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、卡罗型急性成髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、低级别滤泡性淋巴瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、恶性胸腔积液间皮瘤综合征、腹膜癌、乳头状浆液癌、妇科肉瘤、软组织肉瘤、硬皮病、皮肤血管炎、朗格罕(Langerhans)细胞组织细胞增生症、平滑肌肉瘤、进行性骨化性纤维发育不良、激素难治性前列腺癌、切除高风险软组织肉瘤、不可切除的肝细胞癌、瓦登斯通巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、冒烟型骨髓瘤、惰性骨髓瘤、输卵管癌、雄激素独立性前列腺癌、雄激素依赖性IV期非转移性前列腺癌、激素不敏感性前列腺癌、化疗不敏感的前列腺癌、乳头状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌和平滑肌瘤。在一个具体实施例中，癌症是转移性的。在另一个实施例中，癌症对化学疗法或辐射具有难治性或抗性。

在示例性实施例中，含CAR的免疫细胞(例如本公开的CAR-T细胞)用于治疗NHL。

还提供了用于减小个体的肿瘤大小的方法，其包含向个体投予本公开的工程改造细胞，其中所述细胞包含嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含CD19抗原结合结构域并且与肿瘤上的CD19抗原结合。

在一些实施例中，个体患有实体瘤或血液恶性肿瘤，如淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，将工程改造细胞递送到肿瘤床。在一些实施例中，癌症存在于个体的骨髓中。在一些实施例中，工程改造细胞为自体免疫细胞，例如自体T细胞。在一些实施例中，工程改造细胞为同种异体免疫细胞，例如同种异体T细胞。在一些实施例中，工程改造细胞为异源免疫细胞，例如异源T细胞。在一些实施例中，本申请的工程改造细胞在体内转染或转导。在其它实施例中，离体转染或转导工程改造细胞。如本文所使用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。

治疗剂，例如，工程改造的CART细胞的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”，或“治疗有效剂量”，是任何量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时，保护个体免于疾病发作或促进疾病消退，所述疾病消退由疾病症状的严重程度降低来证明，无疾病症状期的频率和持续时间增加，或预防疾病病痛导致的障碍或残疾。治疗剂促进疾病消退的能力可使用熟练的从业者已知的多种方法来评价，例如在临床试验期间在人类个体中、在预测人类中功效的动物模型系统中或通过在体外分析中分析药剂的活性来评价。

术语“患者”和“个体”可互换使用，并且包括人类和非人类动物个体以及患有正式诊断的病症的那些个体、没有正式识别的病症的那些个体、接受医学观察的那些个体、处于发病风险的那些个体等。

术语“治疗(treat/treatment)”包括治疗性治疗、预防性治疗和其中一个降低个体将出现病症或其它风险因素的风险的应用。治疗不需要完全治愈病症并且涵盖其中一个减少症状或潜在风险因素的实施例。术语“预防”不需要100％消除事件发生的可能性。确切地说，其表示在化合物或方法存在下事件的发生的可能性已降低。

组合物中细胞的期望治疗量通常为至少2个细胞(例如，至少1个CD8+中央记忆T细胞和至少1个CD4+辅助T细胞子集)，或更通常大于10²个细胞，并且高达10⁶，高达并且包括10⁸或10⁹个细胞，并且可超过10¹⁰个细胞。细胞的数目将取决于组合物的预期用途和其中所包括的细胞的类型。所需细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。可以将临床相关数目的免疫细胞分摊成累积等于或超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹，或10¹²个细胞的多次输注。在本公开的一些方面中，确切地说，由于所有输注的细胞将被重定向到特定靶抗原(CD19)，因此可以投予10⁶/公斤范围内(每个患者10⁶-10¹¹)的较低数目的细胞。CAR治疗可在这些范围内的剂量下多次投予。细胞对经受治疗的患者可以是自体、同种异体或异源的。

在一些实施例中，所述治疗有效量的CAR T细胞为约1×10⁵个细胞/kg、约2×10⁵个细胞/kg、约3×10⁵个细胞/kg、约4×10⁵个细胞/kg、约5×10⁵个细胞/kg、约6×10⁵个细胞/kg、约7×10⁵个细胞/kg、约8×10⁵个细胞/kg、约9×10⁵个细胞/kg、2×10⁶细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg，或约9×10⁷个细胞/kg。

在一些实施例中，CAR+/CAR-T+/TCR+细胞的目标剂量在1×10⁶-2×10⁸个细胞/kg，例如2×10⁶个细胞/kg的范围内。应了解，高于和低于此范围的给药可适合于某些个体，并且可由医疗保健提供者根据需要确定适当的给药水平。另外，可根据本公开提供多个剂量的细胞。

在一些方面，本公开包含药物组合物，其包含至少一种如本文所述的抗原结合结构域和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物还包含额外活性剂。

本公开的表达CAR的细胞群体可以单独或以与稀释剂和/或与其它组分(如IL-2或其它细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物形式一起投予。本公开的药物组合物可包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的CAR表达或TCR表达细胞群体，如本文所描述的T细胞。这种组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖，甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本公开组合物优选调配用于静脉内投予。

药物组合物(溶液、悬浮液等)可包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液(较佳生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠；不挥发性油，如可以充当溶剂或悬浮介质的合成单或二甘油酯；聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以将肠胃外调配物密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选地是无菌的。

在一些实施例中，在投予患者后，在其细胞表面处表达本文所述的CD19特异性CAR中的任一种的工程改造免疫细胞可减少、杀伤或裂解患者的内源性表达CD19的细胞。在一个实施例中，通过表达本文所述的CD19特异性CAR中的任一种的工程改造免疫细胞表达CD19的内源性细胞或表达CD19的细胞系的细胞的减少或裂解百分比为至少约或大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一个实施例中，通过表达本文所述的CD19特异性CAR中的任一种的工程改造免疫细胞对表达CD19的内源性细胞或表达CD19的细胞系的细胞的减少或裂解百分比为约5％到约95％、约10％到约95％、约10％到约90％、约10％到约80％、约10％到约70％、约10％到约60％、约10％到约50％、约10％到约40％、约20％到约90％、约20％到约80％、约20％到约70％、约20％到约60％、约20％到约50％、约25％到约75％，或约25％到约60％。在一个实施例中，内源性表达CD19的细胞为内源性表达CD19的骨髓细胞。

在一个实施例中，可使用本文所公开的测定来测量通过在其细胞表面膜处表达本公开的CD19特异性CAR的工程改造免疫细胞对靶细胞，例如表达CD19的细胞系的减少或裂解百分比。

所述方法还可包含投予一种或多种化学治疗剂。在某些实施例中，化学治疗剂为淋巴细胞消耗(预处理)化学治疗剂。例如，调节需要T细胞疗法的患者的方法，其包含向患者投予指定有益剂量的环磷酰胺(在200mg/m²/天与2000mg/m²/天之间、约100mg/m²/天与约2000mg/m²/天；例如，约100mg/m²/天、约200mg/m²/天、约300mg/m²/天、约400mg/m²/天、约500mg/m²/天、约600mg/m²/天、约700mg/m²/天、约800mg/m²/天、约900mg/m²/天、约1000mg/m²/天、约1500mg/m²/天或约2000mg/m²/天)和指定剂量的氟达拉滨(在20mg/m²/天与900mg/m²/天之间、在约10mg/m²/天与约900mg/m²/天之间；例如，约10mg/m²/天、约20mg/m²/天、约30mg/m²/天、约40mg/m²/天、约40mg/m²/天、约50mg/m²/天、约60mg/m²/天、约70mg/m²/天、约80mg/m²/天、约90mg/m²/天、约100mg/m²/天、约500mg/m²/天或约900mg/m²/天)。优选给药方案涉及治疗患者，其包含在向患者投予治疗有效量的工程改造的T细胞之前，每日向患者投予约300mg/m²/天的环磷酰胺和约30mg/m²/天的氟达拉滨持续三天。

在一些实施例中，淋巴细胞消耗还包含投予CD52抗体。在一些实施例中，CD52抗体以约13mg/天的剂量IV投予。

在其它实施例中，抗原结合结构域、转导(或以其它方式工程改造的)细胞和化学治疗剂各自以有效治疗个体的疾病或病况的量投予。

在某些实施例中，包含本文所公开的表达CAR的免疫效应细胞的组合物可与任何数目的化学治疗剂一起投予。化学治疗剂的实例包括烷基化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯唑多巴、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、二氯甲二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、胆固醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷诺莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如阿克拉霉素、放射菌素、奥斯拉菌素、氮杂丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、奎那霉素、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如迪诺特宁、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；倍思塔布；比生群；艾达曲克；得弗伐胺；秋水仙碱；地吖醌；艾福米辛；乙酸依利铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他汀(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；甲托辛；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇，如太平洋紫杉醇(TAXOL^TM，布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布肿瘤学(Bristol-Myers Squibb Oncology)，新泽西州普林斯顿(Princeton))和多西他赛(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，法国安东尼(Antony))；氯芥苯丁酸；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；米托蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RF S2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如Targretin^TM(贝瑟罗汀)、Panretin^TM(亚利崔托宁)；ONTAK^TM(地尼白介素)；埃斯波霉素；卡培他滨(capecitabine)；以及以上各者中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中还包括用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬盐酸盐、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(Fareston))；和抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及以上各者中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂的组合也在适当时投予，包括但不限于CHOP，即环磷酰胺多柔比星(Doxorubicin)(羟基多柔比星)、长春新碱和泼尼松(Prednisone)。

在一些实施例中，在投予工程改造细胞、多肽或核酸之后同时或一周内投予化学治疗剂。在其它实施例中，在投予工程改造细胞、多肽或核酸之后1到4周或1周到1个月、1周到2个月、1周到3个月、1周到6个月、1周到9个月或1周到12个月投予化学治疗剂。在其它实施例中，在投予细胞、多肽或核酸之前至少1个月投予化学治疗剂。在一些实施例中，所述方法还包含投予两种或更多种化学治疗剂。

多种额外治疗剂可与本文所述的组合物结合使用。例如，潜在有用的额外治疗剂包括PD-1抑制剂，如纳武单抗(nivolumab)帕博利珠单抗(pembrolizumab)帕博利珠单抗、匹利珠单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)。

适合与本公开组合使用的额外治疗剂包括(但不限于)：依鲁替尼(ibrutinib)奥法木单抗(ofatumumab)利妥昔单抗(rituximab)贝伐珠单抗(bevacizumab)曲妥珠单抗(trastuzumab)曲妥珠单抗恩他新(trastuzumab emtansine)伊马替尼(imatinib)西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)卡妥索单抗(catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥司木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿西替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、托西尼布(toceranib)、来他替尼(lestaurtinib)、阿西替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼(tivozanib)、托西尼布、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、普纳替尼(ponatinib)、拉多替尼(radotinib)、伯舒替尼、来他替尼、卢佐替尼(ruxolitinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、贝美替尼(binimetinib)、阿来替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克卓替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿替泊(adipotide)、地尼白介素(denileukin diftitox)；mTOR抑制剂，如依维莫司(Everolimus)和坦罗莫司(Temsirolimus)；刺猬抑制剂，如索尼得吉(sonidegib)和维莫德吉(vismodegib)；CDK抑制剂，如CDK抑制剂(帕博西尼(palbociclib))。

在一些实施例中，包含含CAR的免疫细胞的组合物可与预防细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性的治疗方案一起投予以。预防细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性的治疗方案可包括仑兹鲁单抗(lenzilumab)、托西利单抗(tocilizumab)、心房利钠肽(atrialnatriuretic peptide，ANP)、阿那白滞素(anakinra)、iNOS抑制剂(例如L-NIL或1400W)。在额外实施例中，包含含CAR的免疫细胞的组合物可与抗炎剂一起投予。抗炎剂或药物包括(但不限于)类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氢皮质酮(hydrocortisone acetate)、氢皮质酮(hydrocortisone)、氢皮质酮、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone))；非类固醇消炎药物(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤(methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药剂、环磷酰胺和霉酚酸酯(mycophenolate)。示例性的NSAID包括布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxen sodium)、Cox-2抑制剂和唾液酸盐。示例性镇痛剂包括乙酰胺苯酚、羟考酮、盐酸丙氧吩的曲马多。示例性糖皮质激素包括可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙(prednisolone)或泼尼松(prednisone)。示例性生物应答修饰剂包括针对细胞表面标记(例如CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂(如TNF拮抗剂(例如依那西普(etanercept)阿达木单抗(adalimumab)和英利昔单抗(infliximab)))、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答修饰剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢灵、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟化氯喹、戈尔德(Gold)(口服(金诺芬(auranofin))和肌内)和米诺环素(minocycline)。

在某些实施例中，本文所述的组合物与细胞因子结合投予。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子之中包括生长激素，如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳素；苗勒氏(mullerian)抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所使用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，和天然序列细胞因子的生物活性等效物。

V.分选和消耗方法

在一些实施例中，提供了用于体外分选免疫细胞群体的方法，其中免疫细胞群体的子集包含表达CD19特异性CAR中的任一种的工程改造免疫细胞，所述CD19特异性CAR包含对单克隆抗体具有特异性的表位(例如，示例性模拟表位序列)。所述方法包含使免疫细胞群体与对表位具有特异性的单克隆抗体接触，并选择结合到单克隆抗体的免疫细胞以获得富集表达CD19特异性CAR的工程改造免疫细胞的细胞群体。

在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地结合于荧光团。在此实施例中，选择结合于单克隆抗体的细胞的步骤可通过荧光激活细胞分选术(FACS)进行。

在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地结合于磁性粒子。在此实施例中，选择结合于单克隆抗体的细胞的步骤可通过磁性激活细胞分选术(MACS)进行。

在一些实施例中，对表达CAR的免疫细胞进行分选的方法中所使用的mAb选自阿仑单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗(basiliximab)、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、聚乙二醇化赛妥珠单抗、达利珠单抗、艾库组单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗(palivizumab)、兰比珠单抗(ranibizumab)、托西利单抗、曲妥珠单抗、维多珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗、贝利单抗、卡那单抗、地诺单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10和/或优特克单抗(ustekinumab)。在一些实施例中，所述mAb为利妥昔单抗。在另一实施例中，所述mAb为QBEND-10。

在一些实施例中，当使用上文所述的用于对表达CAR的免疫细胞进行体外分选的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的表达CAR的免疫细胞。在一些实施例中，当使用所述用于对表达CAR的免疫细胞进行体外分选的方法时获得的表达CAR的免疫细胞的群体包含至少85％的表达CAR的免疫细胞。

在一些实施例中，当使用上文所述的用于对表达CAR的免疫细胞进行体外分选的方法时获得的表达CAR的免疫细胞的群体与初始(未分选)细胞群体相比显示体外细胞毒性活性增加。在一些实施例中，所述细胞毒性活性体外增加10％、20％、30％或50％。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。

在一些实施例中，mAb先前结合于支持物或表面上。固体支持物的非限制性实例可包括珠粒、琼脂糖珠粒、磁珠、塑料孔板、玻璃孔板、陶瓷孔板、柱或细胞培养袋。

可从源群体中在体外富集待投予到接受者的表达CAR的免疫细胞。扩增源群体的方法可包括使用密度离心、免疫磁珠纯化、亲和色谱和荧光活化细胞分选的组合来选择表达抗原(如CD34抗原)的细胞。

流式细胞测量术可用于定量细胞群体内的特定细胞类型。一般来说，流式细胞测量术是一种主要通过光学手段对细胞的组分或结构特征进行定量的方法。由于不同细胞类型可通过对结构特征定量来区分，因此流式细胞测量术和细胞分选可用于对混合物中的不同表型的细胞进行计数和分选。

流式细胞测量术分析涉及两个基本步骤：1)用一种或多种标记的标记对选定细胞类型进行标记，和T)测定相对于群体中的细胞总数的标记细胞数。在一些实施例中，标记细胞类型的方法包括将标记抗体结合于由特定细胞类型表达的标记。抗体可直接标记有荧光化合物或使用例如，识别第一抗体的荧光标记的第二抗体间接标记。

在一些实施例中，用于对表达CAR的T细胞进行分选的方法为磁性激活细胞分选(MACS)。磁性激活细胞分选(MACS)是一种取决于细胞群体表面抗原(CD分子)，通过使用超顺磁纳米粒子和柱分离多种细胞群体的方法。MACS可用于获得纯细胞群体。单细胞悬浮液中的细胞可用微珠磁性标记。将样品施加于由铁磁性球体构成的柱，其覆盖有允许快速和平缓分离细胞的细胞友好型涂层。未经标记的细胞会通过而磁标记的细胞保留在柱中。流过物可收集作为未标记的细胞部分。洗涤步骤之后，从分离器去除所述柱，并使磁标记的细胞从柱洗脱。

用于纯化特定细胞群体(如T细胞)的详细方案可见于Basu S等人(2010)。(BasuS、Campbell HM、Dittel BN、Ray A.《通过荧光激活细胞分选术(FACS)纯化特定细胞群(Purification of specific cell population by fluorescence activated cellsorting)》。《可视化实验杂志(J Vis Exp)》。(41):1546)。

在一些方面，本公开提供了一种用于通过体内消耗来消耗表达CD19特异性CAR的免疫细胞的方法。体内消耗可包括向哺乳动物生物体投予治疗(例如，结合CAR上的表位的分子)，所述治疗旨在通过抑制或消除来阻止表达CAR的免疫细胞的增殖。

本发明的一个方面涉及一种用于体内消耗表达包含mAb特异性表位的CD19 CAR的工程改造免疫细胞的方法，其包含使所述工程改造免疫细胞或所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触。本发明的另一方面涉及一种用于体内消耗表达CAR的免疫细胞的方法，所述免疫细胞包含嵌合scFv(例如，通过插入mAb特异性表位而形成)，所述方法通过使所述工程改造免疫细胞与表位特异性抗体接触而实现。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞和/或抗体是单克隆的。

根据一个实施例，对先前使用本发明的体外方法分选的工程改造免疫细胞进行免疫工程改造细胞的体内消耗。在此情况下，可使用相同的输注的mAb。在一些实施例中，mAb特异性抗原是CD20抗原，并且表位特异性mAb是利妥昔单抗。在一些实施例中，本发明涉及一种用于在患者中体内消耗表达包含mAb特异性表位的CAR的工程改造免疫细胞(表达CAR的免疫细胞)的方法，所述方法包含使所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触。

在一些实施例中，使所述工程改造免疫细胞或所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触的步骤包含向患者输注表位特异性mAb(例如，利妥昔单抗)。在一些实施例中，向患者投予的表位特异性mAb的量足以在患者中消除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％表达CAR的免疫细胞。

在一些实施例中，使所述工程改造免疫细胞或所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触的步骤包含向患者输注375mg/m²的利妥昔单抗一次或多次。在一些实施例中，mAb(例如利妥昔单抗)每周投予一次。

在一些实施例中，当表达包含mAb特异性表位的CAR的免疫细胞(表达CAR的免疫细胞)在补体依赖性细胞毒性(CDC)分析中使用表位特异性mAb消耗时，表达存活CAR的免疫细胞的量减少。在一些实施例中，表达存活CAR的免疫细胞的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，所述mAb特异性表位是CD20表位或模拟表位，和/或表位特异性mAb是利妥昔单抗。

在某些实施例中，CAR工程改造免疫细胞的体内消耗通过输注双特异性抗体来进行。根据定义，双特异性单克隆抗体(BsAb)是由两种不同单克隆抗体的片段组成的人工蛋白质，并且因此结合于两种不同类型的抗原。这些BsAb和其在免疫疗法中的用途已在Muller D和Kontermann R.E.(2010)《用于癌症免疫治疗的双特异性抗体(BispecificAntibodies for Cancer Immunotherapy)》,《生物制药(BioDrugs)》24(2):89-98.

根据另一特定实施例，所输注的双特异性mAb能够结合在表达嵌合scFv的工程改造免疫细胞上携带的mAb特异性表位以及结合在效应和细胞毒性细胞(例如免疫细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL))上的表面抗原。通过这样做，由BsAb触发的工程改造免疫细胞的消耗可通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)发生。(Deo Y M、Sundarapandiyan K、Keler T、Wallace PK和Graziano RF,(2000),《免疫学杂志(Journal of Immunology)》,165(10):5954-5961])。

在一些实施例中，细胞毒性药物偶联于可用于消耗表达CAR的免疫细胞的表位特异性mAb。通过使单克隆抗体的靶向能力与细胞毒性药物的癌症杀伤能力组合，当相比于使用单独的药物时，抗体-药物结合物(ADC)提供健康和病变组织之间的敏感辨别。若干ADC已得到市场批准；其制造技术(尤其利用接头)描述于(Payne,G.(2003)《癌细胞(CancerCell)》3:207-212；Trail等人(2003)《癌症免疫与免疫疗法(CancerImmunol.Immunother.》)52:328-337；Syrigos和Epenetos(1999)《抗癌研究(AnticancerResearch)》19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)《先进药物递送评论(Adv.Drug Del.Rev.)》26:151-172；美国专利第4,975,278号)。

在一些实施例中，待输注的表位特异性mAb预先与能够促进补体依赖性细胞毒性(CDC)的分子结合。因此，补体系统辅助或补充抗体从生物体清除病原体的能力。当刺激时，由于应答的大规模扩增和杀伤细胞的攻膜复合物的活化而触发活化级联。可使用不同分子结合mAb，如聚糖[Courtois,A、Gac-Breton,S.、Berthou,C、Guezennec,J.、Bordron,A.和Boisset,C.(2012),《治疗抗体片段的补体依赖细胞毒活性通过免疫原性聚糖偶联得到(Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragmentsis acquired by immunogenic glycan coupling)》,《生物技术电子杂志(ElectronicJournal of Biotechnology》)ISSN:0717-3458；http://www.ejbiotechnology.info DOI:10.2225/第l5卷-第5期)。

VI.试剂盒和制品

本申请提供了试剂盒，其包含本文所述的含CD19的CAR或含CD19 CAR的免疫细胞中的任一者，和其药组合物。在一些示例性实施例中，本公开的试剂盒包含用于向个体投予淋巴细胞耗尽方案和CAR-T方案的同种异体含CD19 CAR的T细胞和CD52抗体。

本申请还提供包含本文所述的治疗性组合物或试剂盒中的任一者的制品。制品的实例包括小瓶(例如，密封小瓶)。

实例

实例1：抗利妥昔单抗CD19 CAR免疫细胞的产生

如图1和表4所示产生不表达利妥昔单抗结合位点的抗利妥昔单抗抗CD19嵌合抗原受体构建体。将慢病毒载体构建体引入病毒包装细胞系中，并且在Allogene产生含有抗CD19 CAR的慢病毒。

解冻来自四种人类供体(541、604、410和2593)的Pan T细胞，并且在IL-2(100IU/ml)的存在下，以1.5×10⁶个细胞/ml用大规模T细胞TransActTM(1：15比率)活化。在2天后，用2ml包含表4中所述载体的新鲜慢病毒转导1.5×10⁶个细胞(3ml)。修饰的载体的示意图如图1所示。在第0天、第2天、第5天、第7天、第9天和第12天添加IL-2(100IU/ml)。在第5天将总计6×10⁶个细胞转移到6孔G-Rex板中，在第9天和第12天进行培养基交换。在第13天时冷冻细胞。

表4：抗利妥昔单抗CD19 CAR载体

co＝密码子优化

对在淋巴细胞、活CD3+、CAR+、CD4/CD8和下游标记上门控的转导细胞进行流式细胞测量术实验。在第5天和第13天时，使用一组CD3、CD4、CD8、活力、CD34和针对抗CD19 CAR的抗体的抗独特型(4G7抗Id)对人转导检查和CD34小组进行。图2A和2B显示了流式细胞术图，其展示使用抗CD19 CAR抗Id抗体在第5天用表4中所示的CAR表达载体转导的Pan T细胞的CAR表达。

在第9天和第13天进行人表型和活化小组的流式细胞测量术。所述小组包括CD3、CD4、CD8、活力、CD45RO、CD62L、CD25、4-1BB、PD-1、针对抗CD19 CAR的抗体的抗独特型和TIM3。在第13天时，对于来自所有四种供体的细胞扩增和最终CAR表达对细胞进行归一化(图3)。图3中的数据显示，尽管v1.2显示出较高的转导率(CAR+％)，但与例如v1.0和v1.1相比，v1.2转导细胞显示出较低的CAR表达水平(CAR MFI)。监测用抗利妥昔单抗CAR表达载体转导的来自供体541(图4A)、604(图4B)、410(图4C)、2593(图4D)的Pan T细胞的随时间推移的细胞扩增和CAR表达。

测量用抗利妥昔单抗CAR表达载体转导的来自供体541(图5A)、604(图5B)、410(图5C)、2593(图5D)的Pan T细胞的第5天、第9天和第13天的CD4/CD8比率。图6A至6D示出了用抗利妥昔单抗CAR表达载体转导的来自供体541(图6A)、604(图6B)、410(图6C)、2593(图6D)的Pan T细胞的第9天的表型和活化。图7示出了第9天使用TIM3和PD1染色测量到的从所有四种供体平均的表型、活化CD8+％和T细胞无反应性。测量用抗利妥昔单抗CAR表达载体转导的来自供体541(图8A)、604(图8B)、410(图8C)、2593(图8D)的Pan T细胞的第13天的表型和活化。图9示出了第13天使用TIM3和PD1染色从所有四种供体测量到的表型、活化CD8+％和T细胞无反应性。

实例2：短期和长期体外杀伤测定

对来自实例1的转导的CAR细胞进行短期和长期杀伤能力测试。制备与Raji细胞的CAR T细胞共培养物(2：1E比T)，用于后面的流式荧光检测术(Luminex)测定。确定每种CAR构建体使用Raji细胞作为靶细胞的平均短期(24小时)杀伤测定(图10)。图11A至11D示出了使用A549-CD19+细胞作为靶细胞在每种CAR构建体具有8：1的E：T(图11A)、4：1(图11B)、2：1(图11C)和1：1(图11D)的情况下的平均长期杀伤测定。

分析杀伤测定结果与表型特征的相关性。第7天在1：1E比T下的杀伤百分比与CAR+CD4+41BB+、CAR+CD4+Tim3+(p＝0.0352)、CAR+CD4+T_EM+(p＝0.0328)、CAR+CD8+PD-1+(p＝0.0269)和第13天的CAR表达％(p＝0.0245)负相关。第7天在1：1E比T下的杀伤百分比与CAR+CD8+T_SCM+正相关。第9天在1：1E比T下的杀伤百分比与CAR+CD4+Tim3+、CAR+CD4+T_EM+(p＝0.0031)、CAR+CD8+T_cm+(p＝0.0182)和第13天的CAR表达％(p＝0.0469)负相关。第9天在1：1E比T下的杀伤百分比与CAR+CD8+T_SCM+、CAR+CD8+Tim3-PD-1-(p＝0.0318)和CAR+CD4+T_SCM+(p＝0.0289)正相关。

实例3：含有不同慢病毒构建体的慢病毒的滴度分析

在此实验中，将慢病毒载体构建体引入病毒包装细胞系中，并且根据与实例1类似的方案，在Lentigen(Gaithersberg，MD)产生含有慢病毒的抗CD19 CAR并测定滴度。

通过测量病毒蛋白p24水平的物理滴度或通过测量转导滴度来评估慢病毒滴度。出人意料地发现，当安全开关RQR8从慢病毒构建体v1.0去除时，病毒滴度显著降低(比较表5中的v1.0与v1.1)。当将v1.1中的EF1a启动子替换为如v1.2中的短或截短的EF1a启动子(“EF1a(短)启动子”)时，滴度得到改善。

表5携带利妥昔单抗敏感和抗性CD19 CAR构建体的慢病毒的病毒滴度

¹TU＝转导单元

为了分析抗CD19 CAR v1.0、v1.2和v1.3的慢病毒制剂的稳健性，进行了病毒滴定测定。在第5天，在转导pan T细胞后，针对CAR+T细胞％分析v1.0、v1.2和v1.3的慢病毒制剂的连续体积稀释液。结果显示，在低稀释(例如，10％v/v)下，所有三种构建体都表现出相似的可接受的转导效率。然而，在增加稀释时(例如，3.3％，1.1％v/v)，与其它抗利妥昔单抗抗CD19 CAR构建体v1.2相比，抗抗利妥昔单抗抗CD19 CAR构建体v1.3的转导效率下降更显著。参见图12。选择构建体v1.2用于体内分析。

实例4：体内效价测定

在此实验中，与小鼠肿瘤模型中的ALLO-501v1.0相比，分析了ALLO-501v1.2的体内抗肿瘤效价。将携带荧光素酶报告基因的CD19阳性Raji细胞注射到NSG小鼠中。将含有v1.0或v1.2慢病毒构建体的慢病毒转导到两种供体541和604的pan T细胞中。经由尾静脉注射用100,000个荧光素酶Raji细胞接种NSG小鼠。在接种后第4天，将携带Raji的NSG小鼠以指定剂量投予CAR构建体。通过腹膜内注射荧光素酶底物，随后测量累积荧光素酶信号来评价Raji植入和进展。结果绘示于图13A(供体541)和图13B(供体604)中。

尽管已描述关于多种应用、方法、试剂盒和组合物的所公开的传授内容，但应了解，可在不脱离本文中的传授内容和以下所要求的发明的情况下做出多种变化和修改。提供上述实例以较好地阐明所公开的传授内容并且不打算限制本文中呈现的传授内容的范围。虽然已在这些示例性实施例方面描述本传授内容，但所属领域的技术人员将容易理解在不过度实验情况下这些示例性实施例的大量变化和修改是可能的。所有此类变化和修改都在现有传授内容的范围内。

SEQ ID NO.图表