具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种创制番茄远缘杂交后代技术和方法，特别是科学评估方法。所述番茄远缘杂交是指番茄种间的有性杂交，本发明中所述的远缘杂交指以野生醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)作花粉亲本(父本)与栽培番茄e9292(S.lycopersicum)有性杂交获得F₁代，F₁代自交获得F₂代群体，每个F₂单株自交采种获得F₃代(F₂代家系)。

本发明所述番茄野生种和栽培种并不限于本发明所述番茄野生种和栽培种，应视为(Solanaceae)茄属(Solanum)番茄族(Lycopersicon)番茄种的全部。

本发明提供了一种确定番茄远缘杂交后代属性技术和方法，所述的确定番茄远缘杂交后代属性技术和方法是指基于番茄表型和分子标记的遗传多样性确定杂交后代与亲代(父、母本)差异及杂交后代的属性。

本发明提供了一种番茄远缘杂交后代的表型遗传决定于遗传物质因素——广义遗传力方法，基于杂交后代及亲本表型测量数值，可以通过数学方法求得；据此可以估算表型在不同世代选择效率。

本发明提供了一种评估番茄远缘杂交后代表型遗传倾向性方法，基于所述远缘杂交后代表型及亲本间测量值，用数学的统计学方法进行显著性分析，确定所述杂交后代(F1)表型遗传倾向性(所偏向亲本)。

本发明提供了一种针对番茄重要代谢产物，所述代谢产物影响番茄重要农艺性状形成，所述代谢产物可以通过植化方法萃取和相应仪器进行含量测定，并用分子生物学技术解析所述代谢途径因远缘杂交事件而影响代谢产物的分子调控机制。本发明所述的重要代谢产物是指番茄红素，其含量决定番茄的果色；所述类胡萝卜素含量可用超高效色谱法(Ultra-performance Convergence Chromatography，UPC²)分析测定，所述类胡萝卜素合成途径关键基因表达分析用RT-qPCR(Real Time–Quantitative PCR analysis)技术，所述表达结果用于解析远缘杂交对胡萝卜素合成影响。本发明所述的重要农艺性状不仅限于本发明远缘杂交事件对例举番茄红素累积影响，应视为对番茄营养生长、生殖生长、花和果实发育及果实品质形成相关的次生代谢物生物合成。

本发明提供了一种用远缘杂交技术创制抗/耐盐(NaCl)和旱(甘露醇/Mannitol，C6H14O6)等生物/非生物逆境胁迫的番茄新种质，本发明不限于所例举抗/耐盐(NaCl)和旱(甘露醇/Mannitol)新种质，应理解为远缘杂交对番茄抗/耐生物(病、虫)/非生物(涝、风、冷和光)等。

本发明提供了一种前述远缘杂交在番茄种质创新、遗传改良和新品种培育领域中应用。

本发明所述番茄黄果突变体e9292(yellow fruited tomato 3，yft3，Solanumlycopersicum)和野生型红果醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium，LA1585)分别由以色列希伯来大学Dani Zamir教授(http://zamir.sgn.cornell.edu/mutateds)和美国加州大学戴维斯分校(UC Davis)番茄遗传中心(https://tgrc.ucdavis.edu/)Chetelat R T教授惠赠。黄果番茄突变体yft3(e9292)是红果番茄cv.M82(S.lycopersicum)种子用甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate，EMS)化学诱导所得。李文贞博士经分析确认黄果番茄突变体yft3番茄红素含量比野生型M82低。随后黎宇航和赵伟华构建了野生醋栗番茄LA1585与e9292杂交突变群体，F1代小型红果番茄，分离F₂代包括红果和黄果番茄，自交获得，取其中10个F₂单株自交获F₃代家系(5个红果家系和5个黄果家系，每个家系混合取样进行分析作为F₂代结果)；对番茄远缘杂交群体(亲本、F1和F2家系)进行研究。

种质资源匮乏的番茄(S.lycopersicum)作为当下全球重要的果、蔬兼用作物，其野生资源是番茄遗传改良取之不竭基因库，对创制番茄新种质和遗传改良具有巨大潜力。本发明所述野生醋栗番茄(LA1585)作父本与栽培番茄(e9292)杂交，构建了F₁和F₂群体；根据果色、叶形和CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)标记明确了远缘杂交番茄的杂交属性。分析F₁代44个表型发现，22个倾/偏向于LA1585；6个倾/偏向于e9292；16个表型属二亲本中间类型。基于38个有遗传多样性表型系统进化分析，将供试的13个番茄材料分成两组：其中，F₂-328、F₂-266和F₂-253和F₂-318与e-9292归为一组；而F₂-332、F₂-299、F₂-259、F₂-330、F₂-292、F₂-280、F₁与LA1585归为一组。

品质分析发现，F₂-280、F₂-299和F₂-332的Vc含量呈现出超优亲LA1585优势；F₂-280和F₂-332番茄红素含量也表现出超优亲LA1585优势。F₂-280、F₂-292、F₂-299、F₂-328和F₂-332果糖/葡萄糖表现为超优亲e9292优势。F₂-259、F₂-328和F₂-332糖/酸也表现为超优亲e9292优势。Vc、总可溶性固形物(TSS)、类胡萝卜素、果糖、葡萄糖、柠檬酸及果实硬度的广义遗传力依次为99.92％、75.06％、94.87％、96.98％、94.36％、87.31％和93.93％，说明用远缘杂交途径改良番茄品质后代选择有很高的可信度。盐和旱胁迫实验显示，F₂-266和F₂-299表现出对盐和甘露醇胁迫的不敏感性。可见，本发明通过远缘杂交途径创制了批量的优质、抗逆番茄新种质，并对所述新种质进行了科学评，进而为包括番茄在内种子植物用远缘杂交手段创制新种质提供了方法论和理论参考；具有重大理论创新和应用前景。

本发明提供了一种用番茄野生种——醋栗番茄，通过与栽培番茄进行有性杂交创制了批量的番茄新种质，所述新种质可用于番茄进行遗传番茄如品质和抗逆改良提供了技术和科学评估方法。

具体见以下实施例：

实施例1：植物材料来源及远缘杂交种创制

番茄黄果突变体e9292(S.lycopersicum，系红果cv.M82经EMS诱变所得)和醋栗番茄(S.pimpinellifolium,LA1585)分别由以色列希伯来大学Dani Zamir教授(HebrewUniversity of Jerusalem，http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants)和美国加利福尼亚大学戴维斯分校番茄遗传资源中心(Tomato Genetics Resource Center,University ofCalifornia at Davis)Chetelat教授惠赠。以e9292作母本与LA1585杂交。在授粉前一天下午，选发育良好e9292大花蕾去雄，次日(最好晴天)上午(约9.00时)取LA1585当日花花粉授粉。果实完熟后剖取种子洗净于阴干处风干，置阴凉处/或冰箱(-20℃)保存备用。F₁自交创制F₂群体，基于分离世代F₂群体，在田间选择有代表性黄果和红果家系各5个，自交授粉获得F3代种子。

实施例2：番茄催芽和生长条件

13份番茄[e9292、LA1585、F₁(e9292×LA1585)和10个F₂(e9292×LA1585)家系)种子温汤(45℃温水)浸种1小时，随后室温浸种5小时取出后在25℃恒温培养箱(天呈实验仪器制造有限公司，上海，中国)暗黑条件下催芽。种子露白(胚根露出)后，播种于装有湿润育苗土(品氏托普园艺有限公司，上海，中国)的60孔(5×12，1粒/孔)塑料穴盘中(启航花木园艺场，江苏宿迁，中国)。小苗在日光温室(管理按昼28℃/夜20℃)生长至四片真叶展开，定植于上海交通大学浦江绿谷实验基地(闵行区浦江镇联跃路188号)标准日光温室(121°30'10.89”E，31°3'5.20”N，海拔5m)。株、行距为40cm×70cm，田间管理与普通番茄一致。

实施例3：番茄远缘杂交属性确定

在分析表型(果色和叶形)基础上，基于番茄数据库TOMATO-EXPEN 2000(https://solgenomics.net/)图谱分子标记TG294(第8号染色体)序列，用Fultonet al.(1995)方法提取番茄基因组DNA作模板，用引物TG294F:5'-attggctgcaatgatggatt-3'(SEQ ID NO:3)和TG294R:5'-ctaagcaggacggccatcta-3'(SEQ ID NO:4)进行PCR扩增，测序后设计CAPS(CleavedAmplified Polymorphic Sequence)标记；Xmn I酶切和电泳分离分析，确认e9292、LA1585及其不同远缘杂交世代杂种属性。

1.番茄基因组DNA提取

1)田间分别选取番茄野生型LA1585及突变体yft3植株的幼嫩叶片，放入事先加入400μL CTAB提取缓冲液(加2％体积β-巯基乙醇)的1.5mL EP管中；带回实验室后，补加300μL CTAB提取缓冲液，加入2粒干净的钢珠，在组织研磨仪55Hz 90sec将样品磨碎，之后将样品放入65℃的水浴锅中加热30min，每隔5min颠倒混匀一次。

2)待EP管降低至室温在通风橱中加入等体积(700μL)氯仿：异戊醇(V:V＝24:1)，颠倒混匀；

3)混均样品在10000g离心机上离心10min，并吸取400μL上层水相至干净1.5mL EP管中；

4)加入800μL-20℃预冷无水乙醇，颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清并用70％乙醇洗涤收集DNA 3次；离心去痕量乙醇并置通风橱内晾干至无乙醇味；

5)加入50μL ddH₂O溶解DNA样品，并添加入1U的RNA水解酶A 37℃水浴30min消解RNA；

6)DNA样品分别取1μL用Nanodrop 2000测定A260/A230、A260/A280、浓度(ng/μL)和取2μL加入6×loading buffer，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用于后续分析。

2.CAPS标记分析

基于番茄分子标记TG294序列，设计引物TG294F:5'-attggctgcaatgatggatt-3'(SEQ ID 3)和TG294R:5'-ctaagcaggacggccatcta-3'(SEQ ID NO:4)，分别用上述所提取LA1585和yft3番茄基因组DNA为模板，在KOD FX酶催化下扩增，反应体系如下：

将上述PCR反应物充分混均后，在T100^TM PCR仪(Bio-Rad生命医学产品有限公司，加利福尼亚州，美国)中进行扩增反应。反应参数为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，68℃延伸(1kb/min)，35个循环；最后68℃延伸10min。PCR产物加6×loadingbuffer混匀在1％的琼脂糖凝胶上在1×TAE(Tris-acetate-EDTA)中电泳分离，在UVP凝胶成像系统(UVP公司，加利福尼亚州，美国)下检测并回收靶条带，委托铂尚生物技术(上海)有限公司测序。根据测序结果设计CAPS标记。然后分别以醋栗番茄LA1585、yft3、F₁和10个F₂家系番茄共13个家系番茄基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用Xmn I酶切和电泳分离，根据条带多态性确定不同世代远缘杂交番茄的杂种属性(图1)。

实施例4：番茄表型性状及其遗传学分析

参照Anonymous(1996)方法，观察和调查13份番茄材料(e9292、LA1585、F₁和10个F₂代家系)表型性状。其中包括19个质量性状(株型、株形；叶形、叶片着生、叶色、叶脉色、叶缺刻和茸毛着生；花柱类型、簇生花、花梗离层、花色、花序类型；果面茸毛、果顶形状、果肉色、果色、果形、果面棱沟)和25个数量性状(株高、茎粗；叶长、叶宽；第一花序节位、第二花序节位、单花序花数、花萼数、花瓣数、花药数、花萼长、花瓣长、花药长、花柱长；单果重、果肉厚、心室数、果实纵径、果实横径、果形指数、果柄长；种子长、种子宽、种子厚和种子千粒重)(图6、7、8)。基于所调查数据分析遗传特征(遗传力和变异系数)和系统进化分析。其中，用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)软件包进行统计分析遗传特征(表1和表2)。用gplots(R 3.2.2version)(http://mirror.bjtu.edu.cn/cran/andHelpFilehttp://docs.ggplot2.org/current/index.html)软件包的heatmap.2功能构建系统进化树的热图(heat-map)(图2)。

广义遗传力(hB)由公式1-1给出

MSg，组间均方；MSe，组内均方；n₀，有效观测重复次数；Vg，遗传方差；Ve＝MSe，为环境方差。

变异系数由公式1-2给出：

c_v，变异系数；σ，标准差；μ，平均值。

表1不同遗传型番茄品质性状广义遗传力和变异系数

注：ld，极低检出水平；gv,genetic variance；ev,environmental variance；sd，standard deviation；hb,broad-sense heritability；cv,coefficient of variation

表2 F₁(e9292×LA1585)世代表型性状遗传倾向

注：表中数据为五个生物学重复的平均值，“±”后的数值为标准差；小写字母表示在P<0.05水平上进行Duncan’s test测验。右侧中的大写字母指具有不同遗传背景的番茄，并且W指wild tomato LA1585，C是cultivated tomato e9292，M意思为LA1585和e9292中间类型。

实施例5：番茄品质性状分析

Vc含量参照食品安全国家标准GB5009.86-2016的2,6-二氯靛酚滴定法(Jones&Hughes,1983)。总可溶性固形物(total soluble solid,TSS)用日产手持式折光仪(PAL-1,ATAGO)测量。用带5cm圆柱探头的TA-XT plus质构仪(Stable Micro System,England)，采用2mm测距测定番茄果实顶端和赤道面硬度。类胡萝卜素含量测定参考Zhao et al.(2020)方法进行。用气相色谱-飞行时间质谱(gas chromatography-time of flight massspectrometry,GC-TOFMS)测定番茄糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)和酸(柠檬酸、苹果酸、奎宁酸和琥珀酸)含量(Osorio et al.,2011)。上述实验除TSS(5个生物学重复外)，其余均为3个生物学重复。

1类胡萝卜素含量测定

1)类胡萝卜素提取

(1)采收yft3、LA1585、F1和F2(10个家系)绿熟期、破色期和红/黄熟期果实外果皮(赤道面)，避光条件下在液氮中研磨成粉末状。

(2)称取约500mg粉末加入到15mL硅化离心管中，用增重法确定样品质量；加入1.5mL甲醇，加60％KOH(W/V)至终浓度变6％(W/V)，充分混匀，将离心管置于60℃水浴锅中避光温浴30min。

(3)取出温度恢复到室温，向样品混合液中加1.5mL Tris缓冲液，充分混匀，4℃冰箱放置10min。

(4)然后冰浴，加4mL氯仿颠倒混匀，静置10min；在4℃离心机4000g离心10min。

(5)取下层有机相于一新15mL离心管中；水相中再加入4mL氯仿混匀萃取，重复步骤(4)，将两次有机相混合并用氯仿补足至10mL。

(6)取1.5mL有机相加入至2mL离心管，在SPD2010型离心浓缩仪(Thermo Fisher科技有限公司，马萨诸塞州，美国)中干燥。

2)类胡萝卜素测定

(1)干燥后的样品加入50μL甲基叔丁基醚(MTBE)溶解样品，待样品彻底溶解后，12000g离心10min。

(2)取上层液体于样品专用瓶，进样体积为1μL，利用高效合相色谱仪UPC²(Waters科技有限公司，马萨诸塞州，美国)测定类胡萝卜素，参照Li等(2015)设置参数，具体为：进样室温度保持在10℃，柱子选用ACQUITY UPC2 HSS C18 SB(100mm×3.0mm，1.8μm)，双相流动相由(A)CO2和(B)甲醇：乙醇(V：V)＝1:2组成，线性洗脱梯度为：0.5min，95％A+5％B；2min，70％A+30％B；5min，70％A+30％B；5.5min，95％A+5％B；7min,95％A+5％B。系统流量1.5mL/min，柱温45℃，背压22.9MPa；二极管阵列检测器(photo-diode array detector，PDA detector)探测波长在210nm到500nm之间，补偿波长在210nm到280nm之间。

3)标准曲线制作

(1)用甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether，MTBE)溶解番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、叶黄素标品，标品制备成系列浓度梯度(5μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，250μg/mL，500μg/mL)；

(2)标品按照浓度从低到高顺序进样，测定完成后，建立浓度依存峰面积标准曲线，用于求算样品不同类胡萝卜素浓度。

总类胡萝素含量结果显示，F₁(127.11μg/g FW)属于居间类型，不过倾向于野生亲本LA1585(200.48μg/g FW)；F₂世代的F₂-280(235.45μg/g FW)和F₂-332(267.63μg/gFW)表现出超优亲优势(图9)。

实施例6：类胡萝卜素合成途径关键基因表达

用植物总RNA试剂盒(天根生物科技有限公司，北京，中国)提取7份(e9292、LA1585、F₁代和4个F₂代家系F₂-266，F₂-299，F₂-318和F₂-332)番茄红/黄完熟期(Red/Yellowrepining stage,RR/YR)果皮(3个生物学重复)总RNA。用反转录试剂盒(5×PrimeScriptRT Master Mix)合成cDNA第一链，用RNA-free water稀释50倍作模板，以ACTIN(GenBankaccession:BT013524)作内参基因。参照Zhao et al.(2020)方法用RT-qPCR分析CRTISO(carotenoid isomerase)、CYCB(lycopeneβ-cyclase)、DXR(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase)、DXS(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase)、HDR(4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase)、IDI1(IsopentenyldiphosphateΔ-isomerase 1)、LCYE(lycopeneε-cyclase)和PSY1(phytoene synthase 1)转录表达。其中，上述各基因表达定量分析对应的引物为：ACTIN-F:5'-ttgctgaccgtatgagcaag-3'(SEQ ID NO:7)和ACTIN-R:5'-ggacaatggatggaccagac-3'(SEQID NO:8)；DXS-F:5'-aagaggaaatgggatcggtgta-3'(SEQ ID NO:9)和DXS-R:5'-agccactctctccccctcaa-3'(SEQ ID NO:10)；DXR-F:5'-cttaggcgcattatattaactgcat-3'(SEQ ID NO:11)和DXR-R:5'-gtggcagaatcaacagtaatctttt-3'(SEQ ID NO:12)；HDR-F:5'-cgggatgcctaaggctaaactcc-3'(SEQ ID NO:13)和HDR-R:5'-ctggtcagattcttccg-3'(SEQID NO:14)；IDI1-F:5'-ccaatataaggggagaagcagaag-3'(SEQ ID NO:15)和IDI1R:5'-ggaaacggcaacggagagag-3'(SEQ ID NO:16)；PSY1-F:5'-tggcccaaacgcatcatata-3'(SEQID NO:17)和PSY1-R:5'-caccatcgagcatgtcaaatg-3'(SEQ ID NO:18)；CRTISO-F:5'-ttttggcggaatcaactacc-3'(SEQ ID NO:19)和CRTISO-R:5'-gaaagcttcgctcccacag-3'(SEQID NO:20)；LCYE-F:5'-actggatttagtggtaatcggctgt-3'(SEQ ID NO:21)和LCYE-R:5'-agttgtttgtgaaaggaagatcagg-3'(SEQ ID NO:22)；CYCB-F:5'-tgttattgaggaagagaaatgtgtgat-3'(SEQ ID NO:23)和CYCB-R:5'-tcccaccaatagccataacatttt-3'(SEQ ID NO:24)。

结果显示，MEP途径中，远缘杂交事件F₁番茄的DXS和DXR表达水平大幅度提升，暗示远缘杂交事件促进了F₁番茄中丙酮酸与3-磷酸甘油醛缩合，显著加速了C5的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)合成。特别是HDR和IDI1在F₂-332中mRNA累积水平显著高于二亲本e9292和LA1585、F₁代和其余的3个F₂代红果家系，促进了活性的DMAPP合成，大幅度提升了其番茄红素含量(251.30μg/g FW)，约是野生亲本LA1585(174.39μg/g FW)的1.5倍。在类胡萝卜素合成途径，F₁番茄PSY1、CYCB和CYCB的mRNA累积水平显著高于亲本yft3和LA1585，黄果yft3番茄红素含量得以显著改良，F₁番茄红素含量(109.51μg/g FW)也表现出倾向LA1585遗传趋势。F₂-332果实CRTISO和CYCB表达水平显著高于二亲本e9292和LA1585、F₁和F₂代其它家系，F₂-332番茄红素含量在7个遗传型番茄中居首位(图3和图9)。

实施例7：植物抗逆性分析

用75％乙醇(1min)和20％次氯酸钠(10min)对6份番茄(yft3、LA1585、F₁、F₂-266、F₂-299和F₂-332)种子灭菌，无菌水冲洗(至少5次)去净痕量次氯酸钠。然后播种于上覆湿润3M无菌滤纸的MS₀固体培养基(4.44g/L MS，30％蔗糖和0.26％植物凝胶；pH＝5.8)上催芽。选取种子发芽进度基本一致的种子分别播种不同甘露醇(0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L)和氯化钠(0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L)MS₀梯度培养基方形皿中(3个生物学重复)。在25℃(light/dark＝16h/8h)条件下垂直培养，连续6天(每天时间点相同)用imageJ软件测量小苗根和下胚轴生长情况，并拍照记录。结果显示，F₂-266和F₂-299表现出对盐和甘露醇胁迫不敏感的抗/耐逆性的新种质(图4和图5)。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 远缘杂交技术创制番茄新种质的方法及其在番茄改良中应用

<130> KAG47576

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 901

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

attggctgca atgatggatt ccagtctttg aattcggggt cgccgaatcc aaacgttctc 60

attggagcca tcgtgggtgg tcctgatagt agagataact ttgaagatga caggaacaat 120

tatcagcaat cggagcctgc tacatacatt aatgctccac tagttggggc ccttgctttc 180

ttatccgcac caaattaaag tagtagtgga tggagtcaca taatttatta actaaagtaa 240

gtgttgtagc agaagatgag gatcaagaaa tcagtatggt cccgtggtag ctcaacataa 300

ttgtaaaatg aaggttacac atttaggtcc ttctatgcat gtaagcaaga ggaattcctt 360

ggtggtttcc taggaatgtt aagacccttg gtatgaattt ccagacttat tattcacata 420

ttccaaattg aatactcagc cagcaattac aatgaatttc ttgtagaatc ataaatcagt 480

aagtaactaa gaggcaacac tcgaaaaatg aaacatttat cttgggaaaa tgaatataat 540

ctgctctatt agaatcactt acgcatgctt taagttgcca actatcaaag ttgaatttgg 600

attattttct tgttcaattc aactcatagg acttgttcct gtacgacatg taactctatt 660

tttcttgagc acatgaacag aacttaaatc ttatccttgt ttcaattagt ttaactgtta 720

aatcaacacc aaagttttca ataccactgg aagatgacca tgataaactc aatggataat 780

gattgatgat ttgagaatca cttgatagtt gttgtttaac tatcgctttc atatttataa 840

gcactgatgg aagtctatta cacatagctt caaatgtaat gtagatggcc gtcctgctta 900

g 901

<210> 2

<211> 901

<212> DNA

<213> 醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)

<400> 2

attggctgca atgatggatt ccagtctttg aattcggggt cgccgaatcc aaacgttctc 60

attggagcca tcgtgggtgg tcctgatagt agagataact ttgaagatga caggaacaat 120

tatcagcaat cggagcctgc tacatacatt aatgctccac tagttggggc ccttgctttc 180

ttatccgcac caaattaaag tagtagtgga tggagtcaca taatttatta actaaagtaa 240

gtgttgtagc agaagatgag gatcaagaaa tcagtatggt cccgtggtag ctcaacataa 300

ttgtaaaatg aaggttacac atttaggtcc ttctatgcat gtaagcaaga ggaattcctt 360

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aagtaactaa gaggcaacac tcgaaaaatg aaacatttat cttgggaaaa tgaatataat 540

ctgctctatt agaatcactt acgcatgctt taagttgcca actatcaaag ttgaatttgg 600

attattttct tgttcaattc aactcatagg acttgttcct gtacgacatg taactctatt 660

tttcttgagc acatgaacag aacttaaatc ttatccttgt ttcaattagt ttaactgtta 720

aatcaacacc aaagttttca ataccactgg aagatgacca tgataaactc aatggataat 780

gattgatgat ttgagaatca cttgatagtt gttgtttaac tatcgctttc atatttataa 840

gcactgatgg aagtctatta cacatagctt caaatgtaat gtagatggcc gtcctgctta 900

g 901

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attggctgca atgatggatt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaagcagga cggccatcta 20

<210> 5

<211> 356

<212> DNA

<213>醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)

<400> 5

attggctgca atgatggatt ccagtctttg aattcggggt cgccgaatcc aaacgttctc 60

attggagcca tcgtgggtgg tcctgatagt agagataact ttgaagatga caggaacaat 120

tatcagcaat cggagcctgc tacatacatt aatgctccac tagttggggc ccttgctttc 180

ttatccgcac caaattaaag tagtagtgga tggagtcaca taatttatta actaaagtaa 240

gtgttgtagc agaagatgag gatcaagaaa tcagtatggt cccgtggtag ctcaacataa 300

ttgtaaaatg aaggttacac atttaggtcc ttctatgcat gtaagcaaga ggaatt 356

<210> 6

<211> 545

<212> DNA

<213>醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)

<400> 6

ccttcgtggt ttcctaggaa tgttaagacc cttggtatga atttccagac ttattattca 60

catattccaa attgaatact cagccagcaa ttacaatgaa tttcttgtag aatcataaat 120

cagtaagtaa ctaagaggca acactcgaaa aatgaaacat ttatcttggg aaaatgaata 180

taatctgctc tattagaatc acttacgcat gctttaagtt gccaactatc aaagttgaat 240

ttggattatt ttcttgttca attcaactca taggacttgt tcctgtacga catgtaactc 300

tatttttctt gagcacatga acagaactta aatcttatcc ttgtttcaat tagtttaact 360

gttaaatcaa caccaaagtt ttcaatacca ctggaagatg accatgataa actcaatgga 420

taatgattga tgatttgaga atcacttgat agttgttgtt taactatcgc tttcatattt 480

ataagcactg atggaagtct attacacata gcttcaaatg taatgtagat ggccgtcctg 540

cttag 545

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgctgaccg tatgagcaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggacaatgga tggaccagac 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagaggaaat gggatcggtg ta 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agccactctc tccccctcaa 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttaggcgca ttatattaac tgcat 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtggcagaat caacagtaat ctttt 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgggatgcct aaggctaaac tcc 23

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctggtcagat tcttccg 17

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccaatataag gggagaagca gaag 24

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggaaacggca acggagagag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tggcccaaac gcatcatata 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caccatcgag catgtcaaat g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttttggcgga atcaactacc 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaaagcttcg ctcccacag 19

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

actggattta gtggtaatcg gctgt 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agttgtttgt gaaaggaaga tcagg 25

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgttattgag gaagagaaat gtgtgat 27

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcccaccaat agccataaca tttt 24