本发明涉及一种从生产河豚毒素的副产品-河豚鱼内脏油中分离制备四种高纯度多不饱和脂肪酸单体的方法。在用乙醇从河豚鱼内脏提取生产河豚毒素时,产生大量的河豚鱼内脏油副产品；本发明利用这些河豚鱼内脏油分离制备高纯度的二十碳四烯酸(Arachdonic acid,ARA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)四种多不饱和脂肪酸单体；本发明利用河豚毒素生产中的副产品分离制备高纯度、高价值的多不饱和脂肪酸多不饱和脂肪酸单体,具有很高的经济价值；为多不饱和脂肪酸,特别是DPA的制备提供了一种新的来源；本发明的分离制备方法简单,制备过程中使用的溶剂可回收重复使用,无“三废”排放。