阅读说明：本技术 器官纤维化的预防和治疗 (Prevention and treatment of organ fibrosis ) 是由 R·西尔弗 于 2019-01-09 设计创作，主要内容包括：本公开提供了一种治疗器官纤维化的方法,所述方法包括向罹患器官纤维化的患者施用c-P4H抑制剂以抵抗病理性纤维化。c-P4H抑制剂可通过各种途径施用,包括使用喷雾器以气雾化状态施用、静脉内注射、腹膜内注射或皮下注射。(The present disclosure provides a method of treating organ fibrosis, the method comprising administering to a patient suffering from organ fibrosis an inhibitor of c-P4H to combat pathological fibrosis. The c-P4H inhibitor can be administered by various routes including administration in an aerosolized state using a nebulizer, intravenous injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection.)

具体实施方式

仅为示例性的，并不作为限制。

实施例

实施例1：肺成纤维细胞摄取肥大细胞外泌体会刺激胶原合成和分泌：激活成纤维细胞的新方式

已发现，成纤维细胞和肥大细胞在组织中极为接近(图1B)。肥大细胞脱落粒子，即外泌体，其尺寸为20-100nm并且含有RNA和蛋白质。利用质谱分光光度法分析肥大细胞外泌体蛋白含量显示，肥大细胞外泌体含有涉及纤维化发生的蛋白质，如膜联蛋白2和c-P4H的β亚基。如图1A中所示，与肥大细胞外泌体一起孵育的成纤维细胞使外泌体内化。重叠透射光和荧光图像的代表性显微照片(图1A)显示，肥大细胞外泌体(绿色点)被成纤维细胞内化(透射光)。内化后，外泌体激活成纤维细胞，分泌出新形成的胶原(图1C)。激活早在24小时的时候就发生(P<0.01)，并且在48小时(P<0.05)直至72小时(P<0.001)的时候继续激活以刺激人肺成纤维细胞胶原的产生和分泌(图1C)。

实施例2：肥大细胞外泌体和TGF-β作为添加剂通过不同路径激活肺成纤维细胞。

将人肺成纤维细胞的外泌体激活作用与经典的TGF-β1对人肺成纤维细胞的刺激作用相比较。TGF-β1刺激的人肺成纤维细胞胶原分泌与外泌体诱导的胶原分泌遵循不同的时程，具有48小时的时间滞后。外源添加TGF-β1使人肺成纤维细胞在72小时的时间点大量分泌胶原(P<0.05)(图2A相对于图1B)。

将人肺成纤维细胞与外泌体一起孵育并将TGF-β1作为添加剂，其中分别与TGF-β1单独(P<0.05)或外泌体单独(P<0.01)相比较，暴露于外泌体和TGF-β1二者的人肺成纤维细胞中胶原的分泌明显较多(图2B)。

为了确定TGF-β1和外泌体是否利用相同的信号传导路径刺激人肺成纤维细胞胶原分泌，对人肺成纤维细胞匀浆进行蛋白质印迹。正如预期，将人肺成纤维细胞暴露于TGF-β1引起SMAD的磷酸化。这在暴露于外泌体的人肺成纤维细胞中未观察到(图2C)。这些结果显示，如TGF-β1那样，外泌体也可刺激人肺成纤维细胞中分泌新合成的胶原，但具有不同时间进程。这表明在人肺成纤维细胞中激活胶原合成涉及不同的细胞内机制，这一点得到了SMAD结果的证实。

图1和图2中的结果指出一种新的纤维化发生路径，肥大细胞和成纤维细胞通过该路径在肺中连通，这代表了另一种阻断肺纤维化的治疗靶点。

实施例3：HIF PHD酶抑制剂阻断人肺成纤维细胞活性：胶原合成和分泌、增殖和迁移。

由于HIF PHD与c-P4H酶在结构上类似并且都属于2-酮戊二酸(2-OG)依赖性双加氧酶超家族，故推断充当2-OG类似物的HIF PHD拮抗剂也可阻断c-P4H酶活性，2-OG是从分子氧接受一个氧变成琥珀酸酯，此时第二个氧形成反式-4-羟基脯氨酸的辅因子。C-P4H是新形成的胶原的组装所必需的。

RXD及胶原分泌：利用人肺成纤维细胞进行的体外实验显示，RXD抑制未经处理的成纤维细胞、与肥大细胞外泌体共培养的成纤维细胞以及暴露于外源TGF-β1(胶原合成的经典诱导剂)的成纤维细胞中胶原的分泌(图3A)。呈现的值都针对总蛋白质归一化。

RXD及成纤维细胞增殖：图3B-3D中的数据显示，RXD也阻断TGF-β成纤维细胞增殖，如通过成纤维细胞的细胞裂解物的总蛋白质含量所确定：对照-0.800μg/ml/孔(图3B)对比+TGF-β1.138μg/ml/孔(图3C)对比+RXD+TGF-β0.828μg/ml/孔(图3D)。

RXD和成纤维细胞迁移/积累/病灶形成以及通过平滑肌肌动蛋白(SMA)进行的成 纤维细胞激活：定性数据也显示，RXD处理防止成纤维细胞迁移、积累和病灶形成(比较图3B-图3D)。蛋白质印迹显示，RXD还使得肺成纤维细胞中SMA的丰度减小(图3E)。

实施例4：HLF摄取MC-EXO通过不依赖Smad的路径刺激胶原合成

使用从正常废弃组织样本新鲜分离的HLF和从人肥大细胞瘤细胞(HMC-1)上清液收集的MC-EXO进行体外实验显示，如用倒置式落射荧光显微镜观察得到的，用染料PHK-67(荧光素-绿色)标记的MC-EXO被HLF摄取(图18A)。这一摄取是用共聚焦成像(图18B)确定，并且其显示标记的MC-EXO(CellVue Claret Far Red)局限于HLF中的内质网(ER)中，所述HLF使用Lipofectamine2000和作为ER的荧光标记物的mNeonGreen-KDEL瞬时转染(图18B-II)。在瞬时转染24小时之后，使细胞暴露于标记的MC-EXO 60分钟，接着在Zeiss ObservedSD转盘式共聚焦显微镜上成像。与代表性图像中相同，在HLF中(图18B-I、IV)和成功转染的HLF中MC-EXO摄取(红色)较强，出现在ER中。HLF的核用DAPI染色(图18B-III)。

不同于用TGF-β所观察到的结果，HLF摄取MC-EXO不会导致Smad磷酸化(图2C)或胶原1或胶原3基因表达的刺激(图18C)。然而，MC-EXO以及TGF-β使HLF产生的羟基脯氨酸含量(图18D)和胶原分泌增加(图18E)(72小时的时间点)。在平行实验中，将HLF与肺上皮细胞(EPI)EXO一起孵育不会增加胶原分泌(图1E红色柱-72小时的时间点)，表明HLF中EXO的摄取和胶原合成的刺激不是普遍现象。这些发现表明，HLF中MC-EXO的摄取以及肥大细胞外泌体内容物的释放影响胶原合成，同时绕过TGF-β-Smad-转录轴。

由于先前关于IPF药物疗法的大规模临床研究主要集中在TGF-β及其在成纤维细胞增殖和激活中的相关信号传导路径，故到目前为止，多数的临床试验证据表明，IPF药物疗法只是部分有益的。关于这些疗法的确切作用机制尚无足够的信息。本文所公开的结果显示，存在其它路径(如MC-EXO内容物跨细胞交换至HLF)，所述路径绕过纤维基因的转录而引起ER中胶原的合成(图18C)。在ER内胶原合成的细胞内事件由新合成的胶原多肽链中脯氨酸残基的翻译后修饰组成。这一必不可少的脯氨酸羟基化反应由限速酶胶原脯氨酰4-羟化酶(C-P4H)催化。

实施例5：RXD降低了c-P4H四聚体的相对表达，c-P4H四聚体是胶原P4H的催化活性形式，一种在新形成的胶原的合成中负责脯氨酰羟基化的酶。

据猜测，RXD抑制胶原形成的一种可能方式是减小催化活性c-P4H四聚体的丰度。本发明人通过用蛋白质印迹法探测c-P4Hα亚基，估算出单独的人肺成纤维细胞、与肥大细胞外泌体共培养的人肺成纤维细胞或与添加的外源TGF-β±RXD共培养的人肺成纤维细胞中c-P4H的相对丰度(图4)。

据观察，RXD使c-P4H四聚体(在240kD处的箭头)的相对表达减少约5％(Con对比RXD)；约55％(+外泌体(EXO)对比EXO+RXD)；约75％(+TGF-β对比TGF-β+RXD)。这些结果表明，RXD作用的一个方面是干扰c-P4H四聚体形成，由此中断原胶原的脯氨酸羟基化并防止新胶原形成。

实施例6：RXD充当肥大细胞稳定剂.

在浸泡肥大细胞(人肥大细胞瘤细胞)的上清液暴露于高氧24小时(80％)以及随后在室内空气中恢复2天(高氧恢复(HO^rec)和高氧恢复+RXD(HO^rec+RXD))之后，向其中添加RXD。通过测量β-已糖胺酶(β-hex)(图5A)和类胰蛋白酶(图5B)的释放来评估肥大细胞脱粒，β-已糖胺酶是肥大细胞脱粒的经典指示剂。RXD使肥大细胞稳定，由此可防止可能有害的肥大细胞产物的释放，这些肥大细胞产物(如纤维化类胰蛋白酶)可能引起肺损伤。本方案被设计成模拟向因急性恶化而住院的IPF患者提供高氧，随后回到室内空气的临床方案。

实施例7：肥大细胞依赖性成纤维细胞(FB)激活的模式。

图6显示肥大细胞在成纤维细胞胶原合成和分泌中的作用。该图的左侧分支显示促纤维化发生肥大细胞介体，如组胺、类胰蛋白酶、肾素/ANG II、TGF-β如何例如通过受体激活和SMAD信号传导路径来激活FB。受体介导的FB激活引起其增殖、迁移以及胶原合成和分泌的激活。另一分支代表本申请中所公开的新路径，并且显示含有促纤维化发生蛋白质的肥大细胞外泌体被相邻FB摄取，并且能够通过非SMAD路径刺激胶原合成和分泌。HIF PHD抑制剂，如RXD(红色柱)，阻断FB激活中的受体介导的路径和外泌体路径。

实施例8：RXD在肺纤维化博莱霉素实验模型中的作用。

使用8周龄的小鼠(C57BL/6J)以了解RXD是否抑制博莱霉素诱发的肺纤维化的发展。单次口咽施用博莱霉素，随后在第7天、第9天、第11天、第13天、第15天、第17天以及第19天(即表示纤维化增殖并确定纤维化的时间段)治疗性递送RXD(10mg/kg)。在第21天处死小鼠。博莱霉素使肺中羟基脯氨酸含量增加，但该含量在RXD存在下明显减少(图20A)。针对马松三色法染色的肺的组织学评估显示，RXD减轻由博莱霉素引起的纤维化的严重程度(比较图20E与图20D)。

实施例9：用RXD治疗在体内单侧输尿管阻塞(UUO)模型中减少了UUO中的肾纤维化。

所有动物治疗和实验都获得威尔康奈尔医学院(Weill Cornell MedicalCollege)实验动物管理和使用委员会的批准。通过腹膜内施用***(ketamine)(90mg/kg)与甲苯噻嗪(xylazine)(4mg/kg)的混合液来麻醉小鼠。在无菌条件下，通过腹部中线切口，用4-0丝质缝合线结扎小鼠(C57BL/6J)的右侧的单侧输尿管。假手术对照(CON)动物经历相同的手术，但仅处理右侧输尿管。在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天IP施用罗沙司他(10mg/kg)。在第14天处死小鼠。

收集肾并将其固定于10％中性缓冲***(formalin)中，随后包埋于石蜡中。收集切片(5μm)并使用试剂盒(Richard-Allen Scientific)进行马松三色法染色，以检测胶原(染成蓝色)。将石蜡化组织切片的载玻片脱蜡，再水化并在蒸馏水中洗涤。随后，使用三色染色法试剂盒中的组件，并根据制造商的方案对切片进行染色。在二甲苯中脱水并清洗之后，在Vectamount(Vector Laboratories)将这些切片封固于盖玻片中。用介接SPOTInsight 2百万像素彩色相机(Diagnostic Instruments)的倒置式落射荧光显微镜(NikonEclipse TE 2000-U)检查组织切片。

结果

用RXD治疗减少UUO中的肾纤维化。相较于对照肾切片(图16A和16D)，UUO肾(皮质和髓质)中胶原染色(蓝色)较为丰富(图15A、15B、16B和16E)。如在UUO肾皮质和髓质中所见，用RXD治疗减轻纤维化(图15C、15D、16C和16F)。

此外，还在多个高倍视野中，逐像素定量马松三色法染色的固定肾切片中的胶原(蓝色)染色。****P<0.0001，皮质UUO对比皮质UUO+RXD；以及髓质UUO对比髓质UUO+RXD。在RXD存在和不存在下对照皮质与髓质胶原染色之间无显著差异。N＝4只小鼠/组。参看图17。