用于制备谷物提取物的快速方法
阅读说明：本技术 用于制备谷物提取物的快速方法 (Rapid method for preparing cereal extracts ) 是由 索伦·克努森 芬恩·洛克 K·克鲁塞维奇 H·汤姆森 L·马里 T·文特 J·哈尔霍尔特 于 2018-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明大体上涉及谷物的水性提取物的发芽和制备(例如,通过打浆制备),包括用于生产啤酒的方法。因此,本发明提供了谷物的水性提取物的快速发芽和制备的方法。该方法显著加速了制备用于生产基于谷物的饮料的麦芽汁的过程,同时保持了制备具有低水平的β-葡聚糖的所述麦芽汁的潜力。本发明同样适用于其他谷物谷粒-包括水稻、高粱、玉米、小米和小麦-的水性提取物的发芽和制备,以及包含辅料的酿造工艺。(The present invention generally relates to the germination and preparation (e.g., by mashing) of aqueous extracts of cereals, including methods for producing beer. Thus, the present invention provides a method for rapid germination and preparation of an aqueous extract of cereal grains. The method significantly speeds up the process of preparing a wort for use in the production of a cereal-based beverage, while maintaining the potential to prepare said wort with low levels of beta-glucan. The invention is equally applicable to the germination and preparation of aqueous extracts of other cereal grains, including rice, sorghum, maize, millet and wheat, and to brewing processes involving adjuncts.)
技术领域
本发明大体上涉及谷物的水性提取物(例如，通过打浆(mashing)制备的)的发芽和制备，包括用于生产啤酒的方法。因此，本发明提供了用于谷物的水性提取物的快速发芽和制备的方法以及包括谷物的水性提取物的快速发芽和制备的用于生产饮料的方法。这些方法显著加速了制备用于生产基于谷物的饮料的麦芽汁的过程，同时保持了制备具有高水平的可发酵糖、优选具有低水平的β-葡聚糖和木聚糖的所述麦芽汁的潜力。本发明同样适用于其他谷物谷粒-包括水稻、高粱、玉米、小米和小麦-的水性提取物的发芽和制备，以及包含辅料的酿造方法。
背景技术
在商业麦芽制造(malting)过程中，大麦谷粒在受控条件下发芽或制成麦芽，这些条件允许淀粉胚乳的淀粉和蛋白质储备在4-6天的时间内部分动员。通常通过将干的大麦谷粒浸泡在水中来开始麦芽制造过程。这个过程被称为浸泡，其目的不仅是清洁谷粒，而且还将其水分含量提高到约40-45％(w/w)，以便使随后的胚乳动员步骤更快地发生。在浸泡期间，将水排出一次以使谷粒再通气。该步骤被称为“空气静置(air rest)”，并且被认为是必要的，主要是因为浸没的谷粒在约16小时后变得缺氧。在约8小时的“空气静置”之后，将谷粒重新浸泡在水中以在另外8小时的时间段内-或在一系列再浸泡步骤中完成浸泡处理。将干谷粒的水分含量增加到40％或更高的两步浸泡过程总共需要约32小时。在一些麦芽厂，使用喷雾浸泡技术。
将浸泡过的谷粒铺开进行发芽，在此期间，由糊粉和盾片上皮细胞分泌的酶-与淀粉胚乳细胞中预先存在的一些酶一起-降解细胞壁、淀粉和蛋白质。在正常的发芽条件下，植物激素赤霉酸(GA)被认为是在节点区域(nodal region)或胚胎的其他地方合成的，它由此处沿着水梯度扩散(Fincher，2011)。
麦芽制造者通常旨在快速地诱导谷粒中尽可能多的淀粉降解酶的合成。在许多商业麦芽制造方案中，添加GA以加速从糊粉层分泌酶的过程。淀粉降解酶-其包括α-和β-淀粉酶、淀粉脱支酶和α-葡萄糖苷酶-将谷粒的淀粉储备部分解聚为单糖、低聚糖和葡萄糖(Smith等人，2005；关于所述β-淀粉酶，值得注意的是，这些在谷粒发育期间沉积在淀粉胚乳中)。随后淀粉的解聚产物被酵母细胞用作碳源并发酵成啤酒乙醇。糖化力(diastaticpower)是一种麦芽制造质量参数，其是指该组淀粉降解酶的活性水平，具有酿造所需的高值。
大麦谷粒的其他主要组分包括贮藏蛋白质，其也存在于死亡的淀粉胚乳细胞中，并且包括大麦醇溶蛋白以及水和盐溶性蛋白质。这些蛋白质的解聚也在麦芽制造过程中自然开始，但酿造者可以管理这些蛋白质的降解程度，从而释放足够的肽和氨基酸以在啤酒厂的后续发芽步骤期间支持酵母生长。然而，如果贮藏蛋白质的降解过多，则释放的蛋白质会在酿造过程造成困难。特别地，高水平的释放的可溶性蛋白质能够沉淀并在最终啤酒产品中形成不希望的浑浊或增加啤酒储存期间Strecker醛形成的可能性。在麦芽制造质量的规范中，发酵期间酵母生长需要足够水平的游离氨基氮(FAN)。Kolbach指数是可溶性蛋白质：总蛋白质比率的量度，通常优选麦芽产生足够的Kolbach指数。因此，蛋白质降解的程度是麦芽制造者正在面临的挑战。除了可能与过量提取的蛋白质相关的啤酒沉淀问题之外，非常高的FAN水平也能够通过可能形成异味而造成困难。
麦芽制造者还试图诱导高水平的酶，其降解大麦谷粒中的细胞壁多糖，特别是(1,3；1,4)-β-葡聚糖和***糖基木聚糖。不完全降解的(1,3；1,4)-β-葡聚糖对于啤酒制造商来说尤其麻烦，因为它们可以以可溶形式从麦芽中提取出来，形成高粘度水性溶液，从而减缓啤酒厂中的过滤过程并导致在最终啤酒中出现不希望的浑浊。因此，低水平的可溶性(1,3；1,4)-β-葡聚糖代表了重要的麦芽制造质量参数，而高水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶仍然是麦芽质量的重要量度。
在受控的发芽步骤之后，干燥湿麦芽，使水分含量从约40％降至4至5％。这种干燥过程，称为入炉干燥，非常耗能，并且代表了该行业的主要成本。包括窑炉干燥在内的整个过程通常为6-7天。
由于多种原因，窑炉干燥被认为是啤酒生产的重要部分。一个重要原因是在发芽期间形成了小根(rootlet)(也称为“杆(culm)”)。小根具有苦味，这会影响啤酒的余味，此外，小根可能会给啤酒添加不希望的颜色(参见由Shokuhin Sangyo Shimbun出版的BeerBrewing Technology(1999):183以及US9,326,542)。一旦绿麦芽已进行了窑炉干燥，就可以例如使用除根机(deculmer)很容易地除去小根。根据D.E.Briggs的关于“Malts andMalting”的通用教科书，“必须去除杆[...]，因为它们极其吸湿，富含可溶性含氮物质，含有风味不佳和苦味的物质，并且能够富含二氧化硫和/或亚硝胺类。麦芽从窑炉中剥离以帮助其冷却后，并且在小根吸收空气中的水分而变得松弛和柔韧(不易碎)并因此更难以破碎和分离之前，应尽快进行除根”(D.E.Briggs，Malts and Malting；p695，第1版，1998，由Blackie&Professionals出版，London，ISBN0 412 29800)。
窑炉干燥的麦芽通常具有4.5-5.0％的水分含量。窑炉干燥的麦芽随后通过公路、铁路或海运从麦芽制造厂运输到啤酒厂。这涉及以下事实：麦芽制造和酿造过程传统上在不同的地点并且经常是由不同的公司实体进行的。
在啤酒厂中，碾磨窑炉干燥的麦芽以使谷粒破碎打开，并将所得的内容物在称为打浆的过程中用热水提取。提取的材料包括如上所述的部分降解的淀粉、蛋白质和细胞壁分子，并且这些物质被从麦芽中提取的内源谷粒酶进一步降解。在此阶段，一些酿酒商添加额外-且通常更便宜的碳源(辅料)-以支持随后的酵母发酵过程并抵消较高的麦芽成本。所述辅料可以是大麦、水稻、小麦或其他来自未发芽谷粒的谷物粉，但是它们的添加可能必须要伴随添加水解酶，因为麦芽中的内源酶不足以降解辅料的组分。添加的酶通常来自未纯化且相对便宜的真菌和/或细菌培养物提取物。在一些国家，特别是在啤酒必须在严格监管的环境下生产的国家，添加外源酶是不合法的。
淀粉和在热水中提取的其他胚乳组分的进一步降解在被称为糖化(saccharification)的过程中进行。在打浆之后，将提取物过滤，通常在过滤槽中进行，并冷却。提取物可以在啤酒花或啤酒花提取物的存在下煮沸，并且在冷却后，加入酵母培养物，用于将释放的糖发酵成乙醇。如此生产的啤酒通常在装瓶前成熟并过滤。啤酒也可以在装瓶前进行碳酸化。
本发明提供了由谷物的水性提取物生产饮料的方法，该方法包括用于发芽和制备谷物的水性提取物的快速方法。该方法显著加速了制备用于生产基于谷物的饮料的麦芽汁的过程，同时保持了制备具有高水平的可发酵糖，优选具有低水平的β-葡聚糖和木聚糖的所述麦芽汁的潜力。特别地，由所述麦芽汁制备的饮料可以以低水平的涩味为特征。
从本文的实施例、特别是实施例7中可以看出，与包括窑炉干燥的传统方法相比，根据本发明方法制备的麦芽汁和啤酒的一些重要特性保持不变。例如，未经窑炉干燥获得的啤酒的酒***平和真实发酵度类似于经窑炉干燥获得的啤酒的水平。同样，在颜色和泡沫水平方面也没有观察到显著差异。因此，本申请发明人表明，可以不经窑炉干燥即获得水性谷物提取物，其中所述提取物可以进一步加工成饮料，所述饮料的特性与经窑炉干燥得到的饮料的特性相当。
如本领域技术人员所知的，并且如上所述，由于多种原因，窑炉干燥的步骤已被认为是啤酒生产的重要部分，包括小根去除和减少异味。在本发明之前，不知可以省去窑炉干燥步骤。因此，本文描述的方法克服了本领域的偏见并解决了本领域中长期已知的问题。
本发明的一个方面涉及一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.通过包括以下步骤的方法制备水性提取物：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述细分的发芽的谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％；
从而获得谷物的水性提取物；
和
ii.将所述水性提取物加工成饮料。
在另一方面，本发明提供了用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒，其中所述发芽步骤包括将所述谷粒在水性溶液中孵育直到谷粒的水含量为至少30％，其中每小时使至少2L O2/kg干重谷物谷粒通过所述水性溶液；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述磨碎的细分的发芽谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％；
从而生产谷物的水性提取物。
在上述方法的一些实施方案中，整个发芽步骤的持续时间可以不超过96小时，其中发芽的持续时间是从发芽开始时测量的。发芽步骤可以进行72至108小时，例如大约96小时。或者，发芽步骤可以进行65至80小时，例如大约72小时。
在发芽步骤之后，本发明的方法包括细分发芽的谷物谷粒的步骤。本发明的一个特别有趣的方面是，本发明的方法允许在发芽后立即细分发芽的谷物谷粒。因此，该方法通常不包括干燥发芽的谷物谷粒的步骤。特别地，该方法不包括窑炉干燥发芽的谷物谷粒的步骤。如上所述，窑炉干燥的一个重要方面是允许容易地去除小根。在干燥之前，小根的去除很难完成。然而，根据本发明的方法制备的发芽的谷物谷粒具有显著减少的小根(通常少于6g/100g发芽的大麦(干重))，并且如本发明所示，窑炉干燥的步骤对于根据本发明的方法发芽的谷物而言是不需要的。因此，在优选的实施方案中，用于生产饮料的方法不需要窑炉干燥发芽的谷粒的步骤。在优选的实施方案中，生产水性谷物提取物的方法不需要窑炉干燥发芽的谷粒的步骤。
例如可以通过对发芽的谷物谷粒进行湿磨来细分发芽的谷物谷粒，然后例如通过如下文“制备水性提取物”部分中所述在预定温度下打浆持续任何合适的时间，进行制备水性提取物的步骤。在打浆期间通过添加外源酶的混合物可以促进释放的糖例如多糖和蛋白质的转化，所述外源酶催化淀粉、贮藏蛋白质和细胞壁多糖的降解。所述酶可以从大麦本身、从麦芽或从其他来源-或者从可从商业来源购买的真菌和/或细菌酶混合物中部分纯化。
因此，本发明可以通过消除麦芽的干燥来实现大量的节水，以及例如通过省略窑炉干燥步骤，实现大量的节能。另外，可以显著减少制备谷物谷粒的水性提取物所需的总时间以及因此显著减少在加工所述水性提取物之后制备饮料所需的总时间。通过本发明的快速方法可以节省高达50％的能源成本，这可以大大减少该行业的碳足迹。这是很重要的，由于在世界范围内大多数国家在减少麦芽制造和酿造行业的碳足迹方面具有不断增加的立法和税收压力。
此外，在可持续性背景下，本发明允许在现有的啤酒厂设备中进行啤酒的整个生产，从而几乎不需要额外的资本支出。
在所附的权利要求书中进一步定义了本发明。
附图说明
图1显示了微型麦芽制造(micromalting)过程的实例的示意图。
图2显示了在麦芽制造期间大麦突变体和参照谷粒的水吸收。
图3显示了麦芽制造期间大麦谷粒的根生长。还测量了样品的根生长，该样品在通气条件下在水中吸胀24小时，然后在空气中发芽24小时(24+24)。
图4显示了在突变体和参照成熟大麦谷粒(0)中和在1、2、3、4、5、6天的绿麦芽中以及在入炉干燥的麦芽(7天)中编码水解酶的基因的表达。还测量了样品中的酶活性，该样品在水中吸胀24小时，然后在空气中发芽24小时(24+24)。
图5显示了在麦芽制造期间在突变体和参照谷粒中测量的α-淀粉酶(a)、β-淀粉酶(b)和游离极限糊精酶(c)的活性。
图6显示了在突变体和参照成熟大麦谷粒(0天)和在1、2、3、4、5、6天时的绿麦芽中以及在入炉干燥的麦芽(7天)中的(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量。
定义
如本文所用，“一个(a)”可以指一个或多个，取决于使用它的上下文。
当在本文中相对于数值使用时，术语“大约(approximately)”和“约(about)”优选是指±10％，更优选±5％，还更优选±1％。
如本文所用，术语“氨基酸”是指蛋白氨基酸。优选地，蛋白氨基酸是由标准遗传密码编码的20个氨基酸之一。使用IUPAC一个和三个字母代码来命名氨基酸。
如本文所用，术语“对应于X的氨基酸”描述相对于参照多肽(例如SEQ IDNO:1的CsIF6)的氨基酸，给定多肽(例如，突变体CsIF6多肽)的氨基酸。在所述多肽和参照多肽之间比对之后，如果氨基酸与所述比对中的X在相同位置，则该氨基酸对应于X。
在指定核酸的上下文中，“编码(encoding)”或“编码(encoded)”是指包含用于转译成该指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸或多核苷酸可以在核酸的转译区域之内包含非转译序列，例如内含子，或者可以缺少这种干扰的非转译序列，例如在cDNA中。通过使用密码子来说明被编码的蛋白质的信息。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA的片段；它包括编码区之前和之后的区域(启动子和终止子)。此外，植物基因通常被内含子中断的外显子组成。
窑炉干燥(kiln drying)(或入炉干燥(kilning))是麦芽制造过程的一部分，是指干燥发芽的谷粒的步骤；所述谷粒也可以在发芽之前已经进行了浸泡步骤。窑炉干燥可以在常规温度下进行，例如至少75℃，例如80至90℃，例如80至85℃。窑炉干燥通常在升高的温度下进行。窑炉干燥过程的一个实例如下：在60℃下12小时；在68℃下3小时；在74℃下4小时；在80℃下3小时。窑炉干燥步骤将湿麦芽的水分含量或水含量从约40％降低到4％至5％。因此，窑炉干燥的麦芽的水含量为约4至5％。
“突变”包括基因的编码和非编码区中的缺失、***、替换、颠换和点突变。缺失可以是整个基因的缺失，或仅基因的一部分的缺失。点突变可以与一个碱基对的变化有关，并且可能例如导致提前终止密码子、移码突变、剪接位点突变或氨基酸替换。包含突变的基因可以被称为“突变体基因”。如果所述突变体基因包含突变并由此编码具有与野生型不同的序列的多肽，则所述多肽可以称为“突变体多肽”。
如本文所用，术语“辅料”是指在啤酒制备期间添加的富碳原料来源。辅料可以是未发芽的谷物谷粒，其可以与根据本发明制备的发芽的谷粒一起碾磨。辅料也可以是糖浆、糖等。
如本文所用，术语“芽(chit)”是指在谷物谷粒的发芽阶段期间可见的胚胎生长芽。
如本文所用，谷粒的术语“水含量”是指所述谷粒中H2O w/w的百分比。
如本文所用，术语“发芽的谷粒”是指已经发展出可见芽(优选至少1mm、例如至少2mm的芽)和可见茎的谷粒。
如本文所用，术语“开始发芽”是指水含量小于15％的大麦谷粒与足够的水接触以开始发芽的时间点。
除非另有说明，否则如本文所用，术语“β-葡聚糖”是指谷物细胞壁聚合物“(1,3；1,4)-β-葡聚糖”。
如本文所用，术语“(1,3；1,4)-β-葡聚糖合酶”应被认为是催化(1,3；1,4)-β-葡聚糖的合成以及任选地催化吡喃葡萄糖基单体的聚合的任何酶。例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖合酶可以是由CsIF基因编码的多肽或其功能同源物。
类似地，除非另有说明，否则本文所用的术语“木聚糖”是指谷物细胞壁聚合物“***糖基木聚糖”。
如本文所用，术语“窑炉干燥的麦芽(kiln dried malt)”和“入炉干燥的麦芽(kilned malt)”是指已通过窑炉干燥而干燥的发芽的谷物谷粒。窑炉干燥的麦芽的水含量通常为约4至5％。未经过窑炉干燥的麦芽称为“绿麦芽”。
如本文所用，术语“浸泡(steeping)”是指增加谷物籽粒(kernel)的水含量的过程。
如本文所用，术语“β-葡聚糖酶”是指具有使谷物β-葡聚糖解聚的潜力的酶。因此，除非另有说明，否则术语“β-葡聚糖酶”是指以(1,3；1,4)-β-和/或(1,4)-β-葡聚糖酶活性为特征的内切酶或外切酶或其混合物。
如本文所用，术语“木聚糖酶”是指具有降解木聚糖和***糖基木聚糖的主链和侧链的潜力的酶。因此，除非另有说明，否则术语“木聚糖酶”是指特征在于由一种或多种以下酶种类衍生的酶活性的一种酶或酶混合物：内切-1,4-木聚糖酶；外切-1,4-木聚糖酶；***呋喃糖苷酶；阿魏酸酯酶。
如本文所用，谷物谷粒的酶活性是指在由指定谷粒类型制备的面粉中测得的活性。例如，每克谷物谷粒10U/g的α-淀粉酶活性是指在衍生自所述谷物的1g面粉(干物质)的水性提取物中测量的所述α-淀粉酶活性(10U)。α-淀粉酶活性通过K-CERA 01/12(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。β-淀粉酶活性通过K-BETA3(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。极限糊精酶活性通过T-LDZ1000(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。
如本文所述的气体体积是指在1atm和20℃下所述气体的体积。
如本文所述的O2体积是指在1atm和20℃下O2的体积。在其中气体混合物中包含O2的本发明实施方案中，可以确定气体混合物的总体积，并且可以将O2的体积计算为由O2构成的总体积的百分比。举例来说，大气空气包含21％的O2。因此，如本文所用，大气空气中的O2的体积为大气空气总体积的21％。
详细描述
谷物谷粒
本发明的方法包括谷物谷粒发芽的步骤。
谷物谷粒可以是任何谷物的谷粒，例如选自大麦、水稻、高粱、玉米、小米、黑小麦、黑麦、燕麦和小麦的谷物。在本发明的优选实施方案中，谷物谷粒是大麦谷粒。所述谷粒可以是任何大麦品种的谷粒，例如本文下文“大麦”部分中描述的任何大麦品种。
谷物谷粒在发芽前可以具有相对较低的水含量。例如，谷物谷粒可以具有至多30％、优选至多20％、例如至多15％、例如5至15％的水含量。
在发芽之前，谷物谷粒可以已经过一个或多个抗微生物处理步骤。所述抗微生物处理可以是任何有用的抗微生物处理，其不会损害谷粒发芽的潜力。抗微生物处理例如可以是用一种或多种抗微生物剂进行的处理。所述抗微生物剂可以是任何抗微生物剂，其在所使用的浓度下对谷物谷粒没有毒性。例如，抗微生物剂可以是含氯化合物，例如次氯酸盐。该抗微生物剂也可以是过氧化物，例如过氧化氢和/或过乙酸。可用的商业抗微生物剂的非限制性实例包括
在本发明的一些实施方案中，通过在包含抗微生物剂的水性溶液中孵育谷物谷粒来进行抗微生物处理，因此抗微生物处理可以作为浸泡步骤的一部分来进行。在所述孵育之后，可以立即开始发芽步骤。因此，在这样的实施方案中，不需要改变水性溶液，并且相同的水性溶液可以用于抗微生物处理和浸泡步骤。当抗微生物剂是过氧化物(例如过氧化氢)时，尤其是这种情况。
可以优选在根据本发明的发芽步骤之前，所述谷物谷粒没有进行发芽。因此，可以优选谷物谷粒没有经过预发芽步骤。
如上所述，谷物谷粒可以是任何谷物谷粒。一些谷物谷粒包含外壳，而其他谷物谷粒是无壳的。在发芽步骤之前，可以对带壳的谷物谷粒进行处理以除去至少一部分的外壳。通常，如果使用无壳的谷物谷粒，则不需要去除外壳的处理。无壳的谷物包括例如无壳的大麦品种和小麦。
可以通过对谷物谷粒进行除去外壳的物理处理，从而对带壳的谷物谷粒进行处理以去除外壳。所述物理处理可以例如选自抛光、砂磨、剥离和平滑化。优选地，物理处理导致外壳损失。可以将外壳的损失确定为总体重量损失。因此，物理处理优选导致谷物谷粒总重量至少2％的损失，例如2％至7％的损失，优选至少3％的损失，例如3％至6％的损失。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的谷物并非仅通过实质上生物学方法获得。通过技术方法获得的植物的后代在本文中被认为不是仅通过实质上生物学方法获得的，因为亲本植株通过技术方法获得。
在一些实施方案中，谷物谷粒获自包含一种或多种突变的突变植物，其中所述突变是由化学和/或物理试剂诱导的。
大麦
在本发明的优选实施方案中，供本发明方法使用的谷物谷粒是大麦谷粒。
所述谷粒可以是任何大麦植物的谷粒。然而，在一些实施方案中，大麦植物可以包含一种或多种特定特征，例如，如本文下文所述的一种或多种特征。尽管在下文中单独讨论了各种特征，本发明的大麦植物可以具有这些特征的组合。
在本发明的一个实施方案中，大麦可以是无壳的大麦品种(var.)。在本发明中还包括大麦是具有天然薄壳的大麦品种，例如品种Admiral。例如，壳可以小于谷粒和壳总重量的7％。
大麦植物也可以是具有低水平的LOX活性的大麦植物。这样的大麦植物是本领域已知的，并且包括例如，在编码LOX-1的基因中携带突变的大麦植物。例如，大麦植物可以是在WO 02/053721、WO 2005/087934和WO 2004/085652中描述的在LOX-1基因中携带任何突变的大麦植物。
大麦植物也可以是在编码脂氧合酶1(LOX-1)的基因和/或在编码LOX-2的基因中携带突变的大麦植物。例如，大麦植物可以是在WO 2010/075860中描述的在LOX-1和LOX-2基因中携带任何突变的大麦植物。
大麦植物也可以是具有低水平的MMT活性的大麦植物。这样的大麦植物是本领域已知的，并且包括例如，在编码MMT的基因中携带突变的大麦植物。具体地，大麦植物可以是在WO 2010/063288中描述的在MMT基因中携带任何突变的大麦植物。大麦植物也可以是WO2011/150933中描述的任何大麦植物。
大麦植物也可以是以GA信号传导增强为特征的大麦植物。特别地，大麦植物可以是在编码DELLA蛋白的Slender1基因中携带突变的大麦植物。例如，大麦植物可以是携带由Chandler等人，2013，例如，在其中的表1中描述的任何突变的大麦植物。例如，大麦植物可以在Slender1基因中携带一个突变，从而导致编码突变体DELLA蛋白的突变体Slender1基因，其中所述突变体DELLA蛋白携带氨基酸编号46、490、280、268、271、277、231、481、282、277、227、485或237中的一个或多个的突变，例如选自G46E、S490F、R268H、G271D、A277T、V231M、R481H、V282F、A277T、G227E、S485F和C237Y的突变。氨基酸编号是相对于在Genbank登录号AK372064或AF035820(2013年2月4日的版本)下可获得的DELLA蛋白的序列提供的。
具有低水平的β-葡聚糖的大麦植物
如上所述，优选在打浆期间获得的水性提取物具有足够低的粘度以允许打浆混合物具有良好的过滤性。如上文也详细描述的，可溶性β-葡聚糖可以有助于水性提取物的高粘度。因此，在本发明的一些实施方案中，可能优选使用具有低水平β-葡聚糖的谷物植物-并且特别是大麦植物。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物的特征在于谷粒中具有低β-葡聚糖水平。在一个实施方案中，基于干重，谷粒中的所述β-葡聚糖水平为至多5％，例如1-5％w/w。在一个优选的实施方案中，基于干重，谷粒中的β-葡聚糖水平为至多3％，例如1-3％w/w。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物的特征在于谷粒中具有低β-葡聚糖水平。在一个实施方案中，谷粒中所述β-葡聚糖水平为野生型大麦植物(例如其他类似的野生型大麦植物，例如cv.Paustian的大麦植物)籽粒中的β-葡聚糖含量的至多60％，例如至多55％，例如30至60％。
在一个实施方案中，大麦植物可以具有低于检测水平的β-葡聚糖水平，例如没有β-葡聚糖。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物在编码β-葡聚糖合酶的任何基因中携带突变。所述基因例如可以是在US2012/0030784中阐述的编码SEQ ID NO:2的多肽的基因。例如，大麦植物可以是包含如US2012/0030784的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18所阐述的β-葡聚糖-缺陷基因的大麦。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物可以在CslF6基因中携带突变，导致减少的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。来自大麦(Hordeum vulgare)栽培品种Sloop的野生型纤维素合酶样CslF6多肽序列的序列在本文中作为SEQ ID NO:1提供。来自大麦(Hordeum vulgare)栽培品种Sloop的野生型纤维素合酶样CslF6(CslF6)完整编码序列的序列在本文中作为SEQ ID NO:2提供。除了本文中作为SEQ ID NO:1提供的序列之外，野生型CslF6多肽也可以具有SEQ ID NO:1的序列，其中第590位的氨基酸已被苏氨酸替换。因此，携带A590T多态性的SEQ ID NO:1的多肽也可以被认为是野生型CslF6多肽(Taketa等人，(2012))。
在一个实施方案中，大麦植物在CslF6基因中携带突变。该突变可以是影响CslF6mRNA和/或CslF6蛋白质表达水平的突变。在一个实施方案中，突变可以是导致所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽的突变。CslF6基因中的突变可以是CslF6基因的任何突变，例如缺失、***或点突变。在本发明的一个实施方案中，突变是CslF6基因的编码区中的点突变。在一个实施方案中，突变导致提前终止密码子。由所述突变体CslF6基因编码的突变体CslF6多肽可以是任何突变体CslF6多肽。特别地，突变体CslF6多肽可以在CslF6的任何一个膜定位结构域中包含一个氨基酸的替换。突变体CslF6多肽可以优选在膜定位结构域中包含以下替换中的一个或多个：
·非极性氨基酸替换为带电荷的氨基酸，即非极性氨基酸被带电荷的氨基酸替代；和
·极性氨基酸替换为非极性氨基酸，即极性氨基酸被非极性氨基酸替代。
在本发明的一个实施方案中，突变体CslF6多肽可以包含在CslF6的任何一个膜定位结构域中的一个氨基酸的替换，即，在任何一个膜定位结构域中的氨基酸可以被另一氨基替代。CslF6的膜定位结构域在本文表1中显示。
表1.CslF6蛋白中膜定位的氨基酸序列的定位
例如，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847替换为带电荷的氨基酸，即氨基酸847被带电荷的氨基酸替代。例如，所述替换可以是847位上的甘氨酸(G)替换为带负电荷的氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸；换句话说，847位上的甘氨酸(G)可以被带负电荷的氨基酸例如甘氨酸或天冬氨酸替代。优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847的替换之外，其中所述替换是847位上的甘氨酸(G)替换为谷氨酸(E)，即847位上的甘氨酸(G)被谷氨酸(E)替代。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
例如，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748替换为带电荷的氨基酸，即氨基酸748被带电荷的氨基酸替代。例如，所述替换可以是748位上的甘氨酸(G)替换为带负电荷的氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸，即，748位上的甘氨酸(G)可以被带负电荷的氨基酸例如谷氨酸或天冬氨酸替代。优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748的替换之外，其中所述替换是在748位上的甘氨酸(G)替换为天冬氨酸(D)，即748位上的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)替代。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
例如，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体Cs1F6包含氨基酸709替换为非极性氨基酸，即氨基酸709被非极性氨基酸替代。例如，所述替换可以是709位上的苏氨酸(T)替换为非极性氨基酸，例如亮氨酸或异亮氨酸，即709位上的苏氨酸(T)可以被非极性氨基酸，例如亮氨酸或异亮氨酸替代。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸709的替换之外，其中所述替换是在709位上的苏氨酸(T)替换为异亮氨酸(I)，即709位上的苏氨酸(T)被异亮氨酸替代。
突变体CslF6多肽也可以是全长CslF6多肽的片段。例如，突变CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6基因包含提前终止密码子从而编码截短的CslF6多肽外。优选地，突变体CslF6多肽可以由突变体CslF6基因编码，其中突变体CslF6基因具有SEQ ID NO:2，除了突变体CslF6基因在编码序列的2028位上的核苷酸鸟嘌呤(G)替换为腺嘌呤(A)从而产生终止密码子外；换句话说，2028位上的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)替代。因此，所得突变体CslF6多肽包含676位上的苏氨酸(T)替换为终止密码子(T676Stop)，即676位上的苏氨酸(T)。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
大麦植物可以在CslF6基因中携带任何突变。这种突变可能例如导致CslF6基因沉默，导致大麦谷粒具有极低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖(如Taketa等人，2011年所述)。大麦植物也可以是包含CslF6基因中的突变的m351突变体(如Hu等人，(2014)所述)，其导致(1-3,1-4)β-葡聚糖水平极低(<1.6％)。
为了本专利申请的目的，根据布达佩斯条约的规定将大麦植物(大麦(Hordeumvulgare))的种子命名为“突变体2”，其已保存在NCIMB Ltd.Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA Scotland。突变体2大麦植物于2018年11月12日保藏，登记号为NCIMB 43273。在一个实施方案中，大麦植物是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物(大麦(Hordeum vulgare))，登记号为NCIMB 43273，并且称为“突变体2”或其后代。因此，大麦植物可以是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物突变体2，其登记号为NCIMB 43273，或者其任何后代大麦植物，其中大麦植物携带HvCslF6基因(SEQ ID NO:2)的编码序列的核苷酸2243的G→A突变和/或其中所述大麦植物的HvCslF6基因编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸748的Gly→Asp突变的突变体HvCslF6蛋白。
谷物谷粒也可以是植物如突变植物的后代。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的大麦谷粒是来自大麦植物的谷粒，其并非仅是通过实质上生物学方法获得。通过技术方法获得的大麦植物的后代在本文中被认为不是仅通过实质上生物学方法获得的，因为亲本植株是通过技术方法获得的。
在转让给与本申请相同的申请人和具有相同的申请日期的题为“具有改善的细胞壁特性的谷物植物(Cereal plants with improved cell wall properties)”的共同未决申请中描述了用于获得这种植物的方法。
大麦植物也可以在任何其他基因(例如，调节基因)中携带突变，导致低水平的β-葡聚糖。
发芽
本发明的涉及水性谷物提取物的生产或由此类谷物提取物制备的饮料的生产的方法包括使谷物谷粒发芽的步骤。
谷物谷粒可以是本文上文在“谷物谷粒”、“大麦”和“具有低水平的β-葡聚糖的大麦植物”部分中所述的任何谷物谷粒。
发芽步骤可以包括一个或多个浸泡所述谷物谷粒的步骤和一个或多个使所述谷物谷粒发芽的步骤。浸泡和发芽的步骤也可以组合或部分地组合，使得浸泡和发芽同时发生或至少部分地同时发生。
如上文“谷物谷粒”部分所述，在开始发芽之前，该方法还可以包括将所述谷物谷粒去皮的初始步骤。所述去皮对于增强谷物谷粒的水吸收和随后的诱导发芽以及除去谷物谷粒表面上的潜在微生物可能是有益的。另外地或替代地，如上文“谷物谷粒”部分中所述，也可以通过使谷物谷粒进行一个或多个抗微生物处理步骤而在发芽之前除去谷物谷粒上的微生物。
可以通过技术人员已知的任何常规方法进行浸泡。进行浸泡是为了增加谷粒的水含量并由此开始发芽。浸泡通常包括一个或多个在潮湿条件下孵育谷物谷粒的步骤，例如通过将谷物谷粒浸没在水性溶液中。
一个非限制性实例涉及在交替的干燥和潮湿条件下进行浸泡。浸泡可以在任何可用的温度下进行，例如在10至25℃范围内的温度下，例如在大约15℃下进行。
例如，在浸泡期间，可以将谷物谷粒湿孵育30分钟至10小时，然后干孵育30分钟至24小时，并可以任选地在潮湿和/或干燥条件下重复所述孵育2至5次。浸泡后的最终水含量可以为例如40％至50％。
另一个非限制性实例涉及浸泡，其中将谷物谷粒湿孵育以获得32至37％、例如约35％的水含量。这样的湿孵育可以持续例如5至12小时，例如5至10小时，然后干孵育12至30小时，例如15至20小时。然后，可以将谷物谷粒湿孵育以获得约37至43％、例如大约40％的水含量。这可以通过湿孵育2至10小时、例如3至7小时来实现。湿孵育之后，可以进行另外的干孵育10至30小时，例如15至25小时。最后，可以将谷物谷粒湿孵育以达到43-47％、例如约45％的水含量。这可以通过湿孵育1至10小时、例如1至5小时来实现。图1概述了浸泡过程的一个非限制性实例。
在一个实施方案中，所述浸泡或所述湿孵育可以至少部分地在通风下进行。因此，可以将所述谷物谷粒在水性溶液中在气流下孵育，例如同时使O2通过水性溶液。气流可以例如是下文描述的任何气流。在另一个实施方案中，所述浸泡是在没有通风的情况下进行。
谷粒的发芽可以通过技术人员已知的任何常规方法进行。一个非限制性实例涉及在10至25℃范围内、例如在13至18℃范围内的温度下发芽，任选地随变化的温度，持续1至4天。在发芽期间，可以使谷物谷粒处于潮湿条件下，以保持所需的水含量，例如40％至45％的水含量。
另外，例如，如下面更详细地描述的，谷物谷粒可以在发芽期间经受气流。
图1显示了发芽的一个非限制性实例。所述潮湿条件可以通过将水性溶液喷雾到所述谷物谷粒上而获得。潮湿条件也可以通过使潮湿空气流通过发芽中的谷物谷粒而获得。
所述气流可以是可以支持发芽的任何足够的气流。技术人员将能够确定足够的气流，例如基于Briggs等人，1998年或Kunze，2014年，技术酿造和麦芽制造(TechnologyBrewing and Malting)。气流可以是包含O2或甚至由O2组成的任何气体流。在一个实施方案中，气流可以为每小时每千克谷物谷粒至少2L、优选至少3L、更优选至少4L、还更优选至少5L、甚至更优选至少6L的O2。所述谷物谷粒的重量为干重。例如，气流可以为每小时每千克谷物谷粒(干重)2至100L、例如2至75L、例如2至50L、例如4至100L、例如4至75L、例如4至50L、例如6至100L、例如6至75L、例如6至50L的O2。气流通常可以是大气空气形式。因此，气流可以为每小时每千克谷物谷粒至少10L、优选至少15L、更优选至少20L、还更优选至少25L、甚至更优选至少30L的大气空气。所述谷物谷粒的重量为干重。例如，气流可以为每小时每千克谷物谷粒(干重)10至500L、例如10至375L、例如10至250L、例如20至500L、例如20至375L、例如20至250L、例如30至500L、例如30至375L、例如30至250L的大气空气。
在一个实施方案中，本文所述的用于生产水性谷物提取物或用于生产由其衍生的饮料的方法的整个发芽步骤的持续时间不超过108小时。在一个实施方案中，发芽步骤不超过96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行48至108小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行72至108小时，例如大约96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行65至80小时，例如大约72小时。
本发明的一个方面是，发芽的持续时间从开始发芽时测量，例如，发芽的持续时间可以测量为从开始发芽直到细分发芽的谷物谷粒开始为止。
在一些实施方案中，在发芽后，谷物谷粒具有至少30％、优选至少35％、更优选至少40％、例如40％至45％的水含量。在一些实施方案中，谷物谷粒在发芽后具有至少30％的水含量，例如至少31％、例如至少32％、例如至少33％、例如至少34％、例如至少35％、例如至少36％、例如至少37％、例如至少38％、例如至少39％、例如至少40％、例如至少45％、例如至少46％、例如至少47％、例如至少48％、例如至少49％、例如至少50％。
谷物谷粒的水含量可以通过测定谷物谷粒的重量，然后干燥所述谷物谷粒以及测定干燥的谷物谷粒的重量来确定。湿谷物谷粒和干谷物谷粒的重量差被认为是水，并且水含量被提供为水的重量除以谷物谷粒(湿谷物谷粒)的总重量。水含量也可以通过将开始发芽之前的谷物谷粒的重量与发芽期间或之后的谷物谷粒的重量进行比较来确定，其中将发芽的谷物谷粒进行短时间离心以除去任何表面水。因此，以％提供的水含量为w/w％。
谷物谷粒的发芽可以在任何可用的温度下进行。然而，可以优选谷物谷粒在至少10℃的温度下发芽。特别地，谷物谷粒可以在10至25℃、优选12至25℃、例如15至20℃范围内的温度下发芽。
在一些实施方案中，例如如WO2016/071463中所述，可以在发芽步骤期间添加一种或多种外源酶。可以任选地通过添加一种或多种能够加速发芽的化合物来缩短发芽过程。例如，可以添加植物激素赤霉酸(GA)-在孵育开始或在孵育期间。GA“激活”其靶细胞即大麦谷粒的糊粉和盾片上皮中的基因表达，包括编码水解淀粉、贮藏蛋白质和细胞壁多糖所必需的内源酶的基因。
谷物谷粒优选地在发芽后基本上立即进行细分。因此，本发明的方法优选在发芽步骤和细分谷物谷粒之间不包括干燥步骤。优选的是，本发明的方法不包括将所述发芽的谷物谷粒进行窑炉干燥的步骤。
发芽的谷物谷粒
本发明涉及一种用于生产饮料的方法和一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括生产发芽的谷物谷粒的步骤。
发芽的谷物谷粒优选包含一种或多种水解酶活性，例如由α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉脱支酶(例如，极限糊精酶)、α-葡糖苷酶和蛋白酶提供的。
通常，水解酶活性的开始可以以及时协调的方式发生，因此一些水解酶的活性可以用作其他水解酶活性的标志物。
因此，优选的是，发芽的谷物谷粒具有足够水平的可测量的α-淀粉酶活性。优选地，发芽的谷物谷粒具有至少30U/g、例如至少50U/g、例如至少100U/g谷物谷粒(干重)的可测量的α-淀粉酶活性。α-淀粉酶活性优选根据标准方法，例如，通过使用来自爱尔兰Megazyme的Ceralpha试剂盒(K-CERA)来确定。具体地，可以如下文实施例5中所述测定α-淀粉酶活性。
还可以优选发芽的谷物谷粒具有足够水平的可测量的β-淀粉酶活性。优选地，发芽的谷物谷粒具有至少5U/g、例如至少10U/g谷物谷粒(干重)的可测量的β-淀粉酶活性。优选地，β-淀粉酶活性根据标准方法，例如，通过使用来自爱尔兰Megazyme的Betamyl试剂盒(K-BETA3)来测定。特别地，可以如下文实施例5中所述测定β-淀粉酶活性。
还优选的是发芽的谷物谷粒具有足够水平的极限糊精酶活性。优选地，发芽的谷物谷粒具有至少2mU/g、例如至少5U/g、例如至少10U/g、例如至少20U/g谷物谷粒(干重)的极限糊精酶活性。优选地，极限糊精酶活性是根据标准方法，例如通过使用来自爱尔兰Megazyme的极限糊精酶试剂盒T-LDZ1000来确定。特别地，极限糊精酶活性可以如下文实施例5中所述测定。
有趣的是，与常规的绿麦芽相比，根据本发明的发芽的谷物谷粒具有显著减少的小根。因此，根据本发明的发芽的谷物谷粒优选包含每100g发芽的大麦至多10g小根，例如每100g发芽的大麦至多8g小根，优选每100g发芽的大麦至多6g小根，甚至更优选每100g发芽的大麦至多4g小根，其中小根的质量和发芽的大麦的质量均以干重形式提供。优选地，如下文实施例3中所述确定小根的质量。
如上所述，优选在打浆期间获得的水性提取物具有足够低的粘度以允许打浆混合物具有良好的过滤性。如上文也详细描述的，可溶性β-葡聚糖可以有助于水性提取物的高粘度。过滤性可能经常取决于β-葡聚糖的水平。因此，可以优选发芽的谷物谷粒中的β-葡聚糖的水平不太高。
优选地，发芽的谷物谷粒具有的β-葡聚糖含量低于5％，例如低于3％w/w，例如低于2％w/w，例如低于1.5％w/w，优选低于1.0％w/w，基于干重。
细分发芽的谷物谷粒
本发明的用于生产饮料的方法和用于生产谷物的水性提取物的方法，其中所述方法包括细分发芽的谷物谷粒的步骤。
在将所述谷物谷粒细分时，它们优选仍具有高水含量，优选地，所述谷物谷粒的水含量为至少20％，例如不小于25％，例如不小于30％，优选不小于35％，例如不小于40％。在一些实施方案中，谷物谷粒在发芽后直至细分谷物谷粒的任何时候的水含量都不小于30％，例如不小于31％，例如不小于32％，例如不小于33％，例如不小于34％，例如不小于35％，例如不小于36％，例如不小于37％，例如不小于38％，例如不小于39％，例如不小于40％，例如不小于45％，例如不小于46％，例如不小于47％，例如不小于48％，例如不小于49％，例如不小于50％。
例如，发芽的谷物谷粒可以直接从发芽转移到用于细分谷物谷粒的设备中。因此，发芽的谷物谷粒在进行细分时的水含量可以与谷物谷粒在发芽后立即具有的水含量(例如，上文在“发芽”部分中所述的水含量)相同。特别地，该方法通常不包括通过经受升高的温度来干燥发芽的谷物谷粒的步骤。优选地，在发芽后和细分所述谷物谷粒之前的任何时间，发芽的谷物谷粒的水含量不小于20％，例如不小于25％，例如不小于30％，优选不小于35％，例如不小于40％。因此，该方法优选地不包括窑炉干燥发芽的谷物谷粒的步骤。
可以使用适合于细分水含量大于20％、例如不小于25％、例如不小于30％、优选不小于35％、甚至更优选不小于40％、还更优选不小于45％的谷物谷粒的任何设备对发芽的谷物谷粒进行细分。例如，可以对发芽的谷物谷粒进行碾磨，例如湿磨。用于碾磨发芽的谷物谷粒的可用的碾磨机包括可从USA的Millstar获得的碾磨机。也可以对发芽的谷物谷粒进行研磨。
通常，将谷物谷粒细分到一定程度，使得可以制备谷物谷粒的可发酵糖的水性提取物。因此，谷物谷粒被充分地***，使得1kg所述细分的谷物谷粒的7L水性提取物具有至少8°Plato的比重。
在本发明的实施方案中，其中水性提取物由发芽的谷物谷粒和一种或多种辅料制成，也可以对所述辅料进行细分。特别地，当所述辅料包含未发芽的谷物谷粒时可能是这种情况。可以在单独的程序中对所述辅料进行细分，例如碾磨。然而，在本发明中还包括对辅料与发芽的谷物谷粒一起进行细分。类似地，如果水性提取物由发芽的谷物谷粒和窑炉干燥的麦芽制成，则可以在单独的程序中对所述窑炉干燥的麦芽进行细分，例如碾磨。然而，在本发明中还包括对窑炉干燥的麦芽与发芽的谷物谷粒一起进行细分。
制备水性提取物
本发明的方法还包括制备细分的发芽的谷物谷粒的水性提取物的步骤。所述步骤可以例如是，打浆步骤。
通常，可以通过在水中或在水性溶液(在本文中也称为“打浆溶液”)中孵育细分的谷物谷粒来制备上述水性提取物。打浆溶液可以是任何水性溶液，但它通常由水(例如自来水)组成，可以向其中添加一种或多种另外的试剂。为了与在发芽期间添加的另外的试剂进行区分，这些另外的试剂可以称为“另外的打浆剂”。因此，打浆溶液可以由水(例如，自来水)组成，向其中添加一种或多种另外的打浆剂。打浆剂可以从一开始就存在于打浆溶液中，或者它们可以在制备水性提取物的过程期间加入。
所述另外的打浆剂可以是酶。因此，打浆溶液可以包含一种或多种酶。所述酶可以从过程开始时或之后在过程期间添加到打浆溶液中。
所述酶可以例如是一种或多种水解酶。合适的酶包括脂肪酶、淀粉降解酶(例如，淀粉酶)、葡聚糖酶[优选(1-4)-和/或(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶]、和/或木聚糖酶(例如，***糖基木聚糖酶)、和/或蛋白酶，或包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultraflo或Ondea Pro(Novozymes)。例如，打浆溶液可以包含一种或多种水解酶，其中至少一种水解酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，打浆溶液包含以下酶中的一种或多种：
-β-葡聚糖酶，例如内切-(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶。
-木聚糖酶，例如内切-或外切-1,4-木聚糖酶、***呋喃糖苷酶或阿魏酸酯酶
-α-淀粉酶
-支链淀粉酶或极限糊精酶
-葡糖淀粉酶。
是否向打浆溶液中添加酶，以及添加何种酶的决定，可能取决于所用的谷物谷粒。因此，在本发明的实施方案中，其中谷物是具有低水平的β-葡聚糖的大麦植物(例如，如本文上文“大麦”部分中所述)，则可以向打浆溶液中添加很少的β-葡聚糖酶或不添加β-葡聚糖酶。
在一个实施方案中，优选在打浆期间不添加外源蛋白酶。蛋白酶的添加可能不太优选，因为蛋白酶可能影响酶活性。在一个实施方案中，优选在打浆期间不添加外源脂肪酶。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间每克发芽的谷物谷粒(干物质)使用至多700U、优选至多350U的外源葡糖淀粉酶。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间每千克发芽的谷物谷粒(干物质)使用至多400AGU、优选至多200AGU的外源葡糖淀粉酶。AGU的确定可以如US7060468中所述进行。
在另一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间使用的组合的外源葡糖淀粉酶和α-淀粉酶不超过700U、优选不超过350U/g发芽谷物谷粒(干物质)。组合的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶活性可以例如使用K-CERA 01/12(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间使用每千克发芽的谷物谷粒(干物质)至多20U的外源支链淀粉酶或极限糊精酶。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间使用每千克发芽的谷物谷粒(干物质)至多100PUN的支链淀粉酶。PUN的测定可以如US7060468中所述进行。
所述另外的打浆剂也可以是辅料，例如未发芽的谷物谷粒、糖浆或糖。如果添加了辅料，这些辅料也可以已经例如通过碾磨或研磨进行了细分。如果辅料是谷物谷粒，例如尚未发芽的谷物谷粒，则通常可以对其进行细分或碾磨。如果辅料是糖浆、糖等，则对这些通常不进行碾磨。可以在该过程中的任何时间将诸如糖或糖浆的辅料添加到打浆溶液中；然而，也可以将此类辅料添加到水性提取物中或者在如下所述的制备饮料的过程期间稍后进行添加。通常，以比发芽的谷物谷粒少的量添加辅料。因此，水性提取物中至少50％、优选至少70％、例如至少90％的碳水化合物来源于发芽的谷物谷粒，而辅料优选仅占碳水化合物的一小部分。如果辅料是未发芽的谷物谷粒，则优选的是如根据干重测定的，发芽的谷物谷粒占总谷物谷粒的至少50％(w/w)，优选至少70％(w/w)，更优选至少90％(w/w)。
另外的打浆剂也可以是窑炉干燥的麦芽。如果添加了窑炉干燥的麦芽，其也可以已经例如通过碾磨或研磨进行了细分。通常，以比发芽的谷物谷粒少的量添加窑炉干燥的麦芽。因此，如根据干重测定的，发芽的谷物谷粒(即未经过窑炉干燥的发芽的谷物谷粒)占总谷物谷粒和麦芽的至少80％(w/w)，优选至少90％(w/w)，更优选至少95％(w/w)。在优选的实施方案中，不添加窑炉干燥的麦芽。
所述另外的打浆剂，优选具有食品级品质，也可以是盐，例如CaCl2。
所述另外的打浆剂也可以是酸，优选为食品级酸，例如H3PO4。
通常，通过在一个或多个预定温度下将细分的发芽的谷物谷粒在打浆溶液中孵育来制备水性提取物。所述预定的温度在本文中也可以称为“打浆温度”。所述打浆温度可以例如是用于打浆的常规温度。
通常使打浆温度保持恒定(等温打浆)，或逐渐升高，例如以顺序方式升高。在任一种情况下，细分的发芽的谷物谷粒中的可溶性物质都释放到所述打浆溶液中，从而形成水性提取物。
打浆温度通常为30至90℃、例如40至85℃、例如50至80℃范围内的温度。可以根据所使用的谷物类型选择打浆温度。因此，在本发明的实施方案中，其中谷物谷粒是不存在或具有低水平的脂氧合酶(LOX)活性和/或甲基蛋氨酸转移酶(MMT)活性的大麦(参见下文“大麦”部分中的详细信息)，打浆温度可以较低，例如在35至69℃的范围内。
在打浆溶液中孵育可以进行任何合适的时间量。在打浆容器中的打浆溶液中孵育的时间可以例如为60至300分钟，例如60至240分钟，例如90至300分钟，例如90至240分钟，例如90至270分钟。例如，所述在打浆溶液中孵育的时间可以是常规打浆中使用的任何时间。合适的打浆的一个非限制性示例是：
(1)在50-60℃范围内、例如大约55℃的温度下调浆(Mashing-in)，10至30分钟，例如大约15分钟。
(2)加热到60至70℃范围内、优选60至65℃范围内、例如大约62℃的温度，30至90分钟，例如大约60分钟。
(3)加热到70至75℃范围内、例如大约72℃的温度，5至30分钟，例如大约15分钟。
(4)加热到75至80℃范围内、优选75至78℃范围内、例如大约78℃的温度，5至15分钟，例如大约10分钟。
在打浆容器中在打浆溶液中孵育之后，打浆溶液中的细分的发芽的谷物谷粒可以转移到另一个容器(例如，过滤槽)中，并在升高的温度下孵育另外的时间，例如在70至78℃范围内的温度下持续30至120分钟的时间。
因此，除了上述步骤外，在打浆溶液中孵育还包括以下步骤(5)：
(5)加热到70至78℃范围内、优选75至78℃范围内、例如大约78℃的温度，30至120分钟，例如大约60分钟。
非限制性实例可以在酿造文献中找到，例如，Briggs等人(同上)和Hough等人(同上)。
优选的是，打浆步骤不包括煮沸细分的谷物谷粒。换句话说，在水或水性溶液中孵育细分的谷物提取物期间，温度始终保持低于沸点。然而，在分离水性提取物与废谷粒之后，可以将水性提取物煮沸。通常，在远低于沸点温度的温度下，通常在低于90℃、例如低于85℃、例如低于80℃的温度下进行制备细分的发芽的谷物谷粒的水性提取物的步骤。
在打浆溶液中孵育后，通常可以将水性提取物例如通过过滤分离为水性提取物和残留的未溶解的固体谷粒，后者也称为“废谷粒”。过滤例如可以在过滤槽中进行。或者，过滤可以是通过打浆过滤器过滤。如此获得的水性提取物也可以称为“第一麦芽汁”。
在也称为喷洒(sparging)的过程期间，可以将其他液体(例如水)添加到废谷粒中。在喷洒和过滤后，可以获得“第二麦芽汁”。可以通过重复该程序制备进一步的麦芽汁。
因此，水性提取物可以是麦芽汁，例如第一麦芽汁、第二麦芽汁、进一步的麦芽汁或其组合。
水性提取物
通过本发明的方法制备的水性提取物可以具有许多有用的性质，包括-但不限于-本部分中描述的性质。通过本发明方法制备的水性提取物可以如本文所述在饮料中进一步加工。
如上所述，可以对水性提取物进行过滤步骤。因此，可以优选，麦芽汁具有良好的过滤性。例如，过滤高粘度液体可能在技术上具有挑战性-水性提取物具有低粘度可能是优选的原因。
可以以多种方式确定过滤性。在一个实施方案中，将过滤性确定为通过配备有滤纸的过滤漏斗过滤1小时后获得的液体量。在一个实施方案中，当将包含100g细分的谷物谷粒的400mL打浆溶液加入到所述过滤漏斗中时，水性提取物可以具有至少250mL的过滤性。还可以将过滤性确定为如上所述过滤60分钟后获得的液体体积与添加到所述漏斗中的水性提取物的液体体积相比的百分比。因此，在一个实施方案中，过滤性可以例如为至少50％，例如至少60％(v/v)。具体地，可以如国际专利申请PCT/EP2017/065498的实施例3中所述确定过滤性。
过滤性可能经常取决于β-葡聚糖的水平。因此，可以优选，β-葡聚糖的水平不太高。例如，在一个实施方案中，水性提取物可以包含至多200mg/L、优选至多150mg/L的β-葡聚糖。
在一些实施方案中，谷物的水性提取物不包含类黑精。
谷物谷粒的水性提取物的生产方法
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒，其中所述发芽步骤包括将所述谷粒在水性溶液中孵育直到谷粒的水含量为至少30％，其中每小时使至少2L O2/kg干重谷物谷粒通过所述水性溶液；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述碾磨的细分的发芽谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％；
从而生产谷物的水性提取物。
在一个实施方案中，发芽步骤可以包括一个或多个浸泡步骤。可以优选，整个发芽步骤的持续时间不超过108小时，例如可以不超过96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行72至108小时，例如大约96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行65至80小时，例如大约72小时。
本发明的一个方面是，从开始发芽时测量发芽的持续时间。
在一个实施方案中，发芽的结束可以是细分发芽的谷粒的开始。
应当理解，术语“在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％”包括例如所述谷物谷粒在从步骤b)的完成到步骤d)的开始的任何时候都可以具有高于20％的水含量。
用于制备谷物的水性提取物的本发明方法不包括在上述步骤b)和d)之间的任何时间进行窑炉干燥的步骤。在一些实施方案中，该方法不包括在上述步骤b)和c)之间的任何时间进行窑炉干燥的步骤。在其他实施方案中，该方法不包括在步骤c)和d)之间的任何时间进行窑炉干燥的步骤。如上所述，这是因为本发明人惊奇地发现，可以省去窑炉干燥的步骤，并且可以在对发芽的谷粒不进行窑炉干燥的情况下获得水性谷物提取物，特别是适合于生产饮料的提取物。从实施例3中可以看出，根据本发明方法发芽的大麦谷粒的根生长令人惊讶地显著降低；因此，可以省去窑炉干燥的步骤。
谷物谷粒可以是本文上面描述的任何谷物谷粒。在一个实施方案中，大麦植物是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物(大麦(Hordeum vulgare))，登记号为NCIMB43273，并被称为“突变体2”；或其后代。因此，大麦植物可以是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物突变体2，其登记号为NCIMB 43273，或者其任何后代大麦植物，其中所述大麦植物携带HvCslF6基因(SEQ ID NO:2)的编码序列的核苷酸2243的G→A突变和/或其中所述大麦植物的HvCslF6基因编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸748的Gly→Asp突变的突变体HvCslF6蛋白。
谷物谷粒也可以是植物如突变植物的后代。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的大麦谷粒是来自大麦植物的谷粒，所述大麦植物并非仅是通过实质上生物学方法获得。通过技术方法获得的大麦植物的后代在本文中被认为不是仅通过实质上生物学方法获得的，因为亲本植株是通过技术方法获得的。
在转让给与本申请相同的申请人并具有相同的申请日期的题为“具有改善的细胞壁特性的谷物植物(Cereal plants with improved cell wall properties)”的共同未决申请中描述了用于获得这种植物的方法。
重要的是，本发明方法在发芽后的任何时间不需要窑炉干燥的步骤，即在发芽后、在碾磨或细分发芽的谷粒后或在制备水性提取物后不进行窑炉干燥。因此，在优选的实施方案中，本发明方法在直到获得谷物的水性提取物的任何时间不包括窑炉干燥的步骤，所述谷物的水性提取物可用于例如通过酿造来制备饮料。
在一些实施方案中，通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中所含氨基酸的水平与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中包含的氨基酸水平相当。在一些实施方案中，通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的氨基酸水平为500至3000mg/L，例如600至2900mg/L，例如700至2800mg/L，例如800至2700mg/L，例如900至2600mg/L，例如1000至2500mg/L，例如1100至2400mg/L，例如1200至2200mg/L，例如1300至2100mg/L，例如1400至2000mg/L。在一些实施方案中，通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的氨基酸水平为至少500mg/L，例如至少600mg/L，例如至少700mg/L，例如至少800mg/L，例如至少900mg/L，例如至少1000mg/L，例如至少1250mg/L，例如至少1500mg/L，例如至少1600mg/L，例如至少1700mg/L，例如至少1800mg/L，例如至少1900mg/L，例如至少2000mg/L。氨基酸水平代表水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的总氨基酸水平，例如如在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选地如上文所述在发芽48小时至108小时后测量的。测量氨基酸水平的方法是技术人员已知的。
通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中存在的可发酵碳水化合物的水平与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中存在的可发酵碳水化合物的水平相比优选保持不变。在一些实施方案中，可发酵碳水化合物的水平(即，所有可发酵碳水化合物的总和)为5至20mg/100mL，例如6至19mg/100mL，例如7至18mg/100mL，例如8至17mg/100mL，例如9至16mg/100mL，例如10至15mg/100mL，例如10至14mg/100mL，例如11至13mg/100mL，例如约12mg/100mL。在一些实施方案中，通过本发明方法制备的麦芽汁的可发酵碳水化合物的水平为至少5mg/100mL，例如至少6mg/100mL，例如至少7mg/100mL，例如至少8mg/100mL，例如至少9mg/100mL，例如至少10mg/100mL，例如至少11mg/100mL，例如至少12mg/100mL，或更多。可发酵碳水化合物的水平代表水性谷物提取物如麦芽汁中的总可发酵碳水化合物的水平，例如在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选地如上所述在发芽48小时至108小时后测量的。测量可发酵碳水化合物的水平的方法是技术人员已知的。
通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的转化糖的水平与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的水平相比优选保持不变。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的转化糖的水平为1至5g/100mL，例如1.5至4g/100mL，例如1.75至3.25g/100mL，例如2至3g/100mL，例如2.1至2.9g/100mL，例如2.3至2.8g/100mL，例如2.4至2.7g/100mL，例如2.5至2.6mg/100mL。在一些实施方案中，转化糖的水平为至少1mg/100mL，例如至少1.5mg/100mL，例如至少1.6mg/100mL，例如至少1.7mg/100mL，例如至少1.8mg/100mL，例如至少1.9mg/100mL，例如至少2.0mg/100mL，例如至少2.1mg/100mL，例如至少2.2mg/100mL，例如至少2.3mg/100mL，例如至少2.4mg/100mL，例如至少2.5mg/100mL。转化糖的水平代表水性谷物提取物如麦芽汁中的总转化糖的水平，例如在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选地如上所述在发芽48小时至108小时后测量的。测量转化糖水平的方法是技术人员已知的。
制备饮料
在一些实施方案中，本发明的方法还包括将通过本发明的上述方法制备的水性提取物加工成饮料的步骤。
因此，一方面，提供了一种用于生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.通过包括以下步骤的方法制备水性提取物：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述细分的发芽谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％；
从而获得谷物的水性提取物；
和
ii.将所述水性提取物加工成饮料。
水性提取物可以在存在或不存在啤酒花的情况下煮沸，在此之后其可以称为煮沸的麦芽汁。
首先，可以将第二麦芽汁和进一步的麦芽汁合并，然后进行加热或煮沸。可以将水性提取物加热或煮沸任何合适的时间量，例如60分钟至120分钟。在加热或煮沸期间，由于蒸发，水性提取物的体积可能减少。可以优选，水性提取物的体积减少小于8％，优选小于5％。这可以显著降低能耗。
可以通过水性提取物的发酵，例如通过麦芽汁的发酵，来制备饮料。因此，可以通过用酵母发酵水性提取物来制备饮料。
在一个实施方案中，饮料可以是酒精饮料，例如啤酒。在其他实施方案中，饮料可以是基于发芽的谷物谷粒的非酒精饮料。非酒精饮料可以例如是非酒精啤酒或其他种类的非酒精饮料，例如maltina。优选地，饮料不是kvass麦芽汁。
在一个优选的实施方案中，饮料是啤酒。因此，啤酒例如可以选自老啤酒(Altbier)、琥珀啤酒(Amber ale)、大麦酒(Barley wine)、柏林白啤酒(Berlinerweisse)、北法风格窖藏啤酒(Bière de Garde)、苦啤酒(Bitter)、金色麦啤(Blonde Ale)、博克啤酒(Bock)、棕色艾尔啤酒(Brown ale)、加州蒸汽啤酒(California Common)、奶油爱尔啤酒(Cream Ale)、多特蒙德出口型啤酒(Dortmunder Export)、双博克啤酒(Doppelbock)、深色啤酒(Dunkel)、小麦黑啤(Dunkelweizen)、冰啤酒(Eisbock)、水果拉比克啤酒(Fruit lambic)、金色爱尔啤酒(Golden Ale)、哥塞啤酒(Gose)、香槟啤酒(Gueuze)、小麦啤酒(Hefeweizen)、淡啤酒(Helles)、印度淡啤酒(India pale ale)、科隆啤酒
因此，本发明还涉及生产饮料的方法，其包括以下步骤：
-通过根据本发明的方法制备水性提取物。
-将所述提取物加工成饮料。
酒精饮料-如啤酒-可以根据本发明的方法由发芽的谷物谷粒制造。除啤酒花和酵母菌外，发芽的谷物谷粒也有助于啤酒的风味和颜色。
一旦制备了水性提取物，就可以通过包括常规酿造方法在内的任何方法将其加工成啤酒。合适的酿造方法的实例的非限制性描述可以在例如Briggs等人(1981)和Hough等人(1982)的出版物中找到。有许多定期更新的大麦和啤酒产品分析方法可用，例如但不限于美国谷物化学家协会(American Association of Cereal Chemists)(1995)、美国酿造化学家协会(American Society of Brewing Chemists)(1992)、欧洲啤酒酿造大会(European Brewery Convention)(1998)和酿酒研究所(Institute of Brewing)(1997)。公认的是，给定的啤酒厂采用了许多特定的程序，其中最明显的变化与当地消费者的偏好有关。本发明可以使用任何此类生产啤酒的方法。
由水性提取物生产啤酒的第一步优选地包括如上文所述加热所述水性提取物，然后是随后的冷却阶段，以及任选地进行涡旋沉淀静置(whirlpool rest)。可以将一种或多种另外的化合物加入到水性提取物中，例如下文“另外的化合物”部分中所述的一种或多种另外的化合物。在冷却后，可以将水性提取物转移到装有酵母(例如酿酒酵母，如巴斯德酵母(S.pastorianus)或酿酒酵母(S.cerevisiae))的发酵罐中。水性提取物可以发酵任何合适的时间段，通常为1至20天，如1至10天。发酵在任何可用的温度下进行，例如在10至20℃范围内的温度下。所述方法还可以包括添加一种或多种酶，例如可以在发酵之前或发酵期间向麦芽汁中添加一种或多种酶。特别地，所述酶可以是脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶的一个非限制性实例是可从DSM获得的“Brewer's Clarex”。在其他实施方案中，在该方法期间不添加外源酶。
在为期几天的发酵过程期间，糖转化为酒精和CO2，伴随着一些风味物质的出现。发酵可以在任何期望的时间终止，例如一旦观察到％P没有进一步下降。
随后，啤酒可以被进一步处理，例如冰镇(chilled)。也可以将其过滤和/或长期窖藏(lagered)-一种产生令人愉快的香气和较少酵母样风味的过程。还可以添加添加剂。此外，可以添加CO2。最后，在包装啤酒(例如，转移到容器或小桶、瓶装或罐装中)之前，可以将啤酒进行巴氏消毒和/或过滤。啤酒也可以通过标准方法进行巴氏消毒。
通过本发明的方法生产的啤酒通常具有令人愉悦的味道，并且没有涩味或仅有很少的涩味。味道可以例如由专业的啤酒品酒专家小组来分析。
饮料
通过将根据本发明的水性提取物加工成饮料制备的饮料可以具有许多有用的性质，包括-但不限于-本部分中描述的性质。
通常期望根据本发明的饮料包含尽可能少的双乙酰。因此，可以优选的是，饮料中的双乙酰水平低于拉格啤酒中认为异味的阈值。优选地，饮料包含至多30ppb的双乙酰，更优选至多25ppb的双乙酰，甚至更优选至多20ppb的双乙酰。如果饮料是啤酒，例如拉格啤酒，则尤其是这种情况。
根据本发明的饮料可以例如是本文所述的水性提取物，其任选地已经进行过发酵。因此，饮料可以包含所述水性提取物或发酵的水性提取物以及任选的一种或多种另外的化合物或由其组成。所述另外的化合物可以例如是本文下文在“另外的化合物”部分中描述的任何另外的化合物。
在一些实施方案中，通过本发明方法获得的饮料例如啤酒的特性与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的饮料例如啤酒的特性基本上相似。饮料可以是新鲜啤酒，即在生产后立即确定其特性，或者是已储存给定时间的啤酒。这样的特征可以是酒***平、真实发酵度(RDF)、pH、泡沫形成、期望的化合物的水平和/或不期望的化合物(例如乙醛、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、丙醇、乙酸异戊酯、异戊醇、反式-2-壬烯醛(T2N)、Strecker醛、2-甲基-丙醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、苯乙醛、二甲硫醚(DMS))的水平中的任何一种或多种。所述特性可以例如是在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选在如上所述的发芽48小时至108小时后测量的。
特别地，通过本发明方法获得的饮料例如啤酒中的T2N水平在储存之前和/或之后类似于通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的饮料例如啤酒中的T2N水平。特别地，T2N的水平低于感觉阈值，其为0.05mg/L。因此，在一些实施方案中，通过本发明方法制备的啤酒在储存之前和/或之后(例如在37℃下储存2周)的T2N水平低于1mg/L，例如低于0.09mg/L，例如低于0.08mg/L，例如低于0.07mg/L，例如低于0.06mg/L，例如低于0.05mg/L，例如低于0.04mg/L，例如低于0.03mg/L，例如低于0.02mg/L，例如约0.01mg/L或更低。
在一些实施方案中，通过本发明方法获得的饮料例如啤酒中的Strecker醛水平在储存之前和/或之后类似于通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的饮料如啤酒中的Strecker醛水平。在一些实施方案中，Strecker醛的水平为5至25mg/L，例如6至24mg/L，例如7至23mg/L，例如8至22mg/L，例如9至21mg/L，例如10至20mg/L。优选地，Strecker醛的水平低于25mg/L，例如低于24mg/L，例如低于23mg/L，例如低于22mg/L，例如低于21mg/L，例如低于20mg/L。
另外的化合物
本发明的方法可以包括添加一种或多种另外的化合物的步骤。所述另外的化合物可以例如是风味化合物、防腐剂、功能成分、颜料、甜味剂、pH调节剂或盐。pH调节剂可以例如是缓冲剂或酸，例如磷酸。
功能成分可以是为获得给定功能而添加的任何成分。优选地，功能成分使饮料更健康。功能成分的非限制性实例包括维生素或矿物质。
防腐剂可以是任何食品级防腐剂，例如其可以是苯甲酸、山梨酸、山梨酸酯(例如，山梨酸钾)、亚硫酸盐和/或其盐。
另外的化合物也可以是CO2。特别地，可以添加CO2以获得碳酸饮料。
用于本发明的风味化合物可以是任何可用的风味化合物。风味化合物可以例如选自芳香剂、植物提取物、植物浓缩物、植物部位和草浸剂。特别地，风味化合物可以是啤酒花。
序列
>SEQ ID NO:1，纤维素合酶样CslF6序列(基于GenBank号NCBI：EU267181.1)。
MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARINSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIVLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLYVVRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH
>SEQ ID NO:2，大麦纤维素合酶样CslF6(CslF6)、完整的编码序列(基于GenBank编号NCBI：EU267181.1)。
ATGGCGCCAGCGGTGGCCGGAGGGGGCCGCGTGCGGAGCAATGAGCCGGTTGCTGCTGCTGCCGCCGCGCCGGCGGCCAGCGGCAAGCCCTGCGTGTGCGGCTTCCAGGTTTGCGCCTGCACGGGGTCGGCCGCGGTGGCCTCCGCCGCCTCGTCGCTGGACATGGACATCGTGGCCATGGGGCAGATCGGCGCCGTCAACGACGAGAGCTGGGTGGGCGTGGAGCTCGGCGAAGATGGCGAGACCGACGAAAGCGGTGCCGCCGTTGACGACCGCCCCGTATTCCGCACCGAGAAGATCAAGGGTGTCCTCCTCCACCCCTACCGGGTGCTGATTTTCGTTCGTCTGATCGCCTTCACGCTGTTCGTGATCTGGCGTATCTCCCACAAGAACCCAGACGCGATGTGGCTGTGGGTGACATCCATCTGCGGCGAGTTCTGGTTCGGTTTCTCGTGGCTGCTAGATCAGCTGCCCAAGCTGAACCCCATCAACCGCGTGCCGGACCTGGCGGTGCTGCGGCAGCGCTTCGACCGCCCCGACGGCACCTCCACGCTCCCGGGGCTGGACATCTTCGTCACCACGGCCGACCCCATCAAGGAGCCCATCCTCTCCACCGCCAACTCGGTGCTCTCCATCCTGGCCGCCGACTACCCCGTGGACCGCAACACATGCTACGTCTCCGACGACAGTGGCATGCTGCTCACCTACGAGGCCCTGGCAGAGTCCTCCAAGTTCGCCACGCTCTGGGTGCCCTTCTGCCGCAAGCACGGGATCGAGCCCAGGGGTCCGGAGAGCTACTTCGAGCTCAAGTCACACCCTTACATGGGGAGAGCCCAGGACGAGTTCGTCAACGACCGCCGCCGCGTTCGCAAGGAGTACGACGAGTTCAAGGCCAGGATCAACAGCCTGGAGCATGACATCAAGCAGCGCAACGACGGGTACAACGCCGCCATTGCCCACAGCCAAGGCGTGCCCCGGCCCACCTGGATGGCGGACGGCACCCAGTGGGAGGGCACATGGGTCGACGCCTCCGAGAACCACCGCAGGGGCGACCACGCCGGCATCGTACTGGTGCTGCTGAACCACCCGAGCCACCGCCGGCAGACGGGCCCGCCGGCGAGCGCTGACAACCCACTGGACTTGAGCGGCGTGGATGTGCGTCTCCCCATGCTGGTGTACGTGTCCCGTGAGAAGCGCCCCGGGCACGACCACCAGAAGAAGGCCGGTGCCATGAACGCGCTTACCCGCGCCTCGGCGCTGCTCTCCAACTCCCCCTTCATCCTCAACCTCGACTGCGATCATTACATCAACAACTCCCAGGCCCTTCGCGCCGGCATCTGCTTCATGGTGGGACGGGACAGCGACACGGTTGCCTTCGTCCAGTTCCCGCAGCGCTTCGAGGGCGTCGACCCCACCGACCTCTACGCCAACCACAACCGCATCTTCTTCGACGGCACCCTCCGTGCCCTGGACGGCATGCAGGGCCCCATCTACGTCGGCACTGGGTGTCTCTTCCGCCGCATCACCGTCTACGGCTTCGACCCGCCGAGGATCAACGTCGGCGGTCCCTGCTTCCCCAGGCTCGCCGGGCTCTTCGCCAAGACCAAGTACGAGAAGCCCGGGCTCGAGATGACCACGGCCAAGGCCAAGGCCGCGCCCGTGCCCGCCAAGGGTAAGCACGGCTTCTTGCCACTGCCCAAGAAGACGTACGGCAAGTCGGACGCCTTCGTGGACACCATCCCGCGCGCGTCGCACCCGTCGCCCTACGCCGCGGCGGCTGAGGGGATCGTGGCCGACGAGGCGACCATCGTCGAGGCGGTGAACGTGACGGCCGCCGCGTTCGAGAAGAAGACCGGCTGGGGCAAAGAGATCGGCTGGGTGTACGACACCGTCACGGAGGACGTGGTCACCGGCTACCGGATGCATATCAAGGGGTGGCGGTCACGCTACTGCTCCATCTACCCACACGCCTTCATCGGCACCGCCCCCATCAACCTCACGGAGAGGCTCTTCCAGGTGCTCCGCTGGTCCACGGGATCCCTCGAGATCTTCTTCTCCAAGAACAACCCGCTCTTCGGCAGCACATACCTCCACCCGCTGCAGCGCGTCGCCTACATCAACATCACCACTTACCCCTTCACCGCCATCTTCCTCATCTTCTACACCACCGTGCCGGCGCTATCCTTCGTCACCGGCCACTTCATCGTGCAGCGCCCGACCACCATGTTCTACGTCTACCTGGGCATCGTGCTATCCACGCTGCTCGTCATCGCCGTGCTGGAGGTCAAGTGGGCCGGGGTCACAGTCTTCGAGTGGTTCAGGAACGGCCAGTTCTGGATGACAGCAAGTTGCTCCGCCTACCTCGCCGCCGTCTGCCAGGTGCTGACCAAGGTGATATTCCGGCGGGACATCTCCTTCAAGCTCACATCCAAGCTACCCTCGGGAGACGAGAAGAAGGACCCCTACGCCGACCTCTACGTGGTGCGCTGGACGCCGCTCATGATTACACCCATCATCATCATCTTCGTCAACATCATCGGATCCGCCGTGGCCTTCGCCAAGGTTCTCGACGGCGAGTGGACGCACTGGCTCAAGGTCGCCGGCGGCGTCTTCTTCAACTTCTGGGTGCTCTTCCACCTCTACCCCTTCGCCAAGGGCATCCTGGGGAAGCACGGAAAGACGCCAGTCGTGGTGCTCGTCTGGTGGGCATTCACCTTCGTCATCACCGCCGTGCTCTACATCAACATCCCCCACATGCATACCTCGGGAGGCAAGCACACAACGGTGCATGGTCACCATGGCAAGAAGTTGGTCGACACAGGGCTCTATGGCTGGCTCCATTGA
表2：分析的基因的引物和探针序列信息
项目
可以通过以下项目进一步描述本发明：
1.一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；条件是在步骤b)和c)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％，和
d)制备所述细分的发芽的谷粒的水性提取物，
从而生产谷物的水性提取物。
2.一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述细分的发芽的谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％，
从而生产谷物的水性提取物。
3.根据前述项目中任一项所述的方法，其中整个发芽步骤不超过96小时。
4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤进行72至108小时，例如大约96小时。
5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤进行65至80小时，例如大约72小时。
6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中从开始发芽时测量发芽的持续时间。
7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中通过启动步骤c来终止发芽。
8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽在10至30℃、例如10至25℃范围内的温度下进行。
9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中发芽包括进行的一个或多个浸泡步骤，直到在最后的浸泡步骤之后谷物谷粒的水含量为至少30％，如至少35％，例如至少40％，如至少45％。
10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在细分所述谷物谷粒时，所述发芽的谷物谷粒的水含量为至少20％，例如不小于25％，如不小于30％，优选地不小于35％，甚至更优选地不小于40％，还更优选地不小于45％。
11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在完成发芽步骤和细分所述谷物谷粒的时间之间的任何时间，所述发芽的谷物谷粒的水含量均不小于20％，例如不小于25％，如不小于30％，优选地不小于35％，甚至更优选地不小于40％，还更优选地不小于45％。
12.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤至少部分地在通气下进行。
13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤包括通过在潮湿条件下孵育谷物谷粒来浸泡谷物谷粒的步骤。
14.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤不包括在通气下将谷物谷粒浸没在水性溶液中的步骤。
15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中步骤a)中提供的谷粒已经用抗微生物剂处理。
16.根据项目15所述的方法，其中所述抗微生物剂是过氧化物，例如过氧化氢。
17.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽的谷粒包含每100克发芽的谷物谷粒(干物质)至多10g、例如至多8g、例如至多6g、优选至多4g的小根(干物质)。
18.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽的谷粒包含每100g发芽的谷物谷粒(干物质)至多6g小根(干物质)。
19.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法不包括去除小根的步骤。
20.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是带壳的谷物，例如带壳的大麦。
21.根据项目20所述的方法，其中所述方法包括在开始发芽之前去除所述外壳的至少一部分的步骤。
22.根据项目21所述的方法，其中去除所述外壳导致谷物谷粒的总重量损失至少1％，例如损失至少2％，例如损失2％至7％，例如3％至6％。
23.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是无壳的谷物，例如小麦或无壳的大麦。
24.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是大麦。
25.根据项目24所述的方法，其中所述大麦是无壳的大麦或具有薄壳的大麦品种。
26.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是大麦，其特征在于，所述谷粒中的β-葡聚糖水平低。
27.根据项目26所述的方法，其中基于干重，所述谷粒中的β-葡聚糖水平为至多5％，例如1-5％w/w。
28.根据项目26所述的方法，其中基于干重，所述谷粒中的β-葡聚糖水平为至多3％，例如1-3％w/w。
29.根据项目24至28中任一项所述的方法，其中所述大麦的特征在于在编码β-葡聚糖合酶的基因中携带突变。
30.根据项目24至28中任一项所述的方法，其中所述大麦的特征在于在编码CslF6的基因中携带突变。
31.根据项目30所述的方法，其中所述大麦植物的籽粒的β-葡聚糖含量为携带野生型CslF6基因但在其他方面为相同的基因型的大麦植物的β-葡聚糖含量的至多60％，例如至少30％且至多60％，例如至少40％且至多60％。
32.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述谷物是大麦，其特征在于至少以下一种或多种：
A.在编码LOX-1的基因中携带突变
B.在编码LOX-2的基因中携带突变
C.在编码MMT的基因中携带突变；和/或
D.携带导致发芽期间α-淀粉酶活性增加的突变，例如编码DELLA的基因中的突变。
33.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有至少30U/g、例如至少50U/g、优选地例如至少100U/g谷物谷粒的α-淀粉酶活性。
34.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有至少5U/g、优选地至少10U/g谷物谷粒的β-淀粉酶活性。
35.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有至少2mU/g、例如至少10mU/g、优选地至少20mU/g谷物谷粒的极限糊精酶活性。
36.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有低于5％、例如低于3％w/w、例如低于2％w/w、例如低于1.5％w/w、优选低于1.0％w/w的β-葡聚糖含量。
37.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述步骤C.包括在50至80℃范围内的温度下用打浆溶液打浆所述细分的谷粒。
38.根据项目37所述的方法，其中所述打浆在一种或多种添加的水解酶的存在下进行。
39.根据项目38所述的方法，其中至少一种水解酶选自细胞壁和淀粉降解酶，包括但不限于α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶。
40.根据项目37至39中任一项所述的方法，其中所述打浆在至少一种β-葡聚糖酶和至少一种木聚糖酶的存在下进行。
41.根据项目37至40中任一项所述的方法，其中在所述打浆期间每克发芽的谷物谷粒(干重)添加至多700U、优选至多350U的外源葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
42.根据项目37至41中任一项所述的方法，其中在所述打浆期间，每克发芽的谷物谷粒(干重)添加至多100PUN的外源支链淀粉酶。
43.根据项目37至42中任一项所述的方法，其中所述谷物的特征在于所述谷粒中的β-葡聚糖水平低，并且其中在打浆期间不添加β-葡聚糖酶。
44.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法还包括过滤所述水性提取物的步骤。
45.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述水性提取物的氨基酸水平为500至3000mg/L，例如600至2900mg/L，例如700至2800mg/L，例如800至2700mg/L，例如900至2600mg/L，例如1000至2500mg/L，例如1100至2400mg/L，例如1200至2200mg/L，例如1300至2100mg/L，例如1400至2000mg/L。
46.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述水性提取物的可发酵碳水化合物水平为5至20mg/100mL，例如6至19mg/100mL，例如7至18mg/mL，例如8至17mg/100mL，例如9至16mg/100mL，例如10至15mg/100mL，例如10至14mg/100mL，例如11至13mg/100mL，例如约12mg/100mL。
47.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述水性提取物的转化糖水平为1至5g/100mL，例如1.5至4g/100mL，例如1.75至3.25g/100mL，例如2至3g/100mL，例如2.1至2.9g/100mL，例如2.3至2.8g/100mL，例如2.4至2.7g/100mL，例如2.5至2.6mg/100mL。
48.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法不包括窑炉干燥的步骤，优选地所述方法在步骤d)之前的任何时间不包括窑炉干燥的步骤。
49.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法不包括切碎所述发芽的谷物谷粒并且由切碎的发芽的谷物谷粒形成粒料的步骤。
50.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.通过前述项目中任一项所述的方法制备水性提取物；
ii.将所述提取物加工成饮料。
51.根据项目50所述的方法，其中步骤ii.包括以下步骤：
e)任选地在啤酒花或啤酒花提取物的存在下，加热所述水性提取物；
f)冷却所述水性提取物；
g)用酵母将所述水性提取物发酵，从而产生发酵饮料。
52.根据项目50所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤e)或步骤f)之后进行的沉淀步骤。
53.根据项目50至52中任一项所述的方法，其中所述饮料是啤酒。
54.根据项目50至53中任一项所述的方法，其中所述饮料是浅色啤酒，例如选自拉格啤酒、淡啤酒和小麦啤酒。
55.根据项目50至54中任一项所述的方法，其中所述饮料是拉格啤酒。
56.根据项目50至55中任一项所述的方法，其中所述饮料的T2N水平低于1mg/L，例如低于0.09mg/L，例如低于0.08mg/L，例如低于0.07mg/L，例如低于0.06mg/L，例如低于0.05mg/L，例如低于0.04mg/L，例如低于0.03mg/L，例如低于0.02mg/L，例如约0.01mg/L或更低。
57.根据项目50至56中任一项所述的方法，其中所述饮料的Strecker醛的水平为5至25mg/L，例如6至24mg/L，例如7至23mg/L，例如8至22mg/L，例如9至21mg/L，例如10至20mg/L。
58.根据项目50至57中任一项所述的方法，其中步骤i.不包括窑炉干燥步骤。
实施例
实施例1：微型麦芽制造
将大麦样品一式三份地进行处理，每个样品50g。根据图1中所示的方案，对放置在不锈钢烧杯中的样品进行浸泡，第一天在15℃的新鲜水中强制浸泡约7小时，第二天3小时，第三天1小时，以便在每次浸泡结束时分别达到35％、40％和45％的水含量。每次浸泡后，将装有样品的不锈钢烧杯移至15℃的发芽箱中，并保持在那里，直到该过程中的下一步骤。在最后一次浸泡水排出结束时，将样品在发芽箱中保持120小时(第3-7天)，所述发芽箱平衡至45％水并进行喷雾以克服呼吸水损失。发芽过程结束时(第7天)，使用以下斜坡升温程序将样品在不锈钢箱中放入Termaks孵育箱中窑炉干燥21小时：
25℃–55℃(2℃/hrs)
55℃–85℃(4℃/hrs)
85℃持续1.5小时
发芽和窑炉干燥的步骤是在80％新鲜空气的循环气流下进行的。
在每个微型麦芽制造日结束时，一式三份地收集样品进行分析，并冷冻干燥48小时。
使用这种发芽过程研究了两种大麦品系，一种是常规大麦品系cv.Paustian(参照)，一种是具有低β-葡聚糖含量的大麦品系(突变体)。β-葡聚糖含量低的大麦品系为cv.Paustian的大麦植物，其在CslF6基因中携带突变，导致突变体Cslf6基因，其编码在748位携带Gly→Asp突变的突变体CslF6多肽。大麦CslF6多肽的野生型序列(SEQ ID NO:1)可在GenBank数据库中以NCBI登录号EU267181.1获得。
实施例2：水吸收
通过测量谷物谷粒与烧杯快速离心去除表面水分后的起始重量相比的确切重量差，来确定发芽的最初6小时期间的水吸收速度。
结果：
在吸胀的最初6个小时期间，突变体的水吸收比参照样品略快(图2)。
实施例3：根生长
如实施例1所述，在每个发芽日后将发芽的大麦样品冷冻干燥。称重冷冻干燥的样品，并手动除去形成的小根，并再次称重发芽的大麦。根生长计算为处理之前和之后的重量百分比。
结果：
在整个麦芽制造期，突变体和参照的根生长相似，但与入炉干燥的麦芽相比，在第4天显著降低(图3)。
实施例4：麦芽制造期间编码水解酶的基因的表达
RNA分离：
对于每个样品，准备装有两个金属球的2mL微量离心管。称取大约80mg的冷冻干燥的面粉，放置到装有金属球的微量离心管中。样品用100μL的无RNA酶的水预湿，然后加入1mL的Tri-试剂(Tri-Reagent)。随后，将样品剧烈摇动。在室温下孵育5分钟后，将样品在4℃下以12,000×g离心10分钟。将上清液倒入2mL的PhaseLock管中(减速旋转30s，Qiagen#129056)，并加入0.2mL氯仿。用手剧烈摇动试管10-15秒，以混合氯仿和Tri-试剂。将样品在室温下孵育5-15分钟，然后在4℃下以12,000×g离心5分钟。将样品的水相倒入新的微量离心管中，然后加入500μL的2-丙醇。将RNA在冰箱中沉淀过夜。将样品在4℃下以12,000×g离心5分钟，然后除去异丙醇上清液。为了RNA净化，将沉淀物直接重悬于Aurum总RNA迷你试剂盒(BioRad#7326820)的350μL裂解缓冲液中。添加350μL的70％乙醇以重新沉淀RNA。将该溶液转移至置于2mL无盖洗涤管(试剂盒中提供)中的RNA结合柱中，并离心30秒。取出RNA结合柱，并丢弃滤液。将700μL的低严格度洗涤溶液添加到RNA结合柱中，并离心30秒。从洗涤管中丢弃低严格度洗涤溶液，并将结合柱重新放置在同一洗涤管中。
柱上DNA酶处理：
通过将250μL 10mM Tris,pH 7.5添加至小瓶中，并根据提供的手册(BioradAurum总RNA迷你试剂盒#7326820)上下吸液进行混合来重构提供的冻干DNA酶I。将80μL的稀释的DNA酶I添加到每个柱底部的膜堆叠中，并在室温下使其消化15分钟。将700μL的高严格度洗涤溶液添加到RNA结合柱中，并离心30秒。丢弃滤液，并将柱重新放置在相同的洗涤管中。将700μL的低严格度洗涤溶液添加到RNA结合柱中，并离心30秒。丢弃滤液，并将柱重新放置在相同的洗涤管中。将洗涤管和柱再离心另外2分钟以除去残留的洗涤溶液。将RNA结合柱转移到1.5mL加盖的微量离心管中，并将80μL的洗脱缓冲液添加到RNA结合柱底部的膜堆叠中。使溶液浸透膜1分钟，然后离心2分钟以洗脱总RNA。最后，通过NanoDrop(ThermoScientific)对RNA浓度进行定量。
cDNA合成和ddPCR设置：
使用BioRad的iScriptTM cDNA合成试剂盒(#1708891)合成cDNA。在合成cDNA之前，先在NanoDrop(Thermo Scientific)上估算总RNA浓度，然后用无RNA酶的水将其标准化为50ng/μL。对于cDNA合成，根据以下方案使用200ng的RNA。
对于NoRT对照样品，添加水代替逆转录酶(RT)。使用以下方案将完全反应混合物在热循环仪中孵育：
对于ddPCR分析，分析每个样品的目标基因以及一个参照基因。使用来自BioRad的QX200液滴发生器和QX200液滴读取器根据制造商的说明进行ddPCR。在这种情况下，将HORVU5Hr1G041120(一种在发芽期间稳定表达的胞质丙酮酸激酶家族蛋白)用作参照基因。上文“序列”部分中的表2提供了有关引物和探针的详细信息。
在分析之前，将cDNA在水中稀释20倍，并根据以下方案设置每种反应混合物：
将样品在96孔板中充分混合，并在液滴产生(BioRad QX200TM自动液滴发生器)之前以4000rpm离心1分钟。根据以下程序在热循环仪上孵育液滴板：
在BioRad QX200TM液滴读取器上检测到FAM和HEX阳性液滴的存在，并使用BioRad的Quantasoft软件分析。在2D图中手动设置阈值，然后将浓度值输出到Excel，以对所选参照基因进行归一化。
结果：
使用ddPCR分析所选基因的表达；淀粉酶(AMY1)、(1-3；1-4)-β-葡聚糖酶(BGL2)、高pIα-葡萄糖苷酶(AGL97)和极限糊精酶(LD)。AGL97在第2天已经以最高水平表达，而其他三个基因在第4天显示最大表达(图4)。突变体和参照大麦品系均显示出相似的选定基因表达模式，从而证实了低(1-3；1-4)-β-葡聚糖突变体中的最佳表达，以及编码(1-3；1-4)-β-葡聚糖降解酶的基因的相似表达模式。
实施例5：麦芽样品中的水解酶活性
在酶活性分析之前，使用标准的Foss Cyclotech磨机碾磨麦芽样品，该磨机配有碳化钨磨环(Foss 10004463)、镀镍叶轮(Foss 1000 2666)和1mm出口筛(Foss 10001989)。大麦麦芽的所有酶活性测定均在碾磨干样品后48小时内进行。使用来自Megazyme的Ceralpha试剂盒(K-CERA)，使用标准实验室设备测量α-淀粉酶活性。淀粉酶测定是根据制造商的方案(K-CERA 01/12)进行的。淀粉酶活性的计算基于Megazyme方案(K-CERA 01/12)中的公式。使用标准实验室设备，使用来自Megazyme的Betamyl试剂盒(K-BETA3)测量β-淀粉酶活性测定。淀粉酶测定是根据制造商的方案(K-BETA3 10/10)进行的。β-淀粉酶活性的计算基于Megazyme方案(K-BETA3 10/10)中的公式。使用标准实验室设备，并使用来自Megazyme的支链淀粉酶/极限糊精酶测定试剂盒(PullG6方法)试剂盒(K-PullG6)，测量极限糊精酶活性测定。极限糊精酶测定是根据制造商的方案(K-PullG6 05/17)进行的。极限糊精酶活性的计算基于Megazyme方案(K-PullG6 05/17)中的公式。
结果：
在突变体和参照大麦品系中，针对α-淀粉酶、β-淀粉酶和游离极限糊精酶测得的总酶活性遵循相同的模式(图5)。出人意料的是，尽管极限糊精酶基因表达略低(图4)，但早在第3天开始，突变体中的极限糊精酶的活性表现为略高。
实施例6：(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量
分析发芽的谷粒的总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。在Retch旋风磨机上碾磨10mL的大麦谷粒。一式三份分析所有样品。称出20mg的面粉，置于2mL微量离心管中，在烘箱中于100℃加热2小时，然后冷却至室温。总共加入500μL的50％甲醇水溶液，然后将样品以1400rpm的速度振摇1小时。以16000×g离心10分钟后，弃去上清液，并将样品干燥过夜。然后，每10mg面粉加入400μL含1U/mL地衣聚糖酶(Megazyme,International，爱尔兰)的pH6.5的20mM NaHPO4，并在50℃下孵育2.5小时。将样品以16000×g离心10分钟，然后将上清液通过0.45μm过滤器过滤，释放的Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(Dp4)低聚物通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)定量。Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)低聚物通过使用配备有具有2×250mm尺寸的4μm SA-10色谱柱和前置柱的Dionex ICS 5000+Dc系统并采用HPAEC-PAD进行定量。运行条件为0.4mL/min，柱温为40℃，等度100mM NaOH洗脱液15分钟。定量标准品是通过在20mMNaHPO4pH 6.5中用1U/mL地衣聚糖酶(Megazyme International，爱尔兰)消化已知量的中等粘度的(1,3；1,4)-β-葡聚糖(Megazyme International，爱尔兰)而产生的，假设DP3和DP4之间具有等摩尔PAD响应比。总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量计算为DP3和DP4低聚物的总和。
结果：
在麦芽制造程序的第1、2、3、4、5、6天的大麦和绿麦芽(图1)中以及在窑炉干燥的麦芽(图1中的第7天)中监测突变体和参照的(1-3；1-4)-β-葡聚糖的含量。在整个麦芽制造过程期间，突变体的(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量仅为参照的50％，并且在第5天时，突变体(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量类似于参照窑炉干燥的麦芽。
实施例7：对绿麦芽试验、麦芽汁和啤酒的分析
根据本发明方法(即不经入炉干燥)或经入炉干燥(表3-8中的“初步”入炉干燥)由发芽1、2、3、4或5天的大麦以及发芽5天并在后期阶段经入炉干燥(表3-8中的“工业”入炉干燥)的大麦制得的麦芽汁和啤酒的特性在表3和4中示出。在发芽之前，浸泡进行大约36小时。设计该实验是为了每天比较直接用绿麦芽的酿造和用通过入炉干燥生产的麦芽的酿造。在后期阶段进行用入炉干燥的麦芽(表中的“工业”)的酿造。使用大麦cv.Congo。
麦芽汁的糖通过具有电化学检测的HPLC测定。用O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-羟基胺衍生羰基化合物后，通过GC-MS测定Strecker醛，基本上如Groenqvist等人，1993所述。啤酒中的低沸点酯类和高级醇通过具有FID检测的顶空气相色谱法测定。通过CS2从啤酒中提取高沸点酯以及高级醇和脂肪酸，并通过具有FID检测的气相色谱法(液体注入)进行分析。麦芽汁和啤酒中的氨基酸含量是按照EP3237601中所述，使用带有光电二极管阵列检测器的UPLC，使用来自Waters的AccQ-Tag Ultra衍生试剂盒进行测定的，基本上如供应商所述的。用O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-羟基胺衍生羰基化合物后，通过GC-MS测定啤酒中的T2N，基本上如Groenqvist等人，1993所述。使用来自Anton Paar的Alcolyzer啤酒分析系统，如供应商所述，测量真实发酵度(RDF)、酒精、提取物和颜色。使用FT-003泡沫测试仪(Lg-automatic aps,Undalsvej 6,3300Frederiksvaerk,丹麦)，如供应商所述，测量泡沫。
如表3所示，不存在窑炉干燥对麦芽汁的pH值和氨基酸都没有显著影响。发芽3、4或5天后获得的麦芽汁β-葡聚糖的差异被认为是不显著的。因此，尽管不存在窑炉干燥步骤，通过本发明方法制备的麦芽汁令人惊讶地包含足够的氨基酸以用作后期发酵中酵母的营养源。表4表明，不存在窑炉干燥步骤不会显著改变可发酵碳水化合物的浓度。
表3.
表4：糖。Fru：果糖；Fru％P：果糖的Plato％；Glu；葡萄糖；Suc：蔗糖；Mal：麦芽糖；Maltt：麦芽三糖；总和FC：可发酵碳水化合物的总和；总和IS：转化糖的总和。Fru％P以％表示；剩余数据以g/100mL为单位。
在发芽1、2、3、4或5天后，将由通过本发明的方法即不经入炉干燥得到的水性谷物提取物制备的啤酒与由通过传统的方法即经过入炉干燥得到的水性谷物提取物制备的啤酒进行比较。啤酒的特性列于表5-8中。
表5显示了未经窑炉干燥制备的啤酒中酒精的体积百分比类似于经窑炉干燥制备的啤酒中酒精的体积百分比。同样，真实发酵度(RDF)或泡沫形成也没有显著差异。特别地，期望获得高泡沫形成。表6表明，乙醛(从发芽2天开始)、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、丙醇、乙酸异戊酯和异戊醇的浓度在很大程度上不受不存在窑炉干燥的影响。
表5：最终啤酒。RDF：真实发酵度。
表6：最终啤酒。浓度以mg/L为单位。NA：未获得的。
分析了新鲜啤酒(表7)和在37℃下储存2周的啤酒(表8)中几种异味化合物的浓度。在新鲜啤酒(表7)中，未发现醛2-甲基-丙醛、2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、苯乙醛和总Strecker醛的显著差异，这些醛被认为是啤酒陈年风味的重要成分。相反，在某些情况下观察到异味化合物减少的趋势。麦芽的窑炉干燥被认为对于减少一些异味的水平很重要，例如通过使引发T2N形成的脂氧合酶失活来降低反式2-壬烯醛(T2N)的水平。未经窑炉干燥制备的啤酒中T2N水平略高一些；但是，所测得的水平仍低于0.05mg/L的感觉阈值，因此，预期在未经窑炉干燥制备的啤酒中，由T2N引起的异味不会改变。
同样，在未经窑炉干燥制备的情况下于37℃储存2周的啤酒(表8)的异味化合物浓度显示，与经窑炉干燥制备的且在相同条件下储存的啤酒所观察到的浓度差异不大。
表7.新鲜啤酒。2-Me-Pr：2-甲基丙醛；2-Me-Bu：2-甲基丁醛；3-Me-Bu：3-甲基丁醛；PheAcal：苯乙醛；T2N：反式-2-壬烯醛；St.Al.：Strecker醛总和。浓度以mg/L为单位。
表8.在37℃下储存2周的啤酒。2-Me-Pr：2-甲基丙醛；2-Me-Bu：2-甲基丁醛；3-Me-Bu：3-甲基丁醛；PheAcal：苯乙醛；T2N：反式-2-壬烯醛。浓度以mg/L为单位。
总而言之，以上数据表明，根据本发明的方法制备的麦芽汁和新鲜或储藏啤酒的特性出乎意料地很大程度上不受缺少窑炉干燥步骤的影响。
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序列表
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<120> 用于制备谷物提取物的快速方法
<130> P4746PC00
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 947
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 1
Met Ala Pro Ala Val Ala Gly Gly Gly Arg Val Arg Ser Asn Glu Pro
1 5 10 15
Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ser Gly Lys Pro Cys Val
20 25 30
Cys Gly Phe Gln Val Cys Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Ala Ser
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Asp Met Asp Ile Val Ala Met Gly Gln Ile Gly
50 55 60
Ala Val Asn Asp Glu Ser Trp Val Gly Val Glu Leu Gly Glu Asp Gly
65 70 75 80
Glu Thr Asp Glu Ser Gly Ala Ala Val Asp Asp Arg Pro Val Phe Arg
85 90 95
Thr Glu Lys Ile Lys Gly Val Leu Leu His Pro Tyr Arg Val Leu Ile
100 105 110
Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile Trp Arg Ile Ser
115 120 125
His Lys Asn Pro Asp Ala Met Trp Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly
130 135 140
Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp Leu Leu Asp Gln Leu Pro Lys Leu
145 150 155 160
Asn Pro Ile Asn Arg Val Pro Asp Leu Ala Val Leu Arg Gln Arg Phe
165 170 175
Asp Arg Pro Asp Gly Thr Ser Thr Leu Pro Gly Leu Asp Ile Phe Val
180 185 190
Thr Thr Ala Asp Pro Ile Lys Glu Pro Ile Leu Ser Thr Ala Asn Ser
195 200 205
Val Leu Ser Ile Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Val Asp Arg Asn Thr Cys
210 215 220
Tyr Val Ser Asp Asp Ser Gly Met Leu Leu Thr Tyr Glu Ala Leu Ala
225 230 235 240
Glu Ser Ser Lys Phe Ala Thr Leu Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His
245 250 255
Gly Ile Glu Pro Arg Gly Pro Glu Ser Tyr Phe Glu Leu Lys Ser His
260 265 270
Pro Tyr Met Gly Arg Ala Gln Asp Glu Phe Val Asn Asp Arg Arg Arg
275 280 285
Val Arg Lys Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Arg Ile Asn Ser Leu Glu
290 295 300
His Asp Ile Lys Gln Arg Asn Asp Gly Tyr Asn Ala Ala Ile Ala His
305 310 315 320
Ser Gln Gly Val Pro Arg Pro Thr Trp Met Ala Asp Gly Thr Gln Trp
325 330 335
Glu Gly Thr Trp Val Asp Ala Ser Glu Asn His Arg Arg Gly Asp His
340 345 350
Ala Gly Ile Val Leu Val Leu Leu Asn His Pro Ser His Arg Arg Gln
355 360 365
Thr Gly Pro Pro Ala Ser Ala Asp Asn Pro Leu Asp Leu Ser Gly Val
370 375 380
Asp Val Arg Leu Pro Met Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro
385 390 395 400
Gly His Asp His Gln Lys Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Thr Arg
405 410 415
Ala Ser Ala Leu Leu Ser Asn Ser Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys
420 425 430
Asp His Tyr Ile Asn Asn Ser Gln Ala Leu Arg Ala Gly Ile Cys Phe
435 440 445
Met Val Gly Arg Asp Ser Asp Thr Val Ala Phe Val Gln Phe Pro Gln
450 455 460
Arg Phe Glu Gly Val Asp Pro Thr Asp Leu Tyr Ala Asn His Asn Arg
465 470 475 480
Ile Phe Phe Asp Gly Thr Leu Arg Ala Leu Asp Gly Met Gln Gly Pro
485 490 495
Ile Tyr Val Gly Thr Gly Cys Leu Phe Arg Arg Ile Thr Val Tyr Gly
500 505 510
Phe Asp Pro Pro Arg Ile Asn Val Gly Gly Pro Cys Phe Pro Arg Leu
515 520 525
Ala Gly Leu Phe Ala Lys Thr Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Leu Glu Met
530 535 540
Thr Thr Ala Lys Ala Lys Ala Ala Pro Val Pro Ala Lys Gly Lys His
545 550 555 560
Gly Phe Leu Pro Leu Pro Lys Lys Thr Tyr Gly Lys Ser Asp Ala Phe
565 570 575
Val Asp Thr Ile Pro Arg Ala Ser His Pro Ser Pro Tyr Ala Ala Ala
580 585 590
Ala Glu Gly Ile Val Ala Asp Glu Ala Thr Ile Val Glu Ala Val Asn
595 600 605
Val Thr Ala Ala Ala Phe Glu Lys Lys Thr Gly Trp Gly Lys Glu Ile
610 615 620
Gly Trp Val Tyr Asp Thr Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg
625 630 635 640
Met His Ile Lys Gly Trp Arg Ser Arg Tyr Cys Ser Ile Tyr Pro His
645 650 655
Ala Phe Ile Gly Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Glu Arg Leu Phe Gln
660 665 670
Val Leu Arg Trp Ser Thr Gly Ser Leu Glu Ile Phe Phe Ser Lys Asn
675 680 685
Asn Pro Leu Phe Gly Ser Thr Tyr Leu His Pro Leu Gln Arg Val Ala
690 695 700
Tyr Ile Asn Ile Thr Thr Tyr Pro Phe Thr Ala Ile Phe Leu Ile Phe
705 710 715 720
Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Ser Phe Val Thr Gly His Phe Ile Val
725 730 735
Gln Arg Pro Thr Thr Met Phe Tyr Val Tyr Leu Gly Ile Val Leu Ser
740 745 750
Thr Leu Leu Val Ile Ala Val Leu Glu Val Lys Trp Ala Gly Val Thr
755 760 765
Val Phe Glu Trp Phe Arg Asn Gly Gln Phe Trp Met Thr Ala Ser Cys
770 775 780
Ser Ala Tyr Leu Ala Ala Val Cys Gln Val Leu Thr Lys Val Ile Phe
785 790 795 800
Arg Arg Asp Ile Ser Phe Lys Leu Thr Ser Lys Leu Pro Ser Gly Asp
805 810 815
Glu Lys Lys Asp Pro Tyr Ala Asp Leu Tyr Val Val Arg Trp Thr Pro
820 825 830
Leu Met Ile Thr Pro Ile Ile Ile Ile Phe Val Asn Ile Ile Gly Ser
835 840 845
Ala Val Ala Phe Ala Lys Val Leu Asp Gly Glu Trp Thr His Trp Leu
850 855 860
Lys Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Asn Phe Trp Val Leu Phe His Leu
865 870 875 880
Tyr Pro Phe Ala Lys Gly Ile Leu Gly Lys His Gly Lys Thr Pro Val
885 890 895
Val Val Leu Val Trp Trp Ala Phe Thr Phe Val Ile Thr Ala Val Leu
900 905 910
Tyr Ile Asn Ile Pro His Met His Thr Ser Gly Gly Lys His Thr Thr
915 920 925
Val His Gly His His Gly Lys Lys Leu Val Asp Thr Gly Leu Tyr Gly
930 935 940
Trp Leu His
945
<210> 2
<211> 2844
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 2
atggcgccag cggtggccgg agggggccgc gtgcggagca atgagccggt tgctgctgct 60
gccgccgcgc cggcggccag cggcaagccc tgcgtgtgcg gcttccaggt ttgcgcctgc 120
acggggtcgg ccgcggtggc ctccgccgcc tcgtcgctgg acatggacat cgtggccatg 180
gggcagatcg gcgccgtcaa cgacgagagc tgggtgggcg tggagctcgg cgaagatggc 240
gagaccgacg aaagcggtgc cgccgttgac gaccgccccg tattccgcac cgagaagatc 300
aagggtgtcc tcctccaccc ctaccgggtg ctgattttcg ttcgtctgat cgccttcacg 360
ctgttcgtga tctggcgtat ctcccacaag aacccagacg cgatgtggct gtgggtgaca 420
tccatctgcg gcgagttctg gttcggtttc tcgtggctgc tagatcagct gcccaagctg 480
aaccccatca accgcgtgcc ggacctggcg gtgctgcggc agcgcttcga ccgccccgac 540
ggcacctcca cgctcccggg gctggacatc ttcgtcacca cggccgaccc catcaaggag 600
cccatcctct ccaccgccaa ctcggtgctc tccatcctgg ccgccgacta ccccgtggac 660
cgcaacacat gctacgtctc cgacgacagt ggcatgctgc tcacctacga ggccctggca 720
gagtcctcca agttcgccac gctctgggtg cccttctgcc gcaagcacgg gatcgagccc 780
aggggtccgg agagctactt cgagctcaag tcacaccctt acatggggag agcccaggac 840
gagttcgtca acgaccgccg ccgcgttcgc aaggagtacg acgagttcaa ggccaggatc 900
aacagcctgg agcatgacat caagcagcgc aacgacgggt acaacgccgc cattgcccac 960
agccaaggcg tgccccggcc cacctggatg gcggacggca cccagtggga gggcacatgg 1020
gtcgacgcct ccgagaacca ccgcaggggc gaccacgccg gcatcgtact ggtgctgctg 1080
aaccacccga gccaccgccg gcagacgggc ccgccggcga gcgctgacaa cccactggac 1140
ttgagcggcg tggatgtgcg tctccccatg ctggtgtacg tgtcccgtga gaagcgcccc 1200
gggcacgacc accagaagaa ggccggtgcc atgaacgcgc ttacccgcgc ctcggcgctg 1260
ctctccaact cccccttcat cctcaacctc gactgcgatc attacatcaa caactcccag 1320
gcccttcgcg ccggcatctg cttcatggtg ggacgggaca gcgacacggt tgccttcgtc 1380
cagttcccgc agcgcttcga gggcgtcgac cccaccgacc tctacgccaa ccacaaccgc 1440
atcttcttcg acggcaccct ccgtgccctg gacggcatgc agggccccat ctacgtcggc 1500
actgggtgtc tcttccgccg catcaccgtc tacggcttcg acccgccgag gatcaacgtc 1560
ggcggtccct gcttccccag gctcgccggg ctcttcgcca agaccaagta cgagaagccc 1620
gggctcgaga tgaccacggc caaggccaag gccgcgcccg tgcccgccaa gggtaagcac 1680
ggcttcttgc cactgcccaa gaagacgtac ggcaagtcgg acgccttcgt ggacaccatc 1740
ccgcgcgcgt cgcacccgtc gccctacgcc gcggcggctg aggggatcgt ggccgacgag 1800
gcgaccatcg tcgaggcggt gaacgtgacg gccgccgcgt tcgagaagaa gaccggctgg 1860
ggcaaagaga tcggctgggt gtacgacacc gtcacggagg acgtggtcac cggctaccgg 1920
atgcatatca aggggtggcg gtcacgctac tgctccatct acccacacgc cttcatcggc 1980
accgccccca tcaacctcac ggagaggctc ttccaggtgc tccgctggtc cacgggatcc 2040
ctcgagatct tcttctccaa gaacaacccg ctcttcggca gcacatacct ccacccgctg 2100
cagcgcgtcg cctacatcaa catcaccact taccccttca ccgccatctt cctcatcttc 2160
tacaccaccg tgccggcgct atccttcgtc accggccact tcatcgtgca gcgcccgacc 2220
accatgttct acgtctacct gggcatcgtg ctatccacgc tgctcgtcat cgccgtgctg 2280
gaggtcaagt gggccggggt cacagtcttc gagtggttca ggaacggcca gttctggatg 2340
acagcaagtt gctccgccta cctcgccgcc gtctgccagg tgctgaccaa ggtgatattc 2400
cggcgggaca tctccttcaa gctcacatcc aagctaccct cgggagacga gaagaaggac 2460
ccctacgccg acctctacgt ggtgcgctgg acgccgctca tgattacacc catcatcatc 2520
atcttcgtca acatcatcgg atccgccgtg gccttcgcca aggttctcga cggcgagtgg 2580
acgcactggc tcaaggtcgc cggcggcgtc ttcttcaact tctgggtgct cttccacctc 2640
taccccttcg ccaagggcat cctggggaag cacggaaaga cgccagtcgt ggtgctcgtc 2700
tggtgggcat tcaccttcgt catcaccgcc gtgctctaca tcaacatccc ccacatgcat 2760
acctcgggag gcaagcacac aacggtgcat ggtcaccatg gcaagaagtt ggtcgacaca 2820
gggctctatg gctggctcca ttga 2844
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> AMY1 Fwd引物
<400> 3
gggtcatgca gggatatg 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> AMY1 Rev引物
<400> 4
cccagtcgaa gaaatgatc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> AMY1探针(FAM)
<400> 5
tacatcctca cgcacccag 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> BGL2 Fwd引物
<400> 6
taccagaacc tgttcgac 18
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> BGL2 Rev引物
<400> 7
acaccaccag cttcac 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> BGL2探针(FAM)
<400> 8
accgtggacg ccttctac 18
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> AGL97 Fwd引物
<400> 9
gagtcgccgg agatg 15
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> AGL97 Rev引物
<400> 10
gacttcacct tgatggc 17
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> AGL97探针(FAM)
<400> 11
catggtaagg ttcagctgcg 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> LD Fwd引物
<400> 12
cttcgatggg gtttgaac 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> LD Rev引物
<400> 13
ccgatttcct caccaaag 18
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> LD探针(FAM)
<400> 14
cctgtgcagg tgaattcatc a 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> RefA Fwd引物
<400> 15
gtctattgct tcctctgc 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> RefA Rev引物
<400> 16
gatgaccgaa gccttaac 18
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> RefA探针(HEX)
<400> 17
tgcgggcggc tatcaaa 17
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 18
Arg Val Leu Ile Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile
1 5 10 15
Trp Arg Ile Ser
20
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 19
Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp
1 5 10 15
Leu Leu Asp Gln Leu Pro
20
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 20
Leu Gln Arg Val Ala Tyr Ile Asn Ile Thr Thr Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是U
<400> 21
Ala Ile Phe Leu Ile Phe Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Xaa Phe Val
1 5 10 15
Thr
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 22
Thr Met Phe Tyr Val Tyr Leu Gly Ile Val Leu Ser Thr Leu Leu Val
1 5 10 15
Ile Ala
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽序列
<400> 23
Ile Thr Pro Ile Ile Ile Ile Phe Val Asn Ile Ile Gly Ser Ala Val
1 5 10 15
Ala Phe Ala Lys Val Leu Asp
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽序列
<400> 24
Leu Lys Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Asn Phe Trp Val Leu Phe His
1 5 10 15
Leu Tyr Pro Phe
20
PCT/RO/134表
具体实施方式
图1显示了微型麦芽制造(micromalting)过程的实例的示意图。
图2显示了在麦芽制造期间大麦突变体和参照谷粒的水吸收。
图3显示了麦芽制造期间大麦谷粒的根生长。还测量了样品的根生长，该样品在通气条件下在水中吸胀24小时，然后在空气中发芽24小时(24+24)。
图4显示了在突变体和参照成熟大麦谷粒(0)中和在1、2、3、4、5、6天的绿麦芽中以及在入炉干燥的麦芽(7天)中编码水解酶的基因的表达。还测量了样品中的酶活性，该样品在水中吸胀24小时，然后在空气中发芽24小时(24+24)。
图5显示了在麦芽制造期间在突变体和参照谷粒中测量的α-淀粉酶(a)、β-淀粉酶(b)和游离极限糊精酶(c)的活性。
图6显示了在突变体和参照成熟大麦谷粒(0天)和在1、2、3、4、5、6天时的绿麦芽中以及在入炉干燥的麦芽(7天)中的(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量。
定义
如本文所用，“一个(a)”可以指一个或多个，取决于使用它的上下文。
当在本文中相对于数值使用时，术语“大约(approximately)”和“约(about)”优选是指±10％，更优选±5％，还更优选±1％。
如本文所用，术语“氨基酸”是指蛋白氨基酸。优选地，蛋白氨基酸是由标准遗传密码编码的20个氨基酸之一。使用IUPAC一个和三个字母代码来命名氨基酸。
如本文所用，术语“对应于X的氨基酸”描述相对于参照多肽(例如SEQ IDNO:1的CsIF6)的氨基酸，给定多肽(例如，突变体CsIF6多肽)的氨基酸。在所述多肽和参照多肽之间比对之后，如果氨基酸与所述比对中的X在相同位置，则该氨基酸对应于X。
在指定核酸的上下文中，“编码(encoding)”或“编码(encoded)”是指包含用于转译成该指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸或多核苷酸可以在核酸的转译区域之内包含非转译序列，例如内含子，或者可以缺少这种干扰的非转译序列，例如在cDNA中。通过使用密码子来说明被编码的蛋白质的信息。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA的片段；它包括编码区之前和之后的区域(启动子和终止子)。此外，植物基因通常被内含子中断的外显子组成。
窑炉干燥(kiln drying)(或入炉干燥(kilning))是麦芽制造过程的一部分，是指干燥发芽的谷粒的步骤；所述谷粒也可以在发芽之前已经进行了浸泡步骤。窑炉干燥可以在常规温度下进行，例如至少75℃，例如80至90℃，例如80至85℃。窑炉干燥通常在升高的温度下进行。窑炉干燥过程的一个实例如下：在60℃下12小时；在68℃下3小时；在74℃下4小时；在80℃下3小时。窑炉干燥步骤将湿麦芽的水分含量或水含量从约40％降低到4％至5％。因此，窑炉干燥的麦芽的水含量为约4至5％。
“突变”包括基因的编码和非编码区中的缺失、***、替换、颠换和点突变。缺失可以是整个基因的缺失，或仅基因的一部分的缺失。点突变可以与一个碱基对的变化有关，并且可能例如导致提前终止密码子、移码突变、剪接位点突变或氨基酸替换。包含突变的基因可以被称为“突变体基因”。如果所述突变体基因包含突变并由此编码具有与野生型不同的序列的多肽，则所述多肽可以称为“突变体多肽”。
如本文所用，术语“辅料”是指在啤酒制备期间添加的富碳原料来源。辅料可以是未发芽的谷物谷粒，其可以与根据本发明制备的发芽的谷粒一起碾磨。辅料也可以是糖浆、糖等。
如本文所用，术语“芽(chit)”是指在谷物谷粒的发芽阶段期间可见的胚胎生长芽。
如本文所用，谷粒的术语“水含量”是指所述谷粒中H2O w/w的百分比。
如本文所用，术语“发芽的谷粒”是指已经发展出可见芽(优选至少1mm、例如至少2mm的芽)和可见茎的谷粒。
如本文所用，术语“开始发芽”是指水含量小于15％的大麦谷粒与足够的水接触以开始发芽的时间点。
除非另有说明，否则如本文所用，术语“β-葡聚糖”是指谷物细胞壁聚合物“(1,3；1,4)-β-葡聚糖”。
如本文所用，术语“(1,3；1,4)-β-葡聚糖合酶”应被认为是催化(1,3；1,4)-β-葡聚糖的合成以及任选地催化吡喃葡萄糖基单体的聚合的任何酶。例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖合酶可以是由CsIF基因编码的多肽或其功能同源物。
类似地，除非另有说明，否则本文所用的术语“木聚糖”是指谷物细胞壁聚合物“***糖基木聚糖”。
如本文所用，术语“窑炉干燥的麦芽(kiln dried malt)”和“入炉干燥的麦芽(kilned malt)”是指已通过窑炉干燥而干燥的发芽的谷物谷粒。窑炉干燥的麦芽的水含量通常为约4至5％。未经过窑炉干燥的麦芽称为“绿麦芽”。
如本文所用，术语“浸泡(steeping)”是指增加谷物籽粒(kernel)的水含量的过程。
如本文所用，术语“β-葡聚糖酶”是指具有使谷物β-葡聚糖解聚的潜力的酶。因此，除非另有说明，否则术语“β-葡聚糖酶”是指以(1,3；1,4)-β-和/或(1,4)-β-葡聚糖酶活性为特征的内切酶或外切酶或其混合物。
如本文所用，术语“木聚糖酶”是指具有降解木聚糖和***糖基木聚糖的主链和侧链的潜力的酶。因此，除非另有说明，否则术语“木聚糖酶”是指特征在于由一种或多种以下酶种类衍生的酶活性的一种酶或酶混合物：内切-1,4-木聚糖酶；外切-1,4-木聚糖酶；***呋喃糖苷酶；阿魏酸酯酶。
如本文所用，谷物谷粒的酶活性是指在由指定谷粒类型制备的面粉中测得的活性。例如，每克谷物谷粒10U/g的α-淀粉酶活性是指在衍生自所述谷物的1g面粉(干物质)的水性提取物中测量的所述α-淀粉酶活性(10U)。α-淀粉酶活性通过K-CERA 01/12(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。β-淀粉酶活性通过K-BETA3(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。极限糊精酶活性通过T-LDZ1000(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。
如本文所述的气体体积是指在1atm和20℃下所述气体的体积。
如本文所述的O2体积是指在1atm和20℃下O2的体积。在其中气体混合物中包含O2的本发明实施方案中，可以确定气体混合物的总体积，并且可以将O2的体积计算为由O2构成的总体积的百分比。举例来说，大气空气包含21％的O2。因此，如本文所用，大气空气中的O2的体积为大气空气总体积的21％。
详细描述
谷物谷粒
本发明的方法包括谷物谷粒发芽的步骤。
谷物谷粒可以是任何谷物的谷粒，例如选自大麦、水稻、高粱、玉米、小米、黑小麦、黑麦、燕麦和小麦的谷物。在本发明的优选实施方案中，谷物谷粒是大麦谷粒。所述谷粒可以是任何大麦品种的谷粒，例如本文下文“大麦”部分中描述的任何大麦品种。
谷物谷粒在发芽前可以具有相对较低的水含量。例如，谷物谷粒可以具有至多30％、优选至多20％、例如至多15％、例如5至15％的水含量。
在发芽之前，谷物谷粒可以已经过一个或多个抗微生物处理步骤。所述抗微生物处理可以是任何有用的抗微生物处理，其不会损害谷粒发芽的潜力。抗微生物处理例如可以是用一种或多种抗微生物剂进行的处理。所述抗微生物剂可以是任何抗微生物剂，其在所使用的浓度下对谷物谷粒没有毒性。例如，抗微生物剂可以是含氯化合物，例如次氯酸盐。该抗微生物剂也可以是过氧化物，例如过氧化氢和/或过乙酸。可用的商业抗微生物剂的非限制性实例包括
在本发明的一些实施方案中，通过在包含抗微生物剂的水性溶液中孵育谷物谷粒来进行抗微生物处理，因此抗微生物处理可以作为浸泡步骤的一部分来进行。在所述孵育之后，可以立即开始发芽步骤。因此，在这样的实施方案中，不需要改变水性溶液，并且相同的水性溶液可以用于抗微生物处理和浸泡步骤。当抗微生物剂是过氧化物(例如过氧化氢)时，尤其是这种情况。
可以优选在根据本发明的发芽步骤之前，所述谷物谷粒没有进行发芽。因此，可以优选谷物谷粒没有经过预发芽步骤。
如上所述，谷物谷粒可以是任何谷物谷粒。一些谷物谷粒包含外壳，而其他谷物谷粒是无壳的。在发芽步骤之前，可以对带壳的谷物谷粒进行处理以除去至少一部分的外壳。通常，如果使用无壳的谷物谷粒，则不需要去除外壳的处理。无壳的谷物包括例如无壳的大麦品种和小麦。
可以通过对谷物谷粒进行除去外壳的物理处理，从而对带壳的谷物谷粒进行处理以去除外壳。所述物理处理可以例如选自抛光、砂磨、剥离和平滑化。优选地，物理处理导致外壳损失。可以将外壳的损失确定为总体重量损失。因此，物理处理优选导致谷物谷粒总重量至少2％的损失，例如2％至7％的损失，优选至少3％的损失，例如3％至6％的损失。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的谷物并非仅通过实质上生物学方法获得。通过技术方法获得的植物的后代在本文中被认为不是仅通过实质上生物学方法获得的，因为亲本植株通过技术方法获得。
在一些实施方案中，谷物谷粒获自包含一种或多种突变的突变植物，其中所述突变是由化学和/或物理试剂诱导的。
大麦
在本发明的优选实施方案中，供本发明方法使用的谷物谷粒是大麦谷粒。
所述谷粒可以是任何大麦植物的谷粒。然而，在一些实施方案中，大麦植物可以包含一种或多种特定特征，例如，如本文下文所述的一种或多种特征。尽管在下文中单独讨论了各种特征，本发明的大麦植物可以具有这些特征的组合。
在本发明的一个实施方案中，大麦可以是无壳的大麦品种(var.)。在本发明中还包括大麦是具有天然薄壳的大麦品种，例如品种Admiral。例如，壳可以小于谷粒和壳总重量的7％。
大麦植物也可以是具有低水平的LOX活性的大麦植物。这样的大麦植物是本领域已知的，并且包括例如，在编码LOX-1的基因中携带突变的大麦植物。例如，大麦植物可以是在WO 02/053721、WO 2005/087934和WO 2004/085652中描述的在LOX-1基因中携带任何突变的大麦植物。
大麦植物也可以是在编码脂氧合酶1(LOX-1)的基因和/或在编码LOX-2的基因中携带突变的大麦植物。例如，大麦植物可以是在WO 2010/075860中描述的在LOX-1和LOX-2基因中携带任何突变的大麦植物。
大麦植物也可以是具有低水平的MMT活性的大麦植物。这样的大麦植物是本领域已知的，并且包括例如，在编码MMT的基因中携带突变的大麦植物。具体地，大麦植物可以是在WO 2010/063288中描述的在MMT基因中携带任何突变的大麦植物。大麦植物也可以是WO2011/150933中描述的任何大麦植物。
大麦植物也可以是以GA信号传导增强为特征的大麦植物。特别地，大麦植物可以是在编码DELLA蛋白的Slender1基因中携带突变的大麦植物。例如，大麦植物可以是携带由Chandler等人，2013，例如，在其中的表1中描述的任何突变的大麦植物。例如，大麦植物可以在Slender1基因中携带一个突变，从而导致编码突变体DELLA蛋白的突变体Slender1基因，其中所述突变体DELLA蛋白携带氨基酸编号46、490、280、268、271、277、231、481、282、277、227、485或237中的一个或多个的突变，例如选自G46E、S490F、R268H、G271D、A277T、V231M、R481H、V282F、A277T、G227E、S485F和C237Y的突变。氨基酸编号是相对于在Genbank登录号AK372064或AF035820(2013年2月4日的版本)下可获得的DELLA蛋白的序列提供的。
具有低水平的β-葡聚糖的大麦植物
如上所述，优选在打浆期间获得的水性提取物具有足够低的粘度以允许打浆混合物具有良好的过滤性。如上文也详细描述的，可溶性β-葡聚糖可以有助于水性提取物的高粘度。因此，在本发明的一些实施方案中，可能优选使用具有低水平β-葡聚糖的谷物植物-并且特别是大麦植物。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物的特征在于谷粒中具有低β-葡聚糖水平。在一个实施方案中，基于干重，谷粒中的所述β-葡聚糖水平为至多5％，例如1-5％w/w。在一个优选的实施方案中，基于干重，谷粒中的β-葡聚糖水平为至多3％，例如1-3％w/w。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物的特征在于谷粒中具有低β-葡聚糖水平。在一个实施方案中，谷粒中所述β-葡聚糖水平为野生型大麦植物(例如其他类似的野生型大麦植物，例如cv.Paustian的大麦植物)籽粒中的β-葡聚糖含量的至多60％，例如至多55％，例如30至60％。
在一个实施方案中，大麦植物可以具有低于检测水平的β-葡聚糖水平，例如没有β-葡聚糖。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物在编码β-葡聚糖合酶的任何基因中携带突变。所述基因例如可以是在US2012/0030784中阐述的编码SEQ ID NO:2的多肽的基因。例如，大麦植物可以是包含如US2012/0030784的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18所阐述的β-葡聚糖-缺陷基因的大麦。
在一个实施方案中，供本发明的方法使用的大麦植物可以在CslF6基因中携带突变，导致减少的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。来自大麦(Hordeum vulgare)栽培品种Sloop的野生型纤维素合酶样CslF6多肽序列的序列在本文中作为SEQ ID NO:1提供。来自大麦(Hordeum vulgare)栽培品种Sloop的野生型纤维素合酶样CslF6(CslF6)完整编码序列的序列在本文中作为SEQ ID NO:2提供。除了本文中作为SEQ ID NO:1提供的序列之外，野生型CslF6多肽也可以具有SEQ ID NO:1的序列，其中第590位的氨基酸已被苏氨酸替换。因此，携带A590T多态性的SEQ ID NO:1的多肽也可以被认为是野生型CslF6多肽(Taketa等人，(2012))。
在一个实施方案中，大麦植物在CslF6基因中携带突变。该突变可以是影响CslF6mRNA和/或CslF6蛋白质表达水平的突变。在一个实施方案中，突变可以是导致所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽的突变。CslF6基因中的突变可以是CslF6基因的任何突变，例如缺失、***或点突变。在本发明的一个实施方案中，突变是CslF6基因的编码区中的点突变。在一个实施方案中，突变导致提前终止密码子。由所述突变体CslF6基因编码的突变体CslF6多肽可以是任何突变体CslF6多肽。特别地，突变体CslF6多肽可以在CslF6的任何一个膜定位结构域中包含一个氨基酸的替换。突变体CslF6多肽可以优选在膜定位结构域中包含以下替换中的一个或多个：
·非极性氨基酸替换为带电荷的氨基酸，即非极性氨基酸被带电荷的氨基酸替代；和
·极性氨基酸替换为非极性氨基酸，即极性氨基酸被非极性氨基酸替代。
在本发明的一个实施方案中，突变体CslF6多肽可以包含在CslF6的任何一个膜定位结构域中的一个氨基酸的替换，即，在任何一个膜定位结构域中的氨基酸可以被另一氨基替代。CslF6的膜定位结构域在本文表1中显示。
表1.CslF6蛋白中膜定位的氨基酸序列的定位
例如，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847替换为带电荷的氨基酸，即氨基酸847被带电荷的氨基酸替代。例如，所述替换可以是847位上的甘氨酸(G)替换为带负电荷的氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸；换句话说，847位上的甘氨酸(G)可以被带负电荷的氨基酸例如甘氨酸或天冬氨酸替代。优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847的替换之外，其中所述替换是847位上的甘氨酸(G)替换为谷氨酸(E)，即847位上的甘氨酸(G)被谷氨酸(E)替代。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
例如，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748替换为带电荷的氨基酸，即氨基酸748被带电荷的氨基酸替代。例如，所述替换可以是748位上的甘氨酸(G)替换为带负电荷的氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸，即，748位上的甘氨酸(G)可以被带负电荷的氨基酸例如谷氨酸或天冬氨酸替代。优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748的替换之外，其中所述替换是在748位上的甘氨酸(G)替换为天冬氨酸(D)，即748位上的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)替代。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
例如，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体Cs1F6包含氨基酸709替换为非极性氨基酸，即氨基酸709被非极性氨基酸替代。例如，所述替换可以是709位上的苏氨酸(T)替换为非极性氨基酸，例如亮氨酸或异亮氨酸，即709位上的苏氨酸(T)可以被非极性氨基酸，例如亮氨酸或异亮氨酸替代。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸709的替换之外，其中所述替换是在709位上的苏氨酸(T)替换为异亮氨酸(I)，即709位上的苏氨酸(T)被异亮氨酸替代。
突变体CslF6多肽也可以是全长CslF6多肽的片段。例如，突变CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6基因包含提前终止密码子从而编码截短的CslF6多肽外。优选地，突变体CslF6多肽可以由突变体CslF6基因编码，其中突变体CslF6基因具有SEQ ID NO:2，除了突变体CslF6基因在编码序列的2028位上的核苷酸鸟嘌呤(G)替换为腺嘌呤(A)从而产生终止密码子外；换句话说，2028位上的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)替代。因此，所得突变体CslF6多肽包含676位上的苏氨酸(T)替换为终止密码子(T676Stop)，即676位上的苏氨酸(T)。另外，所述突变体CslF6可以任选地携带A590T多态性。
大麦植物可以在CslF6基因中携带任何突变。这种突变可能例如导致CslF6基因沉默，导致大麦谷粒具有极低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖(如Taketa等人，2011年所述)。大麦植物也可以是包含CslF6基因中的突变的m351突变体(如Hu等人，(2014)所述)，其导致(1-3,1-4)β-葡聚糖水平极低(<1.6％)。
为了本专利申请的目的，根据布达佩斯条约的规定将大麦植物(大麦(Hordeumvulgare))的种子命名为“突变体2”，其已保存在NCIMB Ltd.Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA Scotland。突变体2大麦植物于2018年11月12日保藏，登记号为NCIMB 43273。在一个实施方案中，大麦植物是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物(大麦(Hordeum vulgare))，登记号为NCIMB 43273，并且称为“突变体2”或其后代。因此，大麦植物可以是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物突变体2，其登记号为NCIMB 43273，或者其任何后代大麦植物，其中大麦植物携带HvCslF6基因(SEQ ID NO:2)的编码序列的核苷酸2243的G→A突变和/或其中所述大麦植物的HvCslF6基因编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸748的Gly→Asp突变的突变体HvCslF6蛋白。
谷物谷粒也可以是植物如突变植物的后代。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的大麦谷粒是来自大麦植物的谷粒，其并非仅是通过实质上生物学方法获得。通过技术方法获得的大麦植物的后代在本文中被认为不是仅通过实质上生物学方法获得的，因为亲本植株是通过技术方法获得的。
在转让给与本申请相同的申请人和具有相同的申请日期的题为“具有改善的细胞壁特性的谷物植物(Cereal plants with improved cell wall properties)”的共同未决申请中描述了用于获得这种植物的方法。
大麦植物也可以在任何其他基因(例如，调节基因)中携带突变，导致低水平的β-葡聚糖。
发芽
本发明的涉及水性谷物提取物的生产或由此类谷物提取物制备的饮料的生产的方法包括使谷物谷粒发芽的步骤。
谷物谷粒可以是本文上文在“谷物谷粒”、“大麦”和“具有低水平的β-葡聚糖的大麦植物”部分中所述的任何谷物谷粒。
发芽步骤可以包括一个或多个浸泡所述谷物谷粒的步骤和一个或多个使所述谷物谷粒发芽的步骤。浸泡和发芽的步骤也可以组合或部分地组合，使得浸泡和发芽同时发生或至少部分地同时发生。
如上文“谷物谷粒”部分所述，在开始发芽之前，该方法还可以包括将所述谷物谷粒去皮的初始步骤。所述去皮对于增强谷物谷粒的水吸收和随后的诱导发芽以及除去谷物谷粒表面上的潜在微生物可能是有益的。另外地或替代地，如上文“谷物谷粒”部分中所述，也可以通过使谷物谷粒进行一个或多个抗微生物处理步骤而在发芽之前除去谷物谷粒上的微生物。
可以通过技术人员已知的任何常规方法进行浸泡。进行浸泡是为了增加谷粒的水含量并由此开始发芽。浸泡通常包括一个或多个在潮湿条件下孵育谷物谷粒的步骤，例如通过将谷物谷粒浸没在水性溶液中。
一个非限制性实例涉及在交替的干燥和潮湿条件下进行浸泡。浸泡可以在任何可用的温度下进行，例如在10至25℃范围内的温度下，例如在大约15℃下进行。
例如，在浸泡期间，可以将谷物谷粒湿孵育30分钟至10小时，然后干孵育30分钟至24小时，并可以任选地在潮湿和/或干燥条件下重复所述孵育2至5次。浸泡后的最终水含量可以为例如40％至50％。
另一个非限制性实例涉及浸泡，其中将谷物谷粒湿孵育以获得32至37％、例如约35％的水含量。这样的湿孵育可以持续例如5至12小时，例如5至10小时，然后干孵育12至30小时，例如15至20小时。然后，可以将谷物谷粒湿孵育以获得约37至43％、例如大约40％的水含量。这可以通过湿孵育2至10小时、例如3至7小时来实现。湿孵育之后，可以进行另外的干孵育10至30小时，例如15至25小时。最后，可以将谷物谷粒湿孵育以达到43-47％、例如约45％的水含量。这可以通过湿孵育1至10小时、例如1至5小时来实现。图1概述了浸泡过程的一个非限制性实例。
在一个实施方案中，所述浸泡或所述湿孵育可以至少部分地在通风下进行。因此，可以将所述谷物谷粒在水性溶液中在气流下孵育，例如同时使O2通过水性溶液。气流可以例如是下文描述的任何气流。在另一个实施方案中，所述浸泡是在没有通风的情况下进行。
谷粒的发芽可以通过技术人员已知的任何常规方法进行。一个非限制性实例涉及在10至25℃范围内、例如在13至18℃范围内的温度下发芽，任选地随变化的温度，持续1至4天。在发芽期间，可以使谷物谷粒处于潮湿条件下，以保持所需的水含量，例如40％至45％的水含量。
另外，例如，如下面更详细地描述的，谷物谷粒可以在发芽期间经受气流。
图1显示了发芽的一个非限制性实例。所述潮湿条件可以通过将水性溶液喷雾到所述谷物谷粒上而获得。潮湿条件也可以通过使潮湿空气流通过发芽中的谷物谷粒而获得。
所述气流可以是可以支持发芽的任何足够的气流。技术人员将能够确定足够的气流，例如基于Briggs等人，1998年或Kunze，2014年，技术酿造和麦芽制造(TechnologyBrewing and Malting)。气流可以是包含O2或甚至由O2组成的任何气体流。在一个实施方案中，气流可以为每小时每千克谷物谷粒至少2L、优选至少3L、更优选至少4L、还更优选至少5L、甚至更优选至少6L的O2。所述谷物谷粒的重量为干重。例如，气流可以为每小时每千克谷物谷粒(干重)2至100L、例如2至75L、例如2至50L、例如4至100L、例如4至75L、例如4至50L、例如6至100L、例如6至75L、例如6至50L的O2。气流通常可以是大气空气形式。因此，气流可以为每小时每千克谷物谷粒至少10L、优选至少15L、更优选至少20L、还更优选至少25L、甚至更优选至少30L的大气空气。所述谷物谷粒的重量为干重。例如，气流可以为每小时每千克谷物谷粒(干重)10至500L、例如10至375L、例如10至250L、例如20至500L、例如20至375L、例如20至250L、例如30至500L、例如30至375L、例如30至250L的大气空气。
在一个实施方案中，本文所述的用于生产水性谷物提取物或用于生产由其衍生的饮料的方法的整个发芽步骤的持续时间不超过108小时。在一个实施方案中，发芽步骤不超过96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行48至108小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行72至108小时，例如大约96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行65至80小时，例如大约72小时。
本发明的一个方面是，发芽的持续时间从开始发芽时测量，例如，发芽的持续时间可以测量为从开始发芽直到细分发芽的谷物谷粒开始为止。
在一些实施方案中，在发芽后，谷物谷粒具有至少30％、优选至少35％、更优选至少40％、例如40％至45％的水含量。在一些实施方案中，谷物谷粒在发芽后具有至少30％的水含量，例如至少31％、例如至少32％、例如至少33％、例如至少34％、例如至少35％、例如至少36％、例如至少37％、例如至少38％、例如至少39％、例如至少40％、例如至少45％、例如至少46％、例如至少47％、例如至少48％、例如至少49％、例如至少50％。
谷物谷粒的水含量可以通过测定谷物谷粒的重量，然后干燥所述谷物谷粒以及测定干燥的谷物谷粒的重量来确定。湿谷物谷粒和干谷物谷粒的重量差被认为是水，并且水含量被提供为水的重量除以谷物谷粒(湿谷物谷粒)的总重量。水含量也可以通过将开始发芽之前的谷物谷粒的重量与发芽期间或之后的谷物谷粒的重量进行比较来确定，其中将发芽的谷物谷粒进行短时间离心以除去任何表面水。因此，以％提供的水含量为w/w％。
谷物谷粒的发芽可以在任何可用的温度下进行。然而，可以优选谷物谷粒在至少10℃的温度下发芽。特别地，谷物谷粒可以在10至25℃、优选12至25℃、例如15至20℃范围内的温度下发芽。
在一些实施方案中，例如如WO2016/071463中所述，可以在发芽步骤期间添加一种或多种外源酶。可以任选地通过添加一种或多种能够加速发芽的化合物来缩短发芽过程。例如，可以添加植物激素赤霉酸(GA)-在孵育开始或在孵育期间。GA“激活”其靶细胞即大麦谷粒的糊粉和盾片上皮中的基因表达，包括编码水解淀粉、贮藏蛋白质和细胞壁多糖所必需的内源酶的基因。
谷物谷粒优选地在发芽后基本上立即进行细分。因此，本发明的方法优选在发芽步骤和细分谷物谷粒之间不包括干燥步骤。优选的是，本发明的方法不包括将所述发芽的谷物谷粒进行窑炉干燥的步骤。
发芽的谷物谷粒
本发明涉及一种用于生产饮料的方法和一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括生产发芽的谷物谷粒的步骤。
发芽的谷物谷粒优选包含一种或多种水解酶活性，例如由α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉脱支酶(例如，极限糊精酶)、α-葡糖苷酶和蛋白酶提供的。
通常，水解酶活性的开始可以以及时协调的方式发生，因此一些水解酶的活性可以用作其他水解酶活性的标志物。
因此，优选的是，发芽的谷物谷粒具有足够水平的可测量的α-淀粉酶活性。优选地，发芽的谷物谷粒具有至少30U/g、例如至少50U/g、例如至少100U/g谷物谷粒(干重)的可测量的α-淀粉酶活性。α-淀粉酶活性优选根据标准方法，例如，通过使用来自爱尔兰Megazyme的Ceralpha试剂盒(K-CERA)来确定。具体地，可以如下文实施例5中所述测定α-淀粉酶活性。
还可以优选发芽的谷物谷粒具有足够水平的可测量的β-淀粉酶活性。优选地，发芽的谷物谷粒具有至少5U/g、例如至少10U/g谷物谷粒(干重)的可测量的β-淀粉酶活性。优选地，β-淀粉酶活性根据标准方法，例如，通过使用来自爱尔兰Megazyme的Betamyl试剂盒(K-BETA3)来测定。特别地，可以如下文实施例5中所述测定β-淀粉酶活性。
还优选的是发芽的谷物谷粒具有足够水平的极限糊精酶活性。优选地，发芽的谷物谷粒具有至少2mU/g、例如至少5U/g、例如至少10U/g、例如至少20U/g谷物谷粒(干重)的极限糊精酶活性。优选地，极限糊精酶活性是根据标准方法，例如通过使用来自爱尔兰Megazyme的极限糊精酶试剂盒T-LDZ1000来确定。特别地，极限糊精酶活性可以如下文实施例5中所述测定。
有趣的是，与常规的绿麦芽相比，根据本发明的发芽的谷物谷粒具有显著减少的小根。因此，根据本发明的发芽的谷物谷粒优选包含每100g发芽的大麦至多10g小根，例如每100g发芽的大麦至多8g小根，优选每100g发芽的大麦至多6g小根，甚至更优选每100g发芽的大麦至多4g小根，其中小根的质量和发芽的大麦的质量均以干重形式提供。优选地，如下文实施例3中所述确定小根的质量。
如上所述，优选在打浆期间获得的水性提取物具有足够低的粘度以允许打浆混合物具有良好的过滤性。如上文也详细描述的，可溶性β-葡聚糖可以有助于水性提取物的高粘度。过滤性可能经常取决于β-葡聚糖的水平。因此，可以优选发芽的谷物谷粒中的β-葡聚糖的水平不太高。
优选地，发芽的谷物谷粒具有的β-葡聚糖含量低于5％，例如低于3％w/w，例如低于2％w/w，例如低于1.5％w/w，优选低于1.0％w/w，基于干重。
细分发芽的谷物谷粒
本发明的用于生产饮料的方法和用于生产谷物的水性提取物的方法，其中所述方法包括细分发芽的谷物谷粒的步骤。
在将所述谷物谷粒细分时，它们优选仍具有高水含量，优选地，所述谷物谷粒的水含量为至少20％，例如不小于25％，例如不小于30％，优选不小于35％，例如不小于40％。在一些实施方案中，谷物谷粒在发芽后直至细分谷物谷粒的任何时候的水含量都不小于30％，例如不小于31％，例如不小于32％，例如不小于33％，例如不小于34％，例如不小于35％，例如不小于36％，例如不小于37％，例如不小于38％，例如不小于39％，例如不小于40％，例如不小于45％，例如不小于46％，例如不小于47％，例如不小于48％，例如不小于49％，例如不小于50％。
例如，发芽的谷物谷粒可以直接从发芽转移到用于细分谷物谷粒的设备中。因此，发芽的谷物谷粒在进行细分时的水含量可以与谷物谷粒在发芽后立即具有的水含量(例如，上文在“发芽”部分中所述的水含量)相同。特别地，该方法通常不包括通过经受升高的温度来干燥发芽的谷物谷粒的步骤。优选地，在发芽后和细分所述谷物谷粒之前的任何时间，发芽的谷物谷粒的水含量不小于20％，例如不小于25％，例如不小于30％，优选不小于35％，例如不小于40％。因此，该方法优选地不包括窑炉干燥发芽的谷物谷粒的步骤。
可以使用适合于细分水含量大于20％、例如不小于25％、例如不小于30％、优选不小于35％、甚至更优选不小于40％、还更优选不小于45％的谷物谷粒的任何设备对发芽的谷物谷粒进行细分。例如，可以对发芽的谷物谷粒进行碾磨，例如湿磨。用于碾磨发芽的谷物谷粒的可用的碾磨机包括可从USA的Millstar获得的碾磨机。也可以对发芽的谷物谷粒进行研磨。
通常，将谷物谷粒细分到一定程度，使得可以制备谷物谷粒的可发酵糖的水性提取物。因此，谷物谷粒被充分地***，使得1kg所述细分的谷物谷粒的7L水性提取物具有至少8°Plato的比重。
在本发明的实施方案中，其中水性提取物由发芽的谷物谷粒和一种或多种辅料制成，也可以对所述辅料进行细分。特别地，当所述辅料包含未发芽的谷物谷粒时可能是这种情况。可以在单独的程序中对所述辅料进行细分，例如碾磨。然而，在本发明中还包括对辅料与发芽的谷物谷粒一起进行细分。类似地，如果水性提取物由发芽的谷物谷粒和窑炉干燥的麦芽制成，则可以在单独的程序中对所述窑炉干燥的麦芽进行细分，例如碾磨。然而，在本发明中还包括对窑炉干燥的麦芽与发芽的谷物谷粒一起进行细分。
制备水性提取物
本发明的方法还包括制备细分的发芽的谷物谷粒的水性提取物的步骤。所述步骤可以例如是，打浆步骤。
通常，可以通过在水中或在水性溶液(在本文中也称为“打浆溶液”)中孵育细分的谷物谷粒来制备上述水性提取物。打浆溶液可以是任何水性溶液，但它通常由水(例如自来水)组成，可以向其中添加一种或多种另外的试剂。为了与在发芽期间添加的另外的试剂进行区分，这些另外的试剂可以称为“另外的打浆剂”。因此，打浆溶液可以由水(例如，自来水)组成，向其中添加一种或多种另外的打浆剂。打浆剂可以从一开始就存在于打浆溶液中，或者它们可以在制备水性提取物的过程期间加入。
所述另外的打浆剂可以是酶。因此，打浆溶液可以包含一种或多种酶。所述酶可以从过程开始时或之后在过程期间添加到打浆溶液中。
所述酶可以例如是一种或多种水解酶。合适的酶包括脂肪酶、淀粉降解酶(例如，淀粉酶)、葡聚糖酶[优选(1-4)-和/或(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶]、和/或木聚糖酶(例如，***糖基木聚糖酶)、和/或蛋白酶，或包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultraflo或Ondea Pro(Novozymes)。例如，打浆溶液可以包含一种或多种水解酶，其中至少一种水解酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，打浆溶液包含以下酶中的一种或多种：
-β-葡聚糖酶，例如内切-(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶。
-木聚糖酶，例如内切-或外切-1,4-木聚糖酶、***呋喃糖苷酶或阿魏酸酯酶
-α-淀粉酶
-支链淀粉酶或极限糊精酶
-葡糖淀粉酶。
是否向打浆溶液中添加酶，以及添加何种酶的决定，可能取决于所用的谷物谷粒。因此，在本发明的实施方案中，其中谷物是具有低水平的β-葡聚糖的大麦植物(例如，如本文上文“大麦”部分中所述)，则可以向打浆溶液中添加很少的β-葡聚糖酶或不添加β-葡聚糖酶。
在一个实施方案中，优选在打浆期间不添加外源蛋白酶。蛋白酶的添加可能不太优选，因为蛋白酶可能影响酶活性。在一个实施方案中，优选在打浆期间不添加外源脂肪酶。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间每克发芽的谷物谷粒(干物质)使用至多700U、优选至多350U的外源葡糖淀粉酶。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间每千克发芽的谷物谷粒(干物质)使用至多400AGU、优选至多200AGU的外源葡糖淀粉酶。AGU的确定可以如US7060468中所述进行。
在另一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间使用的组合的外源葡糖淀粉酶和α-淀粉酶不超过700U、优选不超过350U/g发芽谷物谷粒(干物质)。组合的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶活性可以例如使用K-CERA 01/12(可从爱尔兰Megazyme获得的方案和试剂盒)测定。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间使用每千克发芽的谷物谷粒(干物质)至多20U的外源支链淀粉酶或极限糊精酶。
在一个实施方案中，优选的是在水性提取物的制备期间使用每千克发芽的谷物谷粒(干物质)至多100PUN的支链淀粉酶。PUN的测定可以如US7060468中所述进行。
所述另外的打浆剂也可以是辅料，例如未发芽的谷物谷粒、糖浆或糖。如果添加了辅料，这些辅料也可以已经例如通过碾磨或研磨进行了细分。如果辅料是谷物谷粒，例如尚未发芽的谷物谷粒，则通常可以对其进行细分或碾磨。如果辅料是糖浆、糖等，则对这些通常不进行碾磨。可以在该过程中的任何时间将诸如糖或糖浆的辅料添加到打浆溶液中；然而，也可以将此类辅料添加到水性提取物中或者在如下所述的制备饮料的过程期间稍后进行添加。通常，以比发芽的谷物谷粒少的量添加辅料。因此，水性提取物中至少50％、优选至少70％、例如至少90％的碳水化合物来源于发芽的谷物谷粒，而辅料优选仅占碳水化合物的一小部分。如果辅料是未发芽的谷物谷粒，则优选的是如根据干重测定的，发芽的谷物谷粒占总谷物谷粒的至少50％(w/w)，优选至少70％(w/w)，更优选至少90％(w/w)。
另外的打浆剂也可以是窑炉干燥的麦芽。如果添加了窑炉干燥的麦芽，其也可以已经例如通过碾磨或研磨进行了细分。通常，以比发芽的谷物谷粒少的量添加窑炉干燥的麦芽。因此，如根据干重测定的，发芽的谷物谷粒(即未经过窑炉干燥的发芽的谷物谷粒)占总谷物谷粒和麦芽的至少80％(w/w)，优选至少90％(w/w)，更优选至少95％(w/w)。在优选的实施方案中，不添加窑炉干燥的麦芽。
所述另外的打浆剂，优选具有食品级品质，也可以是盐，例如CaCl2。
所述另外的打浆剂也可以是酸，优选为食品级酸，例如H3PO4。
通常，通过在一个或多个预定温度下将细分的发芽的谷物谷粒在打浆溶液中孵育来制备水性提取物。所述预定的温度在本文中也可以称为“打浆温度”。所述打浆温度可以例如是用于打浆的常规温度。
通常使打浆温度保持恒定(等温打浆)，或逐渐升高，例如以顺序方式升高。在任一种情况下，细分的发芽的谷物谷粒中的可溶性物质都释放到所述打浆溶液中，从而形成水性提取物。
打浆温度通常为30至90℃、例如40至85℃、例如50至80℃范围内的温度。可以根据所使用的谷物类型选择打浆温度。因此，在本发明的实施方案中，其中谷物谷粒是不存在或具有低水平的脂氧合酶(LOX)活性和/或甲基蛋氨酸转移酶(MMT)活性的大麦(参见下文“大麦”部分中的详细信息)，打浆温度可以较低，例如在35至69℃的范围内。
在打浆溶液中孵育可以进行任何合适的时间量。在打浆容器中的打浆溶液中孵育的时间可以例如为60至300分钟，例如60至240分钟，例如90至300分钟，例如90至240分钟，例如90至270分钟。例如，所述在打浆溶液中孵育的时间可以是常规打浆中使用的任何时间。合适的打浆的一个非限制性示例是：
(1)在50-60℃范围内、例如大约55℃的温度下调浆(Mashing-in)，10至30分钟，例如大约15分钟。
(2)加热到60至70℃范围内、优选60至65℃范围内、例如大约62℃的温度，30至90分钟，例如大约60分钟。
(3)加热到70至75℃范围内、例如大约72℃的温度，5至30分钟，例如大约15分钟。
(4)加热到75至80℃范围内、优选75至78℃范围内、例如大约78℃的温度，5至15分钟，例如大约10分钟。
在打浆容器中在打浆溶液中孵育之后，打浆溶液中的细分的发芽的谷物谷粒可以转移到另一个容器(例如，过滤槽)中，并在升高的温度下孵育另外的时间，例如在70至78℃范围内的温度下持续30至120分钟的时间。
因此，除了上述步骤外，在打浆溶液中孵育还包括以下步骤(5)：
(5)加热到70至78℃范围内、优选75至78℃范围内、例如大约78℃的温度，30至120分钟，例如大约60分钟。
非限制性实例可以在酿造文献中找到，例如，Briggs等人(同上)和Hough等人(同上)。
优选的是，打浆步骤不包括煮沸细分的谷物谷粒。换句话说，在水或水性溶液中孵育细分的谷物提取物期间，温度始终保持低于沸点。然而，在分离水性提取物与废谷粒之后，可以将水性提取物煮沸。通常，在远低于沸点温度的温度下，通常在低于90℃、例如低于85℃、例如低于80℃的温度下进行制备细分的发芽的谷物谷粒的水性提取物的步骤。
在打浆溶液中孵育后，通常可以将水性提取物例如通过过滤分离为水性提取物和残留的未溶解的固体谷粒，后者也称为“废谷粒”。过滤例如可以在过滤槽中进行。或者，过滤可以是通过打浆过滤器过滤。如此获得的水性提取物也可以称为“第一麦芽汁”。
在也称为喷洒(sparging)的过程期间，可以将其他液体(例如水)添加到废谷粒中。在喷洒和过滤后，可以获得“第二麦芽汁”。可以通过重复该程序制备进一步的麦芽汁。
因此，水性提取物可以是麦芽汁，例如第一麦芽汁、第二麦芽汁、进一步的麦芽汁或其组合。
水性提取物
通过本发明的方法制备的水性提取物可以具有许多有用的性质，包括-但不限于-本部分中描述的性质。通过本发明方法制备的水性提取物可以如本文所述在饮料中进一步加工。
如上所述，可以对水性提取物进行过滤步骤。因此，可以优选，麦芽汁具有良好的过滤性。例如，过滤高粘度液体可能在技术上具有挑战性-水性提取物具有低粘度可能是优选的原因。
可以以多种方式确定过滤性。在一个实施方案中，将过滤性确定为通过配备有滤纸的过滤漏斗过滤1小时后获得的液体量。在一个实施方案中，当将包含100g细分的谷物谷粒的400mL打浆溶液加入到所述过滤漏斗中时，水性提取物可以具有至少250mL的过滤性。还可以将过滤性确定为如上所述过滤60分钟后获得的液体体积与添加到所述漏斗中的水性提取物的液体体积相比的百分比。因此，在一个实施方案中，过滤性可以例如为至少50％，例如至少60％(v/v)。具体地，可以如国际专利申请PCT/EP2017/065498的实施例3中所述确定过滤性。
过滤性可能经常取决于β-葡聚糖的水平。因此，可以优选，β-葡聚糖的水平不太高。例如，在一个实施方案中，水性提取物可以包含至多200mg/L、优选至多150mg/L的β-葡聚糖。
在一些实施方案中，谷物的水性提取物不包含类黑精。
谷物谷粒的水性提取物的生产方法
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒，其中所述发芽步骤包括将所述谷粒在水性溶液中孵育直到谷粒的水含量为至少30％，其中每小时使至少2L O2/kg干重谷物谷粒通过所述水性溶液；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述碾磨的细分的发芽谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％；
从而生产谷物的水性提取物。
在一个实施方案中，发芽步骤可以包括一个或多个浸泡步骤。可以优选，整个发芽步骤的持续时间不超过108小时，例如可以不超过96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行72至108小时，例如大约96小时。在一个实施方案中，发芽步骤进行65至80小时，例如大约72小时。
本发明的一个方面是，从开始发芽时测量发芽的持续时间。
在一个实施方案中，发芽的结束可以是细分发芽的谷粒的开始。
应当理解，术语“在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％”包括例如所述谷物谷粒在从步骤b)的完成到步骤d)的开始的任何时候都可以具有高于20％的水含量。
用于制备谷物的水性提取物的本发明方法不包括在上述步骤b)和d)之间的任何时间进行窑炉干燥的步骤。在一些实施方案中，该方法不包括在上述步骤b)和c)之间的任何时间进行窑炉干燥的步骤。在其他实施方案中，该方法不包括在步骤c)和d)之间的任何时间进行窑炉干燥的步骤。如上所述，这是因为本发明人惊奇地发现，可以省去窑炉干燥的步骤，并且可以在对发芽的谷粒不进行窑炉干燥的情况下获得水性谷物提取物，特别是适合于生产饮料的提取物。从实施例3中可以看出，根据本发明方法发芽的大麦谷粒的根生长令人惊讶地显著降低；因此，可以省去窑炉干燥的步骤。
谷物谷粒可以是本文上面描述的任何谷物谷粒。在一个实施方案中，大麦植物是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物(大麦(Hordeum vulgare))，登记号为NCIMB43273，并被称为“突变体2”；或其后代。因此，大麦植物可以是在2018年11月12日在NCIMB保藏的大麦植物突变体2，其登记号为NCIMB 43273，或者其任何后代大麦植物，其中所述大麦植物携带HvCslF6基因(SEQ ID NO:2)的编码序列的核苷酸2243的G→A突变和/或其中所述大麦植物的HvCslF6基因编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸748的Gly→Asp突变的突变体HvCslF6蛋白。
谷物谷粒也可以是植物如突变植物的后代。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的大麦谷粒是来自大麦植物的谷粒，所述大麦植物并非仅是通过实质上生物学方法获得。通过技术方法获得的大麦植物的后代在本文中被认为不是仅通过实质上生物学方法获得的，因为亲本植株是通过技术方法获得的。
在转让给与本申请相同的申请人并具有相同的申请日期的题为“具有改善的细胞壁特性的谷物植物(Cereal plants with improved cell wall properties)”的共同未决申请中描述了用于获得这种植物的方法。
重要的是，本发明方法在发芽后的任何时间不需要窑炉干燥的步骤，即在发芽后、在碾磨或细分发芽的谷粒后或在制备水性提取物后不进行窑炉干燥。因此，在优选的实施方案中，本发明方法在直到获得谷物的水性提取物的任何时间不包括窑炉干燥的步骤，所述谷物的水性提取物可用于例如通过酿造来制备饮料。
在一些实施方案中，通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中所含氨基酸的水平与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中包含的氨基酸水平相当。在一些实施方案中，通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的氨基酸水平为500至3000mg/L，例如600至2900mg/L，例如700至2800mg/L，例如800至2700mg/L，例如900至2600mg/L，例如1000至2500mg/L，例如1100至2400mg/L，例如1200至2200mg/L，例如1300至2100mg/L，例如1400至2000mg/L。在一些实施方案中，通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的氨基酸水平为至少500mg/L，例如至少600mg/L，例如至少700mg/L，例如至少800mg/L，例如至少900mg/L，例如至少1000mg/L，例如至少1250mg/L，例如至少1500mg/L，例如至少1600mg/L，例如至少1700mg/L，例如至少1800mg/L，例如至少1900mg/L，例如至少2000mg/L。氨基酸水平代表水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的总氨基酸水平，例如如在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选地如上文所述在发芽48小时至108小时后测量的。测量氨基酸水平的方法是技术人员已知的。
通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中存在的可发酵碳水化合物的水平与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中存在的可发酵碳水化合物的水平相比优选保持不变。在一些实施方案中，可发酵碳水化合物的水平(即，所有可发酵碳水化合物的总和)为5至20mg/100mL，例如6至19mg/100mL，例如7至18mg/100mL，例如8至17mg/100mL，例如9至16mg/100mL，例如10至15mg/100mL，例如10至14mg/100mL，例如11至13mg/100mL，例如约12mg/100mL。在一些实施方案中，通过本发明方法制备的麦芽汁的可发酵碳水化合物的水平为至少5mg/100mL，例如至少6mg/100mL，例如至少7mg/100mL，例如至少8mg/100mL，例如至少9mg/100mL，例如至少10mg/100mL，例如至少11mg/100mL，例如至少12mg/100mL，或更多。可发酵碳水化合物的水平代表水性谷物提取物如麦芽汁中的总可发酵碳水化合物的水平，例如在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选地如上所述在发芽48小时至108小时后测量的。测量可发酵碳水化合物的水平的方法是技术人员已知的。
通过本发明方法制备的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的转化糖的水平与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的水平相比优选保持不变。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的水性谷物提取物(例如麦芽汁)中的转化糖的水平为1至5g/100mL，例如1.5至4g/100mL，例如1.75至3.25g/100mL，例如2至3g/100mL，例如2.1至2.9g/100mL，例如2.3至2.8g/100mL，例如2.4至2.7g/100mL，例如2.5至2.6mg/100mL。在一些实施方案中，转化糖的水平为至少1mg/100mL，例如至少1.5mg/100mL，例如至少1.6mg/100mL，例如至少1.7mg/100mL，例如至少1.8mg/100mL，例如至少1.9mg/100mL，例如至少2.0mg/100mL，例如至少2.1mg/100mL，例如至少2.2mg/100mL，例如至少2.3mg/100mL，例如至少2.4mg/100mL，例如至少2.5mg/100mL。转化糖的水平代表水性谷物提取物如麦芽汁中的总转化糖的水平，例如在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选地如上所述在发芽48小时至108小时后测量的。测量转化糖水平的方法是技术人员已知的。
制备饮料
在一些实施方案中，本发明的方法还包括将通过本发明的上述方法制备的水性提取物加工成饮料的步骤。
因此，一方面，提供了一种用于生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.通过包括以下步骤的方法制备水性提取物：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述细分的发芽谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％；
从而获得谷物的水性提取物；
和
ii.将所述水性提取物加工成饮料。
水性提取物可以在存在或不存在啤酒花的情况下煮沸，在此之后其可以称为煮沸的麦芽汁。
首先，可以将第二麦芽汁和进一步的麦芽汁合并，然后进行加热或煮沸。可以将水性提取物加热或煮沸任何合适的时间量，例如60分钟至120分钟。在加热或煮沸期间，由于蒸发，水性提取物的体积可能减少。可以优选，水性提取物的体积减少小于8％，优选小于5％。这可以显著降低能耗。
可以通过水性提取物的发酵，例如通过麦芽汁的发酵，来制备饮料。因此，可以通过用酵母发酵水性提取物来制备饮料。
在一个实施方案中，饮料可以是酒精饮料，例如啤酒。在其他实施方案中，饮料可以是基于发芽的谷物谷粒的非酒精饮料。非酒精饮料可以例如是非酒精啤酒或其他种类的非酒精饮料，例如maltina。优选地，饮料不是kvass麦芽汁。
在一个优选的实施方案中，饮料是啤酒。因此，啤酒例如可以选自老啤酒(Altbier)、琥珀啤酒(Amber ale)、大麦酒(Barley wine)、柏林白啤酒(Berlinerweisse)、北法风格窖藏啤酒(Bière de Garde)、苦啤酒(Bitter)、金色麦啤(Blonde Ale)、博克啤酒(Bock)、棕色艾尔啤酒(Brown ale)、加州蒸汽啤酒(California Common)、奶油爱尔啤酒(Cream Ale)、多特蒙德出口型啤酒(Dortmunder Export)、双博克啤酒(Doppelbock)、深色啤酒(Dunkel)、小麦黑啤(Dunkelweizen)、冰啤酒(Eisbock)、水果拉比克啤酒(Fruit lambic)、金色爱尔啤酒(Golden Ale)、哥塞啤酒(Gose)、香槟啤酒(Gueuze)、小麦啤酒(Hefeweizen)、淡啤酒(Helles)、印度淡啤酒(India pale ale)、科隆啤酒
因此，本发明还涉及生产饮料的方法，其包括以下步骤：
-通过根据本发明的方法制备水性提取物。
-将所述提取物加工成饮料。
酒精饮料-如啤酒-可以根据本发明的方法由发芽的谷物谷粒制造。除啤酒花和酵母菌外，发芽的谷物谷粒也有助于啤酒的风味和颜色。
一旦制备了水性提取物，就可以通过包括常规酿造方法在内的任何方法将其加工成啤酒。合适的酿造方法的实例的非限制性描述可以在例如Briggs等人(1981)和Hough等人(1982)的出版物中找到。有许多定期更新的大麦和啤酒产品分析方法可用，例如但不限于美国谷物化学家协会(American Association of Cereal Chemists)(1995)、美国酿造化学家协会(American Society of Brewing Chemists)(1992)、欧洲啤酒酿造大会(European Brewery Convention)(1998)和酿酒研究所(Institute of Brewing)(1997)。公认的是，给定的啤酒厂采用了许多特定的程序，其中最明显的变化与当地消费者的偏好有关。本发明可以使用任何此类生产啤酒的方法。
由水性提取物生产啤酒的第一步优选地包括如上文所述加热所述水性提取物，然后是随后的冷却阶段，以及任选地进行涡旋沉淀静置(whirlpool rest)。可以将一种或多种另外的化合物加入到水性提取物中，例如下文“另外的化合物”部分中所述的一种或多种另外的化合物。在冷却后，可以将水性提取物转移到装有酵母(例如酿酒酵母，如巴斯德酵母(S.pastorianus)或酿酒酵母(S.cerevisiae))的发酵罐中。水性提取物可以发酵任何合适的时间段，通常为1至20天，如1至10天。发酵在任何可用的温度下进行，例如在10至20℃范围内的温度下。所述方法还可以包括添加一种或多种酶，例如可以在发酵之前或发酵期间向麦芽汁中添加一种或多种酶。特别地，所述酶可以是脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶的一个非限制性实例是可从DSM获得的“Brewer's Clarex”。在其他实施方案中，在该方法期间不添加外源酶。
在为期几天的发酵过程期间，糖转化为酒精和CO2，伴随着一些风味物质的出现。发酵可以在任何期望的时间终止，例如一旦观察到％P没有进一步下降。
随后，啤酒可以被进一步处理，例如冰镇(chilled)。也可以将其过滤和/或长期窖藏(lagered)-一种产生令人愉快的香气和较少酵母样风味的过程。还可以添加添加剂。此外，可以添加CO2。最后，在包装啤酒(例如，转移到容器或小桶、瓶装或罐装中)之前，可以将啤酒进行巴氏消毒和/或过滤。啤酒也可以通过标准方法进行巴氏消毒。
通过本发明的方法生产的啤酒通常具有令人愉悦的味道，并且没有涩味或仅有很少的涩味。味道可以例如由专业的啤酒品酒专家小组来分析。
饮料
通过将根据本发明的水性提取物加工成饮料制备的饮料可以具有许多有用的性质，包括-但不限于-本部分中描述的性质。
通常期望根据本发明的饮料包含尽可能少的双乙酰。因此，可以优选的是，饮料中的双乙酰水平低于拉格啤酒中认为异味的阈值。优选地，饮料包含至多30ppb的双乙酰，更优选至多25ppb的双乙酰，甚至更优选至多20ppb的双乙酰。如果饮料是啤酒，例如拉格啤酒，则尤其是这种情况。
根据本发明的饮料可以例如是本文所述的水性提取物，其任选地已经进行过发酵。因此，饮料可以包含所述水性提取物或发酵的水性提取物以及任选的一种或多种另外的化合物或由其组成。所述另外的化合物可以例如是本文下文在“另外的化合物”部分中描述的任何另外的化合物。
在一些实施方案中，通过本发明方法获得的饮料例如啤酒的特性与通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的饮料例如啤酒的特性基本上相似。饮料可以是新鲜啤酒，即在生产后立即确定其特性，或者是已储存给定时间的啤酒。这样的特征可以是酒***平、真实发酵度(RDF)、pH、泡沫形成、期望的化合物的水平和/或不期望的化合物(例如乙醛、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、丙醇、乙酸异戊酯、异戊醇、反式-2-壬烯醛(T2N)、Strecker醛、2-甲基-丙醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、苯乙醛、二甲硫醚(DMS))的水平中的任何一种或多种。所述特性可以例如是在发芽24小时、48小时、72小时、96小时或108小时后测量的，优选在如上所述的发芽48小时至108小时后测量的。
特别地，通过本发明方法获得的饮料例如啤酒中的T2N水平在储存之前和/或之后类似于通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的饮料例如啤酒中的T2N水平。特别地，T2N的水平低于感觉阈值，其为0.05mg/L。因此，在一些实施方案中，通过本发明方法制备的啤酒在储存之前和/或之后(例如在37℃下储存2周)的T2N水平低于1mg/L，例如低于0.09mg/L，例如低于0.08mg/L，例如低于0.07mg/L，例如低于0.06mg/L，例如低于0.05mg/L，例如低于0.04mg/L，例如低于0.03mg/L，例如低于0.02mg/L，例如约0.01mg/L或更低。
在一些实施方案中，通过本发明方法获得的饮料例如啤酒中的Strecker醛水平在储存之前和/或之后类似于通过包括窑炉干燥步骤的常规方法获得的饮料如啤酒中的Strecker醛水平。在一些实施方案中，Strecker醛的水平为5至25mg/L，例如6至24mg/L，例如7至23mg/L，例如8至22mg/L，例如9至21mg/L，例如10至20mg/L。优选地，Strecker醛的水平低于25mg/L，例如低于24mg/L，例如低于23mg/L，例如低于22mg/L，例如低于21mg/L，例如低于20mg/L。
另外的化合物
本发明的方法可以包括添加一种或多种另外的化合物的步骤。所述另外的化合物可以例如是风味化合物、防腐剂、功能成分、颜料、甜味剂、pH调节剂或盐。pH调节剂可以例如是缓冲剂或酸，例如磷酸。
功能成分可以是为获得给定功能而添加的任何成分。优选地，功能成分使饮料更健康。功能成分的非限制性实例包括维生素或矿物质。
防腐剂可以是任何食品级防腐剂，例如其可以是苯甲酸、山梨酸、山梨酸酯(例如，山梨酸钾)、亚硫酸盐和/或其盐。
另外的化合物也可以是CO2。特别地，可以添加CO2以获得碳酸饮料。
用于本发明的风味化合物可以是任何可用的风味化合物。风味化合物可以例如选自芳香剂、植物提取物、植物浓缩物、植物部位和草浸剂。特别地，风味化合物可以是啤酒花。
序列
>SEQ ID NO:1，纤维素合酶样CslF6序列(基于GenBank号NCBI：EU267181.1)。
MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARINSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIVLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLYVVRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH
>SEQ ID NO:2，大麦纤维素合酶样CslF6(CslF6)、完整的编码序列(基于GenBank编号NCBI：EU267181.1)。
ATGGCGCCAGCGGTGGCCGGAGGGGGCCGCGTGCGGAGCAATGAGCCGGTTGCTGCTGCTGCCGCCGCGCCGGCGGCCAGCGGCAAGCCCTGCGTGTGCGGCTTCCAGGTTTGCGCCTGCACGGGGTCGGCCGCGGTGGCCTCCGCCGCCTCGTCGCTGGACATGGACATCGTGGCCATGGGGCAGATCGGCGCCGTCAACGACGAGAGCTGGGTGGGCGTGGAGCTCGGCGAAGATGGCGAGACCGACGAAAGCGGTGCCGCCGTTGACGACCGCCCCGTATTCCGCACCGAGAAGATCAAGGGTGTCCTCCTCCACCCCTACCGGGTGCTGATTTTCGTTCGTCTGATCGCCTTCACGCTGTTCGTGATCTGGCGTATCTCCCACAAGAACCCAGACGCGATGTGGCTGTGGGTGACATCCATCTGCGGCGAGTTCTGGTTCGGTTTCTCGTGGCTGCTAGATCAGCTGCCCAAGCTGAACCCCATCAACCGCGTGCCGGACCTGGCGGTGCTGCGGCAGCGCTTCGACCGCCCCGACGGCACCTCCACGCTCCCGGGGCTGGACATCTTCGTCACCACGGCCGACCCCATCAAGGAGCCCATCCTCTCCACCGCCAACTCGGTGCTCTCCATCCTGGCCGCCGACTACCCCGTGGACCGCAACACATGCTACGTCTCCGACGACAGTGGCATGCTGCTCACCTACGAGGCCCTGGCAGAGTCCTCCAAGTTCGCCACGCTCTGGGTGCCCTTCTGCCGCAAGCACGGGATCGAGCCCAGGGGTCCGGAGAGCTACTTCGAGCTCAAGTCACACCCTTACATGGGGAGAGCCCAGGACGAGTTCGTCAACGACCGCCGCCGCGTTCGCAAGGAGTACGACGAGTTCAAGGCCAGGATCAACAGCCTGGAGCATGACATCAAGCAGCGCAACGACGGGTACAACGCCGCCATTGCCCACAGCCAAGGCGTGCCCCGGCCCACCTGGATGGCGGACGGCACCCAGTGGGAGGGCACATGGGTCGACGCCTCCGAGAACCACCGCAGGGGCGACCACGCCGGCATCGTACTGGTGCTGCTGAACCACCCGAGCCACCGCCGGCAGACGGGCCCGCCGGCGAGCGCTGACAACCCACTGGACTTGAGCGGCGTGGATGTGCGTCTCCCCATGCTGGTGTACGTGTCCCGTGAGAAGCGCCCCGGGCACGACCACCAGAAGAAGGCCGGTGCCATGAACGCGCTTACCCGCGCCTCGGCGCTGCTCTCCAACTCCCCCTTCATCCTCAACCTCGACTGCGATCATTACATCAACAACTCCCAGGCCCTTCGCGCCGGCATCTGCTTCATGGTGGGACGGGACAGCGACACGGTTGCCTTCGTCCAGTTCCCGCAGCGCTTCGAGGGCGTCGACCCCACCGACCTCTACGCCAACCACAACCGCATCTTCTTCGACGGCACCCTCCGTGCCCTGGACGGCATGCAGGGCCCCATCTACGTCGGCACTGGGTGTCTCTTCCGCCGCATCACCGTCTACGGCTTCGACCCGCCGAGGATCAACGTCGGCGGTCCCTGCTTCCCCAGGCTCGCCGGGCTCTTCGCCAAGACCAAGTACGAGAAGCCCGGGCTCGAGATGACCACGGCCAAGGCCAAGGCCGCGCCCGTGCCCGCCAAGGGTAAGCACGGCTTCTTGCCACTGCCCAAGAAGACGTACGGCAAGTCGGACGCCTTCGTGGACACCATCCCGCGCGCGTCGCACCCGTCGCCCTACGCCGCGGCGGCTGAGGGGATCGTGGCCGACGAGGCGACCATCGTCGAGGCGGTGAACGTGACGGCCGCCGCGTTCGAGAAGAAGACCGGCTGGGGCAAAGAGATCGGCTGGGTGTACGACACCGTCACGGAGGACGTGGTCACCGGCTACCGGATGCATATCAAGGGGTGGCGGTCACGCTACTGCTCCATCTACCCACACGCCTTCATCGGCACCGCCCCCATCAACCTCACGGAGAGGCTCTTCCAGGTGCTCCGCTGGTCCACGGGATCCCTCGAGATCTTCTTCTCCAAGAACAACCCGCTCTTCGGCAGCACATACCTCCACCCGCTGCAGCGCGTCGCCTACATCAACATCACCACTTACCCCTTCACCGCCATCTTCCTCATCTTCTACACCACCGTGCCGGCGCTATCCTTCGTCACCGGCCACTTCATCGTGCAGCGCCCGACCACCATGTTCTACGTCTACCTGGGCATCGTGCTATCCACGCTGCTCGTCATCGCCGTGCTGGAGGTCAAGTGGGCCGGGGTCACAGTCTTCGAGTGGTTCAGGAACGGCCAGTTCTGGATGACAGCAAGTTGCTCCGCCTACCTCGCCGCCGTCTGCCAGGTGCTGACCAAGGTGATATTCCGGCGGGACATCTCCTTCAAGCTCACATCCAAGCTACCCTCGGGAGACGAGAAGAAGGACCCCTACGCCGACCTCTACGTGGTGCGCTGGACGCCGCTCATGATTACACCCATCATCATCATCTTCGTCAACATCATCGGATCCGCCGTGGCCTTCGCCAAGGTTCTCGACGGCGAGTGGACGCACTGGCTCAAGGTCGCCGGCGGCGTCTTCTTCAACTTCTGGGTGCTCTTCCACCTCTACCCCTTCGCCAAGGGCATCCTGGGGAAGCACGGAAAGACGCCAGTCGTGGTGCTCGTCTGGTGGGCATTCACCTTCGTCATCACCGCCGTGCTCTACATCAACATCCCCCACATGCATACCTCGGGAGGCAAGCACACAACGGTGCATGGTCACCATGGCAAGAAGTTGGTCGACACAGGGCTCTATGGCTGGCTCCATTGA
表2：分析的基因的引物和探针序列信息
项目
可以通过以下项目进一步描述本发明：
1.一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；条件是在步骤b)和c)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％，和
d)制备所述细分的发芽的谷粒的水性提取物，
从而生产谷物的水性提取物。
2.一种用于生产谷物的水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供谷物的谷粒；
b)使谷物谷粒进行发芽步骤，持续48至108小时，从而获得发芽的谷粒；
c)细分所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒的水含量为至少20％；和
d)制备所述细分的发芽的谷粒的水性提取物，
条件是在步骤b)和d)之间的任何时候，所述谷物谷粒的水含量均不低于20％，
从而生产谷物的水性提取物。
3.根据前述项目中任一项所述的方法，其中整个发芽步骤不超过96小时。
4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤进行72至108小时，例如大约96小时。
5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤进行65至80小时，例如大约72小时。
6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中从开始发芽时测量发芽的持续时间。
7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中通过启动步骤c来终止发芽。
8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽在10至30℃、例如10至25℃范围内的温度下进行。
9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中发芽包括进行的一个或多个浸泡步骤，直到在最后的浸泡步骤之后谷物谷粒的水含量为至少30％，如至少35％，例如至少40％，如至少45％。
10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在细分所述谷物谷粒时，所述发芽的谷物谷粒的水含量为至少20％，例如不小于25％，如不小于30％，优选地不小于35％，甚至更优选地不小于40％，还更优选地不小于45％。
11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在完成发芽步骤和细分所述谷物谷粒的时间之间的任何时间，所述发芽的谷物谷粒的水含量均不小于20％，例如不小于25％，如不小于30％，优选地不小于35％，甚至更优选地不小于40％，还更优选地不小于45％。
12.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤至少部分地在通气下进行。
13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤包括通过在潮湿条件下孵育谷物谷粒来浸泡谷物谷粒的步骤。
14.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽步骤不包括在通气下将谷物谷粒浸没在水性溶液中的步骤。
15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中步骤a)中提供的谷粒已经用抗微生物剂处理。
16.根据项目15所述的方法，其中所述抗微生物剂是过氧化物，例如过氧化氢。
17.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽的谷粒包含每100克发芽的谷物谷粒(干物质)至多10g、例如至多8g、例如至多6g、优选至多4g的小根(干物质)。
18.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述发芽的谷粒包含每100g发芽的谷物谷粒(干物质)至多6g小根(干物质)。
19.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法不包括去除小根的步骤。
20.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是带壳的谷物，例如带壳的大麦。
21.根据项目20所述的方法，其中所述方法包括在开始发芽之前去除所述外壳的至少一部分的步骤。
22.根据项目21所述的方法，其中去除所述外壳导致谷物谷粒的总重量损失至少1％，例如损失至少2％，例如损失2％至7％，例如3％至6％。
23.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是无壳的谷物，例如小麦或无壳的大麦。
24.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是大麦。
25.根据项目24所述的方法，其中所述大麦是无壳的大麦或具有薄壳的大麦品种。
26.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述谷物是大麦，其特征在于，所述谷粒中的β-葡聚糖水平低。
27.根据项目26所述的方法，其中基于干重，所述谷粒中的β-葡聚糖水平为至多5％，例如1-5％w/w。
28.根据项目26所述的方法，其中基于干重，所述谷粒中的β-葡聚糖水平为至多3％，例如1-3％w/w。
29.根据项目24至28中任一项所述的方法，其中所述大麦的特征在于在编码β-葡聚糖合酶的基因中携带突变。
30.根据项目24至28中任一项所述的方法，其中所述大麦的特征在于在编码CslF6的基因中携带突变。
31.根据项目30所述的方法，其中所述大麦植物的籽粒的β-葡聚糖含量为携带野生型CslF6基因但在其他方面为相同的基因型的大麦植物的β-葡聚糖含量的至多60％，例如至少30％且至多60％，例如至少40％且至多60％。
32.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述谷物是大麦，其特征在于至少以下一种或多种：
A.在编码LOX-1的基因中携带突变
B.在编码LOX-2的基因中携带突变
C.在编码MMT的基因中携带突变；和/或
D.携带导致发芽期间α-淀粉酶活性增加的突变，例如编码DELLA的基因中的突变。
33.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有至少30U/g、例如至少50U/g、优选地例如至少100U/g谷物谷粒的α-淀粉酶活性。
34.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有至少5U/g、优选地至少10U/g谷物谷粒的β-淀粉酶活性。
35.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有至少2mU/g、例如至少10mU/g、优选地至少20mU/g谷物谷粒的极限糊精酶活性。
36.根据前述项目中任一项所述的方法，其中基于干重，所述发芽的谷粒具有低于5％、例如低于3％w/w、例如低于2％w/w、例如低于1.5％w/w、优选低于1.0％w/w的β-葡聚糖含量。
37.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述步骤C.包括在50至80℃范围内的温度下用打浆溶液打浆所述细分的谷粒。
38.根据项目37所述的方法，其中所述打浆在一种或多种添加的水解酶的存在下进行。
39.根据项目38所述的方法，其中至少一种水解酶选自细胞壁和淀粉降解酶，包括但不限于α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶。
40.根据项目37至39中任一项所述的方法，其中所述打浆在至少一种β-葡聚糖酶和至少一种木聚糖酶的存在下进行。
41.根据项目37至40中任一项所述的方法，其中在所述打浆期间每克发芽的谷物谷粒(干重)添加至多700U、优选至多350U的外源葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。
42.根据项目37至41中任一项所述的方法，其中在所述打浆期间，每克发芽的谷物谷粒(干重)添加至多100PUN的外源支链淀粉酶。
43.根据项目37至42中任一项所述的方法，其中所述谷物的特征在于所述谷粒中的β-葡聚糖水平低，并且其中在打浆期间不添加β-葡聚糖酶。
44.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法还包括过滤所述水性提取物的步骤。
45.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述水性提取物的氨基酸水平为500至3000mg/L，例如600至2900mg/L，例如700至2800mg/L，例如800至2700mg/L，例如900至2600mg/L，例如1000至2500mg/L，例如1100至2400mg/L，例如1200至2200mg/L，例如1300至2100mg/L，例如1400至2000mg/L。
46.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述水性提取物的可发酵碳水化合物水平为5至20mg/100mL，例如6至19mg/100mL，例如7至18mg/mL，例如8至17mg/100mL，例如9至16mg/100mL，例如10至15mg/100mL，例如10至14mg/100mL，例如11至13mg/100mL，例如约12mg/100mL。
47.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述水性提取物的转化糖水平为1至5g/100mL，例如1.5至4g/100mL，例如1.75至3.25g/100mL，例如2至3g/100mL，例如2.1至2.9g/100mL，例如2.3至2.8g/100mL，例如2.4至2.7g/100mL，例如2.5至2.6mg/100mL。
48.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法不包括窑炉干燥的步骤，优选地所述方法在步骤d)之前的任何时间不包括窑炉干燥的步骤。
49.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法不包括切碎所述发芽的谷物谷粒并且由切碎的发芽的谷物谷粒形成粒料的步骤。
50.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.通过前述项目中任一项所述的方法制备水性提取物；
ii.将所述提取物加工成饮料。
51.根据项目50所述的方法，其中步骤ii.包括以下步骤：
e)任选地在啤酒花或啤酒花提取物的存在下，加热所述水性提取物；
f)冷却所述水性提取物；
g)用酵母将所述水性提取物发酵，从而产生发酵饮料。
52.根据项目50所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤e)或步骤f)之后进行的沉淀步骤。
53.根据项目50至52中任一项所述的方法，其中所述饮料是啤酒。
54.根据项目50至53中任一项所述的方法，其中所述饮料是浅色啤酒，例如选自拉格啤酒、淡啤酒和小麦啤酒。
55.根据项目50至54中任一项所述的方法，其中所述饮料是拉格啤酒。
56.根据项目50至55中任一项所述的方法，其中所述饮料的T2N水平低于1mg/L，例如低于0.09mg/L，例如低于0.08mg/L，例如低于0.07mg/L，例如低于0.06mg/L，例如低于0.05mg/L，例如低于0.04mg/L，例如低于0.03mg/L，例如低于0.02mg/L，例如约0.01mg/L或更低。
57.根据项目50至56中任一项所述的方法，其中所述饮料的Strecker醛的水平为5至25mg/L，例如6至24mg/L，例如7至23mg/L，例如8至22mg/L，例如9至21mg/L，例如10至20mg/L。
58.根据项目50至57中任一项所述的方法，其中步骤i.不包括窑炉干燥步骤。
实施例
实施例1：微型麦芽制造
将大麦样品一式三份地进行处理，每个样品50g。根据图1中所示的方案，对放置在不锈钢烧杯中的样品进行浸泡，第一天在15℃的新鲜水中强制浸泡约7小时，第二天3小时，第三天1小时，以便在每次浸泡结束时分别达到35％、40％和45％的水含量。每次浸泡后，将装有样品的不锈钢烧杯移至15℃的发芽箱中，并保持在那里，直到该过程中的下一步骤。在最后一次浸泡水排出结束时，将样品在发芽箱中保持120小时(第3-7天)，所述发芽箱平衡至45％水并进行喷雾以克服呼吸水损失。发芽过程结束时(第7天)，使用以下斜坡升温程序将样品在不锈钢箱中放入Termaks孵育箱中窑炉干燥21小时：
25℃–55℃(2℃/hrs)
55℃–85℃(4℃/hrs)
85℃持续1.5小时
发芽和窑炉干燥的步骤是在80％新鲜空气的循环气流下进行的。
在每个微型麦芽制造日结束时，一式三份地收集样品进行分析，并冷冻干燥48小时。
使用这种发芽过程研究了两种大麦品系，一种是常规大麦品系cv.Paustian(参照)，一种是具有低β-葡聚糖含量的大麦品系(突变体)。β-葡聚糖含量低的大麦品系为cv.Paustian的大麦植物，其在CslF6基因中携带突变，导致突变体Cslf6基因，其编码在748位携带Gly→Asp突变的突变体CslF6多肽。大麦CslF6多肽的野生型序列(SEQ ID NO:1)可在GenBank数据库中以NCBI登录号EU267181.1获得。
实施例2：水吸收
通过测量谷物谷粒与烧杯快速离心去除表面水分后的起始重量相比的确切重量差，来确定发芽的最初6小时期间的水吸收速度。
结果：
在吸胀的最初6个小时期间，突变体的水吸收比参照样品略快(图2)。
实施例3：根生长
如实施例1所述，在每个发芽日后将发芽的大麦样品冷冻干燥。称重冷冻干燥的样品，并手动除去形成的小根，并再次称重发芽的大麦。根生长计算为处理之前和之后的重量百分比。
结果：
在整个麦芽制造期，突变体和参照的根生长相似，但与入炉干燥的麦芽相比，在第4天显著降低(图3)。
实施例4：麦芽制造期间编码水解酶的基因的表达
RNA分离：
对于每个样品，准备装有两个金属球的2mL微量离心管。称取大约80mg的冷冻干燥的面粉，放置到装有金属球的微量离心管中。样品用100μL的无RNA酶的水预湿，然后加入1mL的Tri-试剂(Tri-Reagent)。随后，将样品剧烈摇动。在室温下孵育5分钟后，将样品在4℃下以12,000×g离心10分钟。将上清液倒入2mL的PhaseLock管中(减速旋转30s，Qiagen#129056)，并加入0.2mL氯仿。用手剧烈摇动试管10-15秒，以混合氯仿和Tri-试剂。将样品在室温下孵育5-15分钟，然后在4℃下以12,000×g离心5分钟。将样品的水相倒入新的微量离心管中，然后加入500μL的2-丙醇。将RNA在冰箱中沉淀过夜。将样品在4℃下以12,000×g离心5分钟，然后除去异丙醇上清液。为了RNA净化，将沉淀物直接重悬于Aurum总RNA迷你试剂盒(BioRad#7326820)的350μL裂解缓冲液中。添加350μL的70％乙醇以重新沉淀RNA。将该溶液转移至置于2mL无盖洗涤管(试剂盒中提供)中的RNA结合柱中，并离心30秒。取出RNA结合柱，并丢弃滤液。将700μL的低严格度洗涤溶液添加到RNA结合柱中，并离心30秒。从洗涤管中丢弃低严格度洗涤溶液，并将结合柱重新放置在同一洗涤管中。
柱上DNA酶处理：
通过将250μL 10mM Tris,pH 7.5添加至小瓶中，并根据提供的手册(BioradAurum总RNA迷你试剂盒#7326820)上下吸液进行混合来重构提供的冻干DNA酶I。将80μL的稀释的DNA酶I添加到每个柱底部的膜堆叠中，并在室温下使其消化15分钟。将700μL的高严格度洗涤溶液添加到RNA结合柱中，并离心30秒。丢弃滤液，并将柱重新放置在相同的洗涤管中。将700μL的低严格度洗涤溶液添加到RNA结合柱中，并离心30秒。丢弃滤液，并将柱重新放置在相同的洗涤管中。将洗涤管和柱再离心另外2分钟以除去残留的洗涤溶液。将RNA结合柱转移到1.5mL加盖的微量离心管中，并将80μL的洗脱缓冲液添加到RNA结合柱底部的膜堆叠中。使溶液浸透膜1分钟，然后离心2分钟以洗脱总RNA。最后，通过NanoDrop(ThermoScientific)对RNA浓度进行定量。
cDNA合成和ddPCR设置：
使用BioRad的iScriptTM cDNA合成试剂盒(#1708891)合成cDNA。在合成cDNA之前，先在NanoDrop(Thermo Scientific)上估算总RNA浓度，然后用无RNA酶的水将其标准化为50ng/μL。对于cDNA合成，根据以下方案使用200ng的RNA。
对于NoRT对照样品，添加水代替逆转录酶(RT)。使用以下方案将完全反应混合物在热循环仪中孵育：
对于ddPCR分析，分析每个样品的目标基因以及一个参照基因。使用来自BioRad的QX200液滴发生器和QX200液滴读取器根据制造商的说明进行ddPCR。在这种情况下，将HORVU5Hr1G041120(一种在发芽期间稳定表达的胞质丙酮酸激酶家族蛋白)用作参照基因。上文“序列”部分中的表2提供了有关引物和探针的详细信息。
在分析之前，将cDNA在水中稀释20倍，并根据以下方案设置每种反应混合物：
将样品在96孔板中充分混合，并在液滴产生(BioRad QX200TM自动液滴发生器)之前以4000rpm离心1分钟。根据以下程序在热循环仪上孵育液滴板：
在BioRad QX200TM液滴读取器上检测到FAM和HEX阳性液滴的存在，并使用BioRad的Quantasoft软件分析。在2D图中手动设置阈值，然后将浓度值输出到Excel，以对所选参照基因进行归一化。
结果：
使用ddPCR分析所选基因的表达；淀粉酶(AMY1)、(1-3；1-4)-β-葡聚糖酶(BGL2)、高pIα-葡萄糖苷酶(AGL97)和极限糊精酶(LD)。AGL97在第2天已经以最高水平表达，而其他三个基因在第4天显示最大表达(图4)。突变体和参照大麦品系均显示出相似的选定基因表达模式，从而证实了低(1-3；1-4)-β-葡聚糖突变体中的最佳表达，以及编码(1-3；1-4)-β-葡聚糖降解酶的基因的相似表达模式。
实施例5：麦芽样品中的水解酶活性
在酶活性分析之前，使用标准的Foss Cyclotech磨机碾磨麦芽样品，该磨机配有碳化钨磨环(Foss 10004463)、镀镍叶轮(Foss 1000 2666)和1mm出口筛(Foss 10001989)。大麦麦芽的所有酶活性测定均在碾磨干样品后48小时内进行。使用来自Megazyme的Ceralpha试剂盒(K-CERA)，使用标准实验室设备测量α-淀粉酶活性。淀粉酶测定是根据制造商的方案(K-CERA 01/12)进行的。淀粉酶活性的计算基于Megazyme方案(K-CERA 01/12)中的公式。使用标准实验室设备，使用来自Megazyme的Betamyl试剂盒(K-BETA3)测量β-淀粉酶活性测定。淀粉酶测定是根据制造商的方案(K-BETA3 10/10)进行的。β-淀粉酶活性的计算基于Megazyme方案(K-BETA3 10/10)中的公式。使用标准实验室设备，并使用来自Megazyme的支链淀粉酶/极限糊精酶测定试剂盒(PullG6方法)试剂盒(K-PullG6)，测量极限糊精酶活性测定。极限糊精酶测定是根据制造商的方案(K-PullG6 05/17)进行的。极限糊精酶活性的计算基于Megazyme方案(K-PullG6 05/17)中的公式。
结果：
在突变体和参照大麦品系中，针对α-淀粉酶、β-淀粉酶和游离极限糊精酶测得的总酶活性遵循相同的模式(图5)。出人意料的是，尽管极限糊精酶基因表达略低(图4)，但早在第3天开始，突变体中的极限糊精酶的活性表现为略高。
实施例6：(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量
分析发芽的谷粒的总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。在Retch旋风磨机上碾磨10mL的大麦谷粒。一式三份分析所有样品。称出20mg的面粉，置于2mL微量离心管中，在烘箱中于100℃加热2小时，然后冷却至室温。总共加入500μL的50％甲醇水溶液，然后将样品以1400rpm的速度振摇1小时。以16000×g离心10分钟后，弃去上清液，并将样品干燥过夜。然后，每10mg面粉加入400μL含1U/mL地衣聚糖酶(Megazyme,International，爱尔兰)的pH6.5的20mM NaHPO4，并在50℃下孵育2.5小时。将样品以16000×g离心10分钟，然后将上清液通过0.45μm过滤器过滤，释放的Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(Dp4)低聚物通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)定量。Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)低聚物通过使用配备有具有2×250mm尺寸的4μm SA-10色谱柱和前置柱的Dionex ICS 5000+Dc系统并采用HPAEC-PAD进行定量。运行条件为0.4mL/min，柱温为40℃，等度100mM NaOH洗脱液15分钟。定量标准品是通过在20mMNaHPO4pH 6.5中用1U/mL地衣聚糖酶(Megazyme International，爱尔兰)消化已知量的中等粘度的(1,3；1,4)-β-葡聚糖(Megazyme International，爱尔兰)而产生的，假设DP3和DP4之间具有等摩尔PAD响应比。总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量计算为DP3和DP4低聚物的总和。
结果：
在麦芽制造程序的第1、2、3、4、5、6天的大麦和绿麦芽(图1)中以及在窑炉干燥的麦芽(图1中的第7天)中监测突变体和参照的(1-3；1-4)-β-葡聚糖的含量。在整个麦芽制造过程期间，突变体的(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量仅为参照的50％，并且在第5天时，突变体(1-3；1-4)-β-葡聚糖含量类似于参照窑炉干燥的麦芽。
实施例7：对绿麦芽试验、麦芽汁和啤酒的分析
根据本发明方法(即不经入炉干燥)或经入炉干燥(表3-8中的“初步”入炉干燥)由发芽1、2、3、4或5天的大麦以及发芽5天并在后期阶段经入炉干燥(表3-8中的“工业”入炉干燥)的大麦制得的麦芽汁和啤酒的特性在表3和4中示出。在发芽之前，浸泡进行大约36小时。设计该实验是为了每天比较直接用绿麦芽的酿造和用通过入炉干燥生产的麦芽的酿造。在后期阶段进行用入炉干燥的麦芽(表中的“工业”)的酿造。使用大麦cv.Congo。
麦芽汁的糖通过具有电化学检测的HPLC测定。用O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-羟基胺衍生羰基化合物后，通过GC-MS测定Strecker醛，基本上如Groenqvist等人，1993所述。啤酒中的低沸点酯类和高级醇通过具有FID检测的顶空气相色谱法测定。通过CS2从啤酒中提取高沸点酯以及高级醇和脂肪酸，并通过具有FID检测的气相色谱法(液体注入)进行分析。麦芽汁和啤酒中的氨基酸含量是按照EP3237601中所述，使用带有光电二极管阵列检测器的UPLC，使用来自Waters的AccQ-Tag Ultra衍生试剂盒进行测定的，基本上如供应商所述的。用O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-羟基胺衍生羰基化合物后，通过GC-MS测定啤酒中的T2N，基本上如Groenqvist等人，1993所述。使用来自Anton Paar的Alcolyzer啤酒分析系统，如供应商所述，测量真实发酵度(RDF)、酒精、提取物和颜色。使用FT-003泡沫测试仪(Lg-automatic aps,Undalsvej 6,3300Frederiksvaerk,丹麦)，如供应商所述，测量泡沫。
如表3所示，不存在窑炉干燥对麦芽汁的pH值和氨基酸都没有显著影响。发芽3、4或5天后获得的麦芽汁β-葡聚糖的差异被认为是不显著的。因此，尽管不存在窑炉干燥步骤，通过本发明方法制备的麦芽汁令人惊讶地包含足够的氨基酸以用作后期发酵中酵母的营养源。表4表明，不存在窑炉干燥步骤不会显著改变可发酵碳水化合物的浓度。
表3.
表4：糖。Fru：果糖；Fru％P：果糖的Plato％；Glu；葡萄糖；Suc：蔗糖；Mal：麦芽糖；Maltt：麦芽三糖；总和FC：可发酵碳水化合物的总和；总和IS：转化糖的总和。Fru％P以％表示；剩余数据以g/100mL为单位。
在发芽1、2、3、4或5天后，将由通过本发明的方法即不经入炉干燥得到的水性谷物提取物制备的啤酒与由通过传统的方法即经过入炉干燥得到的水性谷物提取物制备的啤酒进行比较。啤酒的特性列于表5-8中。
表5显示了未经窑炉干燥制备的啤酒中酒精的体积百分比类似于经窑炉干燥制备的啤酒中酒精的体积百分比。同样，真实发酵度(RDF)或泡沫形成也没有显著差异。特别地，期望获得高泡沫形成。表6表明，乙醛(从发芽2天开始)、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、丙醇、乙酸异戊酯和异戊醇的浓度在很大程度上不受不存在窑炉干燥的影响。
表5：最终啤酒。RDF：真实发酵度。
表6：最终啤酒。浓度以mg/L为单位。NA：未获得的。
分析了新鲜啤酒(表7)和在37℃下储存2周的啤酒(表8)中几种异味化合物的浓度。在新鲜啤酒(表7)中，未发现醛2-甲基-丙醛、2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、苯乙醛和总Strecker醛的显著差异，这些醛被认为是啤酒陈年风味的重要成分。相反，在某些情况下观察到异味化合物减少的趋势。麦芽的窑炉干燥被认为对于减少一些异味的水平很重要，例如通过使引发T2N形成的脂氧合酶失活来降低反式2-壬烯醛(T2N)的水平。未经窑炉干燥制备的啤酒中T2N水平略高一些；但是，所测得的水平仍低于0.05mg/L的感觉阈值，因此，预期在未经窑炉干燥制备的啤酒中，由T2N引起的异味不会改变。
同样，在未经窑炉干燥制备的情况下于37℃储存2周的啤酒(表8)的异味化合物浓度显示，与经窑炉干燥制备的且在相同条件下储存的啤酒所观察到的浓度差异不大。
表7.新鲜啤酒。2-Me-Pr：2-甲基丙醛；2-Me-Bu：2-甲基丁醛；3-Me-Bu：3-甲基丁醛；PheAcal：苯乙醛；T2N：反式-2-壬烯醛；St.Al.：Strecker醛总和。浓度以mg/L为单位。
表8.在37℃下储存2周的啤酒。2-Me-Pr：2-甲基丙醛；2-Me-Bu：2-甲基丁醛；3-Me-Bu：3-甲基丁醛；PheAcal：苯乙醛；T2N：反式-2-壬烯醛。浓度以mg/L为单位。
总而言之，以上数据表明，根据本发明的方法制备的麦芽汁和新鲜或储藏啤酒的特性出乎意料地很大程度上不受缺少窑炉干燥步骤的影响。
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Met Ala Pro Ala Val Ala Gly Gly Gly Arg Val Arg Ser Asn Glu Pro
1 5 10 15
Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ser Gly Lys Pro Cys Val
20 25 30
Cys Gly Phe Gln Val Cys Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Ala Ser
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Asp Met Asp Ile Val Ala Met Gly Gln Ile Gly
50 55 60
Ala Val Asn Asp Glu Ser Trp Val Gly Val Glu Leu Gly Glu Asp Gly
65 70 75 80
Glu Thr Asp Glu Ser Gly Ala Ala Val Asp Asp Arg Pro Val Phe Arg
85 90 95
Thr Glu Lys Ile Lys Gly Val Leu Leu His Pro Tyr Arg Val Leu Ile
100 105 110
Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile Trp Arg Ile Ser
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His Lys Asn Pro Asp Ala Met Trp Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly
130 135 140
Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp Leu Leu Asp Gln Leu Pro Lys Leu
145 150 155 160
Asn Pro Ile Asn Arg Val Pro Asp Leu Ala Val Leu Arg Gln Arg Phe
165 170 175
Asp Arg Pro Asp Gly Thr Ser Thr Leu Pro Gly Leu Asp Ile Phe Val
180 185 190
Thr Thr Ala Asp Pro Ile Lys Glu Pro Ile Leu Ser Thr Ala Asn Ser
195 200 205
Val Leu Ser Ile Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Val Asp Arg Asn Thr Cys
210 215 220
Tyr Val Ser Asp Asp Ser Gly Met Leu Leu Thr Tyr Glu Ala Leu Ala
225 230 235 240
Glu Ser Ser Lys Phe Ala Thr Leu Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His
245 250 255
Gly Ile Glu Pro Arg Gly Pro Glu Ser Tyr Phe Glu Leu Lys Ser His
260 265 270
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275 280 285
Val Arg Lys Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Arg Ile Asn Ser Leu Glu
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His Asp Ile Lys Gln Arg Asn Asp Gly Tyr Asn Ala Ala Ile Ala His
305 310 315 320
Ser Gln Gly Val Pro Arg Pro Thr Trp Met Ala Asp Gly Thr Gln Trp
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Glu Gly Thr Trp Val Asp Ala Ser Glu Asn His Arg Arg Gly Asp His
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Thr Gly Pro Pro Ala Ser Ala Asp Asn Pro Leu Asp Leu Ser Gly Val
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Asp Val Arg Leu Pro Met Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro
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Gly His Asp His Gln Lys Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Thr Arg
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Ala Ser Ala Leu Leu Ser Asn Ser Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys
420 425 430
Asp His Tyr Ile Asn Asn Ser Gln Ala Leu Arg Ala Gly Ile Cys Phe
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Met Val Gly Arg Asp Ser Asp Thr Val Ala Phe Val Gln Phe Pro Gln
450 455 460
Arg Phe Glu Gly Val Asp Pro Thr Asp Leu Tyr Ala Asn His Asn Arg
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Ile Phe Phe Asp Gly Thr Leu Arg Ala Leu Asp Gly Met Gln Gly Pro
485 490 495
Ile Tyr Val Gly Thr Gly Cys Leu Phe Arg Arg Ile Thr Val Tyr Gly
500 505 510
Phe Asp Pro Pro Arg Ile Asn Val Gly Gly Pro Cys Phe Pro Arg Leu
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Ala Gly Leu Phe Ala Lys Thr Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Leu Glu Met
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Thr Thr Ala Lys Ala Lys Ala Ala Pro Val Pro Ala Lys Gly Lys His
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Gly Phe Leu Pro Leu Pro Lys Lys Thr Tyr Gly Lys Ser Asp Ala Phe
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Val Asp Thr Ile Pro Arg Ala Ser His Pro Ser Pro Tyr Ala Ala Ala
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Val Thr Ala Ala Ala Phe Glu Lys Lys Thr Gly Trp Gly Lys Glu Ile
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Met His Ile Lys Gly Trp Arg Ser Arg Tyr Cys Ser Ile Tyr Pro His
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Ala Phe Ile Gly Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Glu Arg Leu Phe Gln
660 665 670
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Asn Pro Leu Phe Gly Ser Thr Tyr Leu His Pro Leu Gln Arg Val Ala
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Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Ser Phe Val Thr Gly His Phe Ile Val
725 730 735
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Thr Leu Leu Val Ile Ala Val Leu Glu Val Lys Trp Ala Gly Val Thr
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Val Phe Glu Trp Phe Arg Asn Gly Gln Phe Trp Met Thr Ala Ser Cys
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acggggtcgg ccgcggtggc ctccgccgcc tcgtcgctgg acatggacat cgtggccatg 180
gggcagatcg gcgccgtcaa cgacgagagc tgggtgggcg tggagctcgg cgaagatggc 240
gagaccgacg aaagcggtgc cgccgttgac gaccgccccg tattccgcac cgagaagatc 300
aagggtgtcc tcctccaccc ctaccgggtg ctgattttcg ttcgtctgat cgccttcacg 360
ctgttcgtga tctggcgtat ctcccacaag aacccagacg cgatgtggct gtgggtgaca 420
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aaccccatca accgcgtgcc ggacctggcg gtgctgcggc agcgcttcga ccgccccgac 540
ggcacctcca cgctcccggg gctggacatc ttcgtcacca cggccgaccc catcaaggag 600
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gagtcctcca agttcgccac gctctgggtg cccttctgcc gcaagcacgg gatcgagccc 780
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ttgagcggcg tggatgtgcg tctccccatg ctggtgtacg tgtcccgtga gaagcgcccc 1200
gggcacgacc accagaagaa ggccggtgcc atgaacgcgc ttacccgcgc ctcggcgctg 1260
ctctccaact cccccttcat cctcaacctc gactgcgatc attacatcaa caactcccag 1320
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> LD探针(FAM)
<400> 14
cctgtgcagg tgaattcatc a 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> RefA Fwd引物
<400> 15
gtctattgct tcctctgc 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> RefA Rev引物
<400> 16
gatgaccgaa gccttaac 18
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> RefA探针(HEX)
<400> 17
tgcgggcggc tatcaaa 17
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 18
Arg Val Leu Ile Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile
1 5 10 15
Trp Arg Ile Ser
20
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 19
Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp
1 5 10 15
Leu Leu Asp Gln Leu Pro
20
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 20
Leu Gln Arg Val Ala Tyr Ile Asn Ile Thr Thr Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是U
<400> 21
Ala Ile Phe Leu Ile Phe Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Xaa Phe Val
1 5 10 15
Thr
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽片段
<400> 22
Thr Met Phe Tyr Val Tyr Leu Gly Ile Val Leu Ser Thr Leu Leu Val
1 5 10 15
Ile Ala
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽序列
<400> 23
Ile Thr Pro Ile Ile Ile Ile Phe Val Asn Ile Ile Gly Ser Ala Val
1 5 10 15
Ala Phe Ala Lys Val Leu Asp
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 寡肽序列
<400> 24
Leu Lys Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Asn Phe Trp Val Leu Phe His
1 5 10 15
Leu Tyr Pro Phe
20
PCT/RO/134表
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