阅读说明：本技术 一种诺氟沙星的检测方法 (Norfloxacin detection method ) 是由 胡高爽 高山 郝建雄 韩雪 赵丹丹 饶欢 李娜 于 2020-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及荧光免疫检测技术领域,具体公开一种诺氟沙星的检测方法。包括以下步骤：将诺氟沙星单克隆抗体与生物素偶联,得免疫配基；将所述免疫配基与羧基化纳米Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>微球偶联,得免疫磁珠；将链霉亲和素与羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子偶联,得荧光信号探针；将所述免疫磁珠加入待测样品中,加入磁场分离富集样品,再加入荧光信号探针,充分反应后磁分离富集样品,得样品溶液；将所述样品溶液滴加至含有诺氟沙星人工抗原的免疫层析试纸条上,观察结果。本发明提供的方法实现了快速分离目标物、双重信号放大提高检测灵敏度和增加检测系统稳定性的目的,能够实现对大量未知样品的简单快速筛选,检测成本低,有利于在实践中推广应用。(The invention relates to the technical field of fluorescence immunoassay, and particularly discloses a norfloxacin detection method. The method comprises the following steps: coupling the norfloxacin monoclonal antibody with biotin to obtain an immune ligand; the immune ligand is reacted with carboxylated nano Fe 3 O 4 Coupling the microspheres to obtain immunomagnetic beads; coupling streptavidin with the converted nanoparticles on the carboxylated water-soluble green light to obtain a fluorescent signal probe; adding the immunomagnetic beads into a sample to be detected, adding a magnetic field to separate and enrich the sample, adding a fluorescent signal probe, and carrying out magnetic separation and enrichment on the sample after full reaction to obtain a sample solution; and (3) dropwise adding the sample solution onto an immunochromatographic test strip containing the artificial norfloxacin antigen, and observing the result. The present invention providesThe method realizes the purposes of quickly separating the target object, improving the detection sensitivity by dual signal amplification and increasing the stability of the detection system, can realize simple and quick screening of a large number of unknown samples, has low detection cost, and is beneficial to popularization and application in practice.)

一种诺氟沙星的检测方法

技术领域

本发明涉及荧光免疫检测技术领域，尤其涉及一种诺氟沙星的检测方法。

背景技术

诺氟沙星(Norfloxacin，NOR)是一种新型的第三代氟喹诺酮类光谱抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，是治疗各种感染性疾病的重要合成药物，在临床上得到广泛地应用。近年来，由于诺氟沙星兽药的乱用和滥用，导致在动物源性食品中出现诺氟沙星兽药残留，对消费者带来了较大的健康风险，如导致过敏反应、癌变反应以及细菌耐药性增强等。因此，对诺氟沙星检测方法的研究迫在眉睫。

目前，有很多方法已经被报道用于检测水产品中的诺氟沙星，包括微生物法、薄层色谱法、分光光度法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。虽然上述这些方法都能够用于诺氟沙星的检测，但是，检测前需要繁琐的样品前处理方法，还需要特定的检测仪器和专业检测人员操作，检测费用昂贵，检测时间长，不适合进行现场快速检测。因此，发展一种灵敏度高、检测快速、操作简便的诺氟沙星检测方法具有十分重要的意义。

免疫分析技术(immunoassay，IA)是一种基于抗原(或抗体)作为选择性化学试剂，特异性测定分析抗体(或抗原)的技术，能够克服上述微生物法、薄层色谱法以及仪器分析法等方法的缺陷，具有操作简单、专一性强和灵敏度高等优点。其中，免疫层析试纸条是二十世纪八九十年代在酶联免疫分析方法的基础上发展的新型快速免疫检测技术，因其具有操作简单快速、结果容易判断、安全无污染等诸多优点使其在世界各国得到广泛应用，成为体外快速诊断领域发展的趋势性方法。然而，该方法以胶体金作为信号标记物，对于实际样品检测需要相对复杂的前处理步骤(需多次重复离心、洗涤步骤)以消除基质对标记物(胶体金等)的影响，从而消除假阳性结果，因而限制了检测方法灵敏度的进一步提高。

发明内容

针对现有检测诺氟沙星的胶体金免疫层析试纸存在的需要繁琐的前处理，以及检测灵敏度有待进一步提高的问题，本发明提供一种诺氟沙星的检测方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种诺氟沙星的检测方法，包括以下步骤：

步骤a，将诺氟沙星单克隆抗体与生物素偶联，得免疫配基；

步骤b，将所述免疫配基与羧基化纳米Fe₃O₄微球偶联，得免疫磁珠；

步骤c，将链霉亲和素与羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子偶联，得荧光信号探针；

步骤d，将所述免疫磁珠加入待测样品中，加入磁场分离富集样品，再加入荧光信号探针，充分反应后，磁分离富集样品，得样品溶液；

步骤e，将所述样品溶液滴加至含有诺氟沙星人工抗原的免疫层析试纸条上，观察结果。

相对于现有技术，本发明通过免疫磁珠上的诺氟沙星单克隆抗体与待检样品中的诺氟沙星发生特异性结合，在外加磁场的作用下，可实现对复杂基质样品中的目标物进行特异性捕捉和富集，从而改变了传统免疫层析方法样品前处理需要离心和稀释造成的灵敏度低和无法实现现场检测等缺陷，能够实现对大量未知样本的简单快速筛选；同时，通过生物素-链和亲霉素的偶联，将富集样本与荧光信号探针结合，实现了免疫分析、磁性分离和荧光检测的联合检测。本发明利用免疫磁珠比表面积大和荧光信号探针荧光性能稳定和抗基质干扰能力强等优点，增加了待测目标物的承载量和检测系统的稳定性，突破了传统免疫层析技术的局限性，实现了快速分离目标物、双重信号放大、提高检测灵敏度和系统稳定性的目的，通过检测线和质控线的荧光强弱，可以实现裸眼条件下对诺氟沙星的快速定性或半定量检测，适合进行现场快速检测，具有广阔的应用前景。

本发明的检测机理为：若样品为阳性，将检测样品与免疫磁珠和荧光探针形成的复合物滴加到免疫层析试纸条上后，通过毛细管的作用力，样品会向吸水纸方向移动，当复合物经过检测线时，如果目标检测物和检测抗体反应完全，则没有多余的检测抗体-Fe₃O₄纳米颗粒-上转换纳米粒子与检测线处的捕获抗原发生特异性反应，因此在检测线不会形成荧光信号条带，当样品继续移动到质控线时，检测抗体则与检测线处的二抗发生特异性的反应，形成荧光信号；若样品为阴性时，样品中没有目标检测物与Fe₃O₄纳米颗粒上标记的检测抗体发生特异性反应，因此，会在检测线和质控线处均会形成荧光信号条带；只要质控线处未观察到荧光信号条带，则证明该试纸条无效。

优选的，步骤a中，每1mg诺氟沙星单克隆抗体与0.13-0.15mmol的生物素偶联。

进一步优选的，步骤a的具体过程为：将1mg诺氟沙星单克隆抗体与0.13-0.15mmol生物素混合均匀，加入0.12mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下(15-35℃)孵育50-70min，用0.1mol/L的pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)室温下进行透析，过滤，除去未反应的生物素，将得到的诺氟沙星单克隆抗体-生物素复合物用0.18-0.22mL的PBS溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)复溶，得到免疫配基。

优选的，步骤b中，所述羧基化纳米Fe₃O₄微球与诺氟沙星单克隆抗体的质量比为1:0.18-0.22。

优选的，步骤b中，所述羧基化纳米Fe₃O₄微球的制备具体包括如下步骤：

步骤1，以氯化铁和氯化亚铁为原料，采用共沉淀法制备得到Fe₃O₄纳米粒子；

步骤2，将所述Fe₃O₄纳米粒子与油酸混合均匀，反应，分离，得油酸包覆的Fe₃O₄纳米粒子；

步骤3，向所述油酸包覆的Fe₃O₄纳米粒子中加入高锰酸钾溶液，反应，分离，得所述羧基化纳米Fe₃O₄微球。

优选的，步骤1中，所述氯化铁和氯化亚铁的摩尔比1.7-2.0:1，反应温度为75-85℃，反应时间为2.5-3.5h。

优选的，步骤2中，所述Fe₃O₄纳米粒子与油酸的摩尔比为1:0.8-1.2，反应温度为65-75℃，反应时间为50-70min。

优选的，步骤3中，所述高锰酸钾溶液的浓度为8-12mg/mL，高锰酸钾与油酸的摩尔比为1:1.5-1.7，反应温度为20-30℃，反应时间为7-9h。

进一步优选的，步骤b的具体包括以下步骤：

按照摩尔比1.7-2.0:1称取FeCl₃·6H₂O与FeCl₂·4H₂O，加入水中，制成氯化铁浓度为0.2-0.3g/mL，氯化亚铁浓度为0.08-0.1g/mL的铁盐混合溶液。将所述铁盐混合溶液于75-85℃惰性气体氛围下，滴加至氢氧化钠溶液(0.05-0.07g/mL)中，氢氧化钠与FeCl₃的摩尔比16-18:1，回流反应2.5-3.5h，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。

在剧烈搅拌条件下按照摩尔比0.8-1.2:1称取油酸和上述Fe₃O₄磁性纳米粒子，混合均匀，惰性气氛下，65-75℃水浴反应50-70min，通过外加磁场分离，得到油酸包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子，无水乙醇洗涤3-4次，然后用水洗涤至pH＝7，按照高锰酸钾与油酸的摩尔比为1:1.5-1.7加入高锰酸钾溶液(8-12mg/mL)，在超声条件下反应7.5-8.5h，通过外加磁场分离，洗涤，真空冷冻干燥39-41h，加PBS(0.1M，pH7.4)溶液溶解，得到质量浓度为4.8-5.2mg/mL的羧基化纳米Fe₃O₄微球溶液。

按照羧基化纳米Fe₃O₄微球与诺氟沙星单克隆抗体的质量比为1:0.18-0.22，移取羧基化纳米Fe₃O₄微球溶液，加入碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，EDC和NHS与羧基化纳米Fe₃O₄微球的质量比均为3.8-4.2:1，室温反应2.5-3.5h，用PBS溶液清洗，加入4.5-5.2wt％的OVA溶液封闭2h，洗涤，得免疫磁珠。

优选的，步骤c中，所述链霉亲和素与羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子的质量比为1:4-7。

优选的，步骤c中，所述羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子的制备方法包括如下步骤：以乙酸钇、乙酸镱和乙酸铒为原料，通过热分解法制备疏水性上转化纳米粒子，然后通过配体交换法将其表面进行羧基化修饰，得到羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子。

优选的，所述乙酸钇、乙酸镱和乙酸铒的摩尔比为78-80:18-22:2。

本发明制备的羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子在980nm激发波长下，在542nm有特征发射峰且没有其他干扰峰，具有光学信号稳定、背景干扰小、抗基质干扰能力强的优点，提高了检测的灵敏度和准确度。

进一步优选的，步骤c具体包括以下步骤：

按照摩尔比为78-80:18-22:2称取乙酸钇、乙酸镱和乙酸铒，加入油酸和十八烯，油酸与乙酸钇的摩尔比为23-25:1，十八烯和乙酸钇的摩尔比为67-69：1，加热至95-105℃，抽真空8-12min，然后加热至155-165℃，反应25-35min，然后自然冷却至室温，得反应液。然后，按照摩尔比为2-3:3-5的摩尔比称取氢氧化钠和氟化铵，加入甲醇，制备氢氧化钠浓度为0.2-0.3mol/L的溶液，氢氧化钠与乙酸钇的摩尔比为3-4:1，逐滴滴加至上述反应液中，室温搅拌反应25-35min，加热除去甲醇，然后加热至95-105℃，抽真空8-12min，在氩气保护氛围下加热至295-305℃，反应50-70min，自然冷却，洗涤，得到疏水性上转换纳米粒子(OA-UCNPs)。

将OA-UCNPs分散于甲苯中，得浓度为14-16mg/mL的OA-UCNPs分散液，按照质量比15-17:1称量聚丙烯酸(PAA)加入分散液中，混合均匀，于105-115℃搅拌反应50-70min，然后升温至230-250℃反应50-70min，离心，得羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子(PAA-UCNPs)。

按照质量比1:4-7称取链霉亲和素与PAA-UCNPs，利用活化酯反应在25-35℃条件下低速震荡孵育反应1.5-2.5h，用HEPES缓冲液洗涤，得荧光信号探针。

本发明中免疫磁珠、荧光信号探针和待测样品的加入比例为本领域常规用量，可由常规调整得到。

优选的，所述免疫层析试纸条包括底板，底板上依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述吸水垫和结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜上且位于所述底板上相对的两侧，所述样品垫交叠压在结合垫上；所述硝酸纤维素膜上设有包被有诺氟沙星人工抗原的检测线和包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线。

优选的，所述诺氟沙星人工抗原的包被量为每条免疫层析试纸上包被0.05-0.1μg，所述羊抗鼠多克隆抗体的包被量为每条免疫层析试纸上包被0.1-0.3μg。

更优选的，所述诺氟沙星人工抗原的包被量为每条免疫层析试纸上包被0.07μg，所述羊抗鼠多克隆抗体的包被量为每条免疫层析试纸上包被0.2μg。

本发明提供的诺氟沙星的检测方法，可将免疫磁珠、荧光信号探针与待测样品特异性反应的样品直接滴加到免疫层析试纸条上，通过免疫层析试纸条上检测线的荧光信号判断是否为阳性样品，读取结果快捷直观，也不需要专业人员操作，检测结果准确度较高，适合于含诺氟沙星样品的现场检测。

附图说明

图1为实施例1中制备的疏水性上转化纳米粒子的透射电镜图；

图2为本发明实施例1中基于免疫层析试纸条的磁分离富集检测示意图；

图3为实施例2中检测限确定的荧光信号图，其中，1为诺氟沙星标准品浓度为0ng/mL，2为诺氟沙星标准品浓度为0.05ng/mL，3为诺氟沙星标准品浓度为0.1ng/mL，4为诺氟沙星标准品浓度为0.5ng/mL；

图4为实施例2中稳定性试验项下放置4周后检测的荧光信号图，其中，1为诺氟沙星标准品浓度为0ng/mL，2为诺氟沙星标准品浓度为0.05ng/mL，3为诺氟沙星标准品浓度为0.1ng/mL；

图5为实施例2中稳定性试验项下放置8周后检测的荧光信号图，其中，1为诺氟沙星标准品浓度为0ng/mL，2为诺氟沙星标准品浓度为0.05ng/mL，3为诺氟沙星标准品浓度为0.1ng/mL；

图6为实施例2中稳定性试验项下放置12周后检测的荧光信号图，其中，1为诺氟沙星标准品浓度为0ng/mL，2为诺氟沙星标准品浓度为0.05ng/mL，3为诺氟沙星标准品浓度为0.1ng/mL；

图7为实施例2中稳定性试验项下放置16周后检测的荧光信号图，其中，1为诺氟沙星标准品浓度为0ng/mL，2为诺氟沙星标准品浓度为0.05ng/mL，3为诺氟沙星标准品浓度为0.1ng/mL；

图8为实施例3制备的疏水性上转化纳米粒子的电子扫描电镜图；

图9为实施例1和实施例3制备的疏水性上转化纳米粒子的荧光强度曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

本发明实施例提供一种诺氟沙星的检测方法，包括如下步骤：

1.免疫层析试纸条的制备

(1)诺氟沙星抗原的制备

将11.7mg的诺氟沙星溶解于350μL N,N-二甲基甲酰胺中，加入21.2mg NHS和70.5mgEDC，室温条件下搅拌过夜。4℃，10000×g条件下，离心5min，弃沉淀，取上清，并将上清液缓慢逐滴加入到鸡卵清白蛋白(OVA)溶液中(33.0mg鸡卵清白蛋白溶于5mL PBS(0.01M，pH 7.4))中，室温搅拌3h后，将此溶液转移到透析袋中，在4℃条件下，PBS溶液(0.01M，pH 7.4)透析三天，得诺氟沙星抗原(NOR-OVA)。

(2)硝酸纤维素膜的包被

采用上海金标的双维平面划膜仪将制备的诺氟沙星抗原包被于硝酸纤维素膜上作为检测线，包被量为0.07μg/条。

将羊抗鼠lgG溶于0.01MPBS和1wt％OVA溶液中，稀释成浓度为1mg/mL，采用划膜仪将其包被到硝酸纤维素膜上作为质控线，包被量为0.2μg/条。

(3)免疫层析试纸条的组装

在PVC底板上顺次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，切成3.7mm宽的小条，真空封装，常温保存。

上述样品垫、结合垫和吸水垫均为常规市售产品，样品垫为上海金标生物科技公司销售的SB06的玻璃纤维，结合垫为上海金标生物科技公司销售的GFCP203000玻璃纤维垫，吸水垫为上海金标生物科技公司销售的CH37M吸水纸。

2.荧光探针的制备

将263.7mg(0.78mmol)的四水合乙酸钇、84.5mg(0.2mmol)的四水合乙酸镱和8.3mg(0.02mmol)的四水合乙酸铒，加入到100.0mL三口瓶中，再加入6.0mL油酸和17.0mL十八烯，于400-650r/min搅拌使其充分混合，将反应体系加热至100℃抽真空10min，然后加热至160℃，反应30min，之后自然冷却至室温，得反应液。

称取100mg(2.5mmol)氢氧化钠和148.2mg(4mmol)氟化铵，加入10mL甲醇，混合均匀，将其滴加至上述反应液中，室温搅拌30min，然后加热除去甲醇，再将体系加热至100℃抽真空10min，在氩气保护氛围下加热至300℃，反应1h，自然冷却至室温，用乙醇洗涤三次，干燥，得疏水性上转化纳米粒子(OA-UCNPs)，制备的OA-UCNPs为均匀的球形，尺寸大小约为30nm，如图1所示。

称取30mg上述制备的OA-UCNPs加入2mL甲苯，混合均匀，加入500mg聚丙烯酸，氩气保护下，110℃搅拌反应1h，然后升温至240℃反应1h，离心，洗涤，得羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子(PAA-UCNPs)。

向5mg上述制备的PAA-UCNPs中加入1mg链和亲霉素，利用活化酯反应在30℃下低温震荡孵育反应2h，用HEPES缓冲液洗涤三次，用HEPES缓冲液定容至1mL，得荧光信号探针。

3.免疫磁珠的制备

称取8.1gFeCl₃·6H₂O和3.3gFeCl₂·4H₂O于小烧杯中，加入38mL蒸馏水中溶解样品，得铁盐混合溶液。称取20.9gNaOH溶解于375mL蒸馏水中，转移至圆底四颈烧瓶中，放置在80℃水浴中，搅拌条件下，逐渐滴入所述铁盐混合液，通氮除氧回流冷凝3h，反应结束后，通过磁铁分离，去离子水洗涤，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。

在剧烈搅拌条件下，将4.66g(16.5mmol)油酸与3.82g(16.5mmol)制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子混合均匀，在氮气保护下，70℃水浴反应1h，通过外加磁场分离，得到油酸包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子，无水乙醇洗涤4次，然后用水洗涤至pH＝7，加入高锰酸钾溶液(1.6g高锰酸钾溶于160mL水中)，超声震荡8h，通过磁铁分离，去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥40h，加PBS(0.1M，pH7.4)溶液溶解，得到质量浓度为5.0mg/mL的羧基化Fe₃O₄纳米微球溶液。

将1mg单克隆抗体与0.14mmol生物素混合均匀，加入0.12mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下孵育1h，用pH7.4 0.1M的PBS溶液室温下进行透析，除去未反应的生物素，用0.2mLPBS溶液(0.1M，pH7.4)复溶生物素标记的单克隆抗体。

取100μL上述羧基化纳米Fe₃O₄微球溶液，加入2mgEDC和2mgNHS，室温反应3h，用PBS缓冲液清洗3次，加入20μL上述生物素标记的单克隆抗体，搅拌过夜，用PBS溶液清洗3次，再加入5％OVA溶液封闭2h，清洗3次，用1mL0.1％OVA溶液复溶，得免疫磁珠，4℃条件下保存备用。

4.样品的检测

(1)样品的预处理

选择本地从超市购买的鸡肉样品(经HPLC证实为阴性样品)作为检测样品。取1g样品用均质机进行均质处理后，置于50mL离心管内，加入0.2mL氢氧化钠(0.01M)和1.8mL甲醇，混合均匀，剧烈震荡5min，用0.01MPBS溶液(pH7.4)稀释5倍，得待检样品。

(2)检测

配制工作液：称取1.21gTris加入到100mL水中，用浓盐酸调节pH至7.0-8.0，加入5g蔗糖，0.5g的BSA，0.5g的PVP，0.5g的F68，0.5mL10wt％的叠氮钠，0.5mL的PEG200，0.5mL的TritonX-100，1.0mL吐温-20。

各取100μL上述待检样品、免疫磁珠和荧光探针混合均匀，加入外加磁场，分离富集样品，然后加入80μLPBS溶液(0.1M，pH7.4)和20μL工作液，复溶反应产物，最后缓慢滴加至制备的免疫层析试纸条上，10分钟后观察结果。可以观察到层析试纸的检测线和质控线均出现荧光信号。检测示意图如图2所示。

实施例2

2.1方法灵敏度试验

配置系列梯度浓度的诺氟沙星标准品(0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL和0.5ng/mL)。然后按照实施例1中检测方法进行检测，结果如图3所示，可以观察到，当诺氟沙星标准品的浓度为0.1ng/mL时，层析免疫试纸条检测线的荧光强度与质控线荧光强度目测有明显的区别，检测线的荧光强度几乎完全消失，因此，本发明提供的检测方法的目视检测限为0.1ng/mL。

2.2方法稳定性试验

将本发明实施例1制备的免疫层析试纸条以及免疫磁珠和荧光信号探针置于4℃条件下保存16周。分别于第4周、第8周、第12周和第16周按照实施例1的检测方法检测，其中诺氟沙星标准品的浓度分别为0ng/mL、0.05ng/mL和0.1ng/mL。

检测结果如图4-图7所示，从图中可以看出，第16周后检测时，0ng/mL样品的检测线的荧光强度依然明显，0.1ng/mL样品的检测线的荧光强度与质控线荧光强度目测有明显的区别，检测线的荧光强度几乎完全消失，说明本发明提供的检测方法的稳定性良好，16周后检测结果仍然准确可靠。

2.3加标样品检测

向鸡肉阴性样品中添加诺氟沙星标准品，样品中诺氟沙星标准品的最终添加浓度为0μg/L、1.0μg/L、5μg/L、15μg/L，最后用PBS缓冲液稀释5倍，每个浓度平行制备三份样品，按照实施例1的检测方法进行检测。并与市售的胶体金免疫层析试纸条(石家庄大为生物技术有限公司)的检测结果进行比较。

胶体金免疫层析试纸条的测试方法如下：

将组织样本剪碎，称取0.5g组织样本装入胶体免疫层析试纸条的配套组织提取液中，充分混匀，然后将离心管放入90℃以上沸水浴加热10min，取出此离心管放至室温，将离心管放入离心机中，4000转离心5分钟后，取上清为待检液，将待检液滴加至胶体金免疫层析试纸条上。

检测结果对比如表1所示。

表1

经测试，本发明免疫层析试纸条的样品检出限为1μg/L，市售的胶体金免疫层析试纸条的样品检出限为15μg/L。

实验结果说明，相对于传统的胶体金免疫层析技术，本发明建立的方法具有更高的检测灵敏度，更加适合复杂基质中诺氟沙星的快速检测，且对比两种方法的检测步骤可以看出，传统胶体金免疫层析技术在样品分离步骤中需要离心机等设备离心5min左右，而本方法直接采用外加磁场分离时间短(2min左右)，分离效果好。此外，胶体金免疫层析试纸条以胶体金作为信号标记物成本高、易受环境介质干扰，因而样品检测限较高。而本发明采用制备的上转换纳米粒子作为信号标记材料光化学性质稳定，不易受外界储存环境的影响，抗基质干扰能力强，且同时结合免疫磁珠，能够实现检测信号的双重方法，提高检测灵敏度。

实施例1中荧光探针的制备方法、免疫磁珠的制备方法中的参数(如原料比、反应温度和时间等参数)均替换为本发明限定的其他范围内的参数，只要各参数在本发明限定的范围内均可达到与实施例1基本相当的检测效果。

实施例3

本实施例提供一种诺氟沙星的检测方法，其步骤与实施例1完全相同，不同的仅是上转化纳米粒子的制备过程不同，本实施例中上转化纳米粒子的制备过程为：

将0.7g氢氧化钠与8mL油酸和8mL乙醇混合，室温快速搅拌形成白色粘稠状溶液。加入5mL水，溶液开始澄清，同时加入NaF水溶液(0.303g NaF溶解于3mL水中)。称取0.88mmolY(NO₃)₃、0.22mmolYb(NO₃)₃和0.02mmolEr(NO₃)₃加入到上述溶液，均质后转移至反应釜中，230℃反应12h，即可得到疏水性上转换纳米粒子。然后按照与实施例1相同的方法将疏水性上转化纳米粒子通过配体交换法制备羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子。

本实施例制备的疏水性上转化纳米粒子的电子扫描电镜图如图8所示，从图中可以看本方法制备的疏水性上转化纳米粒子为棒状结构，直径为110nm，长度为2μm。与实施例1制备的疏水性上转换纳米粒子相比，其尺寸较大且不规则，不利于在硝酸纤维素膜上的迁移。

本方法制备的疏水性上转化纳米粒子和实施例1制备的疏水性上转化纳米粒子的荧光强度对比如图9所示，从图中可以看出，实施例1制备的疏水性上转化纳米粒子荧光强度更高，更有利于提高检测的灵敏度。

综上所述，本发明提供的诺氟沙星的检测方法，可通过磁分离实现复杂基质中目标物的快速分离，简化前处理步骤，预处理和检测耗时更短，检测快速，能够实现对大量未知样品的简单快速筛选，检测成本低，有利于在实践中推广应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。