一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法
阅读说明：本技术 一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法 (Immunofluorescence multiple staining kit for paraffin section and using method ) 是由 池喜峰 来丽丽 王宇 赵成成 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒,包括试剂A、试剂B、稀释液、FITC试剂、Cy3试剂及Cy5试剂,本发明还提供了一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒使用方法,本试剂盒采用TSA信号放大技术,其原理与普通的免疫组化类似,一抗与抗原结合后,孵育HRP标记的二抗,HRP催化加入体系的荧光素底物,生成活化荧光底物,活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合,使样品上稳定地共价结合荧光素,之后用热修复洗去非共价结合的抗体,再换第二种一抗进行第二轮孵育,换另一种荧光素底物,如此往复就可实现多重标记,并且每轮只孵育一种抗体,微波处理后洗去非共价结合的抗体,所以对所用抗体种属来源无限制。(The invention provides a paraffin section immunofluorescence multiple staining kit, which comprises a reagent A, a reagent B, a diluent, an FITC reagent, a Cy3 reagent and a Cy5 reagent, and also provides a method for using the paraffin section immunofluorescence multiple staining kit, the kit adopts a TSA signal amplification technology, the principle is similar to that of common immunohistochemistry, a primary antibody is combined with an antigen, an HRP-labeled secondary antibody is incubated, the HRP is added into a fluorescein substrate of a system in a catalytic manner to generate an activated fluorescein substrate, the activated fluorescein substrate can be covalently combined with tyrosine on the antigen, so that fluorescein is stably covalently combined on a sample, then the non-covalently combined antibody is washed off by thermal restoration, a secondary primary antibody is replaced for secondary incubation, another fluorescein substrate is replaced, so that multiple labeling can be realized by reciprocating, only one antibody is incubated in each round, the non-covalently combined antibody is washed off after microwave treatment, there is no limitation on the source of the antibody species used.)
技术领域
本发明涉及生物医药应用技术领域，尤其是涉及一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法。
背景技术
免疫荧光技术是以抗体与抗原特异性结合为基础的一种实验技术，由于操作简单、效率高、特异性强等优势在基础研究和临床实验中被广泛应用；随着免疫治疗的崛起，越来越多肿瘤微环境中的标志物被发现与疾病治疗、进展密切相关，对这些标志物进行同时染色标记、并研究它们之间的共定位、表达量和距离关系成为肿瘤免疫研究的普遍需求；传统的免疫荧光标记可以做到两种抗体同时标记，且需要此两种抗体制备来源种属不同，用以连接不同荧光素的二抗来显色；该实验方法对一抗来源种属要求高，如果想做两种以上抗原标记则要求所有抗体来源种属不同，往往不能购买符合要求的所有抗体，导致不能进行多种抗原标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法，该石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法可以在同一张切片上同时标记多种不同抗原，且不对所用抗原的一抗来源种属有所限制。
本发明提供一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒，包括试剂A、试剂B、稀释液、FITC试剂、Cy3试剂及Cy5试剂；
所述试剂A主要为Biotin-Tyramide；
所述试剂B为30％H2O2；
所述稀释液为pH为7.4的磷酸缓冲液；
所述FITC试剂为Streptavidin-FITC；
所述Cy3试剂为Streptavidin-Cy3；
所述Cy5试剂为Streptavidin-Cy5。
一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒使用方法，包括以下步骤：
S1：试剂准备，包括以下步骤：
S1-1：取1ul试剂A溶于500ul稀释液，做为试剂1；
S1-2：取1ul试剂B溶于10ul稀释液，做为试剂2；
S1-3：取1ul上述试剂2溶于100ul上述试剂1，制得多重IF染色工作液；
S1-4：取1ul FITC试剂溶于1ml稀释液，制得FITC工作液；
S1-5：取1ul Cy3试剂溶于1ml稀释液，制得Cy3工作液；
S1-6：取1ul Cy5试剂溶于1ml稀释液，制得Cy5工作液；
S2：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、85％酒精5min及75％酒精5min，最后蒸馏水洗；
S3：抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于蒸锅内进行抗原修复，温度达到95℃后计时30min，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S4：画圈自发荧光淬灭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止抗体流走，在圈内加入自发荧光淬灭剂A，室温孵育15min，然后流水冲洗10min，在圈内加入自发荧光淬灭剂B，室温孵育10min，然后流水冲洗10min；
S5：血清封闭:在圈内滴加5％BSA室温孵育30min；
S6：加第一种一抗：甩掉封闭液，圈内滴加第一种一抗，湿盒内4℃孵育过夜；
S7：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内孵育1h；
S8：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S9：加FITC工作液：切片稍甩干后在圈内滴加FITC工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S10：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S11：加第二种一抗：在切片上滴加稀释后的第二种一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜；
S12：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S13：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S14：加Cy3工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy3工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S15：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S16：加第三种一抗：在切片上滴加稀释后的第三种一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜；
S17：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S18：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S19：加Cy5工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy5工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S20：DAPI复染细胞核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
S21：封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；
S22：镜检：显微镜下选取视野拍照。
优选的，在S1中，试剂1、试剂2、多重IF染色工作液、FITC工作液、Cy3工作液及Cy5工作液均需混匀避光待用，多重IF三染工作液根据样本多少计算用量现配现用。
优选的，所述EDTA抗原修复缓冲液的pH值为8.0，所述PBS的pH值为7.4。
优选的，在S4中，孵育完自发荧光淬灭剂B后，组织会被染为蓝黑色，该结果不会影响后续实验结果。
优选的，在S5中，称取5g BSA溶解于100mlPBS中，得到质量体积比为5％的BSA溶液。
优选的，添加第一种一抗、第二种一抗及第三种一抗时湿盒内加少量水防止抗体蒸发。
有益效果
本试剂盒采用TSA信号放大技术，其原理与普通的免疫组化类似，一抗与抗原结合后，孵育HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素，之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换第二种一抗进行第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记，并且每轮只孵育一种抗体，微波处理后洗去非共价结合的抗体，所以对所用抗体种属来源无限制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的TSA原理图；
图2为本发明的第一种实施例视图；
图3为本发明的显微镜下小鼠肺脏E-Cadherin视图；
图4为本发明的显微镜下KLF4视图；
图5为本发明的显微镜下Vimentin视图；
图6为本发明的第二种实施例视图；
图7为本发明的显微镜下大鼠脑BDNF视图；
图8为本发明的显微镜下Iba1视图；
图9为本发明的显微镜下Neun视图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。此外，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1至图9，本发明提供一种技术方案：
一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒，包括试剂A、试剂B、稀释液、FITC试剂、Cy3试剂及Cy5试剂；
所述试剂A主要为Biotin-Tyramide；
所述试剂B为30％H2O2；
所述稀释液为pH为7.4的磷酸缓冲液；
所述FITC试剂为Streptavidin-FITC；
所述Cy3试剂为Streptavidin-Cy3；
所述Cy5试剂为Streptavidin-Cy5。
一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒使用方法，包括以下步骤：
S1：试剂准备，包括以下步骤：
S1-1：取1ul试剂A溶于500ul稀释液，做为试剂1，混匀避光待用；
S1-2：取1ul试剂B溶于10ul稀释液，做为试剂2，混匀避光待用；
S1-3：取1ul上述试剂2溶于100ul上述试剂1，制得多重IF染色工作液，混匀避光待用，多重IF三染工作液根据样本多少计算用量现配现用；
S1-4：取1ul FITC试剂溶于1ml稀释液，制得FITC工作液，混匀避光待用；
S1-5：取1ul Cy3试剂溶于1ml稀释液，制得Cy3工作液，混匀避光待用；
S1-6：取1ul Cy5试剂溶于1ml稀释液，制得Cy5工作液，混匀避光待用；
S2：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、85％酒精5min及75％酒精5min，最后蒸馏水洗；
S3：抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于蒸锅内进行抗原修复，温度达到95℃后计时30min，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S4：画圈自发荧光淬灭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止抗体流走，在圈内加入自发荧光淬灭剂A，室温孵育15min，然后流水冲洗10min，在圈内加入自发荧光淬灭剂B，室温孵育10min，然后流水冲洗10min，孵育完自发荧光淬灭剂B后，组织会被染为蓝黑色，该结果不会影响后续实验结果；
S5：血清封闭:在圈内滴加5％BSA室温孵育30min，称取5g BSA溶解于100mlPBS中，得到质量体积比为5％的BSA溶液；
S6：加第一种一抗：甩掉封闭液，圈内滴加第一种一抗，湿盒内4℃孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S7：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内孵育1h；
S8：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S9：加FITC工作液：切片稍甩干后在圈内滴加FITC工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S10：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S11：加第二种一抗：在切片上滴加稀释后的第二种一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S12：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S13：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S14：加Cy3工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy3工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S15：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S16：加第三种一抗：在切片上滴加稀释后的第三种一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S17：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加对应HRP标记的二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S18：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S19：加Cy5工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy5工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S20：DAPI复染细胞核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
S21：封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；
S22：镜检：显微镜下选取视野拍照。
优选的，在S1中，试剂1、试剂2、多重IF染色工作液、FITC工作液、Cy3工作液及Cy5工作液均需混匀避光待用，多重IF三染工作液根据样本多少计算用量现配现用。
所述EDTA抗原修复缓冲液的pH值为8.0，所述PBS的pH值为7.4。
作为本发明的第一种实施例：一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒使用方法，采用小鼠肺脏E-Cadherin，KLF4，Vimentin免疫荧光同源三染，包括以下步骤：
S1：试剂准备，包括以下步骤：
S1-1：取1ul试剂A溶于500ul稀释液，做为试剂1，混匀避光待用；
S1-2：取1ul试剂B溶于10ul稀释液，做为试剂2，混匀避光待用；
S1-3：取1ul上述试剂2溶于100ul上述试剂1，制得多重IF染色工作液，混匀避光待用，多重IF三染工作液根据样本多少计算用量现配现用；
S1-4：取1ul FITC试剂溶于1ml稀释液，制得FITC工作液，混匀避光待用；
S1-5：取1ul Cy3试剂溶于1ml稀释液，制得Cy3工作液，混匀避光待用；
S1-6：取1ul Cy5试剂溶于1ml稀释液，制得Cy5工作液，混匀避光待用；
S2：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、85％酒精5min及75％酒精5min，最后蒸馏水洗；
S3：抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于蒸锅内进行抗原修复，温度达到95℃后计时30min，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S4：画圈自发荧光淬灭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止抗体流走，在圈内加入自发荧光淬灭剂A，室温孵育15min，然后流水冲洗10min，在圈内加入自发荧光淬灭剂B，室温孵育10min，然后流水冲洗10min，孵育完自发荧光淬灭剂B后，组织会被染为蓝黑色，该结果不会影响后续实验结果；
S5：血清封闭:在圈内滴加5％BSA室温孵育30min，称取5g BSA溶解于100mlPBS中，得到质量体积比为5％的BSA溶液；
S6：加E-Cadherin一抗：甩掉封闭液，圈内滴加E-Cadherin一抗，湿盒内4℃孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S7：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加GoatAnti-Rabbit IgG H&L(HRP)二抗覆盖组织，室温湿盒内孵育1h；
S8：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S9：加FITC工作液：切片稍甩干后在圈内滴加FITC工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S10：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S11：加KLF4一抗：在切片上滴加稀释后的KLF4一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S12：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加GoatAnti-Rabbit IgGH&L(HRP)二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S13：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S14：加Cy3工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy3工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S15：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S16：加Vimentin一抗：在切片上滴加稀释后的Vimentin一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S17：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加GoatAnti-Rabbit IgGH&L(HRP)二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S18：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S19：加Cy5工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy5工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S20：DAPI复染细胞核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
S21：封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；
S22：镜检：显微镜下选取视野拍照；
由图2至图5中小鼠肺脏E-Cadherin、KLF4及Vimentin免疫荧光同源三染结果可知，本试剂盒可在同一张石蜡切片上标记多种抗原，且对一抗来源种属无限制。
作为本发明的第二中实施例：一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒使用方法，采用大鼠脑BDNF，Iba1，Neun免疫荧光同源三染，包括以下步骤：
S1：试剂准备，包括以下步骤：
S1-1：取1ul试剂A溶于500ul稀释液，做为试剂1，混匀避光待用；
S1-2：取1ul试剂B溶于10ul稀释液，做为试剂2，混匀避光待用；
S1-3：取1ul上述试剂2溶于100ul上述试剂1，制得多重IF染色工作液，混匀避光待用，多重IF三染工作液根据样本多少计算用量现配现用；
S1-4：取1ul FITC试剂溶于1ml稀释液，制得FITC工作液，混匀避光待用；
S1-5：取1ul Cy3试剂溶于1ml稀释液，制得Cy3工作液，混匀避光待用；
S1-6：取1ul Cy5试剂溶于1ml稀释液，制得Cy5工作液，混匀避光待用；
S2：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、85％酒精5min及75％酒精5min，最后蒸馏水洗；
S3：抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于蒸锅内进行抗原修复，温度达到95℃后计时30min，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S4：画圈自发荧光淬灭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止抗体流走，在圈内加入自发荧光淬灭剂A，室温孵育15min，然后流水冲洗10min，在圈内加入自发荧光淬灭剂B，室温孵育10min，然后流水冲洗10min，孵育完自发荧光淬灭剂B后，组织会被染为蓝黑色，该结果不会影响后续实验结果；
S5：血清封闭:在圈内滴加5％BSA室温孵育30min，称取5g BSA溶解于100mlPBS中，得到质量体积比为5％的BSA溶液；
S6：加BDNF一抗：甩掉封闭液，圈内滴加BDNF一抗，湿盒内4℃孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S7：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加GoatAnti-Rabbit IgG H&L(HRP)二抗覆盖组织，室温湿盒内孵育1h；
S8：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S9：加FITC工作液：切片稍甩干后在圈内滴加FITC工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S10：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S11：加Iba1一抗：在切片上滴加稀释后的Iba1一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S12：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加GoatAnti-Rabbit IgG H&L(HRP)二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S13：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S14：加Cy3工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy3工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S15：微波处理去除多余一抗：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉中，中火5min停火5min转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
S16：加Neun一抗：在切片上滴加稀释后的Neun一抗，切片平放于湿盒内4℃避光孵育过夜，湿盒内加少量水防止抗体蒸发；
S17：加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加GoatAnti-Rabbit IgG H&L(HRP)二抗覆盖组织，室温湿盒内避光孵育1h；
S18：使用多重IF染色kit试剂：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；圈内滴加现配的多重IF染色工作液，湿盒内室温避光孵育30min；玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动避光洗涤2次，每次5min；
S19：加Cy5工作液：切片稍甩干后在圈内滴加Cy5工作液覆盖组织，室温湿盒内避光孵育30min；
S20：DAPI复染细胞核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
S21：封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；
S22：镜检：显微镜下选取视野拍照；
由图6至图9中大鼠脑BDNF、Iba1及Neun免疫荧光同源三染结果可知，本试剂盒可在同一张石蜡切片上标记多种抗原，且对一抗来源种属无限制。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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