阅读说明：本技术 在主链和侧链具有单分散聚乙二醇的异双官能性化合物 (Heterobifunctional compounds having monodisperse polyethylene glycol in main and side chains ) 是由 义村耕平 粒崎拓真 羽村美华 松野佑纪 于 2019-03-11 设计创作，主要内容包括：一种如式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇：<Image he="153" wi="700" file="DDA0002675609890000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>X<Sup>1</Sup>和Y<Sup>1</Sup>各自为包含能够在与生物功能分子中存在的官能团的反应中形成共价键的官能团的原子团,原子团X<Sup>1</Sup>包含的官能团与原子团Y<Sup>1</Sup>包含的官能团互不相同；R<Sup>1</Sup>是具有1至7个碳原子的烃基或氢原子；n是3至72的整数；l是2至72的整数；A<Sup>1</Sup>表示-L<Sup>1</Sup>-(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>m1</Sub>-或-L<Sup>1</Sup>-(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>m1</Sub>-L<Sup>2</Sup>-(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>m2</Sub>-,L<Sup>1</Sup>表示特定的键或单键,L<Sup>2</Sup>表示特定的键,并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B<Sup>1</Sup>表示-L<Sup>3</Sup>-(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>m3</Sub>-、-L<Sup>3</Sup>-(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>m3</Sub>-L<Sup>4</Sup>-(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>m4</Sub>-或单键,L<Sup>3</Sup>表示酰胺键或单键,L<Sup>4</Sup>表示特定的键,并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数；并且C<Sup>1</Sup>表示-L<Sup>5</Sup>-(CH<Sub>2</Sub>)<Sub>m5</Sub>-、-O-CH<Sub>2</Sub>-或单键,L<Sup>5</Sup>表示特定的键或单键,并且m5表示1至5的整数。(A hetero-bifunctional monodisperse polyethylene glycol of formula (1): X 1 and Y 1 Each being a radical comprising a functional group capable of forming a covalent bond in reaction with a functional group present in a biofunctional molecule, radical X 1 Containing functional groups and radicals Y 1 The functional groups contained are different from each other; r 1 Is a hydrocarbon group having 1 to 7 carbon atoms or a hydrogen atom; n is an integer from 3 to 72; l is an integer from 2 to 72; a. the 1 Is represented by-L 1 ‑(CH 2 ) m1 -or-L 1 ‑(CH 2 ) m1 ‑L 2 ‑(CH 2 ) m2 ‑，L 1 Represents a specific bond or single bond, L 2 Represents a specific bond, and m1 and m2 each independently represent an integer of 1 to 5; b is 1 Is represented by-L 3 ‑(CH 2 ) m3 ‑、‑L 3 ‑(CH 2 ) m3 ‑L 4 ‑(CH 2 ) m4 -or a single bond, L 3 Represents an amide bond or a single bond, L 4 Represents a specific bond, and m3 and m4 each independently represent an integer of 1 to 5; and C 1 Is represented by-L 5 ‑(CH 2 ) m5 ‑、‑O‑CH 2 -or a single bond, L 5 Represents a specific bond or single bond, and m5 represents an integer of 1 to 5.)

在主链和侧链具有单分散聚乙二醇的异双官能性化合物

技术领域

本发明涉及在主链和侧链具有单分散聚乙二醇并且具有两个不同的化学反应性官能团的异双官能性化合物。更具体地，本发明涉及在主链和侧链具有单分散聚乙二醇并且具有两个不同的化学反应性官能团的异双官能性化合物，其用于修饰例如生理活性蛋白、肽、抗体、核酸或低分子量药物的生物功能分子、药物递送系统中的药物载体、诊断用材料或医疗器械等，并且其对于修饰抗体药物是特别有用的。

背景技术

抗体-药物缀合物(Antibody-Drug Conjugate：ADC)是一种抗体药物，其中药物结合于抗体并且其目标为通过抗体的抗原特异性将药物主动运输至疾病位点。近年来，它是在癌症治疗领域中最快速成长的技术之一。ADC是由抗体、药物以及用于连接抗体和药物的连接物的各个部分构成的。

许多用于ADC的药物是疏水性的，当将多个这种疏水药物结合至抗体以制备ADC时，存在由于药物的疏水性导致的聚集发生或抗体在血液中的稳定性下降的问题。因此，每个抗体能够搭载的药物数量受到限制，作为结果，在一些情况下ADC的药效不能充分地获得。

对于该问题，研究的解决方案之一是使用亲水性连接物。作为亲水性连接物，使用了聚乙二醇、亲水性肽和糖链等。特别地，由于聚乙二醇具有低抗原性和高生物相容性，其在临床试验及前临床试验阶段的多个ADC中使用。

在ADC领域中，为了保证ADC的均质性和简化其纯化、分析和药物审批过程的目的，使用了包含90％以上具有特定乙二醇链长的组分的化合物。这样的化合物被称为单分散聚乙二醇。

在使用单分散聚乙二醇作为ADC的连接物的情况下，由于需要分别地结合抗体和药物，所以采用了具有两个不同的化学反应性官能团的异双官能性单分散聚乙二醇。一般而言，ADC是使用在单分散聚乙二醇链的两个末端具有互不相同的化学反应性官能团的化合物而制备的。

然而，近年来，已经报道了一种ADC，其不使用单分散聚乙二醇作为连接抗体和药物的连接物主链，并且导入单分散聚乙二醇作为连接抗体和药物的分枝化连接物的侧链。

在非专利文献1中，对于使用单分散聚乙二醇作为连接抗体和药物的连接物主链的ADC以及使用单分散聚乙二醇作为连接抗体和药物的分枝化连接物的侧链的ADC，比较了其药物动力学和治疗效果，并且报道了后者的ADC对于药物的疏水性具有高掩蔽效果且展现了优秀的药物动力学和治疗效果。

此外，专利文献2和专利文献3公开了各种类型的具有作为分枝化连接物的侧链的单分散聚乙二醇的ADC，以及用于制备这些ADC的中间体。

顺便提及，专利文献1公开了具有季戊四醇骨架且具有四个聚乙二醇链以及在聚乙二醇链的末端处的两种类型的官能团的聚乙二醇衍生物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：JP-T-2013-515791(本文中使用的表述“JP-T”意指PCT专利申请的公开的日文翻译)

专利文献2：WO2015/057699

专利文献3：WO2016/063006

非专利文献

非专利文献1：Nature Biotechnology,2015,33,733-735

发明内容

本发明解决的问题

专利文献1仅公开了具有在季戊四醇骨架上的四个聚乙二醇链以及在聚乙二醇链的末端处的两种类型的官能团的化合物。这是因为在官能团化反应中，具有季戊四醇作为骨架的四链聚乙二醇衍生物的末端羟基衍生为其他官能团，然后通过柱纯化获得单衍生化或二衍生化产物。

在专利文献1公开的使用聚乙二醇衍生物制备ADC的情形中，待制备的ADC是其中抗体和药物结合至聚乙二醇衍生物的末端的ADC，即是其中使用聚乙二醇用作连接抗体和药物的连接物主链的ADC。

在非专利文献1、专利文献2或专利文献3记载的具有作为分枝化连接物的侧链的单分散聚乙二醇的ADC中，在单分散聚乙二醇所结合的连接物的分枝部分中使用了具有非对称碳的氨基酸。

在具有期望的化学结构的连接物使用具有这样的手性中心的化合物通过各种化学转化过程构建而成的情况下，在化学转化过程中所包括的例如酸性或碱性反应条件、在有机催化剂或无机催化剂存在下的反应或者在缩合剂存在下的反应中发生不期望的手性中心的部分立体翻转或外消旋化，因此存在形成立体异构体的混合物的可能性。从立体异构体的混合物中分离具有期望的三维结构的化合物是非常困难的。由于形成非均质ADC，使用这样的立体异构体的混合物作为连接体连接抗体和药物是不优选地。

此外，在专利文献2或专利文献3中，还公开了在分枝化连接物的侧链中具有两个以上单分散聚乙二醇的ADC。然而，各个单分散聚乙二醇侧链的结合位置分离，并且由于作为具有多个聚乙二醇链的分枝化聚乙二醇的特征的“伞状结构”(Biomaterials 2001,22(5),405-417)对于疏水性药物的掩蔽效果小，使得由于多个单分散聚乙二醇侧链的存在而带来的优势不能被有效地利用。

本发明的目的是提供：在主链具有单分散聚乙二醇、具有两个相邻的单分散聚乙二醇侧链并且在分子结构中不具有手性中心的异双官能性单分散聚乙二醇；以及其中使用该异双官能性单分散聚乙二醇连接抗体和药物的抗体-药物缀合物。

解决问题的手段

为解决上述问题进行了大量研究，作为结果，发明人开发了：一种作为异双官能性化合物的异双官能性单分散聚乙二醇，其中主链中存在单分散聚乙二醇并且两个相邻的单分散聚乙二醇侧链相邻地相互结合并且在分子结构中不具有手性中心；以及一种其中使用该异双官能性单分散聚乙二醇连接抗体和药物的抗体-药物缀合物。

此外，在本发明的异双官能性单分散聚乙二醇中，由于两个单分散聚乙二醇侧链通过稳定的醚键结合于分枝部分的四级碳原子，其具有在异双官能性单分散聚乙二醇的结构的化学转化过程中难以分解为单链单分散聚乙二醇的特征。

另外，由于本发明的异双官能性单分散聚乙二醇具有能够调整链长的单分散聚乙二醇主链，其通过在抗体-连接物化合物与药物的结合或者药物-连接物化合物与抗体的结合中增加单分散聚乙二醇的链长，从而具有能够避免由于抗体和药物之间的空间位阻导致的反应性降低并且不损害ADC的亲水性的特征。

即，本发明如下：

[1]一种异双官能性单分散聚乙二醇，如式(1)所示：

(在式(1)中，X¹和Y¹各自为包含至少一个能够在与生物功能分子中存在的官能团的反应中形成共价键的官能团的原子团，原子团X¹包含的官能团与原子团Y¹包含的官能团互不相同；R¹是具有1至7个碳原子的烃基或氢原子；n是3至72的整数；l是2至72的整数；A¹表示-L¹-(CH₂)_m1-或-L¹-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L¹表示醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，L²表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B¹表示-L³-(CH₂)_m3-、-L³-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-或单键，L³表示酰胺键或单键，L⁴表示醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数；并且C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键，L⁵表示酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。)

[2]根据[1]所述的异双官能性单分散聚乙二醇，其中，在式(1)中，A¹表示-NHC(O)-(CH₂)_m1-或-NHC(O)-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，B¹表示-(CH₂)_m3-或-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-，并且C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键。

[3]根据[1]所述的异双官能性单分散聚乙二醇，其中，在式(1)中，A¹表示-CH₂-或-CH₂-L²-(CH₂)_m2-，B¹表示-CH₂-或-CH₂-L⁴-(CH₂)_m4-，并且C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键。

[4]根据[1]所述的异双官能性单分散聚乙二醇，其中，在式(1)中，A¹表示-O-(CH₂)_m1-或-O-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，B¹表示-CH₂-或-CH₂-L⁴-(CH₂)_m4-，并且C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键。

[5]根据[1]所述的异双官能性单分散聚乙二醇，其中，在式(1)中，A¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m1-或-C(O)NH-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，B¹表示-CH₂-或-CH₂-L⁴-(CH₂)_m4-，并且C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键。

[6]根据[1]所述的异双官能性单分散聚乙二醇，其中，在式(1)中，A¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m1-或-C(O)NH-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，B¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m3-或-C(O)NH-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-，并且C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键。

[7]根据[1]至[6]的任意一项所述的异双官能性单分散聚乙二醇，其中，在式(1)中，X¹和Y¹各自独立地选自由式(a)、式(b1)、式(b2)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)、式(j)、式(k)、式(l)、式(m)、式(n)和式(o)所组成的组：

(在式(d)中，R²是氢原子或具有1至5个碳原子的烃基；在所述式(e)中，R³是选自氯原子、溴原子和碘原子的卤素原子；并且在所述式(l)中，R⁴是氢原子或具有1至5个碳原子的烃基。)

[8]一种抗体-药物缀合物，包括异双官能性单分散聚乙二醇，如式(2)所示：

(在式(2)中，X²和Y²中的一个是抗体，并且另一个是药物；R¹是具有1至7个碳原子的烃基或氢原子；n是3至72的整数；l是2至72的整数；A¹表示-L¹-(CH₂)_m1-或-L¹-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L¹表示醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，L²表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B²表示-L³-(CH₂)_m3-L⁶、-L³-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-L⁶或-L⁶-，L³表示酰胺键或单键，L⁴表示醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，m3和m4各自独立地表示1至5的整数，并且L⁶是酰胺键、氨基甲酸酯键、硫醚键、二硫键、碳酸酯键、酯键、醚键、1H-1,2,3-***-1,4-二基结构、仲氨基、酰肼基、氧代酰胺基或包含上述任意的烃基；并且C²表示-L⁵-(CH₂)_m5-L⁷-、-O-CH₂-L⁷-或-L⁷-，L⁵表示酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，m5表示1至5的整数，并且L⁷是酰胺键、氨基甲酸酯键、硫醚键、二硫键、碳酸酯键、酯键、醚键、1H-1,2,3-***-1,4-二基结构、仲氨基、酰肼基、氧代酰胺基或包含上述任意的烃基。)

发明的效果

由于根据本发明的异双官能性单分散聚乙二醇不具有手性中心，在化学转化过程中从根本上会不发生不期望的手性中心的部分立体翻转或外消旋化的问题。此外，由于两个单分散聚乙二醇侧链通过稳定的醚键结合于分枝部分的四级碳原子，其在化学转化过程中难以分解为单链单分散聚乙二醇。因此，通过使用异双官能性单分散聚乙二醇结合抗体与药物，能够获得具有高均质性的抗体-药物缀合物。

除此之外，在异双官能性单分散聚乙二醇中，由于两个单分散聚乙二醇侧链相邻地相互结合，当制备抗体-药物缀合物时，对疏水性药物的掩蔽效果大，因此能够抑制由于药物的疏水性导致的聚集发生或抗体在血液中的稳定性下降。

附图说明

图1是在实施例8中使用疏水作用色谱(HIC)柱的HPLC测量的图表。

图2是在比较例7中使用疏水作用色谱(HIC)柱的HPLC测量的图表。

图3是在比较例14中使用疏水作用色谱(HIC)柱的HPLC测量的图表。

具体实施方式

下文中将详细描述本发明。

在本说明书中，“异双官能性”意指具有两个不同的化学反应性官能团，并且“单分散聚乙二醇”意指包含90％以上具有特定乙二醇链长的组分的化合物。

本发明的异双官能性单分散聚乙二醇如式(1)所示。

本发明式(1)中的R¹是烃基或氢原子。烃基的碳原子的数量优选为7以下。烃基的实例包括烷基、芳基和芳烷基，并且烃基具体包括甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、苯基和苄基。R¹的优选实施方式是甲基或氢原子，更优选为甲基。

本发明式(1)中的n表示单分散聚乙二醇的重复单元的数量，并且是3至72的整数，优选为4至48的整数，更优选为6至36的整数，并且特别优选为8至24的整数。

本发明式(1)中的l表示单分散聚乙二醇的重复单元的数量，并且是2至72的整数，优选为3至36的整数，更优选为4至24的整数，并且特别优选为6至12的整数。并且，l优选为l≤n，更优选为l≤2n/3。

在本说明书中，式(1)中的原子团X¹和Y¹互不相同并且没有特别限定，只要是包含至少一个能够与作为异双官能性单分散聚乙二醇的修饰对象的生物功能分子(例如生理活性蛋白、肽、抗体、核酸或低分子量药物)中存在的官能团的反应以形成共价键的官能团的原子团即可。官能团的实例包括例如在“Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques,2nded.；Academic Press:San Diego,CA,2008”、“Harris,J.M.Poly(Ethylene Glycol)Chemistry；Plenum Press:New York,1992”和“PEGylated Protein Drugs:Basic Scienceand Clinical Applications；Veronese,F.M.,Ed.；Birkhauser:Basel,Switzerland,2009”等中记载的官能团。

其中，X¹和Y¹所包含的官能团各自独立地优选为能够在温和反应条件下以高反应效率与由蛋白质所代表的天然的生物功能分子中存在的官能团(例如氨基、巯基、醛基或羧基)或者能够被人工导入上述生物功能分子的官能团(例如马来酰亚胺基、酮基、叠氮基及或炔基)反应的官能团。更具体地，其优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异腈酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、乙烯基砜基、丙烯酰基、磺酰氧基、羧基、巯基、2-吡啶基二硫基、α-卤代乙酰基、羟基、炔基、烯丙基、乙烯基、氨基、氧代氨基、酰肼基、叠氮基或二苯并环辛炔(DBCO)基。此外，考虑到反应效率，其优选为活性酯基、活性碳酸酯基、马来酰亚胺基、α-卤代乙酰基、炔基、叠氮基或二苯并环辛炔(DBCO)基。

更具体地，X¹和Y¹所包含的官能团各自独立地，在作为修饰对象的生物功能分子中存在的官能团为氨基的情况下，优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异腈酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、乙烯基砜基、丙烯酰基、α-卤代乙酰基、磺酰氧基或羧基；在作为修饰对象的生物功能分子中存在的官能团为巯基的情况下，优选为活性酯基、活性碳酸酯基、醛基、异腈酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、马来酰亚胺基、乙烯基砜基、丙烯酰基、磺酰氧基、羧基、巯基、2-吡啶基二硫基、α-卤代乙酰基、炔基、烯丙基或乙烯基；在作为修饰对象的生物功能分子中存在的官能团为羧基的情况下，优选为巯基、羟基、氨基、氧代氨基或酰肼基；在作为修饰对象的生物功能分子中存在的官能团为炔基的情况下，优选为巯基、氨基、氧代氨基、酰肼基或叠氮基；在作为修饰对象的生物功能分子中存在的官能团为叠氮基的情况下，优选为炔基或二苯并环辛炔(DBCO)基；在作为修饰对象的生物功能分子中存在的官能团为卤代烷基、烷基磺酸酯或芳基磺酸酯的情况下，优选为巯基、羟基或氨基。

此处，“活性酯基”指代由式：-C(＝O)-L表示的活化羰基，其中L表示离去基团。由L表示的离去基团包括琥珀酰亚胺基氧基，邻苯二甲酰亚胺基氧基、4-硝基苯氧基、1-咪唑基、五氟苯氧基、苯并***-1-基氧基和7-氮杂苯并***1-基-氧基等。“活性碳酸酯”指代由式：-O-C(＝O)-L表示的活化碳酸酯基，并且L表示与上述相同的离去基团。

在本发明的优选实施方式中，X¹和Y¹各自独立地是由基团(I)、基团(II)、基团(III)、基团(IV)、基团(V)或基团(VI)表示的基团。

基团(I)：能够通过与生物官能性分子的氨基反应形成共价键的官能团

下列(a)、(b1)、(b2)、(c)、(d)、(e)和(f)：

基团(II)：能够通过与生物官能性分子的巯基反应形成共价键的官能团

下列(a)、(b1)、(b2)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(l)：

基团(III)：能够通过与生物官能性分子的醛基或羧基反应形成共价键的官能团

下列(g)、(i)、(j)、(k)和(o)：

基团(IV)：能够通过与生物官能性分子的炔基反应形成共价键的官能团

下列(g)、(i)、(j)、(k)和(n)：

基团(V)：能够通过与生物官能性分子的叠氮基反应形成共价键的官能团

下列(l)和(m)：

基团(VI)：能够通过与生物官能性分子的卤代烷基、烷基磺酸酯或芳基磺酸酯反应形成共价键的官能团

下列(g)、(i)和(o)。

在本发明的优选实施方式中，X¹和Y¹各自独立地特别优选为基团(a)至(n)。

式中，R²和R⁴各自是氢原子或具有1至5个碳原子的烃基，烃基的实例包括烷基，并且烃基具体包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基和戊基。R³是选自氯原子、溴原子和碘原子的卤素原子。

作为式(1)中的原子团X¹和Y¹所包含的官能团的优选组合，当X¹所包含的官能团是活性酯基或活性碳酸酯基时，Y¹所包含的官能团是选自马来酰亚胺基、乙烯基砜基、α-卤代乙酰基、炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基和叠氮基的基团；当X¹所包含的官能团是醛基时，Y¹所包含的官能团是选自马来酰亚胺基、乙烯基砜基、炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基和叠氮基的基团；当X¹所包含的官能团是马来酰亚胺基、乙烯基砜基或α-卤代乙酰基时，Y¹所包含的官能团是选自活性酯基、活性碳酸酯基、炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基和叠氮基的基团；当X¹所包含的官能团是炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基或叠氮基时，Y¹所包含的官能团是选自马来酰亚胺基、乙烯基砜基、α-卤代乙酰基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基、氧代氨基和羟基的基团；当X¹所包含的官能团是氨基或氧代氨基时，Y¹所包含的官能团是炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基、叠氮基、巯基、羟基或羧基；并且当X¹所包含的官能团是巯基、2-吡啶基二硫基或羟基时，Y¹是选自氨基、氧代氨基、叠氮基和羧基的基团。更优选地，当X¹所包含的官能团是活性酯基或活性碳酸酯基时，Y¹所包含的官能团是选自马来酰亚胺基、α-卤代乙酰基、炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基和叠氮基的基团；当X¹所包含的官能团是醛基时，Y¹所包含的官能团是选自马来酰亚胺基、α-卤代乙酰基、炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基和叠氮基的基团；当X¹所包含的官能团是马来酰亚胺基或α-卤代乙酰基时，Y¹所包含的官能团是选自活性酯基、活性碳酸酯基、炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基和叠氮基的基团；当X¹所包含的官能团是炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基或叠氮基时，Y¹所包含的官能团是选自马来酰亚胺基、α-卤代乙酰基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基、氧代氨基和羟基的基团；当X¹所包含的官能团是氨基或氧代氨基时，Y¹所包含的官能团是炔基、二苯并环辛炔(DBCO)基、叠氮基、羟基或巯基；并且当X¹所包含的官能团是巯基、2-吡啶基二硫基或羟基时，Y¹所包含的官能团是选自氨基、氧代氨基和叠氮基的基团。

本发明式(1)中的A¹是分枝部分的四级碳原子与结合至X¹的单分散聚乙二醇之间的二价间隔物，式(1)中的B¹是分枝部分的四级碳原子与Y¹之间的二价间隔物，式(1)中的C¹是结合至A¹的单分散聚乙二醇与X¹之间的二价间隔物，并且它们分别由共价键构成。具体地，A¹表示-L¹-(CH₂)_m1-或-L¹-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L¹表示醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，L²表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数。B¹表示-L³-(CH₂)_m3-、-L³-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-或单键，L³表示酰胺键或单键，L⁴表示醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数。C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键，L⁵表示酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。

在本发明的优选实施方式中，式(1)中的A¹、B¹和C¹的具体结构以及具有上述A¹、B¹和C¹的异双官能性单分散聚乙二醇的典型合成例将在下文中说明，但是本发明不应被解释为被限定于此。

(A)在本发明的一个优选实施方式中，式(1)中的A¹表示-NHC(O)-(CH₂)_m1-或-NHC(O)-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L²是酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B¹表示-(CH₂)_m3-或-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-，L⁴是醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数；C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键，L⁵是酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。更优选地，A¹表示-NHC(O)-(CH₂)_m1-，并且m1表示1至5的整数；B¹表示-(CH₂)_m3-或-(CH₂)_m3-O-(CH₂)_m4-，并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数；C¹表示-NHC(O)-(CH₂)_m5-或单键，并且m5表示1至5的整数。

上述异双官能性单分散聚乙二醇的合成的典型实例包括以下步骤。此处，例示了导入马来酰亚胺基和对硝基苯基碳酸酯基作为官能团的化合物。

(在式(3)中，P¹是氨基的保护基团，并且P²是羟基的保护基团。)

将式(3)所示的化合物在无水溶剂中在强碱的存在下进行与一甲基单分散聚乙二醇的烷基或芳基磺酸酯或者一甲基单分散聚乙二醇的卤化物的亲核置换反应以获得下式(4)所示的化合物。

本文中所称的“保护基团”是阻止或阻碍分子中特定的官能团在某些反应条件下反应的部分。保护基团取决于要保护的官能团的类型、使用的条件和分子中其他官能团或保护基团的存在而变化。保护基团的特定实例能够在许多普通书籍中找到，并且例如在“Wuts,P.G.M.；Greene,T.W.Protective Groups in Organic Synthesis,4th ed.；Wiley-Interscience:New York,2007”中有描述。此外，对于被保护基团保护的官能团，通过使用适合于各种保护基团的反应条件去保护，即通过发生化学反应，能够再生原始的官能团。保护基团的典型去保护条件记载在上述文献中。

作为要被保护的官能团和保护基团的优选组合，当要被保护的官能团是氨基时，例如，例示了酰基系保护基团和氨基甲酸酯系保护基团，并且其具体实例包括三氟乙酰基、9-芴甲氧羰基和2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基。当要被保护的官能团是羟基时，例如，例示了甲硅烷基系保护基团和酰基系保护基团，并且其具体实例包括叔丁基二苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、乙酰基和三甲基乙酰基。

当要被保护的官能团是羧基时，例如，例示了烷基酯系保护基团和甲硅烷基酯系保护基团，并且其具体实例包括甲基、9-芴甲基和叔丁基二甲基甲硅烷基。当要被保护的官能团是磺酰基时，例如，例示了硫醚系保护基团、硫代碳酸酯系保护基团和二硫化物系保护基团，并且其具体实例包括S-2,4-二硝基苯基、S-9-芴甲氧羰基和S-叔丁基二硫基。此外，可以使用能够同时保护两个相同类型或不同类型的官能团的双官能性保护基团。作为要被保护的官能团和保护基团的优选组合，当要被保护的官能团是两个羟基时，例如，提及了环状缩醛系保护基团和环状甲硅烷系保护基团，并且其具体实例包括2,2-二甲基-1,3-二氧戊环基、2,2-二甲基-1,3-二氧六环基、2-苯基-1,3-二氧戊环基、2-苯基-1,3-二氧六环基和二叔丁基亚甲硅基。当要被保护的官能团是氨基和羟基时，例如，例示了恶唑啉系保护基团，并且其具体实例包括2-苯基恶唑啉基。

保护基团的典型去保护条件记载在上述文献中，并且能够选择适合于各个保护基团的反应条件。然而，在结构中所包含的官能团是在该官能团即使不被保护基团保护时也不抑制其他官能团的化学反应的官能团的情况下，不需要使用保护基团。

在脱保护上式(4)所示化合物的保护基团P¹之后，所得的化合物在缩合剂的存在下与单羧基单分散聚乙二醇的马来酰亚胺基丙酸酰胺反应以获得下式(5)所示的化合物。此处，在选择羟基不与氨基的反应试剂反应的反应条件时，保护基团P²可以与保护基团P¹同时脱保护。

在脱保护上式(5)所示化合物的保护基团P²之后，所得的化合物在碱的存在下与对硝基苯基氯代甲酸酯反应以获得下式(6)所示的化合物。

(B)在本发明的另一优选实施方式中，式(1)中的A¹表示-CH₂-或-CH₂-L²-(CH₂)_m2-，L²是酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m2表示1至5的整数；B¹表示-CH₂-或-CH₂-L⁴-(CH₂)_m4-，L⁴是醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m4表示1至5的整数；C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键，L⁵是酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。更优选地，A¹表示-CH₂-NHC(O)-(CH₂)_m2-，并且m2表示1至5的整数；B¹表示-CH₂-或-CH₂-O-(CH₂)_m4-，并且m4表示1至5的整数；C¹表示-NHC(O)-(CH₂)_m5-或单键，并且m5表示1至5的整数。

上述异双官能性单分散聚乙二醇的合成的典型实例包括以下步骤。此处，例示了导入溴代乙酰胺基和N-琥珀酰亚胺基酯基作为官能团的化合物。

(在式(7)中，P³是氨基的保护基团，并且P⁴是羟基的保护基团。)

将上述式(7)所示的化合物在无水溶剂中在强碱的存在下进行与一甲基单分散聚乙二醇的烷基或芳基磺酸酯或者一甲基单分散聚乙二醇的卤化物的亲核置换反应以获得下式(8)所示的化合物。

在脱保护上式(8)所示化合物的保护基团P⁴之后，所得的化合物在无水溶剂中在碱的存在下与4-羟基丁酸的羧基保护体反应以获得下式(9)所示的化合物。

(在式中，P⁵是羧基的保护基团。)

在脱保护上式(9)所示化合物的保护基团P³之后，所得的化合物与一溴代乙酰胺单分散聚乙二醇的四氟苯基酯反应以获得下式(10)所示的化合物。

在脱保护上式(10)所示化合物的保护基团P⁵之后，所得的化合物在缩合剂的存在下与N-羟基琥珀酰亚胺反应以获得下式(11)所示的化合物。

(C)在本发明的又一优选实施方式中，式(1)中的A¹表示-O-(CH₂)_m1-或-O-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L²是酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B¹表示-CH₂-或-CH₂-L⁴-(CH₂)_m4-，L⁴是醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m4表示1至5的整数；C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键，L⁵是酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。更优选地，A¹表示-O-(CH₂)_m1-NHC(O)-(CH₂)_m2-，m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B¹表示-CH₂-或-CH₂-O-(CH₂)_m4-，并且m4表示1至5的整数；C¹表示-NHC(O)-(CH₂)_m5-或单键，并且m5表示1至5的整数。

上述异双官能性单分散聚乙二醇的合成的典型实例包括以下步骤。此处，例示了导入2-吡啶基二硫基和N-琥珀酰亚胺基碳酸酯基作为官能团的化合物。

(在式(12)中，P⁶是氨基的保护基团，并且P⁷是羟基的保护基团。)

将上述式(12)所示的化合物在无水溶剂中在强碱的存在下进行与一甲基单分散聚乙二醇的烷基或芳基磺酸酯或者一甲基单分散聚乙二醇的卤化物的亲核置换反应以获得下式(13)所示的化合物。

在脱保护上式(13)所示化合物的保护基团P⁶之后，所得的化合物在缩合剂的存在下与单羧基单分散聚乙二醇的3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺反应以获得下式(14)所示的化合物。

在脱保护上式(14)所示化合物的保护基团P⁷之后，所得的化合物在碱的存在下与N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应以获得下式(15)所示的化合物。

(D)在本发明的再一优选实施方式中，式(1)中的A¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m1-或-C(O)NH-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L²是酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B¹表示-CH₂-或-CH₂-L⁴-(CH₂)_m4-，L⁴是醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m4表示1至5的整数；C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键，L⁵是酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。更优选地，A¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m1-，并且m1表示1至5的整数；B¹表示-CH₂-或-CH₂-O-(CH₂)_m4-，并且m4表示1至5的整数；C¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m5-或单键，并且m5表示1至5的整数。

上述异双官能性单分散聚乙二醇的合成的典型实例包括以下步骤。此处，例示了导入叠氮基和对硝基苯基碳酸酯基作为官能团的化合物。

(在式(16)中，P⁸是羧基的保护基团，并且P⁹是羟基的保护基团。)

将式(16)所示的化合物在无水溶剂中在强碱的存在下进行与一甲基单分散聚乙二醇的烷基或芳基磺酸酯或者一甲基单分散聚乙二醇的卤化物的亲核置换反应以获得下式(17)所示的化合物。

在脱保护上式(17)所示化合物的保护基团P⁸之后，所得的化合物在缩合剂的存在下与单氨基单分散聚乙二醇的叠氮化物反应以获得下式(18)所示的化合物。

在脱保护上式(18)所示化合物的保护基团P⁹之后，所得的化合物在碱的存在下与对硝基苯基氯代甲酸酯反应以获得下式(19)所示的化合物。

(E)在本发明的又再一优选实施方式中，式(1)中的A¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m1-或-C(O)NH-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L²是酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数；B¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m3-或-C(O)NH-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-，L⁴是醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数；C¹表示-L⁵-(CH₂)_m5-、-O-CH₂-或单键，L⁵是醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。更优选地，A¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m1-，并且m1表示1至5的整数；B¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m3-NHC(O)-(CH₂)_m4-，并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数；C¹表示-C(O)NH-(CH₂)_m5-或单键，并且m5表示1至5的整数。

上述异双官能性单分散聚乙二醇的合成的典型实例包括以下步骤。此处，例示了导入二苯并环辛炔(DBCO)基和马来酰亚胺基作为官能团的化合物。

(在式(20)中，P¹⁰是羧基的保护基团，并且P¹¹是氨基的保护基团。)

将上述式(20)所示的化合物在无水溶剂中在强碱的存在下进行与一甲基单分散聚乙二醇的烷基或芳基磺酸酯或者一甲基单分散聚乙二醇的卤化物的亲核置换反应以获得下式(21)所示的化合物。

在脱保护上式(21)所示化合物的保护基团P¹⁰之后，所得的化合物在缩合剂的存在下与单氨基单分散聚乙二醇的二苯并环辛炔(DBCO)基衍生物反应以获得下式(22)所示的化合物。

在脱保护上式(22)所示化合物的保护基团P¹¹之后，所得的化合物与3-马来酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺基酯反应以获得下式(23)所示的化合物。

根据本发明的另一个方面，提供了一种式(2)所示的包含异双官能性单分散聚乙二醇的抗体-药物缀合物。

本发明式(2)中的R¹是烃基或氢原子。烃基的碳原子的数量优选为7以下。烃基的实例包括烷基、芳基和芳烷基，并且烃基具体包括甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、苯基和苄基。R¹的优选实施方式是甲基或氢原子，更优选为甲基。

本发明式(2)中的n表示单分散聚乙二醇的重复单元的数量，并且是3至72的整数，优选为4至48的整数，更优选为6至36的整数，并且特别优选为8至24的整数。

本发明式(2)中的l表示单分散聚乙二醇的重复单元的数量，并且是2至72的整数，优选为3至36的整数，更优选为4至24的整数，并且特别优选为6至12的整数。并且，l优选为l≤n，更优选为l≤2n/3。

在本说明书中，式(2)中的X²和Y²中的一个是抗体，并且另一个是药物。

本说明书中的术语“抗体”用于表示其最广泛的含义，并且具体地包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现期望的生物活性(Miller,K.et al.J.Immunol.2003,170,4854-4861)。

抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，或者能够源自其他物种。抗体由免疫系统生成的蛋白质，其能够识别并结合特定的抗原(Janeway,C.；Travers,P.；Walport,M.；Shlomchik,M.Immunobiology,5th ed.；Garland Publishing:New York,2001)。目标抗原一般具有被多个抗体的CDR识别的多个结合位点(也称为表位)。特异性结合于不同表位的抗体具有不同的结构。因此，一个抗原可以具有多于一个的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，包含免疫特异性结合于感兴趣的抗原或其部分的抗原结合位点的分子)。这样的目标包括癌细胞和生成与自体免疫疾病相关联的自体免疫抗体的细胞，但不局限于此。本说明书中公开的免疫球蛋白可以是任意的型(type)(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)、免疫球蛋白的类(class)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或其亚类。免疫球蛋白可以源自任意物种。然而，在一个实施方式中，免疫球蛋白是人源的、鼠源的或兔源的。

多克隆抗体是例如源自免疫化动物的血清的抗体分子的非均质集团。可以通过使用本领域已知的多种方法产生感兴趣的抗原的多克隆抗体。例如，为了产生多克隆抗体，可以通过注射感兴趣的抗体或其衍生物使包括但不限于兔、小鼠、大鼠和豚鼠的各种宿主动物免疫化。取决于宿主的物种，可以通过使用包括但不限于弗氏(完全与不完全)佐剂、诸如氢氧化铝的矿物凝胶、诸如溶血卵磷脂的表面活性剂物质、多聚醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔戚血蓝蛋白、二硝基苯酚以及诸如BCG(Bacille Calmett-Guerin)或小隐孢子虫(Corynebacterium parvum)的潜在有用人类佐剂的各种佐剂来增加免疫应答。这样的佐剂也是本领域已知的。

单克隆抗体是特定的抗原决定簇(例如细胞抗原(癌症或自体免疫细胞抗原)、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学物质、核酸或其抗原结合片段)的抗体的均质集团。可以通过使用本领域已知的任何技术产生感兴趣的抗原的单克隆抗体(mAb)。包括但不限于Kohler,G；Milstein,C.Nature 1975,256,495-497最初记载的杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor,D.et al.Immunol.Today 1983,4,72-79)和EBV-杂交瘤技术(Cole,S.P.C.et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy；Alan R.Liss:NewYork,1985,pp.77-96)。这样的抗体可以是任意的免疫球蛋白的种类，包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD，及其任意亚类。产生本发明的单克隆抗体产生的杂交瘤可以在体外(in vitro)或体内(in vivo)培养。

单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和抗体片段。人单克隆抗体可以通过本领域已知的多种技术的任意一种制造(参见，例如Teng,N.N.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1983,80,7308-7312；Kozbor,D.etal.Immunology Today 1983,4,72-79；Olsson L.et al.Meth.Enzymol.1982,92,3-16；以及美国专利号5,939,598和5,770,429)。例如嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体的重组抗体能够通过本领域已知的标准重组DNA技术制造(参见，例如美国专利号4,816,567和4,816,397)。

抗体的免疫原性也能够通过抗体的表面重建(resurfacing)处理来降低(参见，例如美国专利号5,225,539以及欧洲专利号0239400、0519596和0592106)。

在本发明的一个实施方式中，抗体可以是双特异性抗体。制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统制造方法利用了两个链具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的同时表达(参见，Milstein,C.et al.Nature 1983,305,537-539)。根据不同的方法，双特异性抗体也能够通过融合具有所需的结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定域序列来产生。

其他有用的抗体包括抗体的片段，但不限于F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fvs、单链抗体(SCA)(例如，如美国专利号4,946,778、Bird,R.E.et al.Science 1988,242,423-442、Huston,J.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sot USA 1988,85,5879-5883和Ward,E.S.et al.Nature 1989,334,544-554中所记载)、scFv、sc-Fv-Fc、FvdsFv、微抗体(minibody)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)以及包含CDR并且具有与抗体相同的特异性的任意其他分子，例如域抗体(domain antibody)。

在本发明的优选实施方式中，可以使用用于治疗或预防癌症的已知抗体。包括其表达与癌症、细胞增殖障碍或肿瘤的细胞中的表达相关联的任意靶蛋白的全部靶蛋白能够作为抗体的靶标。

在本发明的优选实施方式中，抗体对于癌症的治疗是有用的。于癌症的治疗有用的抗体的实例包括但不限于：美罗华(Rituxan)(注册商标)(Genentech Inc.)，其是用于治疗患有非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)的患者的嵌合抗-CD20单克隆抗体；OvaRex(AltaRex Corp.)，其是用于治疗卵巢癌的鼠抗体；Panorex(Glaxo WellcomeInc.)，其是用于治疗结肠直肠癌的鼠IgG2a抗体；Cetuximab ERBITUX(ImClone SystemsInc.)，其是用于治疗例如头或颈癌的表皮生长因子阳性癌的抗-EGFR IgG嵌合抗体；Vitaxin(MedImmune Inc.)，其是用于治疗肉瘤的人源化抗体；Campath I/H(LeukositeInc.)，其是用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的人源化IgG1抗体；Smart M 195(ProteinDesign Labs Inc.)，其是用于治疗急性髓性白血病(AML)的人源化抗-CD33 IgG抗体；Lymphocide(Immunomedics Inc.)，其是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的人源化抗-CD22 IgG抗体；Smart ID 10(Protein Design Labs Inc.)，其是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的人源化抗-HLA-DR抗体；Oncolym(Techniclone Inc.)，其是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的放射性标记的鼠抗-HLA-Dr10抗体；AlloMune(BioTransplant Inc.)，其是用于治疗霍奇金病(Hodgkin's disease)或非霍奇金淋巴瘤的人源化抗-CD2 mAb；Avastin(GenentechInc.)，其是用于治疗肺癌或结肠直肠癌的抗-VEGF人源化抗体；Epratuzamab(Immunomedics Inc.和Amgen Inc.)，其是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的抗-CD22抗体；以及CEAcide(Immunomedics Inc.)，其是用于治疗结肠直肠癌的人源化抗-CEA抗体。

在本发明的优选实施方式中，抗体是下列抗原的抗体：CA125、CA15-3、CA19-9、L6、Lewis Y、Lewis X、甲胎蛋白、CA242、胎盘碱性磷酸酶、***特异膜抗原、Ephb2、TMEFF2、***酸性磷酸酶、表皮生长因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、转铁蛋白受体、p97、MUC1-KLH、CEA、gp 100、MART 1、***特异性抗原、IL-2受体、CD20、CD52、CD33、CD22、人绒毛膜***、CD38、CD40、粘蛋白、P21、MPG以及Neu致癌基因产物。一些特异性有用的抗体包括但不限于：CD40抗原的mAb，例如BR96 mAb(Trail,P.A.et al.Science 1993,261,212-215)、BR64(Trail,P.A.et al.Cancer Research 1997,57,100-105)或S2C6 mAb(Francisco,J.A.et al.Cancer Res.2000,60,3225-3231)；或其他抗-CD40抗体，诸如美国专利申请公开号2003/0211100和2002/0142358中公开的那些；CD70抗原的mAb，例如1F6mAb和2F2 mAb；以及CD30抗原的mAb，例如AC10(Bowen,M.A.et al.J.Immunol.1993,151,5896-5906、Wahl,A.F.et al.Cancer Res.2002,62(13),3736-3742)或MDX-0060(美国专利申请公开号2004/0006215)。

能够在本发明中使用的药物包括化疗药剂。化疗药剂是在癌症治疗中有用的化合物。化疗药剂的实例包括下列：烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN(商标))；烷基磺酸盐类，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；亚乙基亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(特别地，布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别地，隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogenmustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲乙胺盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，特别地，加利车霉素gemma 1和加利车霉素theta I，参见例如Angew Chem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)；色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(nitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、块菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；代谢拮抗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)和5-FU；雄激素类(androgen)，例如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类(anti-adrenal)，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；亚丝醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登醇类(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素类(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK(注册商标)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯代三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecene)(特别地，T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇行菌素(anguidine))；脲烷(urethane)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside，“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL(注册商标)，Bristol-Myers Squibb Oncology)和多西他赛(doxetaxel)(TAXOTERE(注册商标)，Rhone-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及任意上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。能够作用以调节或抑制对于肿瘤的激素作用的抗激素剂，例如抗***药物，包括但不限于，他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、4(5)-咪唑抑制芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素药物，例如，定义中也包括下列：氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；siRNA，以及任意上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。能够在本发明中使用的其他化疗药剂在美国专利申请公开号2008/0171040和2008/0305044中公开，其全部内容通过引用以其整体并入本文。

在本发明的优选实施方式中，化疗药剂是低分子量药物。低分子量药物的分子量优选为100至1500，更优选为120至1200，还更优选为200至1000。典型地，低分子量药物指代分子量小于约1000的有机、无机或有机金属化合物，并且该化合物是广泛使用的。本发明的低分子量药物还包括分子量小于约1000的寡肽和其他生物分子。低分子量药物是本领域明确已知的，例如，尤其参见WO 05/058367、EP-A-85901495、EP-A-8590319和美国专利号4,956,303，其全部内容通过引用以其整体并入本文。

本发明的优选的低分子量药物是能够连接至抗体的低分子量药物。本发明包括已知药物，以及具有被了解的可能性的药物。特别优选的低分子量药物包括细胞毒性药剂。

优选的细胞毒性药剂包括美登醇类、CC-1065类似物、吗啉类、多柔比星类、紫杉烷类(taxane)、隐藻素类、埃博霉素类、加利车霉素类、瑞奥西汀类(auristatin)和吡咯并苯二氮平(pyrrolobenzodiazepine)二聚体类。

本发明的式(2)所示的包含异双官能性单分散聚乙二醇的抗体-药物缀合物能够通过使用式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇结合抗体和药物来制备。式(2)所示的抗体-药物缀合物的制备方法可以是其中式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇先结合至药物然后再结合至抗体的方法，或者是其中式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇先结合至抗体然后再结合至药物的方法。此外，纯化可以在抗体和药物的任意一个结合之后进行、或者在抗体和药物两者都结合之后进行。

其中式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇结合至药物的化合物能够通过例如柱色谱、萃取、重结晶、吸附处理、再沉淀或超临界萃取的纯化方法纯化。此外，其中式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇结合至抗体的化合物以及其中式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇结合至抗体与药物两者的抗体-药物缀合物能够通过例如柱色谱、萃取或吸附处理的纯化方法纯化。

通过本发明的式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇结合于抗体的药物的数量由每抗体的平均药物数来定义。药物数量优选为1至20，更优选为2至16，还更优选为3至12，特别优选为4至8。

ADC中每抗体的药物数量能够通过本领域技术人员已知的方法确定，例如紫外/可见分光光谱法、质谱法、ELISA法、电泳法、HPLC(高效液相色谱法)或这些方法的组合。

本发明式(2)中的A¹是分枝部分的四级碳原子与结合至X²的单分散聚乙二醇之间的二价间隔物，式(2)中的B²是分枝部分的四级碳原子与Y²之间的二价间隔物，并且式(2)中的C²是结合至A¹的单分散聚乙二醇与X²之间的二价间隔物，并且它们分别由共价键构成。

具体地，A¹表示-L¹-(CH₂)_m1-或-L¹-(CH₂)_m1-L²-(CH₂)_m2-，L¹表示醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，L²表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1和m2各自独立地表示1至5的整数。

此外，B²表示-L³-(CH₂)_m3-L⁶-、-L³-(CH₂)_m3-L⁴-(CH₂)_m4-L⁶-或-L⁶-，L³表示酰胺键或单键，L⁴表示醚键、酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m3和m4各自独立地表示1至5的整数。此处，L⁶表示通过式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇中的Y¹所包含的官能团与抗体或药物中存在的官能团的反应形成的原子团，并且优选为酰胺键、氨基甲酸酯键、硫醚键、二硫键、碳酸酯键、酯键、醚键、1H-1,2,3-***-1,4-二基结构、仲氨基、酰肼基、氧代酰胺基或包含上述任意的烃基。

此外，C²表示-L⁵-(CH₂)_m5-L⁷-、-O-CH₂-L⁷-或-L⁷-，L⁵表示酰胺键、氨基甲酸酯键、仲氨基或单键，并且m5表示1至5的整数。此处，L⁷表示通过式(1)所示的异双官能性单分散聚乙二醇中的X¹所包含的官能团与抗体或药物中存在的官能团的反应形成的原子团，并且优选为酰胺键、氨基甲酸酯键、硫醚键、二硫键、碳酸酯键、酯键、醚键、1H-1,2,3-***-1,4-二基结构、仲氨基、酰肼基、氧代酰胺基或包含上述任意的烃基。

实施例

将通过参考实施例，进一步具体地描述本发明，但是本发明不被解释为局限于这些实施例。

在¹H-NMR分析中，使用了由JEOL DATUM Ltd.制造的“JNM-ECP400”或“JNM-ECA600”。在测量中，使用了5mm

的试管，并且在氘代溶剂为CDCl₃、CD₂Cl₂或CD₃OD的情况下使用四甲基硅烷(TMS)作为内标物。

实施例1

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的500mL四颈烧瓶中注入三羟甲基氨基甲烷(30.3g，250mmol)、碳酸钠(5.30g，50mmol)、无水甲醇(237g)和苯甲腈(5.15g，50mmol)，在65℃进行反应4小时。在过滤反应混合物并在减压下蒸馏去除溶剂之后，通过加入异丙醇和二氯甲烷溶解残留物，并且用10wt％氯化钠水溶液清洗溶液。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下蒸馏去除溶剂。用THF(四氢呋喃)溶解残留物，并且通过加入己烷进行结晶，随后过滤获得式(24)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.06(2H,brs,-OH),

3.65-3.81(4H,dd,>C(CH₂ OH)₂),

4.38(2H,s,-CNO-CH₂ -),

7.32-7.83(5H,m,芳香H)

实施例2

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的100mL三颈烧瓶中注入十二乙二醇单甲醚(10.4g，18.5mmol)、甲苯(52.0g)、三乙胺(2.44g，24.1mmol)和甲磺酰氯(2.34g，20.4mmol)，在40℃进行反应3小时。通过加入二氯甲烷稀释反应溶液，然后用水清洗，并且将有机层用无水硫酸镁干燥。过滤后，减压蒸馏去除溶剂，以获得式(25)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.08(3H,s,-O-SO₂-CH₃ ),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.45-3.85(46H,m,CH₃-O-(CH₂ CH₂ O)₁₁-CH₂ CH₂-O-SO₂-CH₃),

4.38(2H,m,-CH₂ -O-SO₂-CH₃)

实施例3

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(24)的化合物(0.21g，1.01mmol)、无水THF(7.70g)、式(25)的化合物(2.46g，3.84mmol)、1M叔丁醇钾THF溶液(3.72g，4.04mmol)，在50℃进行反应4小时。在加入二氯甲烷和25wt％氯化钠水溶液后，用水进行清洗，并且将有机层用无水硫酸钠干燥。过滤后，减压蒸馏去除溶剂，以获得式(26)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.38(6H,s,-O-CH₃ ),

3.40-3.75(100H,m,>C(CH₂ O)₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-),

4.36(2H,s,-CNO-CH₂ -),

7.37-7.94(5H,m,芳香H)

实施例4

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的100mL三颈烧瓶中注入式(26)的化合物(1.13g，0.877mmol)和蒸馏水(31.1g)，使化合物溶解。在加入85％磷酸(0.43mL)将pH调整至1.5之后，在50℃进行反应3小时。然后，加入400g/L氢氧化钠水溶液(5.58mL)并且冷却，在50℃进行反应6小时。随后，加入6N盐酸将pH调整至2.0，并且向其中加入甲苯和氯仿进行清洗。加入氯化钠使之成为25％氯化钠水溶液，然后使用400g/L氢氧化钠水溶液将pH调整至12.5。通过使用甲苯进行萃取，并且将萃取物用无水硫酸钠干燥。过滤后，减压蒸馏去除溶剂，以获得式(27)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.08(1H,brs,-OH),

3.38(6H,s,-O-CH₃ ),

3.40-3.80(102H,m,>C(CH₂ O)₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-,>CNH₂-CH₂ -OH)

实施例5

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(27)的化合物(1.50g，1.24mmol)、31-(2,5-二氢-2,-5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷酸(0.811g，1.37mmol)、DMT-MM(0.377g，1.37mmol)、乙腈(15.0g)和三乙胺(0.151g，1.49mmol)，在25℃进行反应9小时。向其中加入pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液(18.0g)，然后通过使用甲苯进行清洗。通过使用甲苯和氯仿进行萃取，然后使用pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液和pH 7.0的磷酸盐缓冲液清洗有机层。此外，用20％的氯化钠水溶液清洗有机层，然后用无水硫酸镁干燥。过滤后，减压蒸馏去除溶剂，以获得式(28)的化合物。顺便提及，DMT-MM指代4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。

¹H-NMR(CD₂Cl₂，TMS内标)；δ(ppm)：

2.46(4H,m,-O-CH₂CH₂ -CONH-,-CH ₂ CH₂-马来酰亚胺基),

3.38(6H,s,-O-CH₃ ),

3.45-3.79(138H,m,>C(CH₂ O)₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-,-CONH-(CH₂ CH₂ O)₈-CH₂ CH₂-CONH-,>CNH-CH₂ -OH,-CH₂ -马来酰亚胺基),

4.65(1H,t,-OH),

6.42(1H,s,-O-CH₂CH₂-CONH-),

6.69(2H,s,-马来酰亚胺基),

6.72(1H,s,-NH-CO-CH₂CH₂-马来酰亚胺基)

实施例6

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(28)的化合物(0.700g，0.393mmol)、N-苯基吗啉(0.160g，0.983mmol)、对硝基苯基氯代甲酸酯(0.158g，0.786mmol)和二氯甲烷(5.22g)，在25℃进行反应3小时。向其中加入蒸馏水(0.042g，2.36mmol)和N-苯基吗啉(0.160g，0.983mmol)，在25℃搅拌2小时然后使用己烷稀释。通过使用0.2M盐酸清洗混合物，然后通过使用pH 10的硼酸盐缓冲液以及10％氯化钠水溶液清洗。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下蒸馏去除溶剂。在乙腈中溶解残留物，通过加入己烷和叔丁醇清洗所得溶液，在减压下蒸馏去除溶剂，以获得式(29)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

2.44(2H,t,-O-CH₂CH₂ -CONH-),

2.51(2H,t,-CONH-CH₂ CH₂-马来酰亚胺基),

3.38(6H,s,-O-CH₃ ),

3.42(2H,m,-CH₂ -CONH-CH₂CH₂-马来酰亚胺基),

3.45-3.90(134H,m,>C(CH₂ O)₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-,-CONH-CH₂CH₂ O-(CH₂ CH₂ O)₇-CH₂ CH₂-CONH-,-CH₂ -马来酰亚胺基),

4.70(2H,s,>CNH-CH₂ -OCOO-),

6.42(1H,s,-NH-CO-CH₂CH₂-马来酰亚胺基),

6.53(1H,s,-O-CH₂CH₂-CONH-)

6.70(2H,s,-马来酰亚胺基),

7.39-8.29(4H,m,芳香H)

实施例7

向装有搅拌棒的4-mL螺纹盖试管中注入多柔比星盐酸盐(6.8mg，11.7μmol)、N,N-二异丙基胺(4.55mg、35.0μmol)、N,N-二甲基甲酰胺和式(29)的化合物(20.6mg，10.6μmol)，进行反应4小时。用二氯甲烷稀释之后，使用5wt％磷酸二氢钠十二水合物水溶液以及离子交换水清洗混合物。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下蒸馏去除溶剂，以获得式(30)的药物-连接物化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.30(3H,m),1.85-2.18(2H,s),2.38-2.41(2H,m),2.52(2H,t),3.04(1H,s),3.38(6H,s),3.40-3.44(2H,m),3.45-3.90(139H,m),4.09(3H,s),4.32(2H,dd),4.69(1H,s),4.78(2H,d),5.33(1H,s),5.53(1H,s),5.71(1H,d),6.54(1H,s),6.59(1H,t),6.71(2H,s),7.41(1H,d),7.80(1H,t),8.06(1H,d)

实施例8

对于实施例7中获得的式(30)的药物-连接物化合物，使用疏水作用色谱(HIC)柱在下列测量条件下进行HPLC测量。测量波长为495nm的结果的图谱在图1中示出。

HPLC仪器：Alliance(Waters)

色谱柱：TSKgel Butyl-NPR(4.6×35mm,2.5μm；Tosoh Corp.)

流速：0.8mL/分钟

分析时间：45分钟

柱温：25℃

进样量：100μL

检测器：紫外可见分光光度计(测量波长：280nm和495nm)

流动相A：包含1.5M硫酸铵的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)

流动相B：包含80％的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)和20％的异丙醇的混合溶液

梯度程序：0％-0％(0分钟-2.5分钟)、0％-100％(2.5分钟-35分钟)、100％-0％(35.1分钟-45分钟)

实施例9

将鼠产生的单克隆抗白细胞介素-1β抗体(0.500mg，Sigma-Aldrich)溶解于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，0.500mL)。将溶液(0.048mL)装入0.5mL聚丙烯试管中，向其中加入50.0mM乙二胺四乙酸(EDTA，0.006mL)和0.800mM三(2-羧甲基)膦盐酸盐(TCEP)水溶液(0.006mL；抗体的15倍当量)，将混合物在37℃震荡1小时。向溶液中加入包含N,N-二甲基甲酰胺和2.50mM式(30)的化合物的溶液(0.007mL；抗体的53倍当量)，进一步将混合物在20℃震荡1小时。向其中加入2.50mM N-乙酰基半胱氨酸溶液(0.007mL；抗体的53倍当量)，进一步将所得混合物在20℃震荡1小时。将所得溶液装入使用PBS(10mL)平衡的NAP-5色谱柱(GEHealthcare Life Science)，用PBS洗脱以分离抗体组分。

实施例10

能够通过测量抗体-药物缀合物的水溶液在280nm和495nm处的UV吸光度，然后进行下列计算来算出抗体-药物缀合物中每抗体的平均结合数。

由于在特定波长的总吸光度等于系统中存在的所有吸光化学物种的吸光度的总和(吸光度的加和性)，假设在抗体与药物的缀合反应前后，抗体和药物的摩尔消光系数没有变化，在抗体-药物缀合物中的抗体浓度和药物浓度由下列关系式表示。

A₂₈₀＝A_D,280+A_A,280＝ε_D,280C_D+ε_A,280C_A 式(i)

A₄₉₅＝A_D,495+A_A,495＝ε_D,495C_D+ε_A,495C_A 式(ii)

此处，A₂₈₀表示抗体-药物缀合物的水溶液在280nm的吸光度，A₄₉₅表示抗体-药物缀合物的水溶液在495nm的吸光度，A_A,280表示抗体在280nm的吸光度，A_A,495表示抗体在495nm的吸光度，A_D,280表示药物-连接物化合物在280nm的吸光度，A_D,495表示药物-连接物化合物在495nm的吸光度，ε_A,280表示抗体在280nm的摩尔消光系数，ε_A,495表示抗体在495nm的摩尔消光系数，ε_D,280表示药物-连接物化合物在280nm的摩尔消光系数，ε_D,495表示药物-连接物化合物在495nm的摩尔消光系数，C_A表示抗体-药物缀合物中的抗体浓度，C_D表示抗体-药物缀合物中的药物浓度。

此处，对于ε_A,280、ε_A,495、ε_D,280和ε_D,495，使用预先准备的值(估计值或从化合物的UV测量中获得的测量值)。ε_A,495通常为0。ε_D,280和ε_D,495能够通过测量其中溶解了特定摩尔浓度的使用的药物-连接物化合物的溶液的吸光度并且根据朗伯-比尔定律计算各个数值而获得(吸光度＝摩尔浓度×摩尔消光系数×样品池光路长度)。C_A和C_D能够通过测量抗体-药物缀合物水溶液的A₂₈₀和A₄₉₅，并且将这些数值带入式(i)和式(ii)，通过解出联立方程而确定。此外，每抗体的平均药物结合数能够通过用C_D除以C_A来确定。

当使用摩尔消光系数ε_A,280＝206999(估计值)、ε_A,495＝0、ε_D,280＝12786(测量值)以及ε_D,495＝12558(测量值)解出上述联立方程时，每抗体的平均药物结合数为7.6。

比较例1

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的100mL三颈烧瓶中注入2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(13.1g，125mmol)、碳酸钠(2.65g，25mmol)、无水甲醇(19.8g)和苯甲腈(2.58g，25mmol)，并且以与实施例1相同的方式进行反应和纯化，以获得式(31)的化合物。

¹H-NMR(CD₃OD，TMS内标)；δ(ppm)：

1.33(3H,s,>CCH₃ -CH₂-OH),

3.49-3.60(2H,dd,>CCH₃-CH₂ -OH),

4.10-4.53(2H,dd,-CNO-CH₂ -),

7.43-7.93(5H,m,芳香H)

比较例2

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(31)的化合物(0.130g，0.680mmol)、无水THF(1.87g)、式(25)的化合物(0.651g，1.02mmol)、1M叔丁醇钾THF溶液(0.928g，1.02mmol)，并且以与实施例3相同的方式进行反应和纯化，以获得式(32)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.37(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-CH₂-),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.40-3.80(50H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-),

4.01-4.47(2H,dd,-CNO-CH₂ -),

7.38-7.95(5H,m,芳香H)

比较例3

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(32)的化合物(0.160g，0.218mmol)和蒸馏水(4.40g)，使化合物溶解。在加入85％磷酸(0.11mL)将pH调整至1.5之后，在50℃进行反应6小时。在加入400g/L氢氧化钠水溶液(1.40mL)并且冷却之后，在50℃进行反应5小时。随后，加入6N盐酸将pH调整至2.0，并且向其中加入甲苯和氯仿进行清洗。然后，以与实施例4相同的方式进行纯化，以获得式(33)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.03(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-),

2.91(1H,brs,-OH),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.00-3.85(52H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-,>CCH₃-CH₂ -OH)

比较例4

向装有搅拌棒的4-mL螺纹盖试管中注入式(33)的化合物(0.0920g，0.142mmol)、6-马来酰亚胺基己酸(0.0345g，0.163mmol)、DMT-MM(0.0564g，0.163mmol)、乙腈(0.980g)和三乙胺(0.0172g，0.170mmol)，在25℃进行反应5小时。向其中加入pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液(1.10g)，然后通过使用甲苯进行清洗。然后，以与实施例5相同的方式进行纯化，以获得式(34)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.27(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-),

1.32(2H,m,-CH₂ CH₂CH₂-CONH-),

1.63(4H,m,-CH₂ CH₂CH₂ CH₂-CONH-),

2.18(2H,t,-CH₂ -CONH-),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.40-3.80(54H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-,>CCH₃-CH₂ -OH,-CH₂ -马来酰亚胺基)

4.62(1H,brs,-OH),

6.20(1H,s,-CH₂-CONH-),

6.69(2H,s,-马来酰亚胺基)

比较例5

向装有搅拌棒的4-mL螺纹盖试管中加入式(34)的化合物(0.050g，0.0595mmol)、N-甲基吗啉(0.0601g，0.595mmol)、(4-二硝基苯基)碳酸酯(0.145g，0.476mmol)和无水乙腈(0.467g)，在氮气气氛下在25℃进行反应4小时。加入蒸馏水(0.030g，1.67mmol)和N-甲基吗啉(0.0361g，0.357mmol)，在25℃搅拌混合物6小时然后使用二氯甲烷稀释。通过使用pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液清洗稀释液，然后进一步通过使用pH 10.0的硼酸盐缓冲液和25％盐水清洗。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，然后在减压下蒸馏去除溶剂，以获得式(35)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.32(2H,m,-CH₂ CH₂CH₂-CONH-),

1.45(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-),

1.60(4H,m,-CH₂ CH₂CH₂ CH₂-CONH-),

2.15(2H,t,-CH₂ -CONH-),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.41-3.80(52H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₁₂-,-CH₂ -马来酰亚胺基),

4.51-4.59(2H,dd,>CCH₃-CH ₂-OCOO-),

5.92(1H,s,-CH₂-CONH-),

6.68(2H,s,-马来酰亚胺基),

7.39-8.29(4H,m,芳香H)

比较例6

向装有搅拌棒的4-mL螺纹盖试管中注入多柔比星盐酸盐(6.34mg，10.9μmol)、N,N-二异丙基胺(2.95mg、22.9μmol)、N,N-二甲基甲酰胺和式(35)的化合物(10.0mg，9.94μmol)，进行反应4小时。然后，以与实施例7相同的方式进行纯化，以获得式(36)的药物-连接物化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.25-1.34(8H,m),1.55-1.65(4H,m),1.75-1.88(2H,m),2.06-2.10(2H,m),2.16-2.38(2H,m),2.88(1H,dd),3.00(1H,s),3.18(2H,dd)3.38(3H,s),3.41-3.90(60H,m),4.03-4.06(1H,m),4.09(3H,s),4.12-4.14(1H,m),4.61(1H,s),4.77(2H,d),5.32(1H,s),5.43-5.48(1H,m),5.53(1H,s),6.06(1H,d),6.68(2H,s),7.41(1H,d),7.80(1H,t),8.06(1H,d)

比较例7

对于比较例6中获得的式(36)的药物-连接物化合物，使用疏水作用色谱(HIC)柱在与实施例8相同的测量条件下进行HPLC测量。测量波长为495nm的结果的图谱在图2中示出。

比较例8

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入二十四乙二醇单甲醚(2.05g，1.88mmol)、甲苯(10.3g)、三乙胺(0.552g，5.45mmol)和甲磺酰氯(0.478g，4.17mmol)，在25℃进行反应8小时。通过加入二氯甲烷稀释反应溶液，然后用水清洗，并且将有机层用无水硫酸镁干燥。过滤后，减压蒸馏去除溶剂，以获得式(37)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

3.09(3H,s,-O-SO₂-CH₃ ),

3.38(3H,s,-OCH₃ ),

3.45-3.85(94H,m,CH₃-O-(CH ₂CH₂ O)₂₃-CH₂ CH₂-O-SO₂-CH₃),

4.38(2H,m,-CH₂ -O-SO₂-CH₃)

比较例9

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(31)的化合物(0.174g，0.910mmol)、无水THF(2.86g)、式(37)的化合物(1.38g，1.18mmol)、1M叔丁醇钾THF溶液(1.82g，2.00mmol)，并且以与实施例3相同的方式进行反应纯化，以获得式(38)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.37(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-CH₂-),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.40-3.80(98H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₂₄-),

4.01-4.47(2H,dd,-CNO-CH₂ -),

7.38-7.95(5H,m,芳香H)

比较例10

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(38)的化合物(0.909g，0.720mmol)和蒸馏水(25.0g)，使化合物溶解。在加入85％磷酸(0.250mL)将pH调整至1.5之后，在50℃进行反应6小时。在加入400g/L氢氧化钠水溶液(7.63mL)并且冷却之后，在50℃进行反应10小时。随后，加入6N盐酸将pH调整至2.0，并且向其中加入甲苯和氯仿进行清洗。然后，以与实施例4相同的方式进行纯化，以获得式(39)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.03(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-),

3.00(1H,brs,-OH),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.30-3.85(100H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₂₄-,>CCH₃-CH₂ -OH)

比较例11

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(39)的化合物(0.729g，0.620mmol)、6-马来酰亚胺基己酸(0.164g，0.775mmol)、DMT-MM(0.214g，0.775mmol)、乙腈(7.29g)和三乙胺(0.082g，0.806mmol)，在25℃进行反应3小时。向其中加入pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液(8.75g)，然后通过使用甲苯进行清洗。然后，以与实施例5相同的方式进行纯化，以获得式(40)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.23(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-),

1.32(2H,m,-CH₂ CH₂CH₂-CONH-),

1.63(4H,m,-CH₂ CH₂CH₂ CH₂-CONH-),

2.18(2H,t,-CH₂ -CONH-),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.40-3.80(102H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₂₄-,>CCH₃-CH₂ -OH,-CH₂ -马来 酰亚胺基),

4.71(1H,brs,-OH),

6.26(1H,s,-CH₂-CONH-),

6.69(2H,s,-马来酰亚胺基)

比较例12

向配备有温度计、氮气进气管、搅拌棒、迪安-斯塔克管和冷凝管的50mL三颈烧瓶中注入式(40)的化合物(0.600g，0.438mmol)、N-苯基吗啉(0.179g，1.10mmol)、对硝基苯基氯代甲酸酯(0.177g，0.876mmol)和二氯甲烷(5.81g)，在25℃进行反应3小时。向其中加入蒸馏水(0.047g，2.63mmol)和N-苯基吗啉(0.179g，1.10mmol)，在25℃搅拌混合物6小时然后使用己烷稀释。然后，以与实施例6相同的方式进行纯化，以获得式(41)的化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.28(2H,m,-CH₂ CH₂CH₂-CONH-),

1.41(3H,s,>CCH₃ -CH₂-O-),

1.63(4H,m,-CH₂ CH₂CH₂ CH₂-CONH-),

2.15(2H,t,-CH₂ -CONH-),

3.38(3H,s,-O-CH₃ ),

3.41-3.80(100H,m,>CCH₃-CH₂ -O-CH₂-,-O-(CH₂ CH₂ O)₂₄-,-CH₂ -马来酰亚胺基),

4.51-4.60(2H,dd,>CCH₃-CH₂ -OCOO-),

6.01(1H,s,-CH₂-CONH-),

6.69(2H,s,-马来酰亚胺基),

7.38-8.36(4H,m,芳香H)

比较例13

向装有搅拌棒的4-mL螺纹盖试管中注入多柔比星盐酸盐(5.40mg，9.31μmol)、N,N-二异丙基胺(2.51mg、19.4μmol)、N,N-二甲基甲酰胺和式(35)的化合物(13.0mg，8.47μmol)，进行反应4小时。然后，以与实施例7相同的方式进行纯化，以获得式(42)的药物-连接物化合物。

¹H-NMR(CDCl₃，TMS内标)；δ(ppm)：

1.25-1.34(8H,m),1.55-1.65(4H,m),1.75-1.88(2H,m),2.06-2.10(2H,m),2.16-2.38(2H,m),2.88(1H,dd),3.00(1H,s),3.18(2H,dd),3.38(3H,s),3.41-3.90(103H,m),4.03-4.06(1H,m),4.09(3H,s),4.12-4.14(1H,m),4.61(1H,s),4.77(2H,d),5.32(1H,s),5.43-5.48(1H,m),5.53(1H,s),6.06(1H,d),6.68(2H,s),7.41(1H,d),7.80(1H,t),8.06(1H,d)

比较例14

对于比较例13中获得的式(42)的药物-连接物化合物，使用疏水作用色谱(HIC)柱在与实施例8相同的测量条件下进行HPLC测量。测量波长为495nm的结果的图谱在图3中示出。

作为比较例，式(36)的药物-连接物化合物在图2的图谱的保持时间14.3分钟处被检出，并且式(42)的药物-连接物化合物在图3的图谱的保持时间14.3分钟处被检出，保持时间处于相同的水平而与单分散聚乙二醇的链长无关。另一方面，根据本发明的式(30)的药物-连接物化合物在图1的图谱的保持时间11.7分钟处被检出。因此，由于式(30)的药物-连接物化合物具有短的保持时间，所以其疏水性低，本发明的异双官能性单分散聚乙二醇能够有效地掩蔽药物的疏水性。

工业实用性

由于本发明的异双官能性单分散聚乙二醇不具有手性中心，在化学转化过程中从根本上不发生不期望的手性中心的部分立体翻转或外消旋化的问题，并且由于两个单分散聚乙二醇侧链通过稳定的醚键结合于分枝部分的四级碳原子，所以在化学转化过程中难以分解为单链单分散聚乙二醇。因此，通过使用异双官能性单分散聚乙二醇结合抗体与药物，能够获得具有高均质性的抗体-药物缀合物。

尽管已详细地并参考具体实施方式对本发明进行了描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以在不背离本发明的精神和范围时，在其中做出各种改变和修改。

本发明基于2018年3月13日提交的日本专利申请(日本专利申请号2018-44992)，其内容通过参考并入本文。