阅读说明：本技术 锌修饰种植体及其制备方法 (Zinc-modified implant and preparation method thereof ) 是由 光梦凯 金洁琪 于 2020-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种锌修饰种植体及其制备方法。所述锌修饰种植体包括种植体基体和形成于所述种植体基体表面的氧化锌复合阵列结构,所述氧化锌复合阵列结构包括氧化锌阵列,和依次涂覆在所述氧化锌阵列表面的多巴胺层和接枝在所述多巴胺层上的质酸层。该锌修饰种植体在体内微环境下会释放锌离子,在不改变种植体原有表面形态的同时,可以控制阵列的形貌和长短,从而控制锌离子的缓慢长期释放行为,进而调控其生物学性能,提高其生物相容性,并减少种植体周围炎症的发生。(The invention provides a zinc modified implant and a preparation method thereof. The zinc modified implant comprises an implant substrate and a zinc oxide composite array structure formed on the surface of the implant substrate, wherein the zinc oxide composite array structure comprises a zinc oxide array, and a dopamine layer and an acid layer, wherein the dopamine layer is sequentially coated on the surface of the zinc oxide array, and the acid layer is grafted on the dopamine layer. The zinc modified implant can release zinc ions in a microenvironment in vivo, and the shape and length of an array can be controlled without changing the original surface form of the implant, so that the slow long-term release behavior of the zinc ions is controlled, the biological performance of the zinc modified implant is regulated, the biocompatibility of the zinc modified implant is improved, and the inflammation around the implant is reduced.)

锌修饰种植体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种锌修饰种植体及其制备方法。

背景技术

近年来，钛种植体、生物陶瓷等生物材料复合锌涂层的研究越来越多。锌涂层钛片可以增强原代大鼠成骨细胞和成骨细胞株MC3T3-E1、RAW264.7的黏附、增殖、分化和成骨

相关基因的表达；体内实验中，锌涂层的钛种植体可以加速骨结合，提高骨-种植体结合率(Bone-Implant Contact，BIC)和新骨形成(New Bone Formation，NBF)。锌还可增加种植体的扭矩和固位强度。此外，在诱导性骨质疏松的大鼠中，含有锌的HA涂层比常规HA涂层的种植体周围NBF和BIC更高。Yusa等报道锌修饰的钛片促进牙髓干细胞成骨向分化。Yu等报道了锌-镁复合涂层的钛片可提升血管内皮细胞活性，促进VEGF及KDR(VEGF受体)基因表达；此外，还可骨髓基质细胞成骨向分化并具有一定抗菌作用。综上，目前绝大多数锌涂层种植体的研究均注重与其对骨形成的影响，而对血管形成的作用则涉及较少，对作用机制更是鲜有报道。

锌被称作“21世纪的钙”，其作为信号传导介质直接调控骨代谢，在维持骨稳态和骨形成方面具有重要作用。锌可以促进成骨细胞增殖及分化，提升碱性磷酸酶活性及增加成骨相关基因和蛋白表达，增加骨形成，促进成骨细胞分泌骨保护素(OPG)阻断破骨细胞分化等。锌可以促进骨髓基质细胞增殖，黏附及成骨向分化。此外，锌对成血管相关细胞的调控作用近两年关注度逐渐增高。Zhu等2017年报道锌可以促进血管内皮细胞增殖，黏附，PDGFRA和VEGFA基因表达，及血管形成等。Shearier等研究发现锌对血管内皮细胞的半致死剂量(LD50)为265μM，远高于生理状态下的血清锌浓度(10-30μM)。Ma等报道了锌对血管内皮细胞的作用具有双向性：低浓度(60μM)时促进其增殖，黏附，迁移及分化；高浓度(140μM)时则抑制。总的来说，生理浓度下锌可以促进成血管相关细胞生物学活性，但浓度过量时则会变为抑制。由于高浓度下锌离子具有一定毒性，锌修饰的种植体模型应当具有有效、稳定且长期低浓度缓释锌离子的性质。

目前大部分种植体的材质主要是纯钛。研究发现，钛金属的生物相容性较好、机械强度高、化学性质稳定，能与正常骨组织形成良好的骨结合。但纯钛作为一种惰性金属，缺少刺激成骨细胞和骨细胞增殖的能力，主要依靠与牙槽骨的机械性锁结提供固位力。为增强种植体与骨的结合、预防种植体周围骨组织吸收、保证长期稳定性，学者们尝试了很多种植体表面改性技术，如使用大颗粒喷砂酸蚀(sandblasting and acid etching，SLA)、等离子喷涂(plasma spraying，PSP)、微弧氧化(micro arc oxidation，MAO)、MAO后碱处理等形成能改变种植体表面成分、形貌、能量、粗糙度以及耐腐蚀性的表面理化涂层，或通过电化学沉积技术、浸涂-烧结法、整合-烧结法、溶胶-凝胶法等形成能提供成骨细胞黏附和生长的铆钉点以及三维生长空间，完善种植体的骨诱导性生物活性涂层。

目前，种植体表面涂层存在结合强度不够、易剥脱、综合生物学性能不足、远期稳定性未知等问题，形成一种机械性能牢固、生物相容性好、骨整合牢靠，且具有抗菌性的完美表面涂层，成为学者们亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、控释效果稳定的锌修饰种植体及其制备方法，具体地，通过在种植体基体上形成具有多巴胺和透明质酸涂覆层的氧化锌阵列结构，改善种植体的结合强度、生物相容性和抗菌性能。

根据本发明的一个方面，提供一种锌修饰种植体，包括种植体基体和形成于所述种植体基体表面的氧化锌复合阵列结构，所述氧化锌复合阵列结构包括氧化锌阵列，和依次涂覆在所述氧化锌阵列表面的多巴胺层和接枝在所述多巴胺层上的质酸层。

进一步地，所述质酸层由醛化质酸接枝形成。

进一步地，所述种植体基体为钛。

进一步地，所述锌修饰种植体具有钛-氧化锌-多巴胺-质酸结构。

根据本发明的另一方面，提供一种锌修饰种植体的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备晶种：将第一锌盐和烷醇胺溶于有机溶剂中搅拌均匀，加热反应至澄清、反应完全，冷却后，将反应后溶液涂覆在种植体基体表面，退火得到种植体基体-氧化锌晶种；

(2)制备氧化锌阵列：以第二锌盐为锌源，以烷基胺为碱配制生长溶液，取生长溶液装入合成反应装置里，并将步骤(1)得到的晶种倒置悬浮在所述生长溶液中，在85-95℃(优选90℃)下反应，反应结束后降温，取出种植体，将所述种植体退火，得到种植体基体-氧化锌阵列；

(3)涂覆多巴胺：将步骤(2)制备的种植体基体-氧化锌阵列置于多巴胺Tris-HCl缓冲液中反应，得到多巴胺涂覆的种植体基体-氧化锌阵列；

(4)接枝质酸：利用氧化剂将质酸氧化，透析冻干后得到醛化质酸，通过席夫碱反应将醛化质酸接枝在多巴胺涂覆的种植体基体-氧化锌阵列上，得到质酸修饰的种植体基体-氧化锌-多巴胺复合阵列。

进一步地，所述第一锌盐为乙酸锌，所述烷醇胺为单乙醇胺，所述有机溶剂为乙二醇单甲醚；

所述第二锌盐为硝酸锌，所述烷基胺为六亚甲基四胺。

进一步地，所述种植体基体为钛。

进一步地，步骤(1)为制备Ti-ZnO晶种的方法，包括：将乙酸锌和单乙醇胺，依次溶于乙二醇单甲醚中，搅拌均匀，将所得溶液在55-65℃(优选60℃)水浴条件下反应30-50min，待溶液澄清、反应完全，冷却后，将所述溶液置入1-4℃下冷藏，作为晶种涂覆溶液，将所述晶种涂覆溶液涂覆在钛种植体基体表面，在380-420℃高温退火得到Ti-ZnO晶种。

进一步地，步骤(2)制备Ti-ZnO阵列的方法包括：以硝酸锌为锌源，六亚甲基四胺为碱配制生长溶液，取生长溶液装入水热合成反应釜里，并将步骤(1)得到的Ti-ZnO晶种倒置悬浮在生长液中，在85-95℃下反应5-7h，反应结束后降温，取出钛种植体，在480-520℃高温退火1-3h，得到Ti-ZnO阵列。

进一步地，步骤(3)涂覆多巴胺的方法包括：将步骤(2)制备的Ti-ZnO阵列置于多巴胺Tris-HCl缓冲液中，在35-40℃反应，得到多巴胺涂覆的Ti-ZnO复合阵列。

根据本发明的锌修饰种植体通过简单的阵列合成办法，将牙种植体功能化，引入的氧化锌阵列同时具有抗菌和促成骨的优势，同时多巴胺的涂覆，可以清除氧化锌产生的高毒性自由基，结合天然多糖透明质酸大大提高了其生物相容性，其丰富的羧基，使得锌离子实现缓慢长期释放。由此，本发明的锌修饰种植体具有提高机械性能和生物相容性，增强抗菌性，提高骨整合牢度的优点。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1示出了本发明的工艺流程示意图；

图2示出了根据实施例1制备的涂层的SEM图像，A为钛基阵列氧化锌(Ti-ZnO)，B为钛基阵列氧化锌涂覆透明质酸(Ti-ZnO-HA)；

图3示出了根据实施例1制备的涂层对大肠杆菌死活染色的激光共聚焦图像；

图4示出了根据实施例1制备的涂层对金黄色葡萄球菌死活染色的激光共聚焦图像；

图5为根据实施例1制备的涂层对大肠杆菌抑菌率；

图6为根据实施例1制备的涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌率；

图7示出了不同Zn²⁺对Abmsc成骨分化的影响；

图8示出了不同浓度的锌离子涂层促进成骨细胞分泌OPN蛋白对比图；

图9中，A为不同浓度的硫酸锌的抑菌率，B为不同生长液浓度锌离子的释放，C为Ti-ZnO涂层12小时释放上清液抑菌率，D为引入多巴胺后涂层后对溶液中细菌的抑制效果及抑菌圈实验。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

本发明的锌修饰种植体，包括种植体基体和形成于种植体基体表面的氧化锌复合阵列结构，所述氧化锌复合阵列结构包括氧化锌阵列，和依次涂覆在所述氧化锌阵列表面的多巴胺层和接枝在所述多巴胺层上的质酸层。

较优地，质酸层由醛化质酸接枝形成，所述种植体基体为钛。锌修饰种植体，所述锌修饰种植体具有钛-氧化锌-多巴胺-质酸结构。

本发明的锌修饰种植体制备方法，包括如下步骤：

(1)制备晶种：将第一锌盐和烷醇胺溶于有机溶剂中搅拌均匀，加热反应至澄清、反应完全，冷却后，将反应后溶液涂覆在种植体基体表面，退火得到种植体基体-氧化锌晶种；

(2)制备氧化锌阵列：以第二锌盐为锌源，以烷基胺为碱配制生长溶液，取生长溶液装入合成反应装置里，并将步骤(1)得到的晶种倒置悬浮在所述生长溶液中，在85-95℃下反应，反应结束后降温，取出种植体，将所述种植体退火，得到种植体基体-氧化锌阵列；

(3)涂覆多巴胺：将步骤(2)制备的种植体基体-氧化锌阵列置于多巴胺Tris-HCl缓冲液中反应，得到多巴胺涂覆的种植体基体-氧化锌阵列；

(4)接枝质酸：利用氧化剂将质酸氧化，透析冻干后得到醛化质酸，通过席夫碱反应将醛化质酸接枝在多巴胺涂覆的种植体基体-氧化锌阵列上，得到质酸修饰的种植体基体-氧化锌-多巴胺复合阵列。

较优地，所述第一锌盐为乙酸锌，所述烷醇胺为单乙醇胺，所述有机溶剂为乙二醇单甲醚；所述第二锌盐为硝酸锌，所述烷基胺为六亚甲基四胺。

更具体地，步骤(1)为制备Ti-ZnO晶种的方法，包括：将乙酸锌和单乙醇胺，依次溶于乙二醇单甲醚中，搅拌均匀，将所得溶液在55-65℃水浴条件下反应30-50min，待溶液澄清、反应完全，冷却后，将所述溶液置入1-4℃下冷藏，作为晶种涂覆溶液，将所述晶种涂覆溶液涂覆在钛种植体基体表面，在380-420℃高温退火得到Ti-ZnO晶种。

步骤(2)制备Ti-ZnO阵列的方法包括：以硝酸锌为锌源，六亚甲基四胺为碱配制生长溶液，取生长溶液装入水热合成反应釜里，并将步骤(1)得到的Ti-ZnO晶种倒置悬浮在生长液中，在85-95℃下反应5-7h，反应结束后降温，取出钛种植体，在480-520℃高温退火1-3h，得到Ti-ZnO阵列。

步骤(3)涂覆多巴胺的方法包括：将步骤(2)制备的Ti-ZnO阵列置于多巴胺Tris-HCl缓冲液中，在35-40℃反应，得到多巴胺涂覆的Ti-ZnO复合阵列。

图1为本发明方法的工艺流程示意图。

主要包括如下步骤：

(1)制备Ti-ZnO晶种：将乙酸锌和单乙醇胺，溶于乙二醇单甲醚中，搅拌均匀，加热反应，待溶液澄清、反应完全，冷却后，作为晶种涂覆在钛种植体表面，退火得到Ti-ZnO晶种。

(2)制备Ti-ZnO：以硝酸锌为锌源，六亚甲基四胺为碱配制生长溶液，取生长溶液装入水热合成反应釜里，并将步骤(1)得到的Ti-ZnO晶种倒置悬浮在生长液中，将反应釜放置于烘箱中在反应，反应结束后降温，取出钛种植体，冲洗，最后将钛种植体置入马弗炉中退火，去除残留的有机物，得到Ti-ZnO。

(3)涂覆多巴胺：将步骤(2)制备的Ti-ZnO置于多巴胺Tris-HCL缓冲液中，反应过夜，得到多巴胺涂覆的Ti-ZnO。

(4)接枝透明质酸：利用高碘酸钠将透明质酸氧化，透析冻干后得到醛化透明质酸，通过席夫碱反应将醛化透明质酸接枝在多巴胺涂覆的Ti-ZnO上，得到透明质酸修饰的涂层Ti-ZnO-PDA-HA。

实施例1

(1)制备Ti-ZnO晶种：取3.293g Zn(CH₃COO)₂·2H₂O和1.18mL单乙醇胺，依次溶于18.82mL乙二醇单甲醚中，搅拌均匀。将所得溶液在60℃水浴条件下反应30min，待溶液澄清、反应完全，冷却后，将其置入4℃下冷藏，作为晶种涂覆溶液。取50μL晶种溶液，3000rpm旋涂30s，400℃高温退火得到Ti-ZnO晶种。

(2)制备Ti-ZnO：以Zn(NO₃)₂·6H₂O为锌源，六亚甲基四胺(HMTA)为碱配制0.025M的生长溶液，取20mL生长溶液装入水热合成反应釜里，并将Ti-ZnO seeds倒置悬浮在生长液中。将反应釜放置于烘箱中在90℃下反应6h。反应结束后降温，取出钛片，用去离子水冲洗。最后将钛片置入马弗炉中500℃高温退火1h，去除残留的有机物，得到Ti-ZnO

(3)涂覆多巴胺(DA)：将制备的Ti-ZnO置于多巴胺Tris-HCL缓冲液中，37℃反应过夜，得到多巴胺涂覆的Ti-ZnO(Ti-ZnO-PDA)。

(4)接枝透明质酸(HA)：利用高碘酸钠将HA氧化，透析冻干后得到醛化HA(OHA)，通过席夫碱反应将OHA接枝在Ti-ZnO-PDA上，得到透明质酸修饰的涂层(Ti-ZnO-PDA-HA)。

利用扫描电镜对制备的涂层进行了表征，图2为本发明制备的涂层的SEM图像，其中A为钛基阵列氧化锌(Ti-ZnO)，阵列氧化锌涂覆透明质酸(Ti-ZnO-HA)。

从图2看出，利用种子生长法，成功的将阵列氧化锌生长在纯钛基体上，利用简单的涂覆方法引入透明质酸涂层。制备的钛基阵列结构分布均匀，阵列尖端直径在20-35nm，涂覆透明质酸(HA)后可明显看到聚合物的存在，证明透明质酸成功涂覆在钛基阵列氧化锌表面。

通过死活染色，利用激光共聚焦(CLSM)对材料表面细菌的死活情况进行表征，结果如图3和图4所示，无论对大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，纯钛(Ti)对细菌活性没有影响，生长阵列涂层(Ti-ZnO)后几乎所有的细菌均被杀死，涂覆HA(Ti-ZnO-HA)后，抗菌效果略有下降。同时对溶液中细菌活性进行了测定，结果如图5和图6所示，共聚焦图像一致。

CCK-8增殖实验

1.设置实验组(锌离子涂层钛片)，对照组(光滑钛片)和空白对照组(培养皿，金标准—通常培养效果最优，如果结果和它一样好，则表面可以促进增殖)，细胞接种于各组后于培养箱预培养24h，72h后取样。

2.向每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2小时后，酶标仪测定450nm处的吸光值。

3.结果示24h时，锌离子涂层钛片细胞增殖显著优于光滑钛片组，与空白对照结果相同。

表1 CCK-8在不同基体上的增殖

LP活性实验

ALP是成骨细胞分化成熟的标志之一。

1.设置实验组1(10^-5mol/L锌离子涂层钛片)，设置实验组2(10^-4mol/L锌离子涂层钛片)和空白对照组，细胞接种于各组后于培养箱预培养1周，2周后取样。

2.利用ALP鉴定试剂盒检测各组ALP活性，步骤详见说明书。

3.结果如图7所示，1周时，10^-4mol/L锌离子涂层钛片组ALP活性显著提升。

Western试验

Western实验可检测细胞蛋白分泌情况，图中检测的是OPN蛋白，一种成骨细胞分化相关蛋白。

1.设置实验组1(10^-5mol/L锌离子涂层钛片)，设置实验组2(10^-4mol/L锌离子涂层钛片)成骨诱导组(金标准—通常培养效果最优，如果结果和它一样好表面可以促进分化)和空白对照组，细胞接种于各组后于培养箱预培养1周后取样。

2.收集细胞行Western实验，步骤详见Western试剂盒说明书

3.结果如图8所示，两个实验组均可促进成骨细胞分泌OPN蛋白，显著优于空白对照，接近成骨诱导组。

图9中，A为不同浓度的硫酸锌的抑菌率，B为不同生长液浓度锌离子的释放，C为Ti-ZnO涂层12小时释放上清液抑菌率，D为引入多巴胺后涂层后对溶液中细菌的抑制效果及抑菌圈实验。上述实验证明了锌离子的最小抑菌浓度，确定了涂层的抗菌机理为锌离子的抑菌效果，通过引入多巴胺降低了锌离子的释放使其更有利于骨细胞的生长。

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。