阅读说明：本技术 一种人纤维蛋白原的制备方法 (Preparation method of human fibrinogen ) 是由 谢长福 胡辉恒 汪模正 邓坤 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种人纤维蛋白原的制备方法,以冷沉淀为起始原料,包括如下步骤：(1)冷沉淀溶解；(2)甘氨酸沉淀；(3)甘氨酸沉淀的溶解及过滤；(4)S/D病毒灭活处理；(5)乙醇沉淀；(6)乙醇沉淀的溶解；(7)Q Sepharose fastflow凝胶层析处理；(8)超滤；(9)原液配制、除菌分装、冻干、轧盖、干热灭活后得到产品。本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法,采用甘氨酸和乙醇沉淀结合色谱凝胶纯化生产工艺,生产步骤简便,易操作且成本较低,便于规模化生产；按本方法制备的人纤维蛋白原成品,纯度达到90％以上；冻干制剂的复溶时间小于5min。(The invention provides a preparation method of human fibrinogen, which takes cryoprecipitate as an initial raw material and comprises the following steps: (1) performing cold precipitation and dissolution; (2) precipitating glycine; (3) dissolving and filtering the glycine precipitate; (4) S/D virus inactivation treatment; (5) ethanol precipitation; (6) dissolving the ethanol precipitate; (7) q Sepharose fast flow gel chromatography treatment; (8) ultrafiltration; (9) preparing stock solution, sterilizing, subpackaging, freeze-drying, capping, and performing dry heat inactivation to obtain the product. The preparation method of the human fibrinogen adopts the glycine and ethanol precipitation combined with the chromatographic gel purification production process, has simple and convenient production steps, is easy to operate, has lower cost and is convenient for large-scale production; the purity of the human fibrinogen finished product prepared by the method reaches more than 90 percent; the reconstitution time of the lyophilized preparation is less than 5 min.)

一种人纤维蛋白原的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种人纤维蛋白原的制备方法。

背景技术

人纤维蛋白原为凝血因子，在临床应用上主要是治疗获得性纤维蛋白原减少症：严重肝脏损伤；肝硬化；弥散性血管内凝血；产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。人纤维蛋白原为人源性血液制剂，临床副作用少，其制备过程含专门的病毒灭活工艺，安全性具有可靠的保障，作为治疗出血性外科用必备制剂，目前国内属紧缺药物。

目前国内已上市销售的冻干人纤维蛋白原制品，一是复溶溶解时间较长，平均需要20分钟以上；二是纯度较低，一般在70～80％左右。这些低纯度的人纤维蛋白原制品在临床应用中普遍存在外观不佳、使用不方便以及存在致血栓风险。

随着我国人口老龄化趋势加剧，以及肝病患者人数居高不下，国内临床上对人纤维蛋白原制剂的需求也逐年加大，现阶段如何研发出高纯度、高活性、安全性高，能速溶的人纤维蛋白原制剂具有积极意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的是要提供一种使用简易层析法提取人纤维蛋白原的制备方法，研发出高纯度、高活性、高安全性，工艺简洁易操作、能速溶的人纤维蛋白原制剂。

本发明采用的技术方案是：

一种人纤维蛋白原的制备方法，以冷沉淀为起始原料，包括如下步骤：

(1)冷沉淀溶解，包括如下步骤：

(a)将切碎的冷沉淀倒入6～10倍冷沉淀重量的溶解液Ⅰ中溶解，搅拌溶解2～3h，溶解后制品的最终温度控制在24～26℃；

(b)将步骤(a)中溶解后制品离心收集上清液Ⅰ；澄清过滤，用溶解液Ⅰ顶洗至冷沉淀重量的8～10倍，得到滤液；

(2)甘氨酸沉淀：计量步骤(b)中所述滤液的重量，在搅拌状态下缓慢加入甘氨酸，加完后继续搅拌1～2h，并降温至5～9℃后离心，收集甘氨酸沉淀；

(3)甘氨酸沉淀的溶解及过滤：准确称量步骤(2)中所述甘氨酸沉淀的重量，加入到4～6倍甘氨酸沉淀重量的溶解液Ⅱ中溶解，搅拌溶解不少于1h，溶解液温度最终控制在24～26℃；离心，收集上清液Ⅱ；澄清过滤，并用溶解液Ⅱ顶洗至甘氨酸沉淀重量的5～8倍，得到蛋白液；

(4)S/D病毒灭活处理：准确计量步骤(3)中所述蛋白液的重量，在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液进行病毒灭活处理；

(5)乙醇沉淀：将步骤(4)中灭活后制品加入到稀释液中，并降温至6～9℃；加入0℃以下的50wt％乙醇，反应最终温度控制在5～8℃，乙醇加毕，继续搅拌，离心收集乙醇沉淀；

(6)乙醇沉淀的溶解：准确计量步骤(5)中所述乙醇沉淀的重量，加入到8倍乙醇沉淀重量的溶解液Ⅲ中溶解，溶解温度控制在24～28℃，搅拌溶解不少于1h；离心收集上清液Ⅲ，澄清过滤，并用溶解液Ⅲ顶洗制品；

(7)Q Sepharose fastflow凝胶层析处理：将步骤(6)中澄清过滤后的溶液经QSepharose fastflow凝胶吸附层析处理，得到收集液；

(8)超滤：对步骤(7)中所述收集液进行超滤浓缩，得到原液；

(9)原液配制、除菌分装、冻干、轧盖、干热灭活后得到产品。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(1)中所述冷沉淀为新鲜制备的冷沉淀或解冻后的冻存冷沉淀，冻存冷沉淀解冻时，将冻存冷沉淀置于离心间自然解冻，自然解冻时间不小于5h，离心间的温度为6～10℃。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(2)中甘氨酸的加入量为130～170g/kg滤液。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(4)具体步骤为：准确计量步骤(3)中所述蛋白液的重量，在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终浓度为0.80～1.20％，磷酸三丁酯最终浓度为0.24～0.36％，将制品温度控制在24～26℃，保温6h进行病毒灭活处理，所述蛋白液与S/D溶液的重量比为10:1。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(5)具体步骤为：将步骤(4)中灭活后制品加入到1.2倍重量的稀释液中，并降温至6～9℃；加入0℃以下的50wt％乙醇，乙醇的终浓度为8wt％，反应最终温度控制在5～8℃，50wt％乙醇加毕，继续搅拌0.5h后离心收集乙醇沉淀；按M_50％乙醇＝M_灭活制品×8/(50-8)计算0℃以下的50wt％乙醇加量，加入速度为≤60kg/h。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(7)具体步骤为：将步骤(6)中澄清过滤后的溶液经Q Sepharose fastflow凝胶吸附层析处理，收集上样流穿液；上样结束后用3～4倍凝胶体积的溶解液Ⅲ冲洗层析柱，第一倍流穿液收集合并于上样流穿液中；用3～4倍凝胶体积的洗脱液洗脱，得到收集液。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(8)具体步骤为：采用超滤器对步骤(7)中所述收集液进行两次超滤浓缩，包括第一次浓缩；第一次浓缩后，按浓缩液重量加入等倍重量的透析液进行透析，共透析8遍；第二次浓缩：透析结束时开始第二次浓缩，将浓缩后的蛋白液收集至配液容器中，用透析液顶洗至5倍8wt％乙醇沉淀重量，得到所述原液。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(9)具体步骤为：准确计量步骤(8)中所述原液的重量并搅拌混匀后对所述原液进行pH值、蛋白质含量检测，根据检测结果进行配液使最终制品中pH值为6.5～7.5，蛋白质含量为2.5％；制品除菌后进行分装、冻干、轧盖、干热灭活后得到产品。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(1)中所述溶解液Ⅰ配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，pH为6.8～7.0，温度≦26℃；步骤(3)所述溶解液Ⅱ配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，氯化钠0.15mol/L，蔗糖0.03mol/L，pH为6.8～7.0，温度≤26℃；步骤(6)和(7)中所述的溶解液Ⅲ配方为：Tris0.2mol/L，氯化钠0.25mol/L，氯化钙0.01mol/L，pH为6.55～6.65，温度24～28℃；步骤(5)所述稀释液配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，氯化钠0.15mol/L，蔗糖0.03mol/L，pH为6.8-7.0，温度为1～5℃；步骤(8)所述透析液配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，盐酸精氨酸0.23mol/L，pH为6.8～7.2，温度20～25℃。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，其中，步骤(b)离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤26℃，离心进液结束后用溶解液Ⅰ顶洗管路；步骤(3)中离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤26℃，离心进液结束后用溶解液Ⅱ顶洗管路；步骤(2)和步骤(5)中离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤15℃，离心进液结束后用离心出液顶洗顶洗管路；步骤(6)中离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤28℃，离心进液结束后用溶解液Ⅲ顶洗管路。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法与现有技术不同之处在于：

1.采用甘氨酸和乙醇沉淀结合色谱凝胶纯化的制备方法，步骤简便，易操作且成本较低，便于规模化生产。甘氨酸具备保护人纤维蛋白原的活性作用，先用甘氨酸沉淀一是能保护人纤维蛋白原的活性，其二是先一步去除部分能激活人纤维蛋白原的因子或酶类，使后续工艺进一步保护人纤维蛋白原的活性，乙醇沉淀是有机溶剂类，对人纤维蛋白原的活性有一定的影响，且是粗放式提取，对蛋白或酶类均能沉淀出来。本方法先用甘氨酸沉淀法提取沉淀获得的最终产品，质量(外观及复溶时间上有明显提升)上明显优于先用乙醇沉淀工艺。

2.按本方法制备的人纤维蛋白原成品，纯度达到90％以上；冻干制剂的复溶时间小于5min。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，溶解液Ⅰ，溶解液Ⅱ，溶解液Ⅲ，稀释液和透析液的成分及配比均为多次试验调整确认得到，采用本申请中的成分和配比能够保证产品制备过程中各步骤沉淀溶解较为充分或最大限度的保护目标蛋白活性。

本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法，步骤(b)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)和步骤(6)中制品用管式离心机离心，离心时，由于进液温度不相同，出液温度不同，能够保证目标蛋白的分离纯化。离心时是会导致反应液升温的，有出液温度控制，是为了保护人纤维蛋白原不变性。

下面将结合具体实施例对本发明的人纤维蛋白原的制备方法作进一步说明。

具体实施方式

一种人纤维蛋白原的制备方法，以冷沉淀为起始原料，包括如下步骤：

(1)冷沉淀溶解

(a)将冷沉淀切成1～3cm块状，然后将切碎的所述冷沉淀倒入8倍冷沉淀重量的溶解液Ⅰ中溶解，搅拌溶解2h，溶解后制品的最终温度控制在24～26℃；

所述冷沉淀为新鲜制备的冷沉淀或解冻后的冻存冷沉淀；冻存冷沉淀解冻时，将冻存冷沉淀置于离心间自然解冻，自然解冻时间为5h，离心间的温度为6～10℃；生产规模：批投冷沉淀量为60±10kg；(所述冷沉淀的具体制备方法参见申请号为201510992448.0的专利“一种人纤维蛋白原的制备方法”)；

所述溶解液Ⅰ配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，pH为6.8～7.0，温度≦26℃；采用溶解液Ⅰ，成本低廉，简易配制就能达到保护和溶解所述冷沉淀的目的。

(b)将步骤(a)中溶解后制品离心收集上清液Ⅰ；离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤26℃，离心进液结束后用溶解液Ⅰ顶洗管路(每台离心机不少于3kg)；所述上清液Ⅰ用经所述溶解液Ⅰ处理的滤器Ⅰ澄清过滤，用溶解液Ⅰ顶洗至冷沉淀重量的9倍，得到滤液；所述滤器Ⅰ的孔径为0.6～0.45nm；

(2)甘氨酸沉淀

计量步骤(b)中所述滤液的重量，在搅拌状态下缓慢加入甘氨酸，加完后继续搅拌1h，并降温至7±2℃后离心，收集甘氨酸沉淀，甘氨酸的加入量为150g/kg滤液(即每1kg滤液中加入150g的甘氨酸)；离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤15℃，离心进液结束后用离心出液顶洗顶洗管路(每台离心机不少于3kg)；

(3)甘氨酸沉淀的溶解及过滤

准确称量步骤(2)中所述甘氨酸沉淀的重量，加入到5倍甘氨酸沉淀重量的溶解液Ⅱ中溶解，搅拌溶解1h，溶解液温度最终控制在24～26℃，离心，收集上清液Ⅱ；

离心时，用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤26℃，离心进液结束后用溶解液Ⅱ顶洗管路(每台离心机不少于3kg)；所述上清液Ⅱ用经溶解液Ⅱ处理的滤器Ⅱ澄清过滤，并用溶解液Ⅱ顶洗至甘氨酸沉淀重量的6.5倍，得到蛋白液；所述滤器Ⅱ的孔径为0.6～0.45nm；

所述溶解液Ⅱ配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，氯化钠0.15mol/L，蔗糖0.03mol/L，pH为6.8～7.0，温度≤26℃；

(4)S/D病毒灭活处理

准确计量步骤(3)中所述蛋白液的重量，在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终浓度为1wt％，磷酸三丁酯最终浓度为0.3wt％；将制品温度控制在24～26℃，保温6h进行病毒灭活处理；所述蛋白液与S/D溶液的重量比为10:1；

(5)乙醇沉淀

将步骤(4)中灭活后制品加入到1.2倍重量的稀释液中，并降温至6～9℃；加入0℃以下的50wt％乙醇，乙醇的终浓度为8wt％，反应最终温度控制在5～8℃，50wt％乙醇加毕，继续搅拌0.5h后离心收集乙醇沉淀；按M_50％乙醇＝M_灭活制品×8/(50-8)计算0℃以下的50wt％乙醇加量，加入速度为≤60kg/h；

离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤15℃，离心进液结束后用离心出液顶洗管路(每台离心机不少于3kg)；

所述稀释液配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，氯化钠0.15mol/L，蔗糖0.03mol/L，pH为6.8～7.0，温度为1～5℃；

根据原乙醇浓度及需要的最终乙醇浓度，按M_50％乙醇＝M_灭活制品×8/(50-8)计算出理论加入50wt％乙醇的量，采用50wt％乙醇，而非95wt％的原浓度乙醇，是由于50wt％的乙醇加入到反应液中，对人纤维蛋白原活性的影响较小，且体积可控，易于后续操作。

(6)乙醇沉淀的溶解

准确计量步骤(5)中所述乙醇沉淀的重量，加入到8倍乙醇沉淀重量的溶解液Ⅲ中溶解，溶解温度控制在24～28℃，搅拌溶解为1h，离心收集上清液Ⅲ；

离心时用管式离心机离心，进液速度为：每台离心机每分钟不超过5kg，出液温度≤28℃，离心进液结束后用溶解液Ⅲ顶洗管路(每台离心机不少于3kg)；所述上清液Ⅲ用经溶解液Ⅲ处理的滤器Ⅲ进行澄清过滤，并用不少于5kg溶解液Ⅲ顶洗制品；所述滤器Ⅲ的孔径为0.6～0.45nm；

所述溶解液Ⅲ配方为：三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.2mol/L，氯化钠0.25mol/L，氯化钙0.01mol/L，pH为6.55～6.65，温度24～28℃；

(7)Q Sepharose fastflow凝胶层析处理

用再生后的Q Sepharose FF凝胶对步骤(6)中过滤后的溶液进行上样层析，并收集上样流穿液；上样结束后用3～4倍凝胶体积的溶解液Ⅲ冲洗层析柱，第一倍流穿液收集合并于上样流穿液中；用3～4倍凝胶体积的洗脱液洗脱，得到收集液；上样、冲洗、洗脱时进液压力＜0.2MPa，流速≤2kg/min；

上样、冲洗、洗脱时，进液压力＜0.2MPa，为层析系统安全使用压力；流速≤2kg/min，能够保证产品制备过程中杂蛋白被吸附去除，目标蛋白纯化。

(8)超滤

采用超滤器对步骤(7)中所述收集液进行两次超滤浓缩，第一次浓缩透析：开启超滤器调节适当压力，进压≤0.4MPa，出压≤0.1MPa，将所述收集液进行第一次浓缩；第一次浓缩后，按浓缩液重量加入等倍重量的透析液进行透析，共透析8遍；第二次浓缩：透析结束时开始第二次浓缩，将浓缩后的蛋白液收集至配液容器中，用透析液顶洗至5倍8wt％乙醇沉淀重量，得到原液；所述超滤器的截留分子量为100KD；

所述透析液配方为：枸橼酸钠0.05mol/L，盐酸精氨酸0.23mol/L，pH为6.8～7.2，温度20～25℃；

(9)原液配制、除菌分装、冻干、轧盖、干热灭活后得到产品

准确计量步骤(8)中所述原液重量并搅拌混匀后对所述原液进行pH值、蛋白质含量检测，根据检测结果用注射用水进行配液使最终制品中pH值为6.5～7.5，蛋白质含量为2.5g/100ml；制品除菌后进行分装、冻干、轧盖、干热灭活后得到产品。

本实施例制备的人纤维蛋白原成品，纯度是90.9％，冻干制剂的复溶时间小于5min。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。