一种人纤维蛋白原的纯化方法
阅读说明：本技术 一种人纤维蛋白原的纯化方法 (Purification method of human fibrinogen ) 是由 鲁涛 牟蕾 李伟 余伟 王黔川 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人纤维蛋白原的纯化方法,属于血浆制品制备工艺领域。所述方法包括以下步骤：将经病毒灭活后的纤维蛋白原进行离子交换层析,得到纯化后的纤维蛋白原；所述离子交换层析采用的缓冲液包括平衡缓冲液,洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。实验结果表明,利用本发明的纯化方法,不仅能够明显提高所得产品中人纤维蛋白原含量和纯度,还能明显降低产品中的病毒灭活剂残留。本发明的方法操作简便,成本低廉,具有良好的工业应用前景。(The invention discloses a purification method of human fibrinogen, belonging to the field of plasma product preparation processes. The method comprises the following steps: performing ion exchange chromatography on the fibrinogen subjected to virus inactivation to obtain purified fibrinogen; the buffers used for ion exchange chromatography include equilibration buffer, washing buffer and elution buffer. Experimental results show that the purification method of the invention not only can obviously improve the content and purity of human fibrinogen in the obtained product, but also can obviously reduce the virus inactivator residue in the product. The method of the invention has simple operation, low cost and good industrial application prospect.)
技术领域
本发明属于血浆制品制备工艺领域，特别涉及一种人纤维蛋白原的纯化方法。
背景技术
人纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)，也称人凝血因子Ⅰ，主要由肝脏实质细胞合成，是血浆蛋白的主要成分之一，血浆中纤原含量丰富，正常人血浆中约为2～4g/L，是凝血系统中的“中心”蛋白质之一。
人纤维蛋白原是凝血过程中凝血因子相继激活的最终底物，具有止血功能，它除了直接参与凝血过程后期阶段外，还能介导血小板聚集、影响血液黏度。在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aα链氨基端Arg16-Gly17释放出一对纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体I；在裂解纤维蛋白原两条Bβ链氨基端Arg14-Gly15释放出一对纤维蛋白肽B，形成纤维蛋白单体II，暴露纤维蛋白单体的聚合部位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子XIII及Ca2+的作用下，纤维蛋白单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白，并将血液的有形成分包绕其中，形成牢固的血栓。除参与凝血外，人纤维蛋白原还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等。因此，制备高纯度的人纤维蛋白原在临床上具有重要价值。
目前采用较多的人纤维蛋白原纯化方法为层析纯化。申请号为201711104891.5的中国专利申请公开了一种人纤维蛋白原的制备方法，包括如下步骤：(1)将人血浆低温乙醇沉淀组分I溶解于提取液中，得到组分I溶液；(2)对步骤(1)得到的组分I溶液进行S/D灭活；(3)将赖氨酸亲和层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(2)得到的溶液进行柱层析，收集穿透峰；(4)将阳离子交换层析介质用平衡液平衡，然后对步骤(3)得到的穿透峰进行柱层析，层析结束后用淋洗液淋洗层析柱，最后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得到人纤维蛋白原溶液。但是，该方法纯化步骤较复杂，需要先后经过赖氨酸亲和柱层析和阳离子交换柱层析；而且，该方法的病毒灭活工艺采用S/D法，但是经该方法纯化后的人纤维蛋白原中还有病毒灭活剂磷酸三丁酯残留。研究发现，磷酸三丁酯对小鼠的半数致死量(LD50)为602mg/kg，对人体有害(The use of tri(n-butyl)phosphate detergent mixtures to inactivatehepatitis viruses and human immunodeficiency virus in plasma and plasma'ssubsequent fractionation.Transfusion.1990 Sep；30(7):591-8.)。因此，需要开发操作更简单、病毒灭活剂磷酸三丁酯残留量更少的纤维蛋白原纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纤维蛋白原的纯化方法，以简化纯化步骤，提高纤维蛋白原纯度，降低病毒灭活剂残留量。
本发明提供了一种纯化纤维蛋白原的方法，所述方法包括以下步骤：将经病毒灭活后的纤维蛋白原进行离子交换层析，得到纯化后的纤维蛋白原；
所述离子交换层析采用的缓冲液包括平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；所述平衡缓冲液为2～8mM的Tris缓冲液；所述洗涤缓冲液由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为20～60mM，Tris的浓度为2～8mM；所述洗脱缓冲液由NaCl和Tris的水溶液组成，其中NaCl的浓度为70～130mM，Tris的浓度为2～8mM。
进一步地，所述方法包括以下步骤：用平衡缓冲液平衡层析填料，将经病毒灭活后的纤维蛋白原上柱，先用洗涤缓冲液淋洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的纤维蛋白原。
进一步地，所述平衡缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗涤缓冲液的pH为8.0～9.0，所述洗脱缓冲液的pH为8.0～9.0。
进一步地，所述平衡缓冲液为5mM的Tris缓冲液，所述平衡缓冲液的pH为8.5；
和/或，所述洗涤缓冲液中，NaCl的浓度为30mM，Tris的浓度为5mM，所述洗涤缓冲液的pH为8.5；
和/或，所述洗脱缓冲液中，NaCl的浓度为100mM，Tris的浓度为5mM，所述洗脱缓冲液的pH为8.5。
进一步地，所述层析填料为阴离子交换层析填料，所述阴离子交换层析填料优选为聚甲基丙烯酸酯类阴离子交换树脂。
进一步地，所述聚甲基丙烯酸酯类阴离子交换树脂选自Capto Q、Fractogel EMDTMAE(M)或Fractogel EMD DEAE(M)，优选为Fractogel EMD DEAE(M)。
进一步地，所述经病毒灭活后的纤维蛋白原是按照以下方法制得的：
(a)取冷沉淀，加水相溶剂溶解得到冷沉淀溶解液；
(b)将冷沉淀溶解液经氢氧化铝吸附，离心，取上清，过滤，保留滤液；
(c)在滤液中加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，灭活，得到经病毒灭活后的纤维蛋白原。
进一步地，步骤(a)中，所述冷沉淀是新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀；所述水相溶剂为Tris缓冲液；
和/或，步骤(b)中，所述氢氧化铝的用量为冷沉淀的1wt.％～5wt.％，所述吸附的时间为10～20分钟，所述吸附的温度为20～35℃；
和/或，步骤(c)中，所述聚山梨酯80的用量为滤液的0.5wt.％～2.0wt.％，所述磷酸三丁酯的用量为滤液的0.1wt.％～0.5wt.％，所述灭活的时间为4～8小时，所述灭活的温度为24～26℃。
进一步地，步骤(a)中，所述水相溶剂为10～30mM、pH为6.0～7.5的Tris缓冲液，优选为20mM、pH为6.8的Tris缓冲液；
和/或，步骤(b)中，所述氢氧化铝的用量为冷沉淀的2wt.％，所述吸附的时间为15分钟，所述吸附的温度为25℃；
步骤(c)中，所述聚山梨酯80和磷酸三丁酯的质量比为10：3，所述聚山梨酯80的用量为滤液的1wt.％，所述灭活的时间为6小时，所述灭活的温度为25℃。
本发明还提供了上述方法制得的纯化后的纤维蛋白原。
进一步地，所述纤维蛋白原为人纤维蛋白原。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
S/D法是一种病毒灭活方法，是指用有机溶剂/去污剂混合物(S/D)破坏包膜病毒的脂膜的方法。一旦破坏脂膜的病毒不可能再与感染细胞结合。
冷沉淀是一种血浆制品，冷沉淀中含有Ⅷ因子及纤维蛋白原，可治疗缺乏Ⅷ因子及纤维蛋白原而出血不止的患者或血友病患者。
Tris是三羟甲基氨基甲烷的缩写。
水相溶剂指水或非有机相的水溶液。
室温指25±2℃。
实验结果表明，利用本发明的纯化方法，不仅能够明显提高所得产品中人纤维蛋白原含量和纯度，还能明显降低产品中的病毒灭活剂残留。本发明的方法操作简便，成本低廉，具有良好的工业应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为线性洗脱层析图谱。其中横坐标为层析体积；纵坐标为洗脱缓冲液中B泵中液体的百分比；蓝色曲线为UV280吸收值；与纵坐标平行的一条绿色直线为指示线，表示此处洗脱缓冲液中B泵中液体的百分比为10％；绿色曲线为B泵百分率；棕色曲线为电导值。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1.人纤维蛋白原的纯化方法
第一步：初步纯化
1、取新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀，于室温下将冷沉淀以1:3的重量比加入20mM、pH为6.8的Tris缓冲液中溶解，得到冷沉淀溶解液；
2、在冷沉淀溶解液中加入氢氧化铝(氢氧化铝的用量为冷沉淀的2wt.％)，于室温下搅拌15分钟进行吸附处理；
3、将吸附后所得体系于4000g下离心20分钟，取上清过0.45μm滤膜，保留滤液；
第二步：病毒灭活
按S/D法对所得滤液进行病毒灭活：取第一步所得滤液，加入聚山梨酯80(聚山梨酯80用量为滤液的1wt.％)和磷酸三丁酯(磷酸三丁酯用量为滤液的0.3wt.％)，于25℃下灭活6小时，得到待上柱样品。
第三步：阴离子交换层析纯化
以Fractogel EMD DEAE(M)为阴离子交换层析填料，对待上柱样品进行纯化，具体步骤如下：
将阴离子交换层析填料Fractogel EMD DEAE(M)用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡，然后将第二步所得待上柱样品上柱，先用的洗涤缓冲液淋洗层析柱，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，得到人纤维蛋白原溶液。
其中，平衡缓冲液为5mM、pH为8.5的Tris缓冲液；洗涤缓冲液pH为8.5，由NaCl和Tris的水溶液组成，洗涤缓冲液中，NaCl的浓度为30mM，Tris的浓度为5mM；洗脱缓冲液pH为8.5，由NaCl和Tris的水溶液组成，洗脱缓冲液中，NaCl的浓度为100mM，Tris的浓度为5mM。
以下以实验例的方式来说明本发明的有益效果。
实验例1.吸附效果评价
1、实验方法
分别以实施例1第一步的冷沉淀、吸附处理后的滤液为测试样品，测试初步纯化前、后样品中的人纤维蛋白原纯度和凝血因子II、VII、IX、X的吸附效果。
2、实验结果
表1初步纯化前、后样品中的人纤维蛋白原和吸附凝血因子II、VII、IX、X(n＝3)
测试指标
初步纯化前
初步纯化后
蛋白含量mg/ml(n＝8)
34.65
33.01
可凝固蛋白含量mg/ml(n＝8)
21.88
21.49
纯度％(n＝8)
63.15
65.10
FII IU/ml(n＝2)
0.32
0.11
FVII IU/ml(n＝2)
0.54
0.08
FIX IU/ml(n＝2)
0.85
0.23
FX IU/ml(n＝2)
0.13
0.04
表1中，蛋白含量指样品中总的蛋白质含量；可凝固蛋白含量即人纤维蛋白原含量，测试方法为：样品与凝血酶溶液孵育后分离沉淀，测定蛋白质含量，即为可凝固蛋白含量；纯度为样品中可凝固蛋白的含量百分比。
从表1结果可以看出，本发明经氢氧化铝吸附处理后能初步提高人纤维蛋白原纯度，该过程对影响人纤维蛋白原稳定性的凝血因子FII、VII、IX、X具有优异的去除效果。
实验例2.病毒灭活效果评价
1、实验方法
以实施例1第二步进行病毒灭活后所得的待上柱样品为测试样品，评价病毒灭活效果。
2、实验结果
表2.SD病毒灭活效果(n＝3)
指示病毒
PRV病毒
Sindbis病毒
HIV病毒
灭活效果
≥4.75logTCID<sub>50</sub>/ml
≥4.02logPFU/ml
≥5.5logTCID<sub>50</sub>/m
从表2结果可以看出，以本发明方法进行SD病毒灭活，能有效灭活脂包膜病毒，达到国家规定的标准。
实验例3.层析介质筛选实验
1、实验方法
按照实施例1的方法，区别仅在于将第三步中的阴离子交换层析填料替换为表3中的Capto Q、Fractogel EMD TMAE(M)或Fractogel EMD DEAE(M)。比较分别采用这三种阴离子交换层析填料时的凝胶载量和收率。
凝胶载量是指凝胶能吸附的目标蛋白的量，载量越高，吸附效果越好，分离同样体积的样品所需的凝胶越少。收率是指通过层析步骤除去杂蛋白等杂质后得到的目标蛋白与层析前的比值。
凝胶载量＝(上柱样品体积×蛋白浓度)/层析柱体积；
注：上柱样品体积是指上样开始至紫外吸收峰明显上升，出现大量蛋白质流穿的体积。
收率＝层析后样品中纤维蛋白原总量/层析前样品中纤维蛋白原总量。
2、实验结果
表3.层析介质筛选实验结果
从表3可以看出，三种层析填料中，凝胶载量按照由大到小依次为Fractogel EMDDEAE(M)＞Fractogel EMD TMAE(M)＞Capto Q，收率按照由大到小依次为Fractogel EMDTMAE(M)＞Fractogel EMD DEAE(M)＞Capto Q。均衡考量载量和收率两方面，FractogelEMD TMAE(M)需要较大层析凝胶体积，成本较高，操作不便，不适合大规模生产，因此选择Fractogel EMD DEAE(M)作为纯化层析介质。
实验例4.洗脱缓冲液筛选实验
1、实验方法
按照实施例1的方法，区别仅在于改变第三步洗脱缓冲液中的NaCl浓度，进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的具体操作为：
A泵中的液体(pH为8.5)为5mM的Tris缓冲液，B泵中的液体(pH为8.5)由Tris缓冲液和NaCl水溶液组成，其中，Tris浓度为5mM，NaCl浓度为1M。以A泵和B泵混合所得液体为洗脱缓冲液，逐步提高洗脱缓冲液中B泵中液体的比例，进行线性梯度洗脱。
2、实验结果
层析谱图如图1所示，经检测发现当B泵中液体的比例为3％～4％时出现了一个杂蛋白峰，当B泵中液体的比例达到10％时得到的洗脱峰富含人纤维蛋白原。因此，洗脱缓冲液中B泵中液体的比例达到10％时可以得到富含人纤维蛋白原的洗脱液。经过换算，此处洗脱缓冲液中Tris浓度为5mM，NaCl浓度为100mM。
实验例5.人纤维蛋白原纯化效果验证实验
1、实验方法
测试样品：本发明实施例1第三步制得的纯化后的人纤维蛋白原(即层析后样品)；本发明实施例1第二步所得待上柱样品(即层析前样品)。
测试以下指标：
可凝固蛋白(即人纤维蛋白原)含量：样品与凝血酶溶液孵育后分离沉淀，测定蛋白质含量，即为可凝固蛋白含量；
纯度：样品中可凝固蛋白含量百分比；
可凝固蛋白收率：层析后与层析前样品可凝固蛋白总量百分比；
聚山梨酯80残留：比色法测定；
磷酸三丁酯残留：气相色谱法测定。
2、实验结果
表4.人纤维蛋白原纯化效果(n＝8)
测试指标
层析前样品
层析后样品
可凝固蛋白含量(mg/ml)
3.81±0.27
4.35±0.51
纯度(％)
63.29±0.05
72.99±0.06
可凝固蛋白收率
/
～70％
聚山梨酯80残留μg/ml
1000
28.13±2.47
磷酸三丁酯残留μg/ml
300
未检出
表4中，可凝固蛋白指产品中的人纤维蛋白原。
从表4可以看出，利用本发明的方法纯化后的产品中人纤维蛋白原含量和纯度明显提高，且收率也较高；同时，本发明的纯化方法能够明显降低病毒灭活剂残留，所得产品中未检出磷酸三丁酯。
综上，本发明提供了一种人纤维蛋白原的纯化方法。实验结果表明，采用本发明的纯化方法，通过离子交换层析时氯化钠的浓度变化，可以使人纤维蛋白原吸附在凝胶上，而杂蛋白和病毒灭活剂流穿，再通过提高缓冲液中氯化钠浓度将人纤维蛋白原从凝胶上洗脱，得到了纯化的人纤维蛋白原。利用本发明的纯化方法，不仅能够明显提高所得产品中人纤维蛋白原含量和纯度，还能明显降低产品中的病毒灭活剂残留。本发明的方法操作简便，成本低廉，具有良好的工业应用前景。
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