阅读说明：本技术 诱导rna沉默的方法 (Methods of inducing RNA silencing ) 是由 羽城周平 安枝寿 中野麻由 新美辉幸 川口春香 于 2019-02-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供在目标生物中高效地诱导RNA沉默的方法。通过用有机溶剂对具有生产用于RNA沉默的RNA的能力的微生物的菌体进行处理,然后使目标生物摄入,而在目标生物中诱导RNA沉默。(The present invention provides methods for efficiently inducing RNA silencing in a target organism. RNA silencing is induced in a target organism by treating a microbial cell having an ability to produce RNA for RNA silencing with an organic solvent and then allowing the target organism to take in.)

诱导RNA沉默的方法

技术领域

本发明涉及在目标生物中诱导RNA沉默的方法。

背景技术

已知，在害虫等目标生物中，通过外部提供的RNA而阻碍所选的基因的功能表达的技术。该技术例如也称为RNA沉默(RNA Silencing)。就用于RNA沉默的RNA而言，例如，可以以单独或与其他成分组合的方式提供给目标生物(专利文献1，非专利文献1)。此外，就用于RNA沉默的RNA而言，例如，可在大肠杆菌等微生物中表达，可将含有该RNA的菌体原样或进行热处理后提供给目标生物(专利文献2～3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2010/140675

专利文献2：US2013-0011372

专利文献3：美国专利9445603

非专利文献

非专利文献1：Zhu F,et.al.,Ingested RNA interference for managing t hepopulations of the Colorado potato beetle,Leptinotarsa decemlineata.PestManag Sci.2011Feb；67(2):175-82.

发明内容

发明所解决的技术问题

在向自然界提供RNA的情况下，存在因UV等电磁波引起的分解作用、氧化或者环境中的RNA分解酶等而使该RNA的结构稳定性成为问题的情况。此外，为了将RNA分离纯化为纯化产物，而需要大量成本。另一方面，在利用存活的表达RNA的微生物的菌体的情况下，存在转基因生物释放至环境中这样的对生态系统造成不良影响的风险。此外，通过加热(热处理)对表达RNA的微生物的菌体进行灭菌并利用的情况下，存在菌体中含有的RNA因热、菌体内的化学反应而被极大地分解这样的问题。

本发明的目的是提供在目标生物中高效地诱导RNA沉默的方法。

解决问题的技术手段

本发明人等发现，能够通过用有机溶剂对具有生产用于RNA沉默的RNA的能力的微生物的菌体进行处理，然后使目标生物摄入，而在该目标生物中高效地诱导RNA沉默，从而完成了本发明。

即，本发明可例举如下。

[1]一种方法，其是在目标生物中诱导RNA沉默的方法，其中，

所述方法包含使目标生物摄入微生物的死菌体的工序，

所述微生物具有生产用于RNA沉默的RNA的能力，

所述死菌体用有机溶剂进行了处理，

所述死菌体含有用于RNA沉默的RNA。

[2]根据上述方法，其在工序之前，还包含通过对所述微生物的菌体进行所述处理而制备所述死菌体的工序的。

[3]根据上述方法，其中，

使所述目标生物摄入以所述RNA的量计为10pg-RNA/个体～10μg-RNA/个体的量的所述死菌体。

[4]一种方法，其是用于在目标生物中诱导RNA沉默的组合物的制造方法，其中，

所述方法包含通过将所述微生物的菌体供给于使用有机溶剂进行的处理而制备死菌体的工序，

所述组合物含有所述死菌体，

所述微生物具有生产用于RNA沉默的RNA的能力，

所述死菌体含有用于RNA沉默的RNA。

[5]根据上述方法，其中，

所述有机溶剂为醇。

[6]根据上述方法，其中，

所述有机溶剂为乙醇或甲醇。

[7]根据上述方法，其中，

在所述有机溶剂为乙醇的情况下，进行所述处理时的所述有机溶剂的浓度为30％(v/v)以上，

在所述有机溶剂为甲醇的情况下，进行所述处理时的所述有机溶剂的浓度为50％(v/v)以上。

[8]根据上述方法，其中，

实施所述处理1分钟以上。

[9]根据上述方法，其中，

所述微生物是棒状细菌或属于肠杆菌科的细菌。

[10]根据上述方法，其中，

所述微生物为棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌或埃希菌(Escherichia)属细菌。

[11]根据上述方法，其中，

所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

[12]根据上述方法，其中，

所述微生物经过了修饰，以使得与未修饰株相比核糖核酸酶III的活性降低。

[13]根据上述方法，其中，

所述目标生物为害虫。

[14]一种组合物，其是用于在目标生物中诱导RNA沉默的组合物，其中，

所述组合物含有微生物的死菌体，

所述微生物具有生产用于RNA沉默的RNA的能力，

所述死菌体用有机溶剂进行了处理，

所述死菌体含有用于RNA沉默的RNA。

[15]根据上述组合物，其中，

所述有机溶剂为醇。

[16]根据上述组合物，其中，

所述有机溶剂为乙醇或甲醇。

[17]根据上述组合物，其中，

在所述有机溶剂为乙醇的情况下，进行所述处理时的所述有机溶剂的浓度为30％(v/v)以上，

在所述有机溶剂为甲醇的情况下，进行所述处理时的所述有机溶剂的浓度为50％(v/v)以上。

[18]根据上述组合物，其中，

实施所述处理1分钟以上。

[19]根据上述组合物，其中，

所述微生物是棒状细菌或属于肠杆菌科的细菌。

[20]根据上述组合物，其中，

所述微生物为棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌或埃希菌(Escherichia)属细菌。

[21]根据上述组合物，其中，

所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

[22]根据上述组合物，其中，

所述微生物经过了修饰，以使得与未修饰株相比核糖核酸酶III的活性降低。

[23]根据上述组合物，其中，

所述目标生物为害虫。

附图说明

[图1]是表示质粒pBS4SΔrnc的构建步骤的图。

[图2]是表示质粒pVC7-sacB的构建步骤的图。

[图3]是表示质粒pVC7-Pf1-Hv-iap的构建步骤的图。

[图4]是表示质粒pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev的构建步骤的图。

[图5]是表示从菌体中提取的RNA的非变性PAGE下的电泳结果的图(照片)，所述菌体是对保持靶RNA的棒状细菌菌体进行了乙醇处理后的菌体。箭头表示靶RNA的位置。

[图6]是表示从菌体中提取的RNA的非变性PAGE下的电泳结果的图(照片)，所述菌体是对保持靶RNA的棒状细菌菌体进行了甲醇处理后的菌体。箭头表示靶RNA的位置。

[图7]表示从棒状细菌菌体中提取的RNA的电泳结果的图(照片)，所述棒状细菌菌体供给于茄二十八星瓢虫的给药实验并且进行了各种处理。C,Hv-i ap RNA的非生产菌株2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2；Hviap,Hv-iap RNA的生产菌株2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev。未灭菌处理：不进行菌体的灭菌处理，将培养后的菌体立即进行RNAprotect Bacteria Reagent处理而提取的RNA。箭头表示靶RNA的迁移位置。

具体实施方式

以下，对本发明详细地进行说明。

在本发明中，利用微生物的死菌体。也将该死菌体称为“有效成分”或“本发明的死菌体”。也将该微生物称为“本发明的微生物”。

具体而言，本发明的死菌体是本发明的微生物的菌体，是供给于使用有机溶剂进行的处理并且含有用于RNA沉默的RNA的菌体。也将使用有机溶剂进行的处理称为“有机溶剂处理”。也将用于RNA沉默的RNA称为“靶RNA”。

通过利用有效成分，具体而言，通过使目标生物摄入有效成分，而能够在目标生物中诱导RNA沉默。即，通过利用有效成分，具体而言，通过使目标生物摄入有效成分，而得到在目标生物中诱导RNA沉默的效果。也将该效果称为“RNA沉默诱导效果”。“RNA沉默”是指，根据RNA的存在而使基因的表达得到抑制的现象。作为RNA沉默，可举出RNA干扰、反义法(antisense method)。也将被RNA沉默抑制表达的基因称为“目标基因”。通过RNA沉默，例如可产生与目标基因的种类、目标基因的表达抑制的程度相应的表型。作为这样的表型，可举出目标生物的活动抑制。即，在一种方式中，通过RNA沉默，而能够抑制目标生物的活动。作为活动抑制，可举出：摄食阻碍、生长阻碍、繁殖阻碍、致死。作为通过表达抑制带来致死等活动抑制的基因，可举出编码凋亡抑制因子的基因。通过抑制目标生物的活动，例如，可消灭目标生物。即，在一种方式中，可通过RNA沉默来消灭目标生物。此外，在目标生物带来危害的情况下，通过抑制目标生物的活动，例如，可防治目标生物造成的危害。即，在一种方式中，可通过RNA沉默来防治目标生物造成的危害。作为目标生物造成的危害，可举出与目标生物的种类对应的危害。作为目标生物造成的危害，例如可举出虫害。具体而言，例如，在目标生物为农业害虫的情况下，作为目标生物造成的危害，可举出植物的虫害。就RNA沉默诱导效果而言，例如可通过将目标基因表达的降低、目标生物的表型或目标生物造成的危害的防治设为指标来进行确认。目标基因表达的降低，可通过与后述使蛋白质的活性降低的手法中基因表达的降低的确认同样的方式来进行确认。就目标基因表达的降低程度而言，只要能得到期望的结果(例如期望的表型)，就没有特别限定。就利用有效成分时目标基因表达量而言，例如可降低至不利用有效成分时的90％以下、70％以下、50％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。表型可根据表型的种类而适宜确认。例如，活动抑制可通过将目标生物的摄食量、体格大小、生存个体数、产卵数、孵化数或孵化率的减少设为指标来进行确认。目标生物的摄食量、体格大小、生存个体数、产卵数、孵化数或孵化率的减少，可分别通过对目标生物的摄食量、体格大小、生存个体数、产卵数、孵化数或孵化率进行测定来确认。作为生存个体数，具体而言，可举出每单位区域(例如，目标生物的生活区域的每单位面积或单位体积)的生存个体数。作为产卵数，具体而言，可举出每单位区域(例如，目标生物的生活区域的每单位面积或单位体积)的产卵数、每个目标生物个体的产卵数。作为孵化数，具体而言，可举出每单位区域(例如，目标生物的生活区域的每单位面积或单位体积)的孵化数、每个目标生物的个体的孵化数。危害的防治可根据危害的种类进行适宜确认。

<1>目标生物

就目标生物而言，如果能够摄入有效成分(即本发明的死菌体)，则没有特别限定。作为目标生物，可举出害虫。作为害虫，可举出：农业害虫、储粮害虫、卫生害虫、食品害虫、财产害虫、家畜害虫、令人感到不快的昆虫。

作为害虫，具体而言，可举出：鳞翅目(菜蛾科、夜蛾科、螟蛾科、卷蛾科、潜蛾科、果蛀蛾科、麦蛾科、草螟科、灯蛾科、毒蛾科等)、半翅目(叶蝉科、飞虱科、木虱科、蚜总科、粉虱科、蚧总科、盲蝽科、网蝽科、蝽科、长蝽科(Lygaeidae)等)、鞘翅目(金龟子科、叩甲科、瓢虫科、天牛科、叶甲科、象甲科等)、双翅目(家蝇科、丽蝇科、麻蝇科、花蝇科、实蝇科、禾蝇科、鸟蝇总科等)、直翅目(蝗科、斑腿蝗科(Catantopinae)、锥头蝗科等)、缨翅目(蓟马科、纹蓟马科、珠角蓟马科等)、垫刃目(滑刃科、新钩虫科(Neotylechidae)等)、弹尾目(棘跳虫科、等节跳虫科等)、螨蜱目(叶螨科、皮刺螨科、粉螨科、疥螨科等)、柄眼目(嗜黏液蛞蝓科、巴蜗牛科等)、蛔虫目(蛔虫科、异尖线虫科等)、后睾目、有壁目、蜚蠊目(匍蜚蠊科、隐尾蠊科、弯翅蠊科等)、缨尾目(衣鱼科、鳞啮虫科、土衣鱼科等)的生物。

作为鳞翅目的害虫，具体而言，可举出二化螟、稻纵卷叶螟、直纹稻弄蝶、大螟、粘虫、稻螟蛉、斜纹夜蛾、豆荚螟、紫花苜蓿荚斑螟、川豆小卷蛾(Matsumuraeses falcana)、大豆食心虫、豆扇野螟(Pleuroptya ruralis)、黄地老虎、小地老虎、甘薯麦蛾(Helcystogramma triannulella)、八字地老虎、烟夜蛾(Helicoverpa assulta)、棉铃虫、甘蓝夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、菜粉蝶、大菜粉蝶、菜心螟、黑点银纹夜蛾(Autographanigrisigna)。作为半翅目的害虫，具体而言，可举出褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱、黑尾叶蝉、电光叶蝉、赤条纤盲蝽(Stenotus rubrovittatus)、水稻盲蝽(Trigonotyluscaelestialium)、中稻缘蝽、黑须稻绿蝽、稻绿蝽、稻椿象(Lagynotomus elongatus)、稻黑蝽、北二星蝽、二星蝽(Eysarcoris lewisi)、广二星蝽、Togo臭虫(Togo hemipterus)、稻棘缘蝽、璧蝽(Piezodorus hybneri)、茶翅蝽、斑须蝽、葱蚜、禾谷缢管蚜、玉米蚜、大豆蚜。作为鞘翅目的害虫，具体而言，可举出稻水象甲、水稻负泥虫、稻象虫、角梳抓扣甲(Melanotuslegatus)、Melanotus fortnumi、古铜异丽金龟、古铜异丽金龟、日本弧丽金龟、栗色绒金龟(Maladera castanea)、墨西哥豆瓢虫、二条叶甲(Medythia nigrobilineata)、Epilachnavigintioctomaculata、茄二十八星瓢虫、异色瓢虫、红铜丽金龟(Anomala rufocuprea)、紫绿彩丽金龟(Mimela testaceipes)、黄守瓜、黄曲条跳甲。作为双翅目的害虫，具体而言，可举出稻秆潜蝇、稻潜叶蝇、麦红吸浆虫、灰地种蝇、大豆荚瘿蚊、豆秆黑潜蝇、三叶斑潜蝇、美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、番茄斑潜蝇。作为直翅目的害虫，具体而言，可举出北海道稻蝗、日本稻蝗。作为缨翅目的害虫，具体而言，可举出稻蓟马(Stenchaetothrips biformis)、棕榈蓟马。作为垫刃目的害虫，具体而言，可举出根结线虫属、线虫类、球形胞囊线虫属。作为弹尾目的害虫，具体而言，可举出Onychiurus pseudarmatus、Onychiurus matsumotoi。作为螨蜱目的害虫，具体而言，可举出麦圆蜘蛛、二斑叶螨、神泽氏叶螨、腐食酪螨、双叶跗线螨。作为柄眼目的害虫，具体而言，可举出蜗牛、蛞蝓。作为蛔虫目的害虫，具体而言，可举出蛔虫。作为后睾吸虫目的害虫，具体而言，可举出横川后殖吸虫。作为有壁目的害虫，具体而言，可举出日本血吸虫。作为蜚蠊目的害虫，具体而言，可举出德国小蠊、黑胸大蠊、美洲大蠊、樱桃红蟑螂。作为缨尾目的害虫，具体而言，可举出毛衣鱼(Ctenolepisma villosa)、家衣鱼(Lepisma saccharina)。

作为目标生物，可以将1种生物作为目标，也可以将2种或2种以上生物作为目标。

<2>有效成分及其制造

有效成分(即本发明的死菌体)通过对本发明的微生物的菌体进行有机溶剂处理获得。即，本发明提供有效成分的制造方法，所述制造方法包含对本发明的微生物的菌体进行有机溶剂处理的工序。也将该工序称为“有机溶剂处理工序”。具体而言，有机溶剂处理工序可以是，通过对本发明的微生物的菌体进行有机溶剂处理而制备有效成分的工序。

本发明的微生物的菌体通过对本发明的微生物进行培养而获得。就有效成分的制造方法而言，在有机溶剂处理工序之前，可进一步包含用培养基对本发明的微生物进行培养的工序。也将该工序称为“培养工序”。具体而言，培养工序可以是通过用培养基对本发明的微生物进行培养而制备本发明的微生物的菌体的工序。有效成分的制造方法例如可以是包含下述工序的方法：用培养基对本发明的微生物进行培养的工序；和对通过所述培养得到的菌体进行有机溶剂处理的工序。

<2-1>本发明的微生物

就本发明的微生物而言，如果能够制备有效成分(即本发明的死菌体)，则没有特别限定。有效成分含有靶RNA。因此，待进行有机溶剂处理的菌体(即本发明的微生物的菌体)含有靶RNA。因此，本发明的微生物是具有生产靶RNA的能力的微生物。本发明的微生物可以具有生产1种靶RNA的能力，也可以具有生产2种或2种以上的靶RNA的能力。同样，有效成分和待进行有机溶剂处理的菌体(即本发明的微生物的菌体)均可以含有1种靶RNA，也可以含有2种或2种以上的靶RNA。

本发明的微生物通过至少具有靶RNA的表达单元，而具有生产靶RNA的能力。即，本发明的微生物具有靶RNA的表达单元。具有靶RNA的表达单元的微生物可通过将靶RNA的表达单元导入微生物中来获得。本发明的微生物例如可通过靶RNA的表达单元的导入或通过靶RNA的表达单元的导入与其他性质的组合，而获得生产靶RNA的能力。

本发明的微生物如果具有生产靶RNA的能力，则可具有任意性质。除了包含靶RNA的表达单元的载体之外，本发明的微生物例如可以具有质粒等载体，也可以不具有。即，例如，在本发明的微生物本来具有质粒的情况下，可以将该质粒消除(除去)。此外，本发明的微生物例如可以经过修饰，以使得核糖核酸酶III(RNaseIII)的活性降低。用于构建本发明的微生物的修饰的实施顺序没有特别限定。

需要说明的是，存在将本发明的微生物或用于构建该微生物中使用的微生物称为“宿主”的情况。

<2-1-1>具有生产靶RNA的能力的微生物

“具有生产靶RNA的能力的微生物”是指，当用培养基培养时，具有表达靶RNA、在菌体内积蓄至可得到RNA沉默诱导效果的程度的能力的微生物。具有生产靶RNA的能力的微生物例如可以是能够在菌体内以1mg/L-培养液以上、2mg/L-培养液以上、5mg/L-培养液以上、10mg/L-培养液以上、20mg/L-培养液以上、50mg/L-培养液以上或100mg/L-培养液以上的量积蓄靶RNA的微生物。

作为微生物，可举出细菌、酵母。

作为细菌，可举出属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌、棒状细菌。

作为属于肠杆菌科的细菌，可举出属于埃希菌(Escherichia)属、肠杆菌(Enterobacter)属、泛菌(Pantoea)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、光杆状菌(Photorhabdus)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、沙门氏菌(Salmonella)属、摩根氏菌(Morganella)等属的细菌。具体而言，可使用根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)的数据库(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分类法归类为肠杆菌科的细菌。

作为埃希菌属细菌，没有特别限定，可举出根据微生物学专家已知的分类被归类为埃希菌属的细菌。作为埃希菌属细菌，例如可举出Neidhardt等人的著作(Backmann,B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichiacoli K-12,p.2460-2488.Table 1.In F.D.Neidhardt(ed.),Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition,American Society forMicrobiology Press,Washington,D.C.)中记载的。作为埃希菌属细菌，例如可举出大肠杆菌(Escherichia coli)。作为大肠杆菌，具体而言，例如可举出：W3110菌株(ATCC 27325)、MG1655菌株(ATCC 47076)等的大肠杆菌K-12菌株；大肠杆菌K5菌株(ATCC 23506)；BL21(DE3)菌株等大肠杆菌B菌株；和它们的派生菌株。

作为肠杆菌属细菌，没有特别限定，可举出根据微生物学专家已知的分类被归类为肠杆菌属的细菌。作为肠杆菌属细菌，例如可举出：成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。作为成团肠杆菌，具体而言，例如可举出成团肠杆菌ATCC12287菌株。作为产气肠杆菌，具体而言，例如可举出：产气肠杆菌ATCC13048菌株、NBRC12010菌株(Biotechnol Bioeng.2007Mar 27；98(2)340-348)、AJ110637菌株(FERM BP-10955)。此外，作为肠杆菌属细菌，例如可举出欧州专利申请公开EP0952221号说明书中记载的。需要说明的是，成团肠杆菌中也存在被归类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)的。

作为泛菌属细菌，没有特别限定，可举出根据微生物学专家已知的分类被归类为泛菌属的细菌。作为泛菌属细菌，例如可举出：菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。作为菠萝泛菌，具体而言，例如可举出：菠萝泛菌LMG20103菌株、AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)、SC17菌株(FERM BP-11091)、SC17(0)菌株(VKPM B-9246)和SC17sucA菌株(FERM BP-8646)。需要说明的是，肠杆菌属细菌、欧文氏菌属细菌中，也存在被重新归类为泛菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989)；Int.J.Syst.Bacteriol.,43,162-173(1993))。例如，最近，基于16S rRNA的碱基序列分析等，成团肠杆菌的一些细菌被重新归类为成团泛菌、菠萝泛菌、斯氏泛菌等(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989))。在本发明中，泛菌属细菌中也包含这样被重新归类为泛菌属的细菌。

作为欧文氏菌属细菌，可举出：解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。作为克雷伯氏菌属细菌，可举出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。

作为棒状细菌，可举出属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、分枝杆菌(Mycobacterium)属和微杆菌(Microbacterium)属等属的细菌。

作为棒状细菌，具体而言，可举出下述种类：嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋麸酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、愈伤棒杆菌(Corynebacterium callunae)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)、热产氨棒状杆菌(有效棒杆菌)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacteriumefficiens))、力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)、叉开短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum))、黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum))、Brevibacteriumimmariophilum、乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、Brevibacterium thiogenitalis、产氨棒杆菌(停滞棒杆菌)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))、白短杆菌(Brevibacterium album)、Brevibacterium cerinum、嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)。

作为棒状细菌，具体而言，可举出下述菌株：嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870；醋麸酸棒状杆菌ATCC 15806；解烷棒状杆菌ATCC 21511；愈伤棒杆菌ATCC 15991；钝齿棒杆菌AS1.542；谷氨酸棒状杆菌ATCC 13020、ATCC 13032、ATCC 13060、ATCC 13869、FERM BP-734；百合棒状杆菌ATCC 15990；栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965；有效棒杆菌(热产氨棒状杆菌)AJ12340(FERM BP-1539)；力士棒杆菌ATCC 13868；叉开短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC14020；黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 13826、ATCC 14067、AJ 12418(FERM BP-2205)；Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC13869；玫瑰色短杆菌ATCC 13825；解糖短杆菌ATCC 14066；Brevibacteriumthiogenitalis ATCC 19240；产氨棒杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC 6871、ATCC6872；白短杆菌ATCC 15111；Brevibacterium cerinum ATCC 15112；嗜氨微杆菌ATCC15354。

需要说明的是，棒状杆菌属细菌中还包含以往被归类为短杆菌属但是现在整合至棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。此外，停滞棒杆菌中还包含以往被归类为产氨棒杆菌但是根据16S rRNA的碱基序列分析等被重新归类为停滞棒杆菌的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。

酵母可以是出芽酵母，也可以是裂殖酵母。酵母可以是单倍体酵母，也可以是二倍体或二倍体以上的倍数的酵母。作为酵母，可举出属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母属、Pichia ciferrii、赛道威毕赤酵母(Pichiasydowiorum)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等的毕赤酵母属(也称为Wickerhamomyces属)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等假丝酵母菌属、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等汉逊酵母属、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母属的酵母。

这些菌株例如可从ATCC(American type culture collection)(地址12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)订购。即，给出了与各菌株对应的登录编号，可利用该登录编号而进行交易(参照http://www.atcc.org/)。与各菌株对应的登录编号记载于ATCC的目录。此外，例如，这些菌株可从保藏各菌株的保藏机关入手。

<2-1-2>靶RNA的表达单元的导入

靶RNA是用于RNA沉默的RNA。“用于RNA沉默的RNA”是指，能够在目标生物中诱导(引起)RNA沉默的RNA。作为靶RNA，可以利用1种RNA，也可以利用2种或2种以上RNA。此外，对于1种目标基因，可以利用1种靶RNA，也可以利用2种或2种以上的靶RNA。在利用2种或2种以上的靶RNA的情况下，这些靶RNA可以由单一的微生物表达，也可以由多种微生物表达。

就靶RNA而言，如果可得到RNA沉默诱导效果，则没有特别限定。靶RNA可以针对1种目标基因而诱导RNA沉默，也可以针对2种或2种以上目标基因而诱导RNA沉默。靶RNA可根据目标生物的种类、目标基因的种类、RNA沉默的方式等各种条件而适宜选择。

作为靶RNA，可举出可与从目标基因转录的RNA杂交的RNA。此外，作为靶RNA，还可举出产生可与从目标基因转录的RNA杂交的RNA的RNA。即，靶RNA例如可以是原样或适宜修饰后可与从目标基因转录的RNA杂交的RNA。具体而言，例如，在将靶RNA构建并表达为用于RNA干扰的长双链RNA(dsRNA)的情况下，由dsRNA产生短双链RNA(siRNA)，进一步从siRNA产生单链siRNA，单链siRNA与从目标基因转录的RNA杂交即可。这样的修饰，例如可在目标生物摄入有效成分之后发生。

为了所述杂交，靶RNA例如可具有与从目标基因转录的RNA的碱基序列或其部分序列互补的碱基序列。也将从目标基因转录的RNA的碱基序列称为“有义序列”。此外，也将所述互补碱基序列(即，与有义序列或其部分序列互补的碱基序列)称为“反义序列”。即，作为靶RNA，可举出具有反义序列的RNA。此外，作为靶RNA，还可举出具有反义序列的变体序列的RNA。变体序列如果可得到RNA沉默诱导效果，具体而言，例如，靶RNA如果可与从目标基因转录的RNA杂交，则没有特别限定。关于变体序列，可援用后述关于核糖核酸酶III基因的变体的记载。此外，靶RNA例如可具有选自如上所述的RNA的碱基序列的两个或两个以上碱基序列的组合。靶RNA例如可以对于1种目标基因具有2拷贝或2拷贝以上的反义序列或其变体序列。此外，靶RNA例如可以对于1种目标基因具有2种或2种以上的反义序列或其变体序列。此外，靶RNA例如可以对于2种或2种以上的目标基因具有反义序列或其变体序列。需要说明的是，除非特别说明，否则“具有碱基序列”这样的表达是指“包含碱基序列”，也包含“由碱基序列组成”的情况。即，靶RNA可以包含反义序列或其变体序列，也可以进一步包含其他碱基序列。就其他碱基序列而言，如果靶RNA可得到RNA沉默诱导效果，具体而言，例如靶RNA可与从目标基因转录的RNA杂交，则没有特别限定。

靶RNA例如可以是单链RNA(包含1分子RNA链的RNA)，也可以是双链RNA(包含2分子RNA链的RNA)。双链RNA可以是包含单一种类RNA分子的双链(同源双链)，也可以是包含2种不同RNA分子的双链(异源双链)。作为双链RNA，具体而言，例如可举出包含某个RNA链与其互补链的双链RNA。此外，靶RNA例如可以是包含1分子RNA链和1分子DNA链的双链。靶RNA可以包含单链区域和双链区域这两者。即，例如，单链RNA可以在分子内部分性地形成有双链结构(例如，茎-环结构)。此外，例如，双链RNA可以部分性地包含单链结构。在诱导RNA干扰的情况下，例如可将靶RNA构建并表达为长双链RNA(dsRNA)、短双链RNA(siRNA)等双链RNA。需要说明的是，RNA干扰中使用的RNA不一定包含2分子RNA链。即，在RNA干扰中，可利用在发夹状的短发夹RNA(shRNA)等分子内形成有双链结构的单链RNA代替双链RNA。此外，在反义法的情况下，例如可将靶RNA构建并表达为单链RNA。

靶RNA的长度没有特别限定。靶RNA的长度例如可以为20残基以上、50残基以上或100残基以上，可以为10000残基以下、5000残基以下、2000残基以下、1000残基以下或500残基以下，也可以为这些的组合。此外，靶RNA具有的反义序列或其变体序列的长度例如可以为20残基以上、50残基以上或100残基以上，可以为10000残基以下、5000残基以下、2000残基以下、1000残基以下或500残基以下，也可以为这些的组合。

“靶RNA的表达单元”是指，被构建成能够表达靶RNA的基因结构物。靶RNA的表达单元在5’至3’方向上包含在宿主中发挥功能的启动子序列和编码靶RNA的碱基序列。也将启动子序列简称为“启动子”。也将编码靶RNA的碱基序列称为“编码靶RNA的基因”或“靶RNA基因”。靶RNA基因连接在启动子的下游，使得靶RNA受到基于该启动子的控制而进行表达即可。此外，靶RNA的表达单元，可以在适当的位置具有有效的控制序列(操纵子、终止子等)以使得它们发挥功能，所述控制序列用于在宿主中使靶RNA表达。需要说明的是，在本发明中，“靶RNA基因的表达”、“靶RNA基因的转录”、“靶RNA的表达”、“靶RNA的转录”可互换使用。靶RNA的表达单元可根据靶RNA的种类、转录方式等各种条件而适宜设计。

就靶RNA的转录方式而言，如果可得到靶RNA，则没有特别限定。靶RNA基因例如可以在一个方向上(即仅将双链中的一条链作为模板)进行转录，也可以在双方向上(即将双链的各链作为模板)进行转录。在双方向上转录靶RNA基因，可通过从夹持该基因并以相反方向配置的启动子(即双链的各链中配置于该基因的5’侧的启动子)对该基因进行转录来实施。即，靶RNA的表达单元可以包含这样的两个启动子。在这种情况下，两个启动子可以相同，也可以不同。通常，通过在一个方向上转录靶RNA基因来获得单链RNA。通常，通过在双方向上转录靶RNA基因而获得双链RNA。此外，也可通过从单个表达单元转录双链RNA的各链来获得双链RNA。

靶RNA基因例如可通过克隆获得。在克隆中，可利用例如包含靶RNA基因的基因组DNA、cDNA等核酸。此外，靶RNA基因例如可通过基于该碱基序列进行全合成来获得(Gene,60(1),115-127(1987))。获得的靶RNA基因可原样或适宜修饰后利用。即，可通过对靶RNA基因进行修饰来获得所述靶RNA基因的变体。基因的修饰可通过公知的手法进行。例如，可通过位点特异性变异法将靶突变导入DNA的靶位点。作为位点特异性变异法，可举出使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.andFrits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。或者，可以全合成靶RNA基因的变体。此外，可对获得的靶RNA基因，适宜进行启动子序列的导入等修饰，获得靶RNA的表达单元。需要说明的是，靶RNA的表达单元的其他构成要素(例如，启动子序列)、整个靶RNA的表达单元也可通过与靶RNA基因同样的方式获得。

就用于使靶RNA基因表达的启动子而言，如果是在宿主中发挥功能的启动子，就没有特别限定。“在宿主中发挥功能的启动子”是指，在宿主中具有启动子活性、即基因的转录活性的启动子。启动子可以是源自宿主的启动子，也可以是异源启动子。启动子可以是靶RNA基因的固有的启动子，也可以是其他基因的启动子。此外，对于基因的表达，启动子可以是诱导性的，也可以是构成性(constitutive)的。

作为启动子，例如可举出糖酵解类、磷酸戊糖途径、TCA循环、氨基酸生合成类、细胞表层蛋白质的基因的启动子。此外，作为启动子，可以使用如下所述的强力启动子。作为在大肠杆菌等肠杆菌科的细菌中发挥功能的强力启动子，例如可举出：T7启动子、T5启动子、T3启动子、SP6启动子、F1启动子、trp启动子、trc启动子、lac启动子、tac启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpoH启动子、msrA启动子、源自双歧杆菌的Pm1启动子、PR启动子和PL启动子。此外，作为在棒状细菌中发挥功能的强力启动子，例如可举出：人为设计修饰的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000))、可用乙酸、乙醇、丙酮酸等诱导的pta、aceA、aceB、adh、amyE启动子、其它强力启动子cspB、SOD、tuf启动子(Journalof Biotechnology 104(2003)311-323,Appl Environ Microbiol.2005Dec；71(12):8587-96.)、lac启动子、tac启动子、trc启动子、F1启动子、T7启动子、T5启动子、T3启动子、SP6启动子。作为启动子，可特别举出：F1启动子、T7启动子、T5启动子、T3启动子、SP6启动子等源自噬菌体的启动子。F1启动子的碱基序列示于SEQ ID NO.17。

作为启动子，可以通过使用各种报告基因，而获得并利用常规的启动子的高活性型。例如，可通过使启动子区域内的-35、-10区域接近共有序列，而提高启动子的活性(WO00/18935)。作为高活性型启动子，可举出各种tac样启动子(Katashkina JI etal.Russian Federation Patent application 2006134574)、pnlp8启动子(WO2010/027045)。启动子的强度的评价法和强力启动子的实例记载于Goldstein等人的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中。

就启动子而言，例如可以是具有所述例举的启动子的碱基序列(例如SEQ IDNO.17的碱基序列)的启动子。此外，启动子可以是所述例举的启动子(例如具有SEQ IDNO.17的碱基序列的启动子)的保守变体。即，例如，所述例举的启动子可原样或适宜修饰后使用。用所述启动子名称指定的启动子，分别除了所述例举的启动子之外，还包含它们的保守变体。例如，“F1启动子”这样的术语是指，除了具有SEQ ID NO.17的碱基序列的启动子之外，还包含其保守变体。对于启动子的保守变体，可援用后述的核糖核酸酶III基因的保守变体有关的记载。例如，就启动子而言，如果保持原始功能，则可以是具有相对于SEQ IDNO.17的碱基序列具有同源性的碱基序列的启动子，所述同源性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上。需要说明的是，启动子的“原始功能”是指，在给定的条件下表达与其紧接的下游连接的基因的功能。“给定的条件下”是指，原始启动子能够表达与其紧接的下游连接的基因的条件。启动子的保守变体例如可以具有原始启动子的80％以上、90％以上或100％以上的转录活性。就基因的表达的有无、强度(转录活性)而言，例如可使用报告基因来进行确认。

靶RNA基因的下游可配置用于终止转录的终止子。就终止子而言，如果是在宿主中发挥功能的终止子，则没有特别限定。终止子可以是源自宿主的终止子，也可以是异源终止子。终止子可以是靶RNA基因固有的终止子，也可以是其他基因的终止子。作为终止子，具体而言，例如可举出：噬菌体BFK20的终止子、T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子和trpA终止子。

关于可在各种微生物中利用的载体、启动子、终止子，例如详细记载于“微生物学基础讲座8基因工程，共立出版，1987年”中并且可利用它们。

将靶RNA的表达单元导入宿主的手法没有特别限定。“靶RNA的表达单元的导入”是指，将靶RNA的表达单元保持在宿主中，具体而言，可以是将靶RNA基因以可表达的方式导入宿主中。除非特别说明，否则，“靶RNA的表达单元的导入”不仅包含将预先构建的靶RNA的表达单元一并导入宿主的情况，还包含至少将靶RNA基因导入宿主，并且在宿主内构建靶RNA的表达单元的情况。在本发明的微生物中，靶RNA的表达单元可以存在于质粒等在染色体外进行自主复制的载体上，也可以整合在染色体上。即，本发明的微生物例如可以在载体上具有靶RNA的表达单元，换而言之，可以具有包含靶RNA的表达单元的载体。此外，本发明的微生物例如可以在染色体上具有靶RNA的表达单元。本发明的微生物可以仅具有1拷贝的靶RNA的表达单元，也可以具有2或2以上拷贝。就本发明的微生物具有的靶RNA的表达单元的拷贝数而言，例如可以为5拷贝/cell以上、10拷贝/cell以上、20拷贝/cell以上、30拷贝/cell以上、50拷贝/cell以上、70拷贝/cell以上、100拷贝/cell以上、150拷贝/cell以上、200拷贝/cell以上、300拷贝/cell以上、500拷贝/cell以上或1000拷贝/cell以上，可以为2000拷贝/cell以下、1500拷贝/cell以下、1000拷贝/cell以下、500拷贝/cell以下或300拷贝/cell以下，也可以为这些的不矛盾的组合。本发明的微生物可以仅具有1种靶RNA的表达单元，也可以具有2种或2种以上的靶RNA的表达单元。靶RNA的表达单元的拷贝数和种类，可分别称为靶RNA基因的拷贝数和种类。在本发明的微生物具有两个或两个以上的靶RNA的表达单元的情况下，这些表达单元以能够制造靶RNA的方式保持在本发明的微生物中即可。例如，这些表达单元可以全部保持在单个表达载体上，也可以全部保持在染色体上。此外，这些表达单元可以分别保持在多个表达载体上，也可以分别保持在染色体与单个或多个表达载体上。

就靶RNA的表达单元，例如可使用包含靶RNA的表达单元的载体导入宿主。也将包含靶RNA的表达单元的载体称为“靶RNA的表达载体”。就靶RNA的表达载体而言，例如可通过使靶RNA的表达单元与载体连接来进行构建。此外，例如，在载体具备在宿主中发挥功能的启动子的情况下，靶RNA的表达载体也可通过将靶RNA基因连接至该启动子的下游来进行构建。可以通过用靶RNA的表达载体对宿主进行转化，而得到导入了该载体的转化体，即，可以将靶RNA的表达单元导入宿主中。作为载体，可使用可在宿主的细胞内自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。就载体的拷贝数而言，例如可以为5拷贝/cell以上、10拷贝/cell以上、20拷贝/cell以上、30拷贝/cell以上、50拷贝/cell以上、70拷贝/cell以上、100拷贝/cell以上、150拷贝/cell以上、200拷贝/cell以上、300拷贝/cell以上、500拷贝/cell以上或1000拷贝/cell以上，可以为2000拷贝/cell以下、1500拷贝/cell以下、1000拷贝/cell以下、500拷贝/cell以下或300拷贝/cell以下，也可以为这些的不矛盾的组合。此外，为了选择转化体，而优选载体具有抗生素抗性基因、营养缺陷型互补基因等标记。此外，载体可以具备用于表达***的基因的启动子、终止子。例如，载体可以是源自细菌质粒的载体、源自酵母质粒的载体、源自噬菌体的载体、粘粒或噬菌粒等。作为可在大肠杆菌等肠杆菌科的细菌中自主复制的载体，具体而言，例如可举出：pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(均可从TAKARABIO公司入手)、pACYC184、pMW219(NIPPONGENE公司)、pTrc99A(PHARMACIA公司)、pPROK类载体(CLONTECH公司)、pKK233-2(CLONTECH公司制)、pET类载体(NOVAGEN公司)、pQE类载体(QIAGEN公司)、pACYC、L4440(US2017-0137841)、广泛宿主范围型载体RSF1010。作为可在棒状细菌中自主复制的载体，具体而言，例如可举出：pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；对这些进行了改良并且具有耐药性基因的质粒；pCRY30(日本特开平3-210184)；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX(日本特开平2-72876、美国专利5,185,262号)；pCRY2和pCRY3(日本特开平1-191686)；pAJ655、pAJ611和pAJ1844(日本特开昭58-192900)；pCG1(日本特开昭57-134500)；pCG2(日本特开昭58-35197)；pCG4和pCG11(日本特开昭57-183799)；pPK4(美国专利6,090,597)；pVK4(日本特开平9-322774)；pVK7(日本特开平10-215883)；pVK9(US2006-0141588)；pVC7(日本特开平9-070291)；pVS7(WO2013/069634)。此外，作为可在棒状细菌中自主复制的载体，具体而言，例如还可举出作为pVC7的变体的pVC7H2(本申请实施例)。

此外，靶RNA的表达单元，例如可使用人工转座子等转座子导入宿主的染色体上。在使用转座子的情况下，通过同源重组或其自身的转座能力而将靶RNA的表达单元导入染色体上。此外，靶RNA的表达单元可通过其它利用同源重组的导入法而导入宿主的染色体上。作为利用同源重组的导入法，例如可举出使用直链状DNA、包含温度敏感性复制起点的质粒、可接合转移的质粒或没有在宿主内发挥功能的复制起点的***载体等的方法。靶RNA的表达单元，可以仅导入1拷贝，也可以导入2拷贝或2拷贝以上。例如，可通过将染色体上存在多个拷贝的序列作为标靶进行同源重组，而向染色体导入靶RNA的表达单元的多个拷贝。作为染色体上存在多个拷贝的序列，可举出重复DNA序列(repetitive DNA)、存在于转座子的两端的反向重复。此外，可以至少将靶RNA基因导入染色体上，在染色体上构建靶RNA的表达单元。例如，可通过将靶RNA导入宿主染色体上的启动子序列的下游，而在染色体上构建靶RNA的表达单元。需要说明的是，靶RNA基因等靶RNA的表达单元的一部分向染色体中的导入，也能够以与靶RNA的表达单元整体导入染色体同样的方式进行。

可通过下述方式确认染色体上导入有靶RNA的表达单元，例如，使用了具有与该表达单元的全部或一部分互补的碱基序列的探针的Southern杂交或使用了基于该表达单元的碱基序列而制成的引物的PCR。

转化的方法没有特别限定，可使用通常使用的方法，例如，原生质体法(Gene,39,281-286(1985))、电穿孔法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))、电脉冲法(日本特开平2-207791号公报)等。

<2-1-3>核糖核酸酶III的活性降低

可以对本发明的微生物进行修饰，以使得核糖核酸酶III(RNaseIII)的活性降低。具体而言，可以对本发明的微生物进行修饰，以使得与未修饰株相比核糖核酸酶III的活性降低。核糖核酸酶III的活性例如可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。即，例如，可以对本发明的微生物进行修饰，以使得核糖核酸酶III的活性缺损(消失)。希望通过以使得核糖核酸酶III的活性降低的方式对微生物进行修饰，而能够提高该微生物生产靶RNA的能力，即，能够使该微生物带来的靶RNA的生产提高。

以下，对核糖核酸酶III及编码该核糖核酸酶III的基因进行说明。

“核糖核酸酶III”是指，具有对剪切双链RNA等特定RNA的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 3.1.26.3)。也将该活性称为“核糖核酸酶III活性”。此外，也将编码核糖核酸酶III的基因称为“核糖核酸酶III基因”。

作为核糖核酸酶III基因，可举出rnc基因。也将rnc基因编码的蛋白质(核糖核酸酶III)称为“Rnc蛋白质”。

微生物具有的rnc基因等核糖核酸酶III基因的碱基序列和这些基因编码的Rnc蛋白质等核糖核酸酶III的氨基酸序列，例如可从NCBI(National Center forBiotechnology Information)等公开数据库获得。分别将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869菌株的rnc基因的碱基序列和该基因编码的Rnc蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO.30和31。即，核糖核酸酶III基因，例如可以是具有所述例举的核糖核酸酶III基因的碱基序列(例如SEQ ID NO.30表示的碱基序列)的基因。此外，核糖核酸酶III例如可以是具有所述例举的核糖核酸酶III的氨基酸序列(例如SEQ ID NO.31表示的氨基酸序列)的蛋白质。需要说明的是，除非特别说明，否则“具有(氨基酸或碱基)序列”这样的表述意味着“包含(氨基酸或碱基)序列”，也包含“由(氨基酸或碱基)序列组成”的情况。

如果保持原始功能，则核糖核酸酶III基因可以是所述例举的核糖核酸酶III基因(例如，具有SEQ ID NO.30表示的碱基序列的基因)的变体。同样，如果保持原始功能，则核糖核酸酶III可以是所述例举的核糖核酸酶III(例如，具有SEQ ID NO.31表示的氨基酸序列的蛋白质)的变体。有时也将这样的保持原始功能的变体称为“保守变体”。在本发明中，“rnc基因”这样的术语不限于所述例举的rnc基因，还包含rnc基因的保守变体。同样，“Rnc蛋白质”这样的术语不限于所述例举的Rnc蛋白质，还包含Rnc蛋白质的保守变体。作为保守变体，例如可举出：所述例举的核糖核酸酶III基因、核糖核酸酶III的同源物、人为修饰体。

“保持原始功能”是指，基因或蛋白质的变体具有与原始基因或蛋白质的功能(活性、性质)对应的功能(活性、性质)。即，在核糖核酸酶III基因的情况下，“保持原始功能”是指基因的变体编码保持了原始功能的蛋白质(即具有核糖核酸酶III活性的蛋白质)。此外，在核糖核酸酶III的情况下，“保持原始功能”是指蛋白质的变体具有核糖核酸酶III活性。

核糖核酸酶III活性可通过下述方式测定：将酶与作为其基质的RNA(例如双链RNA)进行培养(Incubate)并对酶依赖性的RNA的切割进行测定。具体而言，核糖核酸酶III的活性测定，通常以下述方式进行(Methods Enzymol.2001；342:143-58.)。一个方法是，将酶(例如，由细胞(菌体)得到的粗提取液或将其部分纯化得到的酶)添加至用³H标记了的聚(A-U)的合成基质(双链状态)中，在35℃下进行反应，对该反应液进行三氯乙酸处理，对沉淀部分(包含高分子量的核酸)中放射性(radioactivity)随反应时间而降低的程度进行测定。即，可将放射性降低的程度作为基质切割的指标而计算核糖核酸酶III的活性。此外，另一个方法是，将用³²P放射性标记了的双链RNA作为基质，并将其添加至包含酶的反应液(30mM Tris-HCl(pH8.0),250mM谷氨酸钾或160mM NaCl，5mM亚精胺，0.1mM EDTA,0.1mMDTT)中，在37℃下保温5分钟后，添加最终浓度10mM的MgCl₂并开始RNA分解反应，适宜反应后，向其中添加等量的EDTA-电泳用标记色素混合液(使得EDTA的最终浓度变为20mM以上的浓度)，使反应停止。接着，将反应后的样品在包含7M尿素的TBE缓冲液(89mM Tris/Tris-硼酸,2mM EDTA)中进行使用了15％(w/v)改性聚丙烯酰胺凝胶的电泳，将该凝胶应用于放射线图像分析装置，对分解了的RNA的片段进行分析，从而能够检测核糖核酸酶III的活性。

以下，对保守变体举例说明。

就核糖核酸酶III基因的同源物或核糖核酸酶III的同源物而言，例如，可通过BLAST检索、FASTA检索容易地从公开数据库获得，所述BLAST检索、FASTA检索中使用了所述例举的核糖核酸酶III基因的碱基序列或所述例举的核糖核酸酶III的氨基酸序列作为查询序列。此外，核糖核酸酶III基因的同源物例如可通过PCR获得，所述PCR中使用了棒状细菌等微生物的染色体作为模板，并且使用了基于这些公知的核糖核酸酶III基因或其周边区域的碱基序列而制备的寡核苷酸作为引物。

如果保持原始功能，则核糖核酸酶III基因可以是编码具有氨基酸序列的蛋白质的基因，所述氨基酸序列在所述例举的核糖核酸酶III的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.31表示的氨基酸序列)中在1个或者数个位置上1个或数个的氨基酸发生了取代、缺失、***和/或添加。需要说明的是，所述“1个或数个”根据氨基酸残基在蛋白质的三维结构中的位置、氨基酸残基的种类而不同，具体而言，例如为1～50个、1～40个、1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～5个、特别优选为1～3个。

所述1个或数个氨基酸的取代、缺失、***和/或添加，是蛋白质的功能保持正常的保守性突变。代表性的保守性突变为保守性取代。在取代部位为芳香族氨基酸的情况下，保守性取代是在Phe、Trp、Tyr间相互取代的变异，在取代部位为疏水性氨基酸的情况下，保守性取代是在Leu、Ile、Val间相互取代的变异，在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互取代，在为碱基性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互取代，在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互取代，在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互取代。作为被认为是保守性取代的取代，具体而言，可举出：从Ala向Ser或Thr的取代、从Arg向Gln、His或Lys的取代、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代、从Asp向Asn、Glu或Gln的取代、从Cys向Ser或Ala的取代、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代、从Gly向Pro的取代、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的取代、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的取代、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的取代、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代、从Ser向Thr或Ala的取代、从Thr向Ser或Ala的取代、从Trp向Phe或Tyr的取代、从Tyr向His、Phe或Trp的取代和从Val向Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、***或添加中，包含基因来源的微生物的个体差异、物种差异的情况下天然产生的变异(mutant或variant)所引起的氨基酸的取代、缺失、***或添加。

此外，如果保持原始功能，则核糖核酸酶III基因可以是编码下述蛋白质的基因，所述蛋白质具有相对于所述例举的核糖核酸酶III的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.31表示的氨基酸序列)整体具有80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上的同源性的氨基酸序列。需要说明的是，在本说明书中，“同源性”(homology)是指“同一性”(identity)。

此外，如果保持原始功能，则核糖核酸酶III基因可以是在严格条件下与所述例举的核糖核酸酶III基因的碱基序列(例如，SEQ ID NO.30表示的碱基序列)的互补序列或可由该互补序列制备的探针进行杂交的DNA。“严格条件”是指，形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。可举出：同源性高的DNA，例如具有80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上的同源性的DNA彼此杂交，比这些同源性低的DNA彼此不杂交的条件、或作为通常的Southern杂交的洗涤条件的：在60℃，1×SSC，0.1％SDS；优选为60℃，0.1×SSC，0.1％SDS；更优选为68℃，0.1×SSC，0.1％SDS相当的盐浓度和温度下，进行1次，优选2～3次洗涤的条件。

所述探针例如可以是基因的互补序列的一部分。这样的探针可通过将基于公知的基因碱基序列而制备的寡核苷酸作为引物、将包含这些碱基序列的DNA片段作为模板的PCR来进行制备。作为探针，例如可使用约300bp长度的DNA片段。在这种情况下，作为杂交的洗涤条件，可举出50℃，2×SSC，0.1％SDS。

此外，由于密码子的简并性根据宿主而不同，因此，核糖核酸酶III基因可以是任意的密码子被与其等价的密码子取代而得的基因。即，核糖核酸酶III基因可以是因遗传密码的简并而产生的所述例举的核糖核酸酶III基因的变体。

两个序列间的序列同一性的百分比，例如可使用数学算法确定。作为这样的数学算法的非限制性实例，可举出：Myers and Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法、Smith etal(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的检索类似性的方法、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中记载的被改良了的Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法。

可利用基于这些数学算法的程序，进行用于确定序列同一性的序列比较(比对)。程序可通过计算机适当地执行。作为这样的程序，没有特别限定，可举出：PC/Gene程序的CLUSTAL(可从Intelligenetics,Mountain View,Calif.入手)、ALIGN程序(Version 2.0)以及Wisconsin Genetics Software Package,Version 8(可从Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA入手)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用了这些程序的比对，例如可使用初始参数进行。对于CLUSTAL程序，在Higginset al.(1988)Gene 73:237-244，Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153、Corpet etal.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90，Huang et al.(1992)CABIOS 8:155-65和Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331中进行了详细记载。

具体而言，例如可使用BLASTN程序在分数＝100，字长＝12下进行BLAST核苷酸检索，以获得具有与编码靶蛋白的核苷酸序列的同源性的核苷酸序列。具体而言，例如可使用BLASTX程序在分数＝50，字长＝3下进行BLAST蛋白质检索，以获得具有与靶蛋白的同源性的氨基酸序列。关于BLAST核苷酸检索、BLAST蛋白质检索，参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。此外，以比较为目的，可利用Gapped BLAST(BLAST 2.0)以获得带有间隔的比对。此外，可利用PSI-BLAST(BLAST 2.0)进行反复检索来检测序列间的间隔关系。关于Gapped BLAST和PSI-BLAST，参照Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。在利用BLAST、Gapped BLAST或PSI-BLAST的情况下，例如，可使用各程序(例如，对于核苷酸序列为BLASTN，对于氨基酸序列为BLASTX)的初始参数。比对也可以手动进行。

就两个序列间的序列同一性而言，当排列两个序列以获得最大一致时，作为两个序列间一致的残基的比例进行计算。需要说明的是，具体而言，除非特别说明，否则氨基酸序列间的“同一性”可意味着，通过blastp使用默认设定的Scoring Parameters(Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11,Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional scorematrix adjustment)而计算得到的氨基酸序列间的同一性。此外，具体而言，除非特别说明，否则碱基序列间的“同一性”可意味着，通过blastn使用默认设定的Scoring Parameters(Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear)而计算得到的碱基序列间的同一性。

需要说明的是，与所述的基因、蛋白质的变体有关的记载，可应用于其它任意蛋白质、靶RNA和编码它们的基因。

以下，对使核糖核酸酶III等蛋白质(酶)的活性降低的手法进行说明。

“蛋白质的活性降低”是指，与未修饰株相比，该蛋白质的活性降低。具体而言，“蛋白质的活性降低”是指，与未修饰株相比，每个细胞的该蛋白质的活性降低。此处所说的“未修饰株”是指，未进行使靶蛋白的活性降低的修饰的对照菌株。作为未修饰株，可举出野生菌株、亲本菌株。作为未修饰株，具体而言，可举出各微生物种类的标准菌株(typestrain)。此外，作为未修饰株，具体而言，还可举出微生物的说明中例举的菌株。即，在一种方式中，蛋白质的活性可以相比于标准菌株(即属于本发明的微生物的菌种的标准菌株)而降低。此外，在另一种方式中，蛋白质的活性可以相比于谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032菌株而降低。此外，在另一种方式中，蛋白质的活性可以相比于谷氨酸棒状杆菌2256菌株(ATCC13869)而降低。需要说明的是，“蛋白质的活性降低”还包含该蛋白质的活性完全消失的情况。更具体而言，“蛋白质的活性降低”可意味着，与未修饰株相比，每个细胞的该蛋白质的分子数降低和/或该蛋白质的每个分子的功能降低。即，“蛋白质的活性降低”中的“活性”不仅指蛋白质的催化剂活性，还可意味着编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)。需要说明的是，“每个细胞的蛋白质的分子数降低”还包含该蛋白质完全不存在的情况。此外，“蛋白质的每个分子的功能降低”还包含该蛋白质的每个分子的功能完全消失的情况。就蛋白质活性降低程度而言，如果与未修饰株相比蛋白质的活性降低，则没有特别限定。蛋白质的活性例如可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如可通过使编码该蛋白质的基因的表达降低来达成。“基因的表达降低”是指，与未修饰株相比，该基因的表达降低。具体而言，“基因的表达降低”是指，与未修饰株相比，每个细胞的该基因的表达量降低。更具体而言，“基因的表达降低”可意味着，基因的转录量(mRNA量)降低和/或基因的翻译量(蛋白质的量)降低。“基因的表达降低”还包含该基因完全不表达的情况。需要说明的是，也将“基因的表达降低”称为“基因的表达弱化”。基因的表达例如可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

基因表达的降低例如可以归因于转录效率的降低，可以归因于翻译效率的降低，也可以归因于它们的组合。就基因表达的降低而言，例如可通过对基因的启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合部位(RBS))、RBS与起始密码子之间的间隔区域等表达调控序列进行修饰来达成。在对表达调控序列进行修饰的情况下，优选修饰表达调控序列的1碱基以上，更优选修饰2碱基以上，特别优选修饰3碱基以上。就基因的转录效率的降低而言，例如，可通过用较弱的启动子取代染色体上的基因的启动子来达成。“较弱的启动子”是指，基因的转录比原本存在的野生型的启动子弱的启动子。作为较弱的启动子，例如可举出诱导型启动子。即，诱导型启动子可在非诱导条件下(例如，没有诱导物质的情况下)作为较弱的启动子发挥功能。此外，可以使表达调控序列的一部分或全部缺失。此外，基因表达的降低例如还可通过操作与表达控制有关的因子来达成。作为与表达控制有关的因子，可举出：与转录、翻译控制有关的低分子(诱导物质、阻碍物质等)、蛋白质(转录因子等)、核酸(siRNA等)等。此外，基因表达的降低，例如还可通过在基因编码区域中导入使基因的表达降低的变异来达成。例如，可通过将基因编码区域的密码子替换成宿主中利用频率较低的同义密码子而使基因的表达降低。此外，例如，可通过后述的基因的破坏而使基因的表达本身降低。

此外，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如可通过破坏编码该蛋白质的基因来达成。“基因被破坏”是指，该基因经过了修饰，以使得不产生正常发挥功能的蛋白质。“不产生正常发挥功能的蛋白质”还包含，完全不从该基因产生蛋白质的情况、从该基因产生每个分子的功能(活性、性质)降低或消失了的蛋白质的情况。

基因的破坏，例如可通过使染色体上的基因缺失(缺损)来达成。“基因的缺失”是指，基因编码区域的一部分或全部的区域的缺失。此外，可以包含染色体上的基因编码区域前后的序列而使整个基因缺失。基因编码区域前后的序列，例如可包含基因的表达调控序列。如果能达成蛋白质活性的降低，则缺失的区域可以是N末端区域(编码蛋白质N末端侧的区域)、内部区域、C末端区域(编码蛋白质C末端侧的区域)等任一区域。通常，缺失的区域较长的情况下能够可靠地使基因失活。就缺失的区域而言，例如可以是基因编码区域总长的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的长度的区域。此外，优选缺失的区域前后的序列的阅读框不一致。可通过阅读框的不一致而使缺失的区域的下游发生移码。

此外，就基因的破坏而言，例如可通过在染色体上的基因编码区域中导入氨基酸取代(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)或导入1～2个碱基的添加或缺失(移码变异)等来达成(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997),Proceedings ofthe National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998),Journal of BiologicalChemistry 26 116,20833-20839(1991))。

此外，就基因的破坏而言，例如还可通过在染色体上的基因编码区域中***其他碱基序列来达成。虽然***部位可以是基因的任一区域，但是***的碱基序列较长的情况下能够可靠地使基因失活。此外，优选***部位前后的序列的阅读框不一致。可通过阅读框的不一致而使***部位的下游发生移码。作为其他碱基序列，如果是使编码的蛋白质的活性降低或消失的，则没有特别限定，例如可举出：抗生素抗性基因等标记基因、对于目标物质的生产有用的基因。

特别是，可实施基因的破坏，以使得编码的蛋白质的氨基酸序列缺失(缺损)。换而言之，使蛋白质的活性降低的修饰，可通过例如使蛋白质的氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)缺失来达成，具体而言，通过对基因进行修饰以编码氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)发生了缺失的蛋白质来达成。需要说明的是，“蛋白质氨基酸序列的缺失”是指，蛋白质的氨基酸序列的一部分或全部的区域的缺失。此外，“蛋白质氨基酸序列的缺失”是指，蛋白质中原始氨基酸序列消失，还包含原始氨基酸序列变为其他氨基酸序列的情况。即，例如，通过移码变为其他氨基酸序列的区域可以被视为发生了缺失的区域。虽然通过氨基酸序列的缺失，通常可使蛋白质的总长度缩短，但是也存在蛋白质的总长度不变或延长的情况。例如，可通过基因编码区域的一部分或全部的区域的缺失，而使编码的蛋白质的氨基酸序列中该缺失的区域所编码的区域缺失。此外，例如，可通过向基因编码区域导入终止密码子，而使编码的蛋白质的氨基酸序列中该导入部位下游区域所编码的区域缺失。此外，例如，可通过基因编码区域中的移码，而使该移码部位编码的区域缺失。关于氨基酸序列的缺失中缺失的区域的位置和长度，可援用基因的缺失中缺失的区域的位置和长度的说明。

对染色体上的基因进行如上所述的修饰可通过下述方式达成，例如，制备以使其不产生正常发挥功能的蛋白质的方式进行了修饰的破坏型基因，用包含该破坏型基因的重组DNA对宿主进行转化，引起破坏型基因与染色体上的野生型基因之间的同源重组，从而将染色体上的野生型基因用破坏型基因取代。此时，重组DNA根据宿主的营养缺陷型等性质而包含标记基因时容易操作。作为破坏型基因，可举出：缺失了基因编码区域的一部分或全部的区域的基因、导入了错义突变的基因、导入了无义突变的基因、导入了移码变异的基因、***了转座子、标记基因等***序列的基因。同源重组中使用的重组DNA的结构，如果是以期望的方式发生同源重组的，则没有特别限定。例如，可通过用包含破坏型基因并且两端分别具备染色体上的野生型基因的上游和下游的序列的线状DNA对宿主进行转化，分别在野生型基因的上游和下游发生同源重组，而能够一步将野生型基因用破坏型基因取代。由破坏型基因编码的蛋白质即使产生，也具有与野生型蛋白质不同的三维结构，其功能降低或消失。已确立了这样的利用了同源重组的基因取代引起的基因破坏，并且有下述方法：被称为“Red-driven integration”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))、组合了Red-driven integration法和源自λ噬菌体的切除系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号)等使用直链状DNA的方法、使用包含温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的***载体的方法等(美国专利第6303383号，日本特开平05-007491号)。

此外，使蛋白质的活性降低的修饰，例如可通过突变处理进行。作为突变处理，可举出X射线的照射、紫外线的照射和基于N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)等变异剂的处理。

需要说明的是，在蛋白质作为包含多个亚基的复合体而发挥功能的情况下，只要其结果是蛋白质的活性降低，就可以修饰所有这些亚基，也可以仅修饰一部分。即，例如，可以破坏所有编码这些亚基的多个基因，也可以仅破坏一部分。此外，在蛋白质中存在多个同工酶的情况下，只要其结果是蛋白质的活性降低，就可以使所有同工酶的活性降低，也可以仅使一部分的活性降低。即，例如可以破坏所有编码这些同工酶的多个基因，也可以仅破坏一部分。

如上所述的使蛋白质的活性降低的手法可以单独使用，也可以任意组合使用。

蛋白质的活性降低，可通过对该蛋白质的活性进行测定来确认。

蛋白质的活性降低可也通过确认编码该蛋白质的基因的表达降低来进行确认。基因的表达降低可通过下述方式确认：确认该基因的转录量降低、确认从该基因表达的蛋白质的量降低。

基因的转录量降低的确认，可通过将从该基因转录的mRNA的量与未修饰株进行比较来进行。作为评价mRNA的量的方法，可举出：Northern杂交、RT-PCR、微阵列、RNA-Seq等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual/Third Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor(USA),2001)。mRNA的量(例如，每个细胞的mRNA的分子数)例如可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

蛋白质的量降低的确认，可使用抗体并通过蛋白质印迹法进行(Sambrook,J.,etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual/Third Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。蛋白质的量(例如，每个细胞的蛋白质的分子数)例如可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

基因被破坏可通过下述方式确认：根据破坏中使用的手段，对该基因的一部分或全部的碱基序列、限制酶图谱或总长等进行确定。

所述使蛋白质的活性降低的手法不限于核糖核酸酶III的活性降低，可利用任意的蛋白质的活性降低和任意的基因的表达降低。

<2-2>有效成分的制造

<2-2-1>培养

通过对本发明的微生物进行培养，而得到本发明的微生物的菌体。

就本发明的微生物而言，例如可根据细菌等微生物的培养中通常使用的培养条件进行培养。就本发明的微生物而言，例如可用含有碳源、氮源、无机离子的通常的培养基进行培养。此外，例如可根据需要而添加维生素、氨基酸等有机微量营养素。

作为碳源，例如可使用葡萄糖和蔗糖这样的碳水化合物类、乙酸这样的有机酸类、醇类、其它。作为氮源，例如可使用氨气、氨水、铵盐、其它。作为无机离子，例如可根据需要而适宜使用钙离子、镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子等。就培养而言，例如可在pH5.0～8.5、15℃～37℃的适当的范围内在有氧条件下进行10小时～120小时。此外，可参照使用细菌等微生物的L-氨基酸生产中的培养条件、使用细菌等微生物的蛋白质的分泌生产法中的培养条件(WO01/23591、WO2005/103278、WO2013/065869、WO2013/065772、WO2013/118544、WO2013/062029等)。此外，在将诱导型启动子用于靶RNA的表达的情况下，可适当地诱导靶RNA的表达。

通过在这样的条件下对本发明的微生物进行培养，而使靶RNA被转录并积蓄在菌体内，即，得到含有靶RNA的菌体。

靶RNA的表达和积蓄可通过下述方式确认，例如，将包含菌体提取物的部分作为样品进行电泳，对与靶RNA的分子量相当的条带进行检测。

<2-2-2>有机溶剂处理

通过对本发明的微生物的菌体进行有机溶剂处理，而得到有效成分(即本发明的死菌体)。

具体而言，例如，通过对本发明的微生物的菌体进行有机溶剂处理，而能够使菌体死亡，从而得到有效成分。即，待进行有机溶剂处理的菌体可以是活菌体。菌体的死亡程度如果根据有效成分的用途在允许的范围内，则没有特别限定。可实施有机溶剂处理，以使得例如细胞存活率变为1×10^-5以下、1×10^-6以下、1×10^-7以下或1×10^-8以下。“细胞存活率”可意味着，有机溶剂处理后的活菌数与有机溶剂处理前的活菌数之比。“有机溶剂处理前”如果是实施有机溶剂处理之前的时间点，并且，是本发明的微生物的菌体死亡之前的时间点，则没有特别限定。具体而言，“有机溶剂处理前”可意味着例如有机溶剂处理开始时。就菌体的死亡而言，例如可通过对有机溶剂处理后的反应液进行培养来确认。具体而言，菌体的死亡例如可通过将有机溶剂处理后的反应液接种至固体培养基中，对菌落的出现的有无或程度进行确认来确认。即，活菌数例如可作为菌落形成单元(colony forming unit；cfu)进行测定。

菌体可以在包含于培养液中的状态下进行有机溶剂处理，也可以从培养液回收并进行有机溶剂处理。菌体可以进行适宜的浓缩、稀释、洗涤、悬浮等处理之后进行有机溶剂处理。这些处理如果不损害RNA沉默诱导效果，则没有特别限定。这些处理可单独实施或适宜组合实施。即，作为待进行有机溶剂处理的菌体，可举出：含有菌体的培养物、从该培养物回收的菌体、它们的处理产物。这些方式的菌体可单独使用或适宜组合使用。

从培养液中回收菌体的手法没有特别限制，例如可利用公知的手法。作为这样的手法，例如可举出：自然沉淀、离心分离、过滤。此外，可以利用絮凝剂(flocculant)。这些手法可单独使用或适宜组合使用。回收的菌体可使用适当的介质适宜进行洗涤。此外，回收的菌体可使用适当的介质适宜进行重新悬浮。作为可在洗涤、悬浮中利用的介质，例如可举出：水、水性缓冲液等水性介质(水性溶剂)。

有机溶剂处理可通过使菌体与有机溶剂接触来实施。也将实施有机溶剂处理的体系(例如，含有菌体和有机溶剂的悬浮液)称为“反应液”。有机溶剂处理的条件(例如，有机溶剂的种类、浓度，菌体的浓度，有机溶剂处理的时间，有机溶剂处理的温度，有机溶剂处理的pH)如果不损害RNA沉默诱导效果，并且能够使菌体死亡，则没有特别限定。

作为有机溶剂，可适宜选择对本发明的微生物显示出灭菌能力的。作为有机溶剂，可举出：醇类、醚类、酯类、醛类、酮类、烷烃类、酚类。作为醇，可举出乙醇、甲醇。作为有机溶剂，可以使用1种有机溶剂，也可以组合使用2种或2种以上有机溶剂。就反应液中的有机溶剂的浓度而言，例如可以为30％(v/v)以上、40％(v/v)以上、50％(v/v)以上、60％(v/v)以上、70％(v/v)以上、80％(v/v)以上、90％(v/v)以上或95％(v/v)以上，并且可以为99％(v/v)以下、97％(v/v)以下、95％(v/v)以下、90％(v/v)以下、80％(v/v)以下、70％(v/v)以下、60％(v/v)以下或50％(v/v)以下，也可以为这些的不矛盾的组合。就反应液中的有机溶剂的浓度而言，具体而言，例如可以为30％(v/v)～99％(v/v)、40％(v/v)～99％(v/v)或50％(v/v)～99％(v/v)。就反应液中的有机溶剂的浓度而言，在有机溶剂为乙醇的情况下，例如可以为30％(v/v)以上，特别可以为50％(v/v)以上。就反应液中的有机溶剂的浓度而言，在有机溶剂为甲醇的情况下，例如可以为50％(v/v)以上，特别可以为70％(v/v)以上。

就反应液中的菌体的浓度(例如，有机溶剂处理开始时的反应液中活菌体的浓度)而言，例如可以为1×10⁶cells/mL以上、1×10⁷cells/mL以上、1×10⁸cells/mL以上、1×10⁹cells/mL以上或1×10¹⁰cells/mL以上，可以为1×10¹²cells/mL以下、1×10¹¹cells/mL以下、1×10¹⁰cells/mL以下、1×10⁹cells/mL以下或1×10⁸cells/mL以下，可以为这些的不矛盾的组合。具体而言，反应液中的菌体的浓度(例如，有机溶剂处理开始时的反应液中活菌体的浓度)例如可以为1×10⁷cells/mL～1×10¹¹cells/mL。

反应液可以由菌体和有机溶剂组成，也可以含有其他成分。作为其他成分，可举出水、水性缓冲液等水性介质(水性溶剂)。

就有机溶剂处理的时间而言，例如可以为1分钟以上、2分钟以上、3分钟以上、5分钟以上、10分钟以上或20分钟以上，可以为2小时以下、1小时以下、30分钟以下、20分钟以下、10分钟以下或5分钟以下，可以为这些的不矛盾的组合。具体而言，有机溶剂处理的时间例如可以为1分钟～20分钟。就有机溶剂处理的温度而言，例如可以为10℃以上、20℃以上或30℃以上，可以为50℃以下、40℃以下、30℃以下或20℃以下，可以为这些的不矛盾的组合。具体而言，有机溶剂处理的温度例如可以为20℃～30℃。通常，有机溶剂处理的温度可以为室温。有机溶剂处理的pH例如可以为5～9或6～8。就有机溶剂处理而言，例如可以在静置状态下实施，也可以在搅拌或振荡下实施。就有机溶剂处理的条件而言，可以从有机溶剂处理开始至结束是一致的，也可以是不一致的。

通过这样实施有机溶剂处理，而得到有效成分(本发明的死菌体)。

就本发明的死菌体而言，可以以包含在反应液中的状态而用于RNA沉默，也可以从反应液中回收而用于RNA沉默。本发明的死菌体可以适宜进行浓缩、稀释、洗涤、悬浮等处理之后用于RNA沉默。这些处理如果不损害RNA沉默诱导效果，则没有特别限定。这些处理可单独实施或适宜组合实施。即，作为本发明的死菌体，可举出：含有死菌体的反应液、从该反应液回收的死菌体、它们的处理产物。这些方式的死菌体可单独使用或适宜组合使用。本发明的死菌体的回收、处理，可与待进行有机溶剂处理的菌体的回收、处理同样的方式实施。例如可以回收、洗涤、重新悬浮本发明的死菌体并用于RNA沉默。具体而言，本发明的死菌体例如可以被制备为本发明的组合物，用于RNA沉默。

<3>本发明的组合物

本发明的组合物是含有有效成分(即本发明的死菌体)的组合物。

本发明的组合物可被目标生物摄入而进行利用。本发明的组合物的使用方式在“本发明的方法”中进行了详细描述。可通过利用本发明的组合物，具体而言，通过使目标生物摄入本发明的组合物，而在目标生物中诱导RNA沉默，即，得到RNA沉默诱导效果。即，本发明的组合物可以是用于在目标生物中诱导RNA沉默的组合物。也将用于诱导RNA沉默的组合物称为“RNA沉默诱导剂”。需要说明的是，在一种方式中，可通过RNA沉默，而抑制目标生物的活动。即，用于诱导RNA沉默的组合物的一个方式可以是用于抑制目标生物的活动的组合物。也将用于抑制目标生物的活动的组合物称为“目标生物的活动抑制剂”。此外，在一种方式中，可通过RNA沉默，而消灭目标生物。即，用于诱导RNA沉默的组合物的一个方式可以是用于消灭目标生物的组合物。也将用于消灭目标生物的组合物称为“目标生物的消灭剂”。此外，在一种方式中，可通过RNA沉默，而防治目标生物造成的危害。即，用于诱导RNA沉默的组合物的一个方式可以是用于防治目标生物造成的危害的组合物。也将用于防治目标生物造成的危害的组合物称为“目标生物造成的危害的防治剂”。

本发明的组合物可以由有效成分组成，也可以含有有效成分以外的成分。

有效成分以外的成分如果不损害RNA沉默诱导效果，则没有特别限定。作为有效成分以外的成分，可利用根据本发明的组合物的用途而被允许的成分。作为有效成分以外的成分，例如可举出农药用、肥料用、饲料用、药物用等用途中通常使用的成分。作为这样的成分，具体而言，例如可举出：赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、稀释剂、表面活性剂、铺展剂、pH调整剂、水、醇、维生素、矿物等添加剂。此外，作为有效成分以外的成分，还可举出培养工序、处理工序中使用的成分。作为有效成分以外的成分，可以使用1种成分，也可以组合使用2种或2种以上成分。

本发明的组合物的形态没有特别限定。本发明的组合物例如可以为粉末状、颗粒状、液态、糊状、立方体状等任一形态。本发明的组合物可以以目标生物可原样摄入的方式提供，也可以以目标生物可摄入的方式在使用前进行制备。本发明的组合物例如可以被构建为用于目标生物的饵(饲料)。此外，本发明的组合物例如可以被构建为农药。

就本发明的组合物中的各成分(即，有效成分和任意其它成分)的含量、含量比而言，如果得到RNA沉默诱导效果，则没有特别限定。本发明的组合物中的各成分的含量、含量比可根据有效成分的方式、其它成分的种类、目标生物的种类和本发明的组合物的利用方式等各种条件进行适宜选择。

就本发明的组合物中的有效成分的含量而言，例如，作为基于干燥菌体重量或湿菌体重量的含量，可以为0.01％(w/w)以上、0.1％(w/w)以上、1％(w/w)以上、5％(w/w)以上或10％(w/w)以上，可以为100％(w/w)以下、99.9％(w/w)以下、70％(w/w)以下、50％(w/w)以下、30％(w/w)以下、10％(w/w)以下、5％(w/w)以下或1％(w/w)以下，可以为这些的不矛盾的组合。

此外，就本发明的组合物中的有效成分的含量而言，例如可以是使目标生物对于有效成分的摄入量在期望的范围内的量。具体而言，就本发明的组合物中的有效成分的含量而言，例如可以是利用本发明的组合物使目标生物摄入有效成分时使目标生物对于有效成分的摄入量在期望的范围内的量。目标生物对于有效成分的摄入量，例如可以在后述的范围内。

在本发明的组合物含有2种或2种以上成分的情况下，各成分可以相互混合而包含在本发明的组合物中，可以分别单独或任意组合单独地包含在本发明的组合物中。

本发明的组合物通过制造有效成分而得到。即，本发明提供本发明的组合物的制造方法，所述方法包含制造有效成分的工序。关于制造有效成分的工序，可援用有效成分的制造方法的记载。即，有效成分的制造方法可以直接看作本发明的组合物的制造方法。

<4>本发明的方法

本发明的方法是包含使目标生物摄入有效成分(即本发明的死菌体)的方法。

此外，本发明的方法可以包含制备本发明的死菌体的工序。即，就本发明的方法而言，例如可以包含有机溶剂处理工序，可以包含培养工序。

可通过本发明的方法，具体而言，通过使目标生物摄入有效成分，而在目标生物中诱导RNA沉默，即，得到RNA沉默诱导效果。即，本发明的方法可以是在目标生物中诱导RNA沉默的方法。需要说明的是，在一种方式中，可通过RNA沉默，而抑制目标生物的活动。即，本发明的方法的一个方式可以是抑制目标生物的活动的方法。此外，在一种方式中，可通过RNA沉默，而消灭目标生物。即，本发明的方法的一个方式可以是消灭目标生物的方法。此外，在一种方式中，可通过RNA沉默，而防治目标生物造成的危害。即，本发明的方法的一个方式是防治目标生物造成的危害的方法。

就目标生物对于有效成分的摄入量而言，如果得到RNA沉默诱导效果，则没有特别限定。就有效成分的摄入量而言，以靶RNA的量计，例如可以为10pg-RNA/个体以上、100pg-RNA/个体以上、1ng-RNA/个体以上、10ng-RNA/个体以上或100ng-RNA/个体以上，可以为100μg-RNA/个体以下、10μg-RNA/个体以下、1μg-RNA/个体以下、100ng-RNA/个体以下或10ng-RNA/个体以下，可以为这些的不矛盾的组合。具体而言，有效成分的摄入量以靶RNA的量计例如可以为10pg-RNA/个体～10μg-RNA/个体。

使目标生物摄入有效成分手段没有特别限定。使目标生物摄入有效成分手段可根据目标生物的种类等各种条件适宜设定。

例如，可通过将有效成分配置在目标生物的巢、移动路径等生活区域，而使目标生物摄入有效成分。在这种情况下，将有效成分以目标生物可摄入的方式配置在生活区域即可。例如，可将保持有效成分的目标生物用的饵配置在生活区域。作为这样的饵，例如可利用含有有效成分并且构建为用于目标生物的饵的组合物。关于含有有效成分的组合物，可援用本发明的组合物的说明。此外，作为这样的饵，例如可将有效成分与用于目标生物的饵组合利用。

此外，例如，在目标生物是引起虫害的生物的情况下，可通过使有效成分保持在遭受虫害的目标物中，而使目标生物摄入目标物时，同时摄入有效成分。作为遭受虫害的目标物，可举出植物。即，有效成分例如可施用于植物等遭受虫害的目标物。有效成分的施用方法可根据目标物的种类等各种条件适宜选择。作为施用至植物的实例，可举出散布、涂布至植物体。有效成分可以施用于整个植物体，也可以施用于植物体的一部分。有效成分例如可以施用于植物体的整个地上部分。作为植物体的一部分，可举出：叶、茎、干、根、果实。有效成分可以至少施用于因目标生物而遭受虫害的部分。在将有效成分施用于叶的情况下，有效成分可以仅施用于叶的表面和背面中一者，也可以施用于两者。就有效成分而言，例如可原样施用于目标物、或适宜制备成含有有效成分的组合物而施用于目标物。关于含有有效成分的组合物，可援用本发明的组合物的说明。有效成分特别是可以液体形态施用于目标物。即，具体而言，有效成分例如可制备为含有有效成分的液体组合物，施用于目标物。

需要说明的是，将有效成分配置在目标生物的生活区域的情况、将有效成分施用于遭受虫害的目标物的情况等使有效成分为目标生物可摄入的状态的情况，也被称为“有效成分的使用”。

就有效成分的使用时期、使用量而言，如果得到RNA沉默诱导效果，则没有特别限定。有效成分的使用时期、使用量可根据目标生物的种类等各种条件适宜设定。有效成分例如可以在产生目标生物前预防性地使用，也可以在产生目标生物后对症性地使用。有效成分可以仅使用1次，也可以使用2次或2次以上。有效成分可以间歇性地使用，也可以连续地使用。例如，可对有效成分的使用量进行设定，以使得能够达成所述有效成分期望的摄入量。

此外，有效成分可以与其他成分组合使用。关于其他成分，可援用本发明的组合物的说明中对有效成分以外的成分的记载。

就有效成分而言，例如可利用本发明的组合物(即通过摄入本发明的组合物)，使目标生物摄入。即，本发明的方法的一个方式例如可以是包含使目标生物摄入本发明的组合物的方法。“使目标生物摄入有效成分”还包含使目标生物摄入本发明的组合物。同样，就有效成分而言，例如可利用本发明的组合物，配置在目标生物的生活区域、施用于遭受虫害的目标物。即，“使用有效成分”还包含使用本发明的组合物。就本发明的组合物而言，例如可原样使用、或适宜用水、生理盐水、缓冲液、醇等液体进行稀释、分散或溶解后使用。此外，本发明的组合物可以与其他成分组合使用。关于其他成分，可援用本发明的组合物的说明中对有效成分以外的成分的记载。关于本发明的组合物的使用方式，可援用所述与有效成分的使用有关的记载。

<5>有效成分的使用

此外，本发明提供有效成分在如上所述的用途中的使用。即，例如，本发明提供：有效成分在RNA沉默诱导、目标生物的活动抑制、目标生物的消灭或目标生物造成的危害的防治中的使用；有效成分在用于RNA沉默诱导、用于目标生物的活动抑制、用于目标生物的消灭或用于防治目标生物造成的危害的组合物的制造中的使用。

实施例

以下，基于非限定性的实施例，进一步对本发明更具体地进行说明。

<1>谷氨酸棒状杆菌的核糖核酸酶III基因缺陷型菌株的获得

以下述方式制备谷氨酸棒状杆菌2256菌株(ATCC13869菌株，以下有时仅记为2256菌株)的核糖核酸酶III(RNaseIII)同源基因(以下，记为rnc基因)的破坏菌株。

首先，基于氨基酸序列与已知的RNaseIII的同源性，推测在基因数据库(GenBank)中谷氨酸棒状杆菌2256(Accession No.AP017557)的基因组序列信息中存在于REGION:2115207..2115950的区域为rnc基因。因此，作为使该基因缺损所需要的信息，从基因数据库(GenBank)中获得其ORF(开放阅读框)区域以及其上游区域和下游区域各约1000碱基(1kb)的DNA碱基序列信息。

接下来，使用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN制)从2256菌株的菌体获得基因组DNA，以该基因组DNA为模板，分别使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物通过PrimeSTARGXL DNA Polymerase(TAKARA BIO制)进行PCR扩增而获得rnc基因的上游约1kb的DNA片段，使用SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4的引物通过PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA BIO制)进行PCR扩增而获得rnc基因的下游约1kb的DNA片段。需要说明的是，PCR条件以制造商推荐的方案为标准。接着，通过以下的步骤将这些DNA片段连接至携带sacB基因的质粒pBS4S(WO2005/113745和WO2005/113744；在谷氨酸棒状杆菌中不具有复制能力)。具体而言，将pBS4S作为模板，使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物，通过PrimeSTAR GXL DNAPolymerase进行PCR扩增，获得pBS4S的扩增片段。接着，将通过以上方式获得的rnc基因上游区域和下游区域的两DNA片段与pBS4S的扩增片段混合，使用In-Fusion HD Cloning Kit(CLONTECH制)进行这3个片段的连接(图1)。并且，使用该反应液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARA BIO制)进行转化，涂布在包含25μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上。在37℃下培养过夜后，从琼脂培养基上出现的菌落中分离单个菌落，得到具有卡那霉素抗性的转化体。通过常规方法从得到的转化体提取质粒，通过结构分析，对包含rnc基因的上游区域和下游区域的DNA片段的质粒进行确认。并且，将其命名为pBS4SΔrnc(图1)。

由于该质粒不能在棒状细菌内自主复制，因此，在将该质粒导入棒状细菌的情况下，虽然频率非常低，但是通过遗传的同源重组反应将该质粒导入染色体中，出现显示出卡那霉素抗性的转化菌株。因此，通过电脉冲法使用高浓度的所述质粒pBS4Δrnc对2256菌株进行转化，涂布在包含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(葡萄糖5g/L，聚蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·7H₂O0.01g/L，尿素3g/L，大豆水解物1.2g/L，pH7.5(用KOH调整)，琼脂20g/L)上，在30℃下培养过夜。其结果，出现数个菌落。就可生长在该培养基上的菌株而言，在该质粒的rnc基因的附近(上游区域或下游区域)的DNA序列片段与2256菌株的基因组上的同一基因附近的区域之间发生同源重组，其结果，成为在该基因组中***了源自该质粒的卡那霉素抗性基因和sacB基因的菌株即所谓的一次重组菌株。

接下来，将这些一次重组体在不包含卡那霉素的CM-Dex液体培养基(除了不包含琼脂之外，与CM-Dex琼脂培养基具有相同的组成)中在30℃下培养过夜，适当稀释后，涂布在不包含卡那霉素并且含有10％(w/v)蔗糖的Dex-S10琼脂培养基(蔗糖10g/L，聚蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·4H₂O 0.01g/L，尿素3g/L，大豆水解物1.2g/L，生物素10μg/L，pH7.5(用KOH调整)，琼脂20g/L)上，在30℃下培养过夜。其结果，出现数个菌落。此处，对出现的菌落进行使用了KOD FX NEO(TOYOBO制)的菌落PCR反应，挑选rnc基因缺陷型菌株。使用SEQ ID NO.7和SEQID NO.8的引物，通过PCR扩增分析这些菌株的rnc基因区域的长度，其结果，PCR扩增中的DNA片段的长度比将2256菌株(野生型)的基因组DNA作为模板的短。因此，挑选其中一个菌株作为rnc基因缺陷型菌株，命名为2256Δrnc菌株。

<2>2256菌株的内源性质粒pAM330的消除

2256菌株具有pAM330作为内源性质粒(Yamaguchi,Ryuji,et al."Determinationof the complete nucleotide sequence of Brevibacterium lactofermentum plasmidpAM330 and analysis of its genetic information."Agricultural and biologicalchemistry 50.11(1986):2771-2778.)。制备在pAM330与作为大肠杆菌通用载体的pHSG399(TAKARA BIO制)形成的复合质粒pVC7(日本特开1997-070291)上搭载了sacB基因的pVC7-sacB。具体而言，将pBS4S质粒作为模板，使用SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物，通过PrimeSTARGXL DNA Polymerase进行PCR扩增，得到sacB基因的扩增片段。此外，将pVC7质粒作为模板，使用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的引物，通过KOD FX NEO(TOYOBO制)进行PCR扩增，得到pVC7载体的扩增片段。将这样得到的扩增片段混合，使用In-Fusion HD CloningKit(CLONTECH制)相互连接。接下来，使用该反应溶液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARA BIO制)进行转化，涂布在包含25μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下培养过夜。然后，从出现的菌落中分离单个菌落。通过常规方法从由此得到的转化体中提取质粒DNA，通过DNA测序分析确认目标质粒，将其命名为pVC7-sacB(图2)。通过电脉冲法将pVC7-sacB导入2256Δrnc菌株，涂布在包含5μg/ml氯霉素的CM-Dex琼脂培养基上，在30℃下培养过夜后，获得多个2256Δrnc/pVC7-sacB菌株的转化体。接着，将这些菌株在CM-Dex培养基中培养过夜，然后将这些菌株涂布在Dex-S10琼脂培养基上，在30℃下培养过夜，从而得到pVC7-sacB丢失并对蔗糖不敏感的2256ΔrncΔpAM330菌株。

<3>表达载体的构建

在质粒pVC7(日本特开1997-070291)中，pVC7的整个碱基序列6679bp中，将1172位(将限制酶HindIII的切割识别位点的5’末端的第二个碱基A设为+1)的碱基从胞嘧啶(C)替换为鸟嘌呤(G)，从而获得pVC7H2。需要说明的是，pVC7H2使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司制)进行制备。具体而言，将质粒pVC7作为模板，根据所述试剂盒中附带的制作方案，使用SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的引物，从而制备pVC7H2。根据常规方法，将pVC7H2转化为2256ΔpAM330菌株。选择培养基使用包含氯霉素(5μg/ml)的CM-Dex培养基。其结果，良好地形成菌落，将该菌落添加至包含氯霉素(5mg/L)的CM-Dex液体培养基，在30℃下振荡培养过夜。根据常规方法从该培养液中提取保持的质粒，将该制备的质粒溶液的一部分进行琼脂糖电泳，检查质粒的DNA条带，其结果，pVC7H2显示出高拷贝数。

<4>靶RNA表达质粒pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev的构建

通过以下步骤构建在F1启动子的控制下在双方向上表达作为靶RNA的Hv-iap RNA的质粒pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev。

基于WO2010/140675所述的信息，通过化学合成制备Hv-iap(SEQ ID NO.15)的DNA片段，所述Hv-iap(SEQ ID NO.15)的DNA片段是源自iap基因的cDNA的部分序列，所述iap基因编码源自茄二十八星瓢虫的凋亡抑制因子IAP。此外，通过化学合成制备包含源自噬菌体BFK20的F1启动子(SEQID NO.17)的SEQ ID NO.16的DNA片段。并且，如下实施包含在F1启动子之后连接了Hv-iap序列的DNA序列的质粒的构建(图3)。首先，将pVC7作为模板，使用SEQID NO.18和SEQ ID NO.19的引物，通过KOD FXNEO(TOYOBO制)进行PCR扩增，得到pVC7的DNA片段。此外，将SEQ ID NO.16的DNA片段作为模板，使用SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21的引物，通过PrimeSTAR HS(TAKARA BIO制)进行PCR扩增，得到包含F1启动子序列的DNA片段。此外，将SEQ ID NO.15的DNA片段作为模板，使用SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23的引物，通过PrimeSTAR HS(TAKARA BIO制)进行PCR扩增，得到Hv-iap序列的DNA片段。并且，将这3种DNA片段混合，通过In-Fusion HD Cloning Kit(CLONTECH制)进行连接。接下来，使用该反应溶液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARABIO制)进行转化，获得25μg/ml氯霉素的抗性菌株，通过常规方法从得到的转化体中提取质粒。通过DNA测序分析确认目标质粒，将其中之一命名为pVC7-Pf1-Hv-iap(图3)。

将pVC7H2作为模板，使用SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.24的引物，通过KOD FX NEO(TOYOBO制)进行PCR扩增，得到pVC7H2的DNA片段。此外，将SEQ ID NO.16的DNA片段作为模板，使用SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的引物，通过PrimeSTAR HS(TAKARA BIO制)进行PCR扩增，得到包含F1启动子序列的DNA片段。将这样得到的两个DNA片段混合，通过In-FusionHD Cloning Kit(CLONTECH制)进行连接。接下来，使用该反应溶液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARA BIO制)进行转化，涂布在包含25μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下培养过夜。然后，从出现的菌落中分离单个菌落，通过常规方法从得到的转化体中提取质粒。通过DNA测序分析确认目标质粒，将其命名为pVC7H2-Pf1rev(图4)。

接下来，为了在pVC7H2-Pf1rev的F1启动子的下游导入限制酶位点KpnI位点和XhoI位点，而将pVC7H2-Pf1rev作为模板，使用SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.27的引物，使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO制)实施反向PCR后，进行DpnI处理、磷酸化反应和自连接反应并使扩增DNA片段环状化，导入大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARA BIO制)。将这些菌体涂布在包含25μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下培养过夜。然后，从出现的菌落中分离单个菌落，通过常规方法从得到的转化体中提取质粒。通过DNA测序分析确认目标质粒，将其命名为pVC7H2-KpnI-XhoI-Pf1rev(图4)。

接着，将pVC7-Pf1-Hv-iap作为模板，使用SEQ ID NO.28和SEQ IDNO.29的引物，通过PrimeSTAR HS(TAKARA BIO制)进行PCR，获得形成KpnI限制酶位点―F1启动子区域―Hv-iap区域―XhoI限制酶位点的排列的DNA片段。并且，对该DNA片段和pVC7H2-KpnI-XhoI-Pf1rev的各个进行基于限制酶KpnI和XhoI的剪切后，通过MinElute PCR PurificationKit(QIAGEN制)进行纯化，将两个纯化产物混合，通过Ligation high Ver.2(TOYOBO制)实施连接反应，从而连接两个DNA片段。接下来，使用该反应溶液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARA BIO制)进行转化，获得25μg/ml氯霉素的抗性菌株。通过常规方法从得到的转化体中提取质粒，通过DNA测序分析确认目标质粒，将其命名为pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev(图4)。

<5>含有Hv-iap RNA的棒状细菌菌体的乙醇处理

分别用所述的实施例中记载的方法将所述实施例中制备的质粒pVC7H2和pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev导入谷氨酸棒状杆菌2256ΔrncΔpAM330菌株，获得转化体。并且，将这些转化体在添加了5μg/ml的氯霉素的CM-Dex培养基中进行24小时振荡培养。然后，从该培养液中提取一部分，稀释10⁷倍，接种于CM-Dex琼脂培养基，从而计算所述的培养液中包含的活菌数。其结果，发现活菌数为4.4x10⁹个/mL。接下来，将所述的培养液0.2mL进行离心，收集菌体。向该菌体添加包含表1所述的各浓度的乙醇的10mM磷酸缓冲液(pH6.8)1mL，充分混合，从而对菌体进行乙醇处理。即，乙醇处理开始时的活菌体浓度为约10⁹个/mL。需要说明的是，处理温度和处理时间设为在室温(约25℃)下进行10分钟。将处理后的菌体悬浮液进行离心(12000rpm,2分钟)，除去上清液后，向其中添加0.2mL的CM-Dex培养基而使菌体悬浮。将该悬浮液0.1mL(作为活菌数为约4×10⁸个)接种至CM-Dex琼脂培养基，对生长进行确认。

将结果示于表1。在进行了乙醇浓度为30％至95％的范围内的处理的菌体的情况下，琼脂培养基上未形成菌落。即，在乙醇浓度为30％至95％的范围内，细胞存活率至少变为10^-8以下。由此发现，乙醇浓度为30％以上时，该棒状细菌菌体实际上完全死亡。

表1棒状细菌的乙醇处理和存活率

++…长满整个板面

接下来，为了调查乙醇处理引起的菌体内的靶RNA的变化，而在所述乙醇处理后，将收集的菌体静置在室温下24小时，然后从菌体中提取总RNA，对其进行非变性PAGE。具体而言，对所述菌体添加15mg-溶菌酶(SIGMA制)/ml-TE缓冲液225μl并在室温下进行30分钟反应，进一步添加20mg/ml ProteinaseK(TAKARA制)25μl，再进行30分钟反应后，使用TRIzol LS Reagent(THERMO FISHER SCIENTIFIC制)并根据方案，实施RNA的提取。此外，根据方案用6％的TBE Gel(Novex制)对非变性PAGE进行评价。

需要说明的是，作为用于该RNA稳定性评价的对照区，使用不进行乙醇处理而将培养液0.2mL份的菌体悬浮于仅1mL的10mM磷酸缓冲液(pH6.8)中的。具体而言，将所述磷酸缓冲液的悬浮液静置10分钟，离心后除去上清液部分，制备菌体，将该菌体在室温下静置24小时而作为“无处理”样品，此外，将在菌体的培养后迅速进行RNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN制)处理的用作“P.C.”样品。

将结果示于图5。发现用10％～40％浓度(v/v)的乙醇进行了处理的样品中长度为350bp附近的靶RNA的条带比“P.C.”对照区少，用50％～95％浓度(v/v)的乙醇进行了处理的样品中长度为350bp附近的靶RNA的条带与“P.C.”对照区保持大致相同水平。此外发现，用50％～95％浓度(v/v)的乙醇进行了处理的样品与“无处理”样品相比，靶RNA的量较多，由此可见，通过进行乙醇处理，而对靶RNA的生产菌株进行灭菌的同时更稳定地保持菌体内的靶RNA。

<6>含有Hv-iap RNA的棒状细菌菌体的甲醇处理

与实施例<5>同样，使用10％～95％浓度(v/v)甲醇/10mM磷酸缓冲液(pH6.8)对棒状细菌菌体进行处理，评价棒状细菌的存活率和靶RNA的积蓄量。

将结果示于表2和图6。在甲醇浓度为50％至95％的范围内，细胞存活率为至少10^-8以下。由此发现，在甲醇浓度为50％以上的情况下，该棒状细菌菌体实际上完全死亡。此外，发现菌体内的靶RNA在70％～95％浓度的甲醇处理区中得到了良好保持。

表2棒状细菌的甲醇处理和存活率

++…长满整个板面

<7>含有Hv-iap RNA的棒状细菌菌体的加热处理

将实施例<5>中得到的培养液0.2mL无菌性地置于微量离心管中，将离心得到的菌体悬浮于1ml的10mM磷酸缓冲液(pH6.8)，静置10分钟。再次离心，通过将得到的菌体用设定为100℃的加热块进行30分钟的加热而进行灭菌处理。在灭菌处理后的菌体中添加0.2mL的CM-Dex培养基而使菌体悬浮，将0.1mL份的悬浮液接种于CM-Dex琼脂培养基，其结果，琼脂培养基上未形成菌落。即，细胞存活率为至少10^-8以下。由此发现，在100℃下进行30分钟的加热处理的情况下，棒状细菌菌体实际上完全死亡。由此，制备进行了加热灭菌的含有靶RNA的菌体。

<8>含有Hv-iap RNA的棒状细菌菌体对于茄二十八星瓢虫的给药实验

使用实施例<5>和<6>中制备的在各醇的浓度(v/v)为80％的条件下进行了处理的菌体、和实施例<7>中制备的进行了热处理(100℃，30分钟)的菌体，实施茄二十八星瓢虫的给药实验。即，作为Hv-iap生产菌株，使用2256Δrnc ΔpAM330/pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev菌株。此外，作为对照区，使用仅导入了不生产Hv-iap的载体的2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2菌株。通过非变性PAGE对各处理后的菌体内的RNA进行评价，其结果可确认，与热处理相比，在乙醇处理和甲醇处理的情况下明确观察到作为靶RNA的Hv-iap的RNA条带，Hv-iap稳定地保持在菌体内(图7)。

接下来，如下所述，为了使作为作物害虫的茄二十八星瓢虫摄食，制备实施了乙醇处理、甲醇处理或热处理的各菌体样品。

乙醇处理菌体样品和甲醇处理菌体样品通过以下步骤制备。对实施例<5>中得到的培养液1.5mL进行离心并收集，向该菌体颗粒中添加1125μl的灭菌milliQ水和375μl的200mM磷酸缓冲液，通过移液进行悬浮之后，将该悬浮液转移至15mL容积的Falcon管，向其中添加6ml乙醇或甲醇进行充分混合。在室温下静置10分钟，然后，进行5000rpm(3270g)×10分钟的离心，收集菌体。接下来，向其中添加10mM磷酸缓冲液(pH6.8)7.5mL而使菌体悬浮，进行离心，将菌体洗涤后，向菌体添加0.8mL的10mM磷酸缓冲液(pH6.8)再次进行悬浮。并且，将其置于微量离心管，在离心后除去上清液，从而得到乙醇处理或甲醇处理菌体。

通过以下步骤制备热处理菌体样品。将实施例<5>中得到的培养液1.5mL进行离心，向收集的菌体添加7.5mL的10mM磷酸缓冲液(pH6.8)而使菌体悬浮。将其转移至5根管中，每管约1.5mL，然后进行离心(14000g×5分钟)，除去上清液，将含有菌体的管置于设定为100℃的加热块并进行30分钟加热。然后，向各管添加0.8mL的10mM磷酸缓冲液(pH6.8)进行悬浮，最终将其收集在一根微量离心管中，通过离心去除上清液，得到热处理菌体。

将50μl的蒸馏水添加至如上所述制备的实施了乙醇处理、甲醇处理或热处理的各菌体样品中进行悬浮，从而制备各个的菌体悬浮液。并且，使茄二十八星瓢虫的3龄幼虫通过口服摄入0.5μl该菌体悬浮液。此外，作为对照区，使茄二十八星瓢虫的3龄幼虫仅摄入水。即，实验区设为表3所示的7个区，对于各实验区使用4～5只幼虫。摄入所述样品(菌体悬浮液或水)后，将幼虫转移至用于喂食的马铃薯叶。24小时后，将各实验区的幼虫转移至新马铃薯叶，回收被摄食的旧马铃薯叶。再过24小时后(样品摄入的48小时后)，回收被摄食的马铃薯叶。测定0～24小时和24～48小时的幼虫对马铃薯叶的摄食程度，分别作为“24小时后”和“48小时后”的摄食数据。

将结果示于表3。发现可通过用适当浓度的乙醇或甲醇对含有靶RNA的菌体进行处理而使菌体死亡，从而可制备含有能够在目标害虫中诱导RNA沉默的RNA的死菌体(实验区3和5)。即显示，与现有的通过热处理制备含有RNA的死菌体(实验区7)的方法相比，该手法在RNA沉默的诱导方面非常有效。

[表3]

编号	实验区	Hv-iap RNA生产	24小时后*	48小时后*
					1	对照区(仅水)	无	+++	+++++
2	乙醇处理区	无	+++	+++++
					3	乙醇处理区	有	+	+
4	甲醇处理区	无	+++	+++++
					5	甲醇处理区	有	+	+
6	加热处理区	无	+++	+++++
					7	加热处理区	有	+++	++++

*表示茄二十八星瓢虫幼虫对于24小时后和48小时后回收的马铃薯叶的摄食程度。

+越多，表示摄食程度越高，即表示茄二十八星瓢虫幼虫的生长越好。

<9>靶RNA表达质粒pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev的构建

通过以下步骤构建在T7启动子的控制下在双方向上表达作为靶RNA的Hv-iap RNA的质粒pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev。

<9-1>pVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7rev的制备

将pVC7作为模板，使用SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33的引物，通过KOD FX NEO(TOYOBO制)进行PCR扩增，得到pVC7的DNA片段。接下来，为了获得包含[T7启动子区域-KpnI限制酶位点-XhoI限制酶位点-反向T7启动子区域]的DNA片段，而将SEQ ID NO.34和SEQ IDNO.35的DN A片段合成并退火。将两个DNA片段混合，通过In-Fusion HD Cloning Kit(CLONTECH制)进行连接。接下来，使用该反应溶液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARA BIO制)进行转化，涂布在包含25μg/ml氯霉素的L B琼脂培养基上，在37℃下培养过夜。然后，从出现的菌落中分离单个菌落，通过常规方法从得到的转化体中提取质粒。通过DNA测序分析确认目标质粒，将其命名为pVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7rev。

<9-2>pVC7-Pt7-Hviap-Pt7rev的制备

将作为源自iap基因的cDNA的部分序列的Hv-iap(SEQ ID NO.15)的D NA片段作为模板，所述iap基因编码源自茄二十八星瓢虫的凋亡抑制因子IAP，使用SEQ ID NO.36和SEQID NO.37的引物，通过KOD FX NEO(TOYOBO制)进行PCR扩增，得到包含[KpnI限制酶位点-Hv-iap序列-XhoI限制酶位点]的DNA片段。并且，用限制酶KpnI和XhoI分别将该DNA片段和pVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7rev剪切，通过MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN制)进行纯化。将两个纯化产物混合，通过Ligation high Ver.2(TOYOBO制)实施连接反应，从而使两个DNA片段连接。接下来，使用该反应溶液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARABIO制)进行转化，涂布在包含25μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下培养过夜。然后，从出现的菌落中分离单个菌落，通过常规方法从得到的转化体中提取质粒。通过DNA测序分析确认目标质粒，将其命名为pVC7-Pt7-Hviap-Pt7rev。

<9-3>pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev的制备

将质粒L4440(US2017-0137841)作为模板，使用SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39的引物，通过KOD FX NEO(TOYOBO制)进行PCR扩增，得到DNA片段。此外，将质粒pVC7-Pt7-Hviap-Pt7rev作为模板，使用SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41的引物，通过KOD FX NEO(TOYOBO制)进行PCR扩增，得到DNA片段。将两个DNA片段混合，通过In-Fusion HD CloningKit(CLONTECH制)进行连接。接下来，使用该反应溶液，对大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞(TAKARA BIO制)进行转化，涂布在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上并在37℃下培养过夜。然后，从出现的菌落中分离单个菌落，通过常规方法从得到的转化体中提取质粒。通过DNA测序分析确认目标质粒，将其命名为pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev。

<10>含有Hv-iap RNA的E.coli菌体的制备

将质粒pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev导入E.coli HT115(DE3)菌株(GE HealthcareDharmacon公司)，获得转化体pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev/HT115(DE3)。将该转化体用添加了100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基在37℃、120rpm的条件下进行振荡培养。培养开始约3小时后，在培养液的OD₆₆₀达到约0.5的时间点，添加IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷)并使得最终浓度为1mM，进一步进行3小时培养。从该培养液中提取一部分，用LB培养基稀释10⁴倍，将该稀释液的0.1mL接种于LB琼脂培养基，从而测定该培养液中包含的活菌数。其结果发现，活菌数为约2×10⁷个/mL。接下来，对该菌体进行乙醇处理。乙醇处理通过下述方式实施：向通过离心分离从培养液5.6mL中收集的菌体添加包含80％的乙醇的10mM磷酸缓冲液(pH6.8)5.6mL，充分混合后，在室温(25℃)静置10分钟。然后，通过离心分离回收乙醇处理菌体。

另外，为了调查乙醇处理后的存活率，以所述同样的方式实施乙醇处理，将0.1mL份的处理菌体液(作为乙醇处理前的活菌数为约2×10⁶个)作为培养液接种至LB琼脂培养基。其结果，琼脂培养基上未形成菌落。即，细胞存活率为2×10⁶分之1以下。由此确认，通过所述乙醇处理，E.coli菌体实际上完全死亡。

另一方面，将作为载体质粒的L4440导入E.coli HT115(DE3)菌株，获得转化体L4440/HT115(DE3)。以与所述同样的步骤，培养该转化体，对从培养液5.6mL中收集的菌体实施乙醇处理，获得乙醇处理菌体。

此外，以与实施例<5>同样的方式确认菌体内的Hv-iap RNA的积蓄。

<11>含有Hv-iap RNA的E.coli对于茄二十八星瓢虫的给药实验

将50μl的蒸馏水添加至实施例<10>中制备的进行了乙醇处理的各菌体样品而进行悬浮，从而制备各个的菌体悬浮液。并且，使茄二十八星瓢虫的3龄幼虫通过口服摄入0.5μl该菌体悬浮液。此外，作为对照区，使茄二十八星瓢虫的3龄幼虫仅摄入水。即，实验区设为表4所示的3个区，对于各实验区使用5只幼虫。在摄入所述样品(菌体悬浮液或水)后，将幼虫转移至用于喂食的马铃薯叶。24小时后，将各实验区的幼虫转移至新马铃薯叶，回收被摄食的旧马铃薯叶。再过24小时后(样品摄入的48小时后)，回收被摄食的马铃薯叶。测定0～24小时和24～48小时的幼虫对马铃薯叶的摄食程度，分别作为“24小时后”和“48小时后”的摄食数据。

将结果示于表4。在经过乙醇处理的含有Hv-iap RNA的E.coli菌体的情况下，至24小时时观察到马铃薯叶的摄食量降低，在24小时之后观察到摄食量进一步显著降低。即，发现可通过使用经过乙醇处理的E.coli菌体而在目标害虫中充分诱导RNA沉默。

[表4]

*表示茄二十八星瓢虫幼虫对于24小时后和48小时后回收的马铃薯叶的摄食程度。

+越多，表示摄食程度越高，即表示茄二十八星瓢虫幼虫的生长越好。

工业实用性

如果根据本发明，则能够在目标生物中高效地诱导RNA沉默。

<序列表的说明>

SEQ ID NO.1～14：引物

SEQ ID NO.15：Hv-iap的碱基序列

SEQ ID NO.16：包含F1启动子的DNA片段的碱基序列

SEQ ID NO.17：F1启动子的碱基序列

SEQ ID NO.18～29：引物

SEQ ID NO.30：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的rnc基因的碱基序列

SEQ ID NO.31：谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC 13869)的Rnc蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO.32～41：引物

序列表

<110> 味之素株式会社

<120> 诱导RNA沉默的方法

<130> E045-18585

<150> JP2018-028262

<151> 2018-02-20

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

aaaacgacgg ccagtggctg aatctgagcg cctgg 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

tcaacttcag gcagtaggaa cttctccaaa ccagc 35

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

actgcctgaa gttgaggtgg tg 22

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gaccatgatt acgccaagaa aatcgacact gtcag 35

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttc 26

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

actggccgtc gttttacaac gtcg 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ggctgaatct gagcgcctgg tc 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

aagaaaatcg acactgtcag ccag 24

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gacgttgatc ggcacgacga tcctttttaa cccatcac 38

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

agacgtagac aagctcatat gggattcacc tttatgttg 39

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

agcttgtcta cgtctgatgc tttg 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

gtgccgatca acgtctcatt ttc 23

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gtagctcgca cgggggtttg tcttg 25

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

gaactcatat gcacgggggc cacataac 28

<210> 15

<211> 346

<212> DNA

<213> 茄二十八星瓢虫

<400> 15

cctcggaatc ggcgaccaga cgttgtgctt ctactgcggc ggcggtctga aagattgggt 60

cgaagaagac gatccgtggg aacagcacgc gctttggttc ccccagtgta attatctatt 120

attgaagaaa acacccgctt tcgtcaaaga cgtccaagaa aaacataaag gcgatttgtc 180

gtcatccaag caaaacgaga ccgaagtggt agcaagtagt agcagtagtc acaactccaa 240

agaatctcca agtgcggtgg tagaagagcg agaaagaaac aacgcagagg aaagctcgac 300

attatgcaaa atatgttata aaaatgaatt ggctgttgta tttcta 346

<210> 16

<211> 259

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含F1启动子的DNA片段

<400> 16

gatctactcg ttactcaagg caaggtcgag cgggacggtc gaaccagctt caagcgaccg 60

gatgagtatg ttacagtaga tagcgagcgg gagaccgctc gaccttagtt ctcctgttgc 120

gggggagttc atgggatcca cgtaccctgc gagacaggag taatcctaaa cagggcattg 180

cactccgccc ttgctagcat agcataaaat aacgccccac cttcttaacg ggaggtgggg 240

cgttattttt acggggatc 259

<210> 17

<211> 139

<212> DNA

<213> 噬菌体BFK20

<400> 17

gatctactcg ttactcaagg caaggtcgag cgggacggtc gaaccagctt caagcgaccg 60

gatgagtatg ttacagtaga tagcgagcgg gagaccgctc gaccttagtt ctcctgttgc 120

gggggagttc atgggatcc 139

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

agcctggggt gcctaatgag 20

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gctgttgtat ttctaaaggc caggaaccgt aaaaag 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

taggcacccc aggctgatct actcgttact caaggc 36

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

tcgctatcta ctgtaacata ctc 23

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

tacagtagat agcgacctcg gaatcggcga ccag 34

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

tagaaataca acagccaatt c 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

aaggccagga accgtaaaaa g 21

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

acggttcctg gccttgatct actcgttact caaggc 36

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

taggcacccc aggcttcgct atctactgta acatactc 38

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

ggtaccggat cccctcgagt cgctatctac tgtaacatac tc 42

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ccaggtaccg atctactcgt tactcaaggc 30

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

cgaactcgag tagaaataca acagccaatt c 31

<210> 30

<211> 744

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 30

gtgagcagga aaaagaatcg cctcaccggg gtagacgcac tcaatgaagc attcgatgca 60

gtagatcatc agccgctgct tgaccacctt ggtgtggaca tccagcgcga tctgttggtg 120

cttgcgttga ctcaccgctc tttcgccaac gaaaacggca tgctgcccaa taatgagcgc 180

ttggagttcc tcggcgacgc cgtcttgggt ctctccgtgg ccaacaagct ctatgagcag 240

taccccagca gccctgaatc tgatgtctcc aagatgcgcg cttcaattgt cagccgttac 300

ggcctggcag atatcgctcg cgaaattgat cttggcaacc acatattgct gggcaaaggc 360

gaattgctca ccgaaggtcg cagtaaggat tccattcttg cggacaccac agaggcgtta 420

ttcggcgcga ttttccgcca gcacggtttt gaaaccgccc gcgacgtaat tttgcgcctg 480

tttgcctaca agatcgataa cgcatcggcc aggggcattc accaggactg gaagaccacg 540

ctgcaggagg aacttgccca gcgcaagcgc cccatggctg aatattccgc cacctcagtc 600

ggtccggatc acgatctagt gttcaccgcc atcgtgacgc tggaaggtga agaaatgggt 660

cggggagaag gcccgaacaa gaagctggcc gagcaggaag cagcgcacca ggcattccga 720

aagcttcggg agtcccgtgc ctga 744

<210> 31

<211> 247

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 31

Met Ser Arg Lys Lys Asn Arg Leu Thr Gly Val Asp Ala Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ala Phe Asp Ala Val Asp His Gln Pro Leu Leu Asp His Leu Gly Val

20 25 30

Asp Ile Gln Arg Asp Leu Leu Val Leu Ala Leu Thr His Arg Ser Phe

35 40 45

Ala Asn Glu Asn Gly Met Leu Pro Asn Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu

50 55 60

Gly Asp Ala Val Leu Gly Leu Ser Val Ala Asn Lys Leu Tyr Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Pro Ser Ser Pro Glu Ser Asp Val Ser Lys Met Arg Ala Ser Ile

85 90 95

Val Ser Arg Tyr Gly Leu Ala Asp Ile Ala Arg Glu Ile Asp Leu Gly

100 105 110

Asn His Ile Leu Leu Gly Lys Gly Glu Leu Leu Thr Glu Gly Arg Ser

115 120 125

Lys Asp Ser Ile Leu Ala Asp Thr Thr Glu Ala Leu Phe Gly Ala Ile

130 135 140

Phe Arg Gln His Gly Phe Glu Thr Ala Arg Asp Val Ile Leu Arg Leu

145 150 155 160

Phe Ala Tyr Lys Ile Asp Asn Ala Ser Ala Arg Gly Ile His Gln Asp

165 170 175

Trp Lys Thr Thr Leu Gln Glu Glu Leu Ala Gln Arg Lys Arg Pro Met

180 185 190

Ala Glu Tyr Ser Ala Thr Ser Val Gly Pro Asp His Asp Leu Val Phe

195 200 205

Thr Ala Ile Val Thr Leu Glu Gly Glu Glu Met Gly Arg Gly Glu Gly

210 215 220

Pro Asn Lys Lys Leu Ala Glu Gln Glu Ala Ala His Gln Ala Phe Arg

225 230 235 240

Lys Leu Arg Glu Ser Arg Ala

245

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

aaggccagga accgtaaaaa g 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

agcctggggt gcctaatgag 20

<210> 34

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

taggcacccc aggcttaata cgactcacta taggggtacc ggatcccctc gagcctatag 60

tgagtcgtat taaaggccag gaaccgt 87

<210> 35

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

acggttcctg gcctttaata cgactcacta taggctcgag gggatccggt acccctatag 60

tgagtcgtat taagcctggg gtgccta 87

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

cttggtaccc ctcggaatcg gcgaccag 28

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gttctcgagt agaaatacaa cagccaattc 30

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

ctcactggcc gtcgttttac 20

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

atttcgataa gccaggttgc ttcc 24

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

ctggcttatc gaaattaggc accccaggct taatac 36

<210> 41

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

acgacggcca gtgagacggt tcctggcctt taatacg 37