植物白粉病抗性相关蛋白Pm5e及其编码基因和应用
阅读说明：本技术 植物白粉病抗性相关蛋白Pm5e及其编码基因和应用 (Plant powdery mildew resistance related protein Pm5e, and coding gene and application thereof ) 是由 刘志勇 郭广昊 谢菁忠 王勇 吴秋红 陆平 陈永兴 董玲丽 于 2019-03-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种植物白粉病抗性相关蛋白Pm5e及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质,获自小麦,命名为Pm5e蛋白,为序列表中序列1所示的蛋白质。编码Pm5e蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护Pm5e蛋白的应用,为提高植物的白粉病抗病性。本发明还保护一种制备转基因植物的方法,包括如下步骤：在受体植物中导入所述核酸分子,得到白粉病抗病性增强的转基因植物。本发明对于植物白粉病育种具有重大的应用推广价值。(The invention discloses a plant powdery mildew resistance related protein Pm5e, and a coding gene and application thereof. The protein provided by the invention is obtained from wheat, is named as Pm5e protein and is a protein shown in a sequence 1 in a sequence table. The nucleic acid molecule encoding the Pm5e protein also belongs to the protection scope of the invention. The invention also protects the application of the Pm5e protein, and aims to improve the disease resistance of plants to powdery mildew. The invention also provides a method for preparing a transgenic plant, which comprises the following steps: the nucleic acid molecule is introduced into a receptor plant to obtain a transgenic plant with enhanced powdery mildew disease resistance. The method has great application and popularization values for breeding the powdery mildew of the plants.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物白粉病抗性相关蛋白Pm5e及其编码基因和应用。
背景技术
小麦是世界上最主要的粮食作物之一，提供全球所需约20％的热量。小麦白粉病是由布氏白粉菌小麦专化型(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)引起的主要真菌性病害，可以明显影响小麦的分蘖数、穗粒数和千粒重，严重降低小麦的产量和品质。因此，控制白粉病危害对提高小麦产量、降低农药和人力成本、以及保护环境有十分重要的意义。化学防治不仅危害环境、损害人体健康，还可使病原菌产生抗药性，造成更加严重的损失。而挖掘抗病基因和培育抗病品种是防治小麦白粉病最经济、环保、有效的措施。
目前，我国小麦白粉病抗病育种面临着白粉菌变异速度过快，强毒性新小种流行范围不断扩大且可利用抗性基因有限的问题，同时育成品种遗传基础狭窄化问题日益严重，因此需要不断挖掘新的抗病基因，扩大抗病基因来源，合理布局已有的抗病基因，从而有效的将多基因进行聚合培育出广谱、持久抗性的品种，使得病原菌难以得到大规模爆发和流行，有效防控小麦白粉病危害，做到减少投入，提高效益。
在长期的小麦栽培进程、不同的地理环境和复杂的自然条件影响下，形成了丰富宝贵的小麦地方品种种质资源，其中潜藏着育成品种所缺乏的优良基因。我国小麦地方品种种类繁多，是巨大的优良遗传资源的宝库。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物白粉病抗性相关蛋白Pm5e及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，获自小麦(Triticum aestivum L.)，命名为Pm5e蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物白粉病抗病性相关的蛋白质；
(a4)来源于小麦且与(a1)具有98％以上同一性且与植物白粉病抗病性相关的蛋白质。
标签具体如表1所示。
表1标签的序列
标签
残基
序列
Poly-Arg
5-6(通常为5个)
RRRRR
Poly-His
2-10(通常为6个)
HHHHHH
FLAG
8
DYKDDDDK
Strep-tag II
8
WSHPQFEK
c-myc
10
EQKLISEEDL
HA
9
YPYDVPDYA
蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
编码Pm5e蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(b2)序列表中序列3所示的DNA分子；
(b3)来源于小麦且与(b1)或(b2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述核酸分子的重组表达载体。使用所述核酸分子构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。
所述重组载体具体可为重组表达载体。所述重组表达载体具体可为在现有植物表达载体中***所述核酸分子得到的重组质粒。现有植物表达载体具体可为pCAMBIA1300载体或pTCK303载体。
本发明还保护Pm5e蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)：
(c1)调控植物的白粉病抗病性；
(c2)提高植物的白粉病抗病性。
本发明还保护所述核酸分子的应用，为如下(d1)或(d2)：
(d1)培育白粉病抗病性改变的转基因植物；
(d2)培育白粉病抗病性增强的转基因植物。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中导入所述核酸分子，得到白粉病抗病性增强的转基因植物。
本发明还保护所述方法在植物育种中的应用。所述植物育种的目的为获得白粉病抗病性增强的植物。
本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中Pm5e蛋白的含量和/或活性，从而提高目的植物的白粉病抗病性。
以上任一所述植物可为单子叶植物。以上任一所述植物可为禾本科植物。以上任一所述植物可为小麦属植物。以上任一所述植物可为小麦Fielder。
以上任一所述白粉病可为白粉病致病菌引起的白粉病。所述白粉病致病菌可为布氏白粉菌小麦专化型。所述白粉病致病菌具体可为E20生理小种。
本发明的发明人获得了中国小麦地方品种中含有的抗白粉病基因Pm5e,为小麦育种工作提供更加丰富的白粉病抗病基因资源。将Pm5e蛋白的编码基因导入白粉病感病小麦，转基因植株的抗病性显著增高，实现了白粉病抗病。本发明对于植物白粉病育种具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为Pm5e基因在不同接种时间的表达分析的结果。
图2为实施例3的步骤一中白粉病抗病性鉴定的结果。
图3为实施例3的步骤二中白粉病抗病性鉴定的结果。
图4为实施例4中抗病性鉴定的表型照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小麦品种复壮30，简称小麦复壮30，为高抗白粉病的中国小麦地方品种。小麦品种农大015，简称小麦农大015，为高感白粉病的品种。小麦品种Fielder，简称小麦Fielder，为白粉病感病的品种。小麦品种薛早，简称小麦薛早，为白粉病感病的品种。
实施例中采用的白粉病致病菌为白粉病菌(Blumeriagraminis,sp.tritici，Bgt)E20生理小种。
根据表型，植株的白粉病抗病性采用0-4级的分级标准。0为免疫。0；为近免疫。1为高度抗病。2为中度抗病。3为中度感病。4为高度感病。按大分类来说，0-2为抗病，3-4为感病。各个分级标准相应的表型见表2。
表2
级别
表型
0
植株无白粉病相关症状
0；
出现过敏性坏死反应，失绿反应
1
菌丝层较稀薄且病斑少，可透绿
2
菌丝层较厚，不透绿，能产生一定量的孢子
3
菌丝层比较厚且病斑多，产孢量大，但菌丝不会连成片
4
菌丝层厚、菌丝致密且病斑多，产孢量大，菌丝连成片
实施例1、蛋白及其编码基因的发现
利用混池转录组测序(BSR-Seq)方法开发分子标记，以小麦复壮30和小麦农大015杂交后代的3705个F2：3家系为作图群体，进行精细定位，最终将Pm5e定位在染色体7BL分子标记WGGB2和WGGB3之间，标记之间的物理区间约为13.5kb。利用诺唯赞高保真DNA聚合酶，通过PCR扩增小麦复壮30及小麦农大015定位区间的物理序列。
最终从小麦复壮30中发现一个新蛋白，如序列表的序列1所示，将该蛋白命名为Pm5e蛋白。复壮30的cDNA中编码Pm5e蛋白的开放阅读框如序列表的序列2所示。复壮30的基因组DNA中，编码Pm5e蛋白的基因如序列表的序列3所示(具有4个外显子)。
实施例2、Pm5e基因在不同接种时间的表达分析
供试植株为小麦复壮30植株。
供试植株培养至一叶一心期，然后接种白粉病致病菌，分别于接种0h、4h、6h、12h、24h、48h和72h后，取植株的第一片叶片，检测Pm5e基因的相对表达水平。接种方式：将感染白粉病致病菌并充分发病(充分发病的表型：菌丝层厚、菌丝致密且病斑多，产孢量大，菌丝连成片)的小麦薛早植株在供试植株上方进行人工拂掸。检测Pm5e基因的相对表达水平的方法：提取叶片的总RNA，以Actin基因为内参基因，通过qRT-PCR检测Pm5e基因的相对表达水平。
用于鉴定Pm5e基因表达量的引物如下：
NLR-QF：5’-GAAGGCAAGGAAAGCAGGTC-3’；
NLR-QR：5’-GTACTGCTGCCCTTGACTTG-3’。
结果见图1。Pm5e基因的表达受到白粉病致病菌的诱导，接种白粉病致病菌6h后表达量达到最高，之后恢复到正常水平。
实施例3、转基因验证蛋白功能
一、转基因组中目的基因验证
1、构建重组质粒
(1)取小麦复壮30的叶片，提取基因组DNA。
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用NLR-com-VF和NLR-com-VR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
NLR-com-VF：5’-AATTCGAGCTCGGTACCCGGG ACATTCTGAGCTTCCACTTC-3’；
NLR-com-VR：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGCCA GACCTGAAACCTGAAGTGTT-3’。
(3)取pCAMBIA1300载体，用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切，回收载体骨架。
(4)取步骤(2)得到的PCR扩增产物和步骤(3)得到的载体骨架，进行同源重组，得到重组质粒pCAMBIA1300-Bar-NLR。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1300-Bar-NLR进行结构描述如下：在pCAMBIA1300载体中***了序列表的序列3所示的DNA分子。
2、制备转基因植株
(1)将步骤1得到的重组质粒导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对小麦Fielder的胚性愈伤组织进行遗传转化，然后培养获得植株，即为T0代植株。
(3)T0代植株自交获得籽粒，将籽粒培育为植株，即为T1代植株。
(4)从T1代植株中筛选转基因植株。
筛选转基因植株的方法：提取植株叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用NLR-MD1F和NLR-MD1R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到164bp的扩增产物，该植株为转基因植株。
NLR-MD1F：5’-TCGTCCAAAGTGCTCGAGAT-3’；
NLR-MD1R：5’-GTTGAAGGCTTCCCACGTG-3’。
3、制备转空载体植株
用pCAMBIA1300载体代替重组质粒，参照步骤2进行操作，得到转空载体植株。
4、白粉病抗病性鉴定
供试植株：20株T1_NLR_com1植株、20株T1_NLR_com2植株、20株T1_NLR_com3植株、20株T1代转空载体植株、20株小麦复壮30植株(用FZ30表示)和20株小麦Fielder植株。T1_NLR_com1植株为从同一T0代植株的自交后代中筛选得到的转基因植株。T1_NLR_com2植株为从同一T0代植株的自交后代中筛选得到的转基因植株。T1_NLR_com3植株为从同一T0代植株的自交后代中筛选得到的转基因植株。
供试植株培养至一叶一心期，然后接种白粉病致病菌，接种10天后，观察植株的第一片叶片的表型并拍照。接种方式：将感染白粉病致病菌并充分发病(充分发病的表型：菌丝层厚、菌丝致密且病斑多，产孢量大，菌丝连成片)的小麦薛早植株在供试植株上方进行人工拂掸。
照片见图2(每种供试植株提供3株植株的示例性照片)。转基因植株与小麦复壮30植株表型一致，表现出显著的白粉病抗病性。转空载体植株和小麦Fielder植株表型一致，表型出显著的白粉病感病性。T1_NLR_com1植株、T1_NLR_com2植株和T1_NLR_com3植株的抗病等级均为1级。小麦复壮30植株的抗病等级为0；级。转空载体植株和小麦Fielder植株的抗病等级均为4级。
二、转基因编码区序列对目的基因验证
1、构建重组质粒
(1)取小麦复壮30的叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA。
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用NLR-OE-VF和NLR-OE-VR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
NLR-OE-VF：5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACC ATGGCGCAGATGGAGGATGTAG-3’；
NLR-OE-VR：5’-TTCGAGCTCTCTAGAACTAGT TTAGCGCTTGGGTTGGGGCGGG-3’。
(3)取pTCK303载体，用限制性内切酶KpnI和SpeI进行双酶切，回收载体骨架。
(4)取步骤(2)得到的PCR扩增产物和步骤(3)得到的载体骨架，进行同源重组，得到重组质粒pTCK303-Hyg-NLR。根据测序结果，对重组质粒pTCK303-Hyg-NLR进行结构描述如下：在pTCK303载体中***了序列表的序列2所示的DNA分子。
2、制备转基因植株
(1)将步骤1得到的重组质粒导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对小麦Fielder的胚性愈伤组织进行遗传转化，然后培养获得植株，即为T0代植株。
(3)T0代植株自交获得籽粒，将籽粒培育为植株，即为T1代植株。
(4)从T1代植株中筛选转基因植株。
筛选转基因植株的方法：提取植株叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用NLR-MD2F和NLR-MD2R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到扩增产物，该植株为转基因植株。
NLR-MD2F：5’-TTAGCCCTGCCTTCATACGC-3’；
NLR-MD2R：5’-CACTTTGGACGAAGTTGAGG-3’。
3、制备转空载体植株
用pTCK303载体代替重组质粒，参照步骤2进行操作，得到转空载体植株。
4、白粉病抗病性鉴定
供试植株：20株T1_NLR_OE1植株、20株T1_NLR_OE2植株、20株T1_NLR_OE3植株、20株T1代转空载体植株、20株小麦复壮30植株(用FZ30表示)和20株小麦Fielder植株。T1_NLR_OE1植株为从同一T0代植株的自交后代中筛选得到的转基因植株。T1_NLR_OE2植株为从同一T0代植株的自交后代中筛选得到的转基因植株。T1_NLR_OE3植株为从同一T0代植株的自交后代中筛选得到的转基因植株。
供试植株培养至一叶一心期，然后接种白粉病致病菌，接种10天后，观察植株的第一片叶片的表型并拍照。接种方式：将感染白粉病致病菌并充分发病(充分发病的表型：菌丝层厚、菌丝致密且病斑多，产孢量大，菌丝连成片)的小麦薛早植株在供试植株上方进行人工拂掸。
照片见图3(每种供试植株提供3株植株的示例性照片)。转基因植株与小麦复壮30植株表型一致，表现出显著的白粉病抗病性。转空载体植株和小麦Fielder植株表型一致，表型出显著的白粉病感病性。T1_NLR_OE1植株、T1_NLR_OE2植株和T1_NLR_OE3植株的抗病等级均为0级。小麦复壮30植株的抗病等级为0；级。转空载体植株和小麦Fielder植株的抗病等级均为4级。
实施例4、
利用浓度0.4％的EMS试剂处理小麦复壮30的种子，分单株收取得到3356个M2家系的种子。对每个家系进行白粉病抗性鉴定(方法同实施例3的步骤一的3)，共获得3个独立的感病突变体家系(M2384家系、M2586家系、M3208家系)。
小麦复壮30植株、小麦薛早植株以及3个独立的感病突变体家系的白粉病抗性鉴定的表型照片见图4。
扩增感病突变体家系的基因组DNA及cDNA中的目的基因。突变体Mut2384在外显子-内含子边界发生突变导致剪切方式发生改变。突变体Mut2586造成翻译提前终止。突变体Mut3208有15bp的缺失。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 植物白粉病抗性相关蛋白Pm5e及其编码基因和应用
<130> GNCYX190094
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1067
<212> PRT
<213> Triticum aestivum L.
<400> 1
Met Ala Gln Met Glu Asp Val Asp Ala Ala Ser Pro Leu Pro Ala Met
1 5 10 15
Ala Leu Asp Pro Asp Leu His Ala Ala Ile Arg Ala Pro Val Thr Val
20 25 30
Met Leu Gly Pro Ser Ala Leu Leu Leu Arg Glu Leu Asp Ser Ser Gly
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Gly Ala Glu Glu Leu Arg Leu Leu Arg Asp Ala Leu
50 55 60
Arg Glu Val Cys Ile Pro Leu Lys Ser Met Ser Glu Asp Asp Gly Ala
65 70 75 80
Ser Phe Met Ala Arg Trp Trp Met Lys Ile Val Arg Glu Leu Cys Tyr
85 90 95
Asp Thr Gln Asp Tyr Leu Asn Phe Val Gln Ser Ala Arg Asp Arg Pro
100 105 110
Glu Phe Ser Glu Leu Pro Asp Arg Ala Lys Ala Val Tyr Ser Gly Leu
115 120 125
Leu Ala Arg Ala Ile Asp Ala Arg Glu Arg Arg Arg Gly Phe Lys Trp
130 135 140
Ser Pro Lys Thr Thr Arg Ser Asp Thr Trp Glu Ala Phe Asn Arg Arg
145 150 155 160
Phe Ser Lys Lys Leu Val Gln Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val His Thr
165 170 175
Thr Pro Gly Ala Val Val Val Glu Ala Pro Asn Lys Leu Val Gln Leu
180 185 190
Leu Ala Leu Asp Asp Asp Val Asn Asp Lys Thr Leu Lys Val Ile Pro
195 200 205
Ile Ile Gly Cys Ala Gly Val Gly Lys Thr Thr Ala Ala Arg Thr Leu
210 215 220
Tyr His Lys His Gly Gly Lys Phe Gln Cys Arg Ala Phe Val Ser Val
225 230 235 240
Ser Gln Asn Pro Asp Met Arg Gly Ile Leu Thr Ser Met Leu Ala Gln
245 250 255
Leu Lys Ala Pro Arg Pro Pro Gly Phe Pro Asp Val Leu Asp Leu Ile
260 265 270
Gly Ala Ile Ser Arg His Leu Gln Gly Lys Gly Tyr Leu Ile Val Leu
275 280 285
Asp Asp Leu Trp Thr Ala Ser Val Trp His Ile Val Ser Arg Ala Phe
290 295 300
Pro Arg Gly Asp His Arg Ser Arg Ile Ile Thr Thr Thr Gln Val His
305 310 315 320
Asp Val Ala Leu Ala Cys Ser Gly Tyr His Pro Val Arg Ile Tyr Lys
325 330 335
Met Glu Leu Leu Asp Glu Tyr Glu Ser Arg Lys Leu Phe Phe Arg Arg
340 345 350
Val Phe Ser Ser Ala Pro Gly Asp Gly Cys Ser Pro Ala Thr Lys Glu
355 360 365
Val Ser Tyr Glu Ile Ile Arg Lys Cys Glu Gly Leu Pro Leu Ala Ile
370 375 380
Val Ser Ile Ala Gly Leu Leu Ala Ser Glu Leu Ser Ile Val Met Glu
385 390 395 400
Asp Trp Arg His Ile Gln Asn Ser Phe Ser Ser Thr Ser Glu Gly Met
405 410 415
Lys Asp Ile Leu Asn Leu Ile Tyr Asn Ser Leu Pro Pro Gly Leu Arg
420 425 430
Thr Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Met Tyr Pro Gln Gly Tyr Val Met Lys
435 440 445
Lys Ala Glu Leu Val Lys His Trp Val Ala Glu Gly Phe Ile Gly Val
450 455 460
Val Glu Gly Thr Val Ala Met Lys Ile Ala Glu Arg Tyr Phe Asp Glu
465 470 475 480
Leu Val Ser Arg Ala Met Val Gln Ala Val Asp Thr Asp Tyr Thr Gly
485 490 495
Lys Val Leu Ser Cys Thr Val His His Leu Val Leu Asp Phe Ile Arg
500 505 510
Ser Lys Ser Leu Asp Glu Asn Phe Val Thr Thr Val Asp Tyr Ser Glu
515 520 525
Ser Thr Leu Ala His Pro Asp Lys Val Arg Arg Leu Ser Ile Gln Phe
530 535 540
Gly Gly Val Lys Ser Ala Tyr Ile Pro Glu Thr Ile Val Thr Ser Lys
545 550 555 560
Val Arg Ser Leu Val Phe Trp Gly Phe Phe Lys Cys Ala Pro Pro Ser
565 570 575
Ile Met Asp Tyr Gly Phe Leu Arg Ile Leu Asn Leu His Ile Trp Ala
580 585 590
Asp Glu Asp Asn Glu Ile Phe Asp Leu Ile Gly Ile Gly Asn Leu Phe
595 600 605
Leu Leu Lys Tyr Leu Thr Val Glu Cys Asn Ile Thr Val Lys Leu Pro
610 615 620
Glu Lys Ile Gly Met Leu Arg Tyr Leu Glu Thr Leu Glu Val Asp Ala
625 630 635 640
Arg Leu Phe Ala Val Pro Ser Asp Met Asp Asn Leu Glu Arg Leu Leu
645 650 655
His Leu Arg Leu Pro Ser Glu Ser Ile Leu Pro Gln Gly Val Ala His
660 665 670
Met Thr Ser Leu Arg Thr Leu Gly Asn Phe Asp Leu Ser Arg Arg Tyr
675 680 685
Ser Ile Glu Asn Val Leu Gln Leu Gly Gly Leu Ser Asn Leu Gln Asp
690 695 700
Leu Gln Leu Thr Cys Ala Met Ala Gln Gln Ala Glu Asn Leu Glu Lys
705 710 715 720
Asn Val Leu Leu Leu Gly Trp Ile Val Glu Arg Leu Ser Phe Leu Gln
725 730 735
Thr Ile Thr Leu Val Pro Ala Ser Val Ser Ser His Gln Asp Asp Gly
740 745 750
Gln Ala Ala Ala Pro Thr Ser Ile Ile Ile Pro Pro Asp Gly Phe Asn
755 760 765
Met Glu Pro Pro Pro Asp Leu Leu Leu Gln Arg Ile Glu Met Ser Arg
770 775 780
His Cys Cys Ile Phe Phe Cys Ile Pro Lys Cys Phe Gly Glu Leu Arg
785 790 795 800
Lys Leu Cys Ile Leu Lys Ile Ala Ile Arg Ser Leu Ser Arg Ser Asp
805 810 815
Ile Glu Ile Leu Glu Arg Met Pro Ala Leu Ala Ala Leu Ala Leu Tyr
820 825 830
Asn Gln Thr Thr Pro Thr Glu Lys Met Ile Met Thr Asp Gly Gly Phe
835 840 845
Tyr Arg Leu Thr Tyr Phe Lys Phe Leu Cys Ala Ala Pro Cys Leu Ser
850 855 860
Phe Glu Gln Gly Ala Met Pro Lys Leu Gln Asn Leu Asn Leu Gly Phe
865 870 875 880
Asn Ser Asp Gln Trp Arg Ser Asp Thr Phe Glu Thr Leu Gly Leu Ser
885 890 895
His Leu Arg Gly Leu Thr Asp Val Cys Val Arg Leu Gly Thr Gly Ala
900 905 910
Ala Asp Asn Phe Asn Val Lys Val Ala Glu Ser Ala Leu Glu Ala Val
915 920 925
Val Arg Asn His Pro Asn Ser Pro Arg Ile Arg Ile Lys Phe Val Asp
930 935 940
Leu Ile Phe Asp Gly Lys Glu Asp Asp Ser Thr Ala Thr His Gln Tyr
945 950 955 960
Gln Glu Gly Lys Glu Ser Arg Ser Ala Arg Gly Gln Asp Gly Lys Gln
965 970 975
Asp Ala Thr Arg Gly Glu Arg Gln Gln Gln Gly Pro Pro Met Ser Lys
980 985 990
Gln Asp Ala Arg Arg Ser Lys Ala Val Gly Ala Ser Ser Lys Ala Val
995 1000 1005
Pro Pro Ile Ser Lys Ala Val Asn Ala Ser Lys Ser Arg Ala Ala Val
1010 1015 1020
Pro Pro Pro Thr Ser Ser Ser Pro Ser Lys Pro Met Pro Ser Ser Ser
1025 1030 1035 1040
Leu Thr Ser Pro Pro Lys Pro Arg Arg Arg Gly Ser Arg Thr Ser Pro
1045 1050 1055
Pro Arg Pro Thr Ser Pro Pro Gln Pro Lys Arg
1060 1065
<210> 2
<211> 3204
<212> DNA
<213> Triticum aestivum L.
<400> 2
atggcgcaga tggaggatgt agatgccgcg tcccctctgc cagcgatggc gttggaccct 60
gatctccacg cagcgattcg agctcctgtt actgttatgc tgggtccgtc ggccctcctc 120
ctccgggaac tcgattcttc cggacagagt cttctcggtg cggaggagct tcgtcttctt 180
agagatgctc tcagggaagt atgcatcccc ctgaagagta tgtccgaaga cgacggtgct 240
agctttatgg cccggtggtg gatgaagata gttcgggagc tttgttatga tacgcaggat 300
tacctcaact tcgtccaaag tgctcgagat cgtcctgaat tttcagagtt acctgatcgt 360
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