阅读说明：本技术 一种经基因修饰的vegfa蛋白及其单克隆抗体与应用 (Genetically modified VEGFA protein, monoclonal antibody thereof and application ) 是由 屠志刚 刘晗青 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体的制备和应用。本发明利用SUMO对VEGFA进行了修饰,得到优化后的SUMO-VEGFA蛋白,并有利于此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体,本发明的抗VEGFA单克隆抗体具有特异性高,可大量生产的特点,所得抗体的效价达到1×10<Sup>6</Sup>以上。能够特异性的结合VEGFA蛋白,可用于细胞的免疫学检测,具有广阔的市场前景,也可能对进一步开发以VEGFA为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。(The invention belongs to the field of biotechnology, and particularly relates to a VEGFA protein modified by genes and preparation and application of a monoclonal antibody thereof, wherein the invention utilizes SUMO to modify VEGFA to obtain optimized SUMO-VEGFA protein, and is favorable for preparing a murine monoclonal antibody by immunizing the protein 6 The above. Capable of specific bindingThe VEGFA protein can be used for immunological detection of cells, has wide market prospect, and also has important clinical significance for further developing biological treatment medicaments taking VEGFA as targets.)

一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体与应用。

背景技术

癌症血管生成是肿瘤生长的基本过程，这个过程会产生新的血管，给肿瘤细胞提供了增殖所需的氧气和营养的供应，促进了癌症的发展与转移，在癌症的病理过程中都发挥着重要的作用。血管生成过程复杂，有许多调控因子参与。其中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族及其受体（VEGFRs），是促进血管细胞分化和血管形成最重要的组织因子。VEGF家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盘生长因子（placental growth factor，PIGF）五个成员。VEGFA是一种45 KD 的同型二聚体糖蛋白，是该家族成员中最具特异性、功能性最强的血管生成因子，VEGFA主要与VEGFR2结合，参与血管生成的调控，是参与活化促进血管内皮细胞有丝***和通透性最主要的信号传导通路。VEGFA与VEGFR2结合前后会引发上下游通路中无数中间信号形成级联反应，最终以内皮细胞增殖、存活、迁移、通透性增加及浸润到周围组织等，促进肿瘤的生长和转移。

近年来，VEGFA被发现或可作为癌症早期检测和不良预后的肿瘤标志物，其在胃癌、肠癌等多种肿瘤中高表达。目前用于检测的VEGFA抗体存在特异性差，产量低等的缺点，限制了VEGFA的应用，因此，开发一种特异性好、亲和性高的SUMO化修饰的VEGFA抗体，可能对以VEGFA为靶点的临床诊断及生物治疗药物具有重要的临床意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种经SUMO修饰的VEGFA蛋白基因SUMO-VEGFA蛋白，利用该SUMO-VEGFA构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，获得的抗VEGFA单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于分子免疫学研究，或制成多种体外诊断试剂盒用于检测VEGFA抗原的免疫检测工具中。可用于制备抗VEGFA的生物诊断试剂的研究与开发。

本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：

一种经修饰的VEGFA蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

一种经修饰的VEGFA蛋白，由上述经修饰的VEGFA蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

一种表达载体，该载体含有上述经修饰的VEGFA蛋白基因。

在某一具体实施方案中，本发明还提供有一种抗VEGFA单克隆抗体，所述抗VEGFA单克隆抗体采用上述经修饰VEGFA蛋白基因的表达载体为免疫原；所述的抗VEGFA单克隆抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ .ID.NO. 3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ .ID.NO. 4所示。

在某一

具体实施方式

中，本发明还提供所述抗VEGFA单克隆抗体的一种制备方法，首先用SUMO-VEGFA蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗VEGFA单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗VEGFA单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗VEGFA单克隆抗体。具体制备工艺步骤如下：

（1）重组蛋白的表达与纯化；

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选；

（4）抗VEGFA单克隆抗体的生产及纯化。

在某一具体实施方式中，本发明还提供了一种能产生上述抗VEGFA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明还提供了所述的抗VEGFA单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。

进一步地，所述的抗VEGFA单克隆抗体在制备检测VEGFA蛋白的生物检测试剂中的用途。进一步的所述的用途为制备检测VEGFA抗原的试剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用SUMO化对VEGFA蛋白质进行供价修饰，得到优化后的SUMO-VEGFA蛋白，并有利于此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明的抗VEGFA单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×10⁶以上。能够特异性的结合VEGFA蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，也可能对进一步开发以VEGFA为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。

附图说明

图1是重组蛋白的 SDS-PAGE电泳图；

图2是纯化后的VEGFA单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；

图3是不同稀释度的抗VEGFA单克隆抗体的免疫效价检测结果图；

图4是抗VEGF单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；

图5是VEGFA单克隆抗体对HUVEC、SH-SY5Y、Hela细胞中进行Western blot实验结果；

图6是VEGFA单克隆抗体对Hela细胞进行免疫荧光染色实验结果。

具体实施方式

本发明公开了一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1：抗VEGFA单克隆抗体制备

（1）重组SUMO-VEGFA蛋白的表达与纯化

a. 转化大肠杆菌BL21表达目标重组蛋白

SUMO、VEGFA基因的核苷酸序列均可以在公共数据库中获得，SUMO 的Genbank登陆号为29843，VEGFA 的Genbank登陆号为7422；用SUMO对VEGFA基因进行修饰，SUMO修饰后的VEGFA基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其序列经南京金斯瑞生物技术有限公司合成并***原核表达载体pET-30a，构成重组表达质粒pET-30a-SUMO-VEGFA。采用42℃热激90s的方法将重组表达质粒pET-SUMO-VEGFA转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在500 mL LB培养基中培养至菌液OD为0.6~0.8时，加入0.5 mM IPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12 h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。

b. 重组蛋白纯化

将步骤a中得到的菌体裂解液上清加入镍柱层析柱中（购自Qiagen），4℃结合过夜，弃去上清，用Wash Buffer缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白，然后用10倍柱体积的500 mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，收集合并洗脱后的重组蛋白SUMO-VEGFA，冻干后进行后续动物免疫。采用相同的方法收集正常的VEGFA蛋白（未经SUMO修饰）作为对比例。SDS-PAGE电泳分别检测各蛋白的表达情况，图1是重组蛋白SUMO-VEGFA与VEGFA蛋白洗脱组分收集的SDS-PAGE电泳图，如图1所示，洗脱后分别获得了较高纯度的SUMO-VEGFA蛋白与VEGFA蛋白。

（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测

本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。按常规方法进行小鼠免疫（参考北京大学出版社出版的《现代抗体技术及其应用》和科学出版社的《抗体制备与使用实验指南》）。

用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清效价。分别取步骤（1）中的SUMO-VEGFA蛋白、VEGFA蛋白，用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液蛋白稀释为1 μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000 g离心15 min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100 μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100 μL TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：10⁵以上小鼠，进行第三次免疫。

（3）杂交瘤细胞的融合、筛选

制备饲养层细胞，准备SP2/0骨髓瘤细胞，免疫结束后3~4天取BALB/c小鼠脾脏细胞进行细胞融合。融合后的细胞铺板（4块96孔板），利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，经过两轮亚克隆筛选分别得到抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株，编号命名为：VEGFA mAb与SUMO-VEGFA mAb。

（4）抗VEGFA单克隆抗体的生产及纯化。

按常规方法制备采集小鼠中的单克隆抗体腹水，利用正辛酸-蛋白G法对腹水中的抗体进行纯化，分别得到抗SUMO-VEGFA单克隆抗体（SUMO-VEGFA mAb）及VEGFA单克隆抗体（VEGFA mAb），对纯化后的抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证，如图2所示，VEGFA mAb与SUMO-VEGFA mAb抗体经洗脱后能获得较高的纯度，制备的抗体IgG(H+L)分子量均约为160 KD，其中IgG重链约为55 KD，IgG轻链约为25 KD。

实施例2：单克隆抗体效价测定及特异性

（1）单克隆抗体的效价测定：

用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将VEGFA蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将以上单克隆抗体按1:10³、1:10⁴、1：10⁵、1：10⁶稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h；取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30 min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值，如图3所示，VEGFA单克隆抗体的效价为1×10⁵，SUMO化修饰的VEGFA单克隆抗体的效价达到1×10⁶，高于VEGFA单克隆抗体10倍。

（2）单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定：

用将碳酸盐缓冲液分别将VEGFA、HSP90、HBEGF、EGFR、HGF蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1 μg/mL BSA蛋白，用SUMO-VEGFA单克隆抗体进行间接法ELISA检测，图4是特异性及交叉反应鉴定结果；如图4所示，SUMO-VEGFA单克隆抗体与HSP90、HBEGF、EGFR、HGF蛋白之间均无交叉反应，表明该抗体具有较好的特异性。

实施例3：VEGFA单克隆抗体的应用

（1）Western blot实验：收集人脐静脉内皮细胞HUVEC（购自中科院昆明细胞库）、人骨髓神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y（购自中科院昆明细胞库）、人***细胞Hela（购自中科院昆明细胞库），利用RIPA裂解液将细胞裂解，5000 g 4℃离心20 min，收集上清，BCA试剂盒（购于碧云天生物技有限公司）检测蛋白浓度；细胞裂解液经12％ SDS-PAGE电泳分离，随后将PAGE胶（购于碧云天生物技有限公司）置于PVDF膜上，120 mA转膜240 min；将PVDF膜放入5％的脱脂牛奶中室温封闭1 h，然后分别用1:5000本发明实施例1中得到的SUMO-VEGFA单克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜；取出PVDF膜，PBS-T漂洗3次，每次5min，置于1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗中室温孵育1 h后，弃二抗，PBS-T洗涤5次，每次5min；将膜加入显色液中避光显影，拍照记录实验结果，如图5所示，本发明实施例1中所制备的SUMO-VEGFA单克隆抗体能够特异性识别VEGFA蛋白，并且能够用于检测细胞中的VEGFA蛋白，说明本发明中的生产的VEGFA抗体具有较高的特异性。

（2）免疫荧光实验：利用免疫荧光实验检测SUMO-VEGFA单克隆抗体结合人***细胞Hela中VEGFA的能力，与单克隆抗体孵育进行免疫荧光染色实验，具体实验方法如下：

Hela细胞贴壁生长后，采用4％多聚甲醛进行固定；细胞固定后，利用PBS洗涤3次，加入0 .5% TritonX-100，室温静置5 min，利用PBS洗涤3次后，加入5％BSA-PBS，37℃封闭1 h；细胞封闭后加入SUMO-VEGFA单克隆抗体（1μg/mL），37℃孵育1 h；PBS洗涤3次后，加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），室温孵育45 min；PBS洗涤3次后，加入DAPI荧光染料室温避光孵育10 min；PBS洗涤3次后，荧光显微镜观察，拍照。结果如图6所示：SUMO-VEGFA单克隆抗体均能特异地与Hela细胞中的VEGFA结合并呈现出较强的绿色荧光。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司

<120> 一种经基因修饰的VEGFA蛋白及其单克隆抗体与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60

gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120

gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180

atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240

atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300

aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360

agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420

aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 480

aagtcctgga gcgttccctg tgggccttgc tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa 540

gatccgcaga cgtgtaaatg ttcctgcaaa aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag 600

cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt gacaagccga ggcggaatga gaactatacc 660

actgacttca ttttcaacct gtactctgag gaggggaagg gcatcttcga cagcaggaag 720

aatgtgcttg gtcacatgca gcagggtggg agcccaaccc catttgatag gaattttgcc 780

actaagatgg gcgccaaggc tatgaactgg atgtctggga aaatcaaaga gagttaccgt 840

aatgggcgga tctttgccaa tactccagat tcgggctgtg ttctggggat gcgtaagagg 900

gctctggtct tccaaccagt ggctgagctg aaggaccaga cagattttga gcatcgaatc 960

cccaaggaac agtggtggct gaaactgagg cccatcctca aaatcctagc caagtacgag 1020

attgacttgg acacttcaga ccatgcccac ctggagcaca tcacccggaa gcggtccggg 1080

gaagctgccg tctaa 1095

<210> 2

<211> 364

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 2

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

130 135 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His

165 170 175

Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr

180 185 190

Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys

195 200 205

Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Asn Glu Asn Tyr Thr Thr Asp Phe Ile

210 215 220

Phe Asn Leu Tyr Ser Glu Glu Gly Lys Gly Ile Phe Asp Ser Arg Lys

225 230 235 240

Asn Val Leu Gly His Met Gln Gln Gly Gly Ser Pro Thr Pro Phe Asp

245 250 255

Arg Asn Phe Ala Thr Lys Met Gly Ala Lys Ala Met Asn Trp Met Ser

260 265 270

Gly Lys Ile Lys Glu Ser Tyr Arg Asn Gly Arg Ile Phe Ala Asn Thr

275 280 285

Pro Asp Ser Gly Cys Val Leu Gly Met Arg Lys Arg Ala Leu Val Phe

290 295 300

Gln Pro Val Ala Glu Leu Lys Asp Gln Thr Asp Phe Glu His Arg Ile

305 310 315 320

Pro Lys Glu Gln Trp Trp Leu Lys Leu Arg Pro Ile Leu Lys Ile Leu

325 330 335

Ala Lys Tyr Glu Ile Asp Leu Asp Thr Ser Asp His Ala His Leu Glu

340 345 350

His Ile Thr Arg Lys Arg Ser Gly Glu Ala Ala Val

355 360

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 3

Asp Ile Gly Gly Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asn Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Arg Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Tyr Asp Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser

115 120