肝细胞生长因子的制备方法
阅读说明：本技术 肝细胞生长因子的制备方法 (Preparation method of hepatocyte growth factor ) 是由 游婷婷 王丁力 于 2019-07-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种肝细胞生长因子的制备方法,包括：将酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合；所述酶原形式的肝细胞生长因子为肝细胞生长因子的α-链与肝细胞生长因子β-链直接相连的多肽片段；所述肝细胞生长因子激活剂选自：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示,且氨基酸有一个或多个取代,但生物活性不变的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示,且氨基酸有一个或多个取代,但生物活性不变的多肽。解决了成熟形式的肝细胞生长因子不易表达,难以大规模生产,应用受到限制的问题。(The invention provides a preparation method of a hepatocyte growth factor, which comprises the following steps: mixing a zymogen form of hepatocyte growth factor with a hepatocyte growth factor activator; the zymogen-form hepatocyte growth factor is a polypeptide fragment in which an alpha-chain of the hepatocyte growth factor is directly connected with a beta-chain of the hepatocyte growth factor; the hepatocyte growth factor activator is selected from: polypeptide with amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 15; or a polypeptide with the amino acid sequence shown as SEQ ID NO.15 and one or more substituted amino acids with unchanged biological activity; or a polypeptide with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 16; or polypeptide with amino acid sequence shown in SEQ ID NO.16 and one or several amino acid substitutions and unchanged bioactivity. Solves the problems that the mature hepatocyte growth factor is difficult to express, is difficult to produce in large scale and has limited application.)
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种肝细胞生长因子的制备方法。
背景技术
肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)被认为是血清中促进肝再生的生长因子。HGF是以无活性的酶原形式分泌至细胞外，随后被丝氨酸蛋白酶切割成成熟的异二聚体，此二聚体由二硫键连接的69kDaα-亚基和34kDaβ-亚基组成。HGF影响不同组织包括肝、肺、肾、肠、心血管系统的形态发生、细胞迁移、器官再生、肿瘤入侵。
在近期的研究中也揭示了HGF在不同疾病中潜在的药用价值，如肝纤维化和肝硬化、肾纤维化、肺纤维化、闭塞性动脉硬化等等。因此开发重组HGF对于医疗应用具有重要意义。然而，传统常用的大肠杆菌表达重组HGF，纯化时需经过变性复性过程，其过程较复杂不利于大规模生产，酵母表达的重组HGF其修饰程度并未完全接近于天然存在的HGF，其药效还未可知。另一方面，HGF重组质粒打进人体后，由于个体的差异，其表达也将存在差异，无法保证药效的一致性。而哺乳动物细胞表达的蛋白质，其修饰程度非常接近天然形式HGF，因此在哺乳动物细胞中进行HGF表达具有潜在的应用价值。
HGF根据其是否加工成熟可以进一步细分为HGF酶原形式(HGF pro)和HGF成熟形式(HGF mature)。在实际应用中，不易直接体外表达得到具有良好生物活性的HGF matrue，可以采用体外重组表达HGFpro的方法获取HGF，理论上，HGF pro被注射到生物体内后有可能在血液中转化为具有生物活性的HGF mature，从而发挥药效。但由于生物体代谢的复杂性和个体的差异性，其转化效率存在差异，若用于药物治疗可能会导致药效的不稳定性和延迟性。而且，随着细胞治疗技术的发展，如干细胞治疗，CAR-T，考虑到血清的高风险性，其对培养基的无动物源性有越来越高的要求，无生物活性的HGF pro在无血清的条件下无法转化为成熟形式的HGF，因此将在上述这些领域的应用受到限制。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种肝细胞生长因子的制备方法，实现能够高效、稳定地制备得到具有生物活性的成熟形式的HGF。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种肝细胞生长因子的制备方法，包括：将酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合；
所述酶原形式的肝细胞生长因子为肝细胞生长因子的α-链与肝细胞生长因子β-链直接相连的多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述肝细胞生长因子激活剂选自：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽。
在其中一些实施例中，所述酶原形式的肝细胞生长因子的制备方法包括：构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞细胞中，培养；和/或
所述肝细胞生长因子激活剂的制备方法包括：构建表达肝细胞生长因子激活剂的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞细胞中，培养。
在其中一些实施例中，所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒上还含有编码肝细胞生长因子信号肽的片段，所述编码信号肽的片段与编码酶原形式的肝细胞生长因子的片段依次连接；和/或
所述表达肝细胞生长因子激活剂的质粒上还含有编码TNFR信号肽的片段，所述TNFR信号肽与所述表达肝细胞生长因子激活剂依次连接。
在其中一些实施例中，所述编码信号肽的片段的序列如SEQ ID NO.6所示；和/或
所述编码TNFR信号肽的片段的序列如SEQ ID NO.17所示。
在其中一些实施例中，所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒的构建方法包括以下步骤：
以含有HGF基因片段的DNA为模板，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物扩增，得目的片段；
将目的片段与表达载体连接。
在其中一些实施例中，所述表达载体为pMCX。
在其中一些实施例中，所述目的片段***在所述表达载体的Not I和BamH I之间。
在其中一些实施例中，所述酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合的方法，包括以下步骤：
分别构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒；
将所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒转染至宿主细胞中，培养、分离纯化，得酶原形式的肝细胞生长因子；
将所述表达肝细胞生长因子激活剂的质粒转染至宿主细胞中，培养、分离纯化，得肝细胞生长因子激活剂；
将所述酶原形式的肝细胞生长因子与所述肝细胞生长因子激活剂混合。
在其中一些实施例中，所述酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合的方法，包括以下步骤：
分别构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒，将所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒共转染至宿主细胞细胞中，培养。
在其中一些实施例中，所述酶原形式的肝细胞生长因子与所述肝细胞生长因子激活剂混合的质量比为10：1至100：1。
在其中一些实施例中，所述宿主细胞为HEK293细胞。
在其中一些实施例中，所述HEK293细胞的培养方法为：采用无血清培养基，悬浮培养。
本发明还提供了一种宿主细胞，具体如下：
一种宿主细胞，转染或转化有如上所述的表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和/或如上所述的表达肝细胞生长因子激活剂的质粒。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明通过将合适的肝细胞生长因子激活剂与具有特定序列的酶原形式的肝细胞生长因子混合，促使该酶原形式的肝细胞生长因子向成熟形式转变，制备得到具有生物活性的成熟形式的肝细胞生长因子，从而解决了成熟形式的肝细胞生长因子不易表达，难以大规模生产，应用受到限制的问题。并且，本发明直接制备得到具有生物活性的成熟形式的HGF具有更广泛的应用前景和应用价值，可直接用于需要无血清培养、或对培养基的无动物源性要求很高的领域，例如干细胞治疗，CAR-T技术等。
而且，本发明通过构建体外表达载体，通过哺乳动物表达平台表达酶原形式的HGF和HGF激活剂，两者混合后转化为成熟形式的HGF，相对于常用的大肠杆菌方法，其具有更接近HGF的糖基化修饰，并且无需分别表达后的体外复性过程，步骤简单、且更接近天然状态的HGF。
另外，本发明用于表达酶原形式的HGF和HGF激活剂的哺乳动物细胞为悬浮细胞，采用悬浮培养的形式，可以在生产时选用环轨摇晃式生物反应器，可通过摇晃轨道和参数控制，实现从0.1mL～2500L放大过程中细胞培养条件的一致性，不必像传统方式再针对大规模表达重新摸索条件，为后续放大工艺提供了方便。
附图说明
图1本发明实施例中肝细胞生长因子的重组表达的研究流程图；
图2为HGF结构图；
图3为HGF重组质粒构建示意图；
图4为HGF-A重组质粒构建示意图；
图5为HGF-pro基因测序结果；
图6为HGF-pro双酶切凝胶电泳检测图；
图7为Western Blot检测rhHGF pro在HEK细胞中表达检测结果图；
图8为亲和层析纯化rhHGF pro的凝胶电泳检测结果；
图9为采用HGF-activator对rhHGF pro体外酶切后产物的凝胶电泳检测结果；
图10为HEK293细胞表达得到的rhHGF pro和rhHGF mature的活性检测结果；
图11为pUC57质粒图谱；
图12为还原条件下HGF-Activator蛋白样品的凝胶电泳检测结果；
图13为采用CHO细胞表达HGF pro结果；
图14为HGF pro和HGF-Activator共表达细胞池筛选过程细胞活率变化；
图15为Western blot检测pro-HGF与HGF-Activator在CHO-DG44细胞中共表达情况。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一种肝细胞生长因子的制备方法，其特征在于，包括：将酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合；
所述酶原形式的肝细胞生长因子为肝细胞生长因子的α-链与肝细胞生长因子β-链直接相连的多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述肝细胞生长因子激活剂选自：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的多肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，且氨基酸有一个或多个取代，但生物活性不变的多肽。
优选地，所述酶原形式的肝细胞生长因子的制备方法包括：构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞中，培养。
优选地，所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒上还含有编码肝细胞生长因子信号肽的片段，所述编码信号肽的片段与编码酶原形式的肝细胞生长因子的片段依次连接。
优选地，所述编码信号肽的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。或者，其核苷酸序列为与SEQ ID NO.6编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.6不同的序列。
优选地，所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒的构建方法包括以下步骤：
以含有HGF基因片段的DNA为模板，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物扩增，得目的片段；
将目的片段与表达载体连接。
更优选地，所述含有HGF基因片段的DNA为pUC57-HGF，即为：在质粒pUC57上***了HGF基因片段的重组质粒。
具体地，所述HGF基因片段的序列如SEQ ID NO.5所示。
在其他一些实施例中，还可以采用其他含有HGF基因片段的DNA作为模板，进行扩增，得到酶原形式的肝细胞生长因子。
具体地，所述目的片段与表达载体经相同的限制性内切酶酶切。优选地，所述表达载体为pMCX，经过NotⅠ和BamHⅠ双酶切，与末端带有NotⅠ和BamHⅠ酶切位点的目的片段连接。
在其中一些实施例中，所述肝细胞生长因子激活剂的制备方法包括：构建表达肝细胞生长因子激活剂的质粒，瞬时转染至悬浮的宿主细胞中，培养。
优选地，所述表达肝细胞生长因子激活剂的质粒上还含有编码TNFR信号肽的片段，所述TNFR信号肽与所述表达肝细胞生长因子激活剂依次连接。
更优选地，编码TNFR信号肽的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。或者，其核苷酸序列为与SEQ ID NO.17编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ IDNO.17不同的序列。
优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选为HEK293细胞。更优选的，所述HEK293细胞为HEK293E细胞。相比大肠杆菌宿主，HEK293细胞具有更接近天然HGF的糖基化修饰，并且无需在大肠杆菌中分别表达α链和β链体外复性的过程，更接近天然状态的HGF。
优选地，所述培养为：采用无血清培养基，悬浮培养。采用悬浮的HEK293细胞进行悬浮培养，细胞生长空间相对于贴壁细胞不受限制，更利于大规模培养及蛋白的表达。
所述酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合的方法，包括以下步骤：分别构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒；将所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒转染至宿主细胞中，培养、分离纯化，得酶原形式的肝细胞生长因子；将所述表达肝细胞生长因子激活剂的质粒转染至宿主细胞中，培养、分离纯化，得肝细胞生长因子激活剂；将所述酶原形式的肝细胞生长因子与所述肝细胞生长因子激活剂混合。
优选地，上述转染的步骤包括：将质粒和PEI依次加入至宿主细胞中，需转染的质粒与PEI的质量比为1：(1-3)。更优选为1:2。
优选地，所述转染时使用的培养基为RPMI1640培养基。更优选地，转染完毕后，采用Excell 293培养基培养。进一步优选的，所述Excell 293培养基中还含有3-4mM的VPA。
在其他一些实施例中，所述酶原形式的肝细胞生长因子与肝细胞生长因子激活剂混合的方法，包括以下步骤：分别构建表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒，将所述表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和表达肝细胞生长因子激活剂的质粒共转染至宿主细胞中，培养。其中，两个质粒共转染至宿主细胞中后，两个质粒分别表达肝细胞生长因子激活剂和酶原形式的肝细胞生长因子，两者在胞内或分泌到胞外混合后，得到成熟形式的肝细胞生长因子。
优选地，所述共转染时，质粒混合物与PEI的质量比为1：(1-3)。更优选为1:2。
本发明的一种宿主细胞，转染或转化有如上任一项所述的表达酶原形式的肝细胞生长因子的质粒和/或如有如上任一项所述的表达肝细胞生长因子激活剂的质粒。
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种肝细胞生长因子的重组表达方法，并对其进行活性检测，具体流程如图1。
1、蛋白质序列分析及引物设计
HGF由728个氨基酸组成，HGF包括含31个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO.2)、含463个氨基酸α链(SEQ ID NO.3)及含334个氨基酸的β链(SEQ ID NO.4)。在HGF蛋白质序列中，共有5个糖基化位点。在α链上含有3个糖基化位点，在β链上含有2个糖基化位点。HGF的序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEG(SEQ ID NO.2)QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLR(SEQ ID NO.3)VVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS(SEQ ID NO.4)
HGF由2个亚基组成也即α链(α-chain)和β链(βchain)，两个亚基之间通过二硫键连接形成成熟形式HGF。其结构图如图2，从结构图分析可知，在HGFβ链上添加组氨酸标签对于纯化不存在明显影响。
以含有HGF基因片段的质粒pUC57-HGF为模板，pUC57-HGF为：在质粒pUC57上***了HGF基因片段的重组质粒。pUC57的质粒图谱如图11所示。所述HGF基因片段的序列为SEQID NO.5所示(下划线部分为信号肽)：
atgtgggtgaccaaactcctgccagccctgctgctgcagcatgtcctcctgcatctcctcctgctccc catcgccatcccctatgcagagggacaaaggaaaagaagaaatacaattcatgaattcaaaaaatcagcaaagactaccctaatcaaaatagatccagcactgaagataaaaaccaaaaaagtgaatactgcagaccaatgtgctaatagatgtactaggaataaaggacttccattcacttgcaaggcttttgtttttgataaagcaagaaaacaatgcctctggttccccttcaatagcatgtcaagtggagtgaaaaaagaatttggccatgaatttgacctctatgaaaacaaagactacattagaaactgcatcattggtaaaggacgcagctacaagggaacagtatctatcactaagagtggcatcaaatgtcagccctggagttccatgataccacacgaacacagctttttgccttcgagctatcggggtaaagacctacaggaaaactactgtcgaaatcctcgaggggaagaagggggaccctggtgtttcacaagcaatccagaggtacgctacgaagtctgtgacattcctcagtgttcagaagttgaatgcatgacctgcaatggggagagttatcgaggtctcatggatcatacagaatcaggcaagatttgtcagcgctgggatcatcagacaccacaccggcacaaattcttgcctgaaagatatcccgacaagggctttgatgataattattgccgcaatcccgatggccagccgaggccatggtgctatactcttgaccctcacacccgctgggagtactgtgcaattaaaacatgcgctgacaatactatgaatgacactgatgttcctttggaaacaactgaatgcatccaaggtcaaggagaaggctacaggggcactgtcaataccatttggaatggaattccatgtcagcgttgggattctcagtatcctcacgagcatgacatgactcctgaaaatttcaagtgcaaggacctacgagaaaattactgccgaaatccagatgggtctgaatcaccctggtgttttaccactgatccaaacatccgagttggctactgctcccaaattccaaactgtgatatgtcacatggacaagattgttatcgtgggaatggcaaaaattatatgggcaacttatcccaaacaagatctggactaacatgttcaatgtgggacaagaacatggaagacttacatcgtcatatcttctgggaaccagatgcaagtaagctgaatgagaattactgccgaaatccagatgatgatgctcatggaccctggtgctacacgggaaatccactcattccttgggattattgccctatttctcgttgtgaaggtgataccacacctacaatagtcaatttagaccatcccgtaatatcttgtgccaaaacgaaacaattgcgagttgtaaatgggattccaacacgaacaaacataggatggatggttagtttgagatacagaaataaacatatctgcggaggatcattgataaaggagagttgggttcttactgcacgacagtgtttcccttctcgagacttgaaagattatgaagcttggcttggaattcatgatgtccacggaagaggagatgagaaatgcaaacaggttctcaatgtttcccagctggtatatggccctgaaggatcagatctggttttaatgaagcttgccaggcctgctgtcctggatgattttgttagtacgattgatttacctaattatggatgcacaattcctgaaaagaccagttgcagtgtttatggctggggctacactggattgatcaactatgatggcctattacgagtggcacatctctatataatgggaaatgagaaatgcagccagcatcatcgagggaaggtgactctgaatgagtctgaaatatgtgctggggctgaaaagattggatcaggaccatgtgagggggattatggtggcccacttgtttgtgagcaacataaaatgagaatggttcttggtgtcattgttcctggtcgtggatgtgccattccaaatcgtcctggtatttttgtccgagtagcatattatgcaaaatggatacacaaaattattttaacatataaggtaccacagtca
以此设计HGF-pro基因扩增引物，并将引物序列发至引物合成公司合成。引物合成后，将其用水溶解，将其浓度调整至5μM，-20℃保存。
2、质粒构建
构建非成熟酶原形式的HGF表达质粒，即α-chain与β-chain直接相连的全长形式的HGF(rhHGF pro)。表达载体为pMCX。重组质粒命名为pMCX-proHGF，其含信号肽，含His-tag，如图3所示。
其中，rhHGF pro的序列为：
QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS(SEQ ID NO.6)
以pUC57-HGF为模板，使用正向引物A及反向引物B扩增rhHGF-pro，并进行纯化，获得目的片段。引物A和引物B的序列见表1。
表1
其中，ATTT和CGC为保护碱基，下划线部分为酶切位点序列，用于在扩增时给目的片段两端引入酶切位点NotⅠ和BamHⅠ，以便于目的片段与表达载体连接，不含酶切位点的序列如表2所示。其他一些实施例中，可以根据表达载体和酶切位点的需要，在表2列两端添加用于引入酶切位点的合适的序列。
表2
引物名称
序列详细信息
SEQ ID NO.
引物A
GCCACCATGTGGGTGACCAAAC
9
引物B
TCAGTGATGATGATGATGATGAGAACCTGACTGTGGTACC
10
将纯化后的目的片段与表达载体pMCX经NotⅠ/BamHⅠ酶进行双酶切反应，并纯化酶切后产物。将经过相同限制性内切酶酶切的目的片段与表达载体进行连接，获得重组表达质粒pMCX-proHGF。将重组质粒转化感受态DH5α细胞，转化后菌液涂于含有氨苄青霉素的平板上，获得单菌落。挑3-5个单菌落于1ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3h，进行菌液PCR鉴定实验。挑取PCR阳性菌落送测序公司进行测序，待测序公司反馈测序结果后，进行序列比对。
图4为构建的非成熟形式HGF基因测序结果。测序结果表明，非成熟形式HGF正确***表达载体中。
构建HGF激活剂(HGF-Activator)的表达质粒，HGF激活剂的序列来源于UniProtKB数据库，编号为Q04756的蛋白质。该序列号为Q04756的蛋白质由一段含35个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO.11)，一段含337个氨基酸的前导肽(SEQ ID NO.12)，一段含35个氨基酸的短链(SEQ ID NO.13)及248个氨基酸长链(SEQ ID NO.14)组成。
UniProtKB数据库编号为Q04756的蛋白质的序列(SEQ ID NO.15)如下：
MGRWAWVPSPWPPPGLGPFLLLLLLLLLLPRGFQP(SEQ ID NO.11)QPGGNRTESPEPNATATPAIPTILVTSVTSETPATSAPEAEGPQSGGLPPPPRAVPSSSSPQAQALTEDGRPCRFPFRYGGRMLHACTSEGSAHRKWCATTHNYDRDRAWGYCVEATPPPGGPAALDPCASGPCLNGGSCSNTQDPQSYHCSCPRAFTGKDCGTEKCFDETRYEYLEGGDRWARVRQGHVEQCECFGGRTWCEGTRHTACLSSPCLNGGTCHLIVATGTTVCACPPGFAGRLCNIEPDERCFLGNGTGYRGVASTSASGLSCLAWNSDLLYQELHVDSVGAAALLGLGPHAYCRNPDNDERPWCYVVKDSALSWEYCRLEACESLTR(SEQ ID NO.12)VQLSPDLLATLPEPASPGRQACGRRHKKRTFLRPR(SEQ ID NO.13)IIGGSSSLPGSHPWLAAIYIGDSFCAGSLVHTCWVVSAAHCFSHSPPRDSVSVVLGQHFFNRTTDVTQTFGIEKYIPYTLYSVFNPSDHDLVLIRLKKKGDRCATRSQFVQPICLPEPGSTFPAGHKCQIAGWGHLDENVSGYSSSLREALVPLVADHKCSSPEVYGADISPNMLCAGYFDCKSDACQGDSGGPLACEKNGVAYLYGIISWGDGCGRLHKPGVYTRVANYVDWINDRIRPPRRLVAPS(SEQ ID NO.14)
将表达TNFR信号肽的基因序列与表达序列号为Q04756的蛋白质成熟段(373-655位的氨基酸序列，SEQ ID NO.16，即SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14相连接的序列)的基因序列相连，构成重组质粒命名为pMCX-HGF-A。质粒构建示意图见图5。
其中，表达TNFR信号肽的基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.17)为：
atgggcctctccaccgtgcctgacctgctgctgccactggtgctcctggagctgttggtgggaatatacccctcaggggttattggac
其中，HGF-Activator序列来源于UniProtKB数据库，序列号为Q04756。HGFactivator由一段含35个氨基酸的信号肽，一段含337个氨基酸的前导肽，一段含35个氨基酸的短链及248个氨基酸长链组成。
3、重组质粒提取
将测序正确的菌液进行扩大培养，使用Plasmid Midi试剂盒(QIAGEN)抽提质粒，步骤如下：
(1)25mL过夜振荡培养菌液，在4℃，6000×g离心15min，倒掉培养上清液；
(2)收集菌体重悬在4mL溶液P1；
(3)加入4mL溶液P2，颠倒管子4-6次，室温(15-25℃)孵育5min。
(4)加入4mL 4℃预***液P3，颠倒管子4-6次，冰上孵育15min。
(5)4℃，20000×g，离心30min；
(6)将上清转移至另一干净50mL管，4℃，20000×g，离心15min。离心后上清转移至另一干净的50mL管；
(7)加入4mL溶液QBT平衡QIAGEN-tip，通过重力流过柱子；
(8)将步骤(6)的上清倒入QIAGEN-tip，通过重力流过柱子；
(9)用10mL溶液QC洗QIAGEN-tip 2次；
(10)用5mL溶液QF洗脱DNA到干净的15mL管中；
(11)加入3.5mL室温异丙醇至洗脱DNA中，混匀。4℃，15000×g，离心30min。小心将上清吸出来；
(12)用2mL 70％乙醇洗DNA沉淀，4℃，15000×g，离心10min。小心将上清吸出来；
(13)晾干5-10min，再溶解于一定体积的纯水中，-20℃保存。
4、重组质粒酶切鉴定
在无菌条件下，取2μg提取质粒DNA进行酶切反应，反应体系见表3。
表3限制性内切酶反应体系
酶切反应体系在37℃水浴中反应30min，取5μL样品进行琼脂糖凝胶电泳实验，通过凝胶成像系统记录实验结果。
实验结果：
图6为为HGF-pro双酶切图；其中，M表示标准分子量，1泳道样品为提取的pMCX-proHGF质粒；2泳道为BamHⅠ酶切后样品；3泳道为NotⅠ和BamHⅠ酶切后样品。从结果可知，酶切后目的片段分子量大小均与预期相符，因此提取的质粒均为目的片段***正确的质粒。
5、HGF瞬时表达
在本方案中通过瞬时转染HEK-293E细胞表达rhHGF pro。将在液氮中冻存的HEK-293E进行复苏及培养，待细胞生长速率正常并经过3次传代可进行转染操作。转染前将细胞密度调整为0.5×106cells/ml，经过两次更换培养基后可进行转染操作。转染时将质粒与PEI以1:2的比例预混，质粒终浓度为1.5μg/106cells，PEI终浓度为3μg/106cells。转染时将细胞密度调整至20×106cells/ml，将细胞重悬至新鲜RPMI1640培养基中。将重悬好的细胞加入预混质粒与PEI混合物中，迅速混匀，放入37℃摇床孵育3h。加入新鲜Excell 293培养基，稀释细胞密度至1.0×106cells/ml，并加入3.75mM丙戊酸钠(VPA)，放于37℃摇床表达5天。
6、HGF-Activator表达
在本方案中通过瞬时转染HEK-293E细胞表达HGF-A。将在液氮中冻存的HEK-293E进行复苏及培养，待细胞生长速率正常并经过3次传代可进行转染操作。转染前将细胞密度调整为0.5×106cells/ml，经过两次更换培养基后可进行转染操作。转染时将质粒与PEI以1:2的比例预混，质粒终浓度为1.5μg/106cells，PEI终浓度为3μg/106cells。转染时将细胞密度调整至20×106cells/ml，将细胞重悬至新鲜RPMI1640培养基中。将重悬好的细胞加入预混质粒与PEI混合物中，迅速混匀，放入37℃摇床孵育3h。加入新鲜Excell293培养基，稀释细胞密度至1.0×106cells/ml，并加入3.75mM VPA，放于37℃摇床表达5天。5天后，离心收获细胞培养上清液，用于酶切实验。
7、表达水平检测
HGF表达水平检测
取适量表达3天HGF样品，1300rpm，离心5min，分离培养液上清和细胞沉淀。分别加入5×上样缓冲液后，100℃，加热10min。将准备好蛋白样品加至SDS-PAGE中，进行电泳。蛋白样品PAGE电泳结束后，将浓缩胶从胶板上切除，将分离胶放入1×WB转膜缓冲液内浸润，随后进行蛋白免疫印迹实验。转膜结束后，将含有目的蛋白的NC膜放置于5％脱脂牛奶中，室温孵育1h。随后孵育一抗即小鼠来源的anti-His抗体，4℃孵育过夜。第二天，TBST洗膜5min，重复洗膜三次。按1:5000比例加入HRP-labelled Goat Anti-mouse Ig(H+L)二抗，室温孵育1h。TBST洗膜5min，重复洗膜三次。使用天地人和Smart ECL试剂盒进行显影。取solutionⅠ液和solutionⅡ液按1:1混合，均匀铺在膜上，在凝胶成像系统中显影。
实验结果：
图7为rhHGF pro表达检测结果，其中，1泳道为对照实验样品；2泳道为rhHGF pro样品，rhHGF pro大小与预期相符。
HGF-activator表达水平检测：
检测方法与HGF表达水平检测的方法基本相同。结果如图12所示。泳道1为在还原条件下HGF-Activator蛋白样品。
8、蛋白质纯化实验
将收获的细胞培养液，于4℃，1500rpm，离心5min，丢弃细胞沉淀，保留细胞培养上清液。使用注射器将含HGF的培养上清液进行过滤，滤膜直径为0.45μm。过滤后，细胞培养液上清经镍柱亲和层析进行纯化。纯化后的样品过夜透析至1×PBS中，pH7.4，并于超滤管中浓缩至一定浓度，并过滤除菌，保存于-80℃。
实验结果：
图8为纯化后获得的非成熟形式的HGF，其大小与预期一致。其中，1泳道为细胞培养液与填料结合后的穿透液；2泳道为缓冲液清洗填料时的穿透液；3泳道为使用100mM咪唑洗脱下的蛋白样品；4泳道为使用200mM咪唑洗脱下的蛋白样品；5泳道为使用250mM咪唑洗脱下的蛋白样品。
9、rhHGF pro体外酶切实验
首先，在HEK293细胞中表达重组加工HGF的蛋白酶即HGF-Activator。将5ml含有HGF-Activator细胞培养液浓缩至80μL备用。
取25μg经镍柱亲和层析的0.5mg/ml rhHGF pro平均分成5份，即每份含有5μgrhHGF pro。每份rhHGF pro分别加入已浓缩的HGF-Activator 4μl，2μl，1μl，0.5μl，0.25μl，补加缓冲液至20μl，反应体系置于室温下反应过夜。第二天取10μl样品进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图9所示。可见，rhHGF pro经过HGF-Activator孵育后，可转变成成熟形式的HGF，即图中具有单独HGF-α-chain和β-chain。由此证明，在本项目中获得的rhHGF为酶原形式，在蛋白酶的作用下可被转化成成熟形式HGF。
10、HGF活性检测实验
从液氮罐中复苏人正常肝细胞-L02细胞，使其在RPMI1640(含10％FBS)生长。经3次传代后，以3×104个/ml细胞密度接种至96孔板中，培养基为100μl/孔，做6个重复孔。24h后，进行细胞换液。在无菌条件下分别加入含有0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的rhHGF mature和rhHGF pro新鲜培养基。37℃孵育3天后，加入MTT孵育5h，吸去培养液。每孔加入适量DMSO，置摇床上低速振荡10min，于570nm下测定各孔吸光值。
实验结果：
图10为HGF活性检测实验结果，通过分别加入rhHGF mature和rhHGF pro至L02细胞，经MTT方法检测增殖情况。从图中结果可知，rhHGF mature和rhHGF pro均能够促进L02细胞的增殖。原因是，rhHGF pro为酶原形式的HGF，本身无生物活性，但是加入含血清的培养基培养的细胞中后，血清中含有能够将rhHGF pro转化为rhHGF mature的酶，从而同样能够发挥生物活性。但是，由于其需要一个转化的过程，尤其是在低浓度状态下，其促进L02细胞增殖的效果较rhHGF mature差，说明其发挥生物活性前，需要耗费一定的转化时间，存在部分未转化为rhHGF mature的无活性rhHGF pro，故生物活性稍微偏低，在体外实验中体现为细胞增殖的速率较慢，进而，在实际应用于临床时，由于个体差异，其转化效率更加存在差异，若用于药物治疗导致的药效的不稳定性和延迟性将会体现得更明显，其应用受到限制。而本发明制备得到的rhHGF mature为成熟形式的HGF，其在直接应用时，无需耗费转化时间，可以直接快速发挥生物活性，具有效果好、起效快、药效稳定的优势。
实施例2
与实施例1的区别为：本实施例用于表达HGF pro和用于表达HGF-Activator的均为CHO-DG44细胞，步骤如下：将在液氮中冻存的CHO-DG44细胞进行复苏及培养，待细胞生长速率正常并经过2次传代可进行转染操作。转染前一天将细胞密度调整为1.5×106cells/ml，第二天细胞密度预期能长至4×106cells/ml，将细胞密度调整至5×106cells/ml，并更换新鲜proCH5培养基。在转染实验中使用的转染试剂为聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)，DNA与PEI的比例为1:5。DNA终浓度为0.6μg/106cells/ml，PEI终浓度为3μg/106cells/ml。DNA与PEI依次加入重悬好的CHO-DGG细胞中，迅速混匀后放入31℃摇床表达。表达3天后取适量细胞样品进行SDS-PAGE及Western blot检测。转染5天后，收获转染细胞，用于检测及纯化。
CHO表达HGF pro结果如图13所示。1泳道为在非还原条件下HGF pro蛋白样品。
结果为：
当使用CHO-DG44细胞表达HGF pro时，可能由于宿主细胞自身的特点，HGF pro被加工成分子量大小接近的两种蛋白形式，见图13结果。而当使用HEK细胞进行表达HGF pro时，HGF pro只含有单一的蛋白形式，因此使用HEK细胞所产生的HGF pro形式单一，更适合大规模生产与应用。
实施例3
在本方案中通过稳定转染CHO-DG44细胞共表达HGF pro和HGF-Activator。将在液氮中冻存的CHO-DG44进行复苏及培养，待细胞生长速率正常并经过3次传代后可进行转染操作。转染前一天将细胞密度调整为2.0×106cells/ml，第二天细胞密度长至4.5-4.8×106cells/ml。转染时，将细胞密度调整至3.0×106cells/ml，并更换新鲜proCH5培养基。在转染实验中使用的转染试剂为聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)，DNA总量与PEI的比例为1:5。质粒DNA终浓度为1.5μg/106cells，PEI终浓度为7.5μg/106cells。在此次转染实验中，加入质粒DNA包括含目的基因的p2MPT-pro-HGF和pMPTN-HGF-Activator，其质量比为9:1。同时加入含转座酶基因的重组质粒pMPT-PBase-ori，加入量为的DNA总量总和的1/10。按下表将DNA与PEI依次加入新鲜培养基重悬的CHO-DG44细胞中，迅速混匀后放入37℃摇床进行转染。
HGF pro和HGF-Activator共表达细胞池筛选
重组p2MPT-pro-HGF及pMPTN-HGF-Activator转染CHO-DG44细胞72h后，将细胞密度调整至0.5×106cells/ml，加嘌呤霉素至10μg/ml，放于37℃摇床进行培养。此后每2天进行一次换液操作，并将细胞密度调整至0.5×106cells/ml，并嘌呤霉素浓度加至10μg/ml。经过10天筛选，可获得阳性细胞池。筛选过程中，细胞活率变化如图14。由结果可知，细胞池在筛选10天后，细胞活率达到96％。
细胞池表达
在获得阳性细胞池后，将其细胞密度调整至2.0×106cells/ml，培养体积调整至10ml/管，并加入丁酸钠至1mM，放于31℃摇床培养5天。表达完成后1500rpm，5min离心收获表达上清。取适量样品进行Western Blot实验。从结果来看(见图15)，泳道1即为HGFmature(蛋白分子量约为85kD)，泳道2样品经过还原剂处理后，可见清晰的β链(蛋白分子量约为37kD)。因此，HGFpro和HGF-Activator共表达后可以获得HGF mature。泳道1为在非还原条件下HGF pro与HGF-Activator共表达蛋白样品；泳道2为在还原条件下HGF pro与HGF-Activator共表达蛋白样品。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 佛山汉腾生物科技有限公司
广州汉腾生物科技有限公司
<120> 肝细胞生长因子的制备方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 728
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
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Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
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Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
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Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
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Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
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Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
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His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
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260 265 270
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His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
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Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
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370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
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Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
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Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
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Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
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Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
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Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
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Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
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Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
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Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
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<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
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Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
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Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala
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<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu
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<210> 5
<211> 2184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
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tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020
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tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740
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ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920
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Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln
50 55 60
Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu
65 70 75 80
Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn
85 90 95
Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr
100 105 110
Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu
115 120 125
His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn
130 135 140
Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr
145 150 155 160
Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser
165 170 175
Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met
180 185 190
Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr
195 200 205
Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe
210 215 220
Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys
225 230 235 240
Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr
245 250 255
Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr
260 265 270
Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr
275 280 285
Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His
290 295 300
Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu
305 310 315 320
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr
325 330 335
Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys
340 345 350
Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr
355 360 365
Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp
370 375 380
Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp
385 390 395 400
Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala
405 410 415
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420 425 430
Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn
435 440 445
Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val
450 455 460
Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu
465 470 475 480
Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser
485 490 495
Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp
500 505 510
Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu
515 520 525
Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu
530 535 540
Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp
545 550 555 560
Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro
565 570 575
Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile
580 585 590
Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn
595 600 605
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610 615 620
Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly
625 630 635 640
Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val
645 650 655
Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro
660 665 670
Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile
675 680 685
Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
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<211> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Gly Arg Trp Ala Trp Val Pro Ser Pro Trp Pro Pro Pro Gly Leu
1 5 10 15
Gly Pro Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Arg Gly
20 25 30
Phe Gln Pro
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Pro Gly Gly Asn Arg Thr Glu Ser Pro Glu Pro Asn Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Pro Ala Ile Pro Thr Ile Leu Val Thr Ser Val Thr Ser Glu Thr
20 25 30
Pro Ala Thr Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gly Pro Gln Ser Gly Gly Leu
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Pro Pro Pro Pro Arg Ala Val Pro Ser Ser Ser Ser Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg Pro Cys Arg Phe Pro Phe Arg Tyr Gly
65 70 75 80
Gly Arg Met Leu His Ala Cys Thr Ser Glu Gly Ser Ala His Arg Lys
85 90 95
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100 105 110
Cys Val Glu Ala Thr Pro Pro Pro Gly Gly Pro Ala Ala Leu Asp Pro
115 120 125
Cys Ala Ser Gly Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Ser Asn Thr Gln
130 135 140
Asp Pro Gln Ser Tyr His Cys Ser Cys Pro Arg Ala Phe Thr Gly Lys
145 150 155 160
Asp Cys Gly Thr Glu Lys Cys Phe Asp Glu Thr Arg Tyr Glu Tyr Leu
165 170 175
Glu Gly Gly Asp Arg Trp Ala Arg Val Arg Gln Gly His Val Glu Gln
180 185 190
Cys Glu Cys Phe Gly Gly Arg Thr Trp Cys Glu Gly Thr Arg His Thr
195 200 205
Ala Cys Leu Ser Ser Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys His Leu Ile
210 215 220
Val Ala Thr Gly Thr Thr Val Cys Ala Cys Pro Pro Gly Phe Ala Gly
225 230 235 240
Arg Leu Cys Asn Ile Glu Pro Asp Glu Arg Cys Phe Leu Gly Asn Gly
245 250 255
Thr Gly Tyr Arg Gly Val Ala Ser Thr Ser Ala Ser Gly Leu Ser Cys
260 265 270
Leu Ala Trp Asn Ser Asp Leu Leu Tyr Gln Glu Leu His Val Asp Ser
275 280 285
Val Gly Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu Gly Pro His Ala Tyr Cys Arg
290 295 300
Asn Pro Asp Asn Asp Glu Arg Pro Trp Cys Tyr Val Val Lys Asp Ser
305 310 315 320
Ala Leu Ser Trp Glu Tyr Cys Arg Leu Glu Ala Cys Glu Ser Leu Thr
325 330 335
Arg
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<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Gln Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro Glu Pro Ala Ser
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Pro Gly Arg Gln Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys Arg Thr Phe Leu
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Arg Pro Arg
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro Gly Ser His Pro Trp Leu Ala
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Ala Ile Tyr Ile Gly Asp Ser Phe Cys Ala Gly Ser Leu Val His Thr
20 25 30
Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Ser His Ser Pro Pro Arg
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50 55 60
Asp Val Thr Gln Thr Phe Gly Ile Glu Lys Tyr Ile Pro Tyr Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Val Phe Asn Pro Ser Asp His Asp Leu Val Leu Ile Arg Leu
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100 105 110
Ile Cys Leu Pro Glu Pro Gly Ser Thr Phe Pro Ala Gly His Lys Cys
115 120 125
Gln Ile Ala Gly Trp Gly His Leu Asp Glu Asn Val Ser Gly Tyr Ser
130 135 140
Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Asp His Lys Cys
145 150 155 160
Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Pro Asn Met Leu Cys
165 170 175
Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly
180 185 190
Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly Val Ala Tyr Leu Tyr Gly Ile
195 200 205
Ile Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg Leu His Lys Pro Gly Val Tyr
210 215 220
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Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser
245
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Pro Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Arg Gly
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Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ile Pro Thr Ile Leu Val Thr Ser Val Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Gly Leu Pro Pro Pro Pro Arg Ala Val Pro Ser Ser Ser Ser Pro
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Asp Pro Cys Ala Ser Gly Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Ser
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Asn Thr Gln Asp Pro Gln Ser Tyr His Cys Ser Cys Pro Arg Ala Phe
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Phe Ala Gly Arg Leu Cys Asn Ile Glu Pro Asp Glu Arg Cys Phe Leu
275 280 285
Gly Asn Gly Thr Gly Tyr Arg Gly Val Ala Ser Thr Ser Ala Ser Gly
290 295 300
Leu Ser Cys Leu Ala Trp Asn Ser Asp Leu Leu Tyr Gln Glu Leu His
305 310 315 320
Val Asp Ser Val Gly Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu Gly Pro His Ala
325 330 335
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Arg Pro Trp Cys Tyr Val Val
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Glu Pro Ala Ser Pro Gly Arg Gln Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys
385 390 395 400
Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro
405 410 415
Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala Ile Tyr Ile Gly Asp Ser Phe Cys
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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595 600 605
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625 630 635 640
Ile Asn Asp Arg Ile Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser
645 650 655
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<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Val Gln Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro Glu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Gly Arg Gln Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys Arg Thr Phe Leu
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65 70 75 80
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165 170 175
Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Asp
180 185 190
His Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Pro Asn
195 200 205
Met Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp Ala Cys Gln Gly
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Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly Val Ala Tyr Leu
225 230 235 240
Tyr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg Leu His Lys Pro
245 250 255
Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp Ile Asn Asp Arg
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Ile Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser
275 280
<210> 17
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccactgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggac 88
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