阅读说明：本技术 淫羊藿多糖用于制备山羊***冷冻保存稀释液的应用 (Application of epimedium polysaccharide in preparation of goat semen cryopreservation diluent ) 是由 胡建宏 李宇 张利坤 张星 任发 席华明 牛统娟 韩宁 王立强 李延华 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了淫羊藿多糖用于制备山羊精液冷冻保存稀释液的应用。本发明利用淫羊藿多糖作为山羊精液的冷冻保存剂有效成分,能够在山羊精液冷冻保存过程中很好地保护精子的生理活性,包括一步稀释法和两步稀释法。尤其是,相对于现有山羊精液冷冻普遍采用两步稀释法的情况,本发明的含有淫羊藿多糖的冷冻保存剂配合一步稀释法冷冻程序即可达到冷冻保存的要求。(The invention provides application of epimedium polysaccharide in preparing goat semen cryopreservation diluent. The invention utilizes epimedium polysaccharide as the effective component of the cryopreservation agent of goat semen, can well protect the physiological activity of the sperm in the process of cryopreservation of the goat semen, and comprises a one-step dilution method and a two-step dilution method. Particularly, compared with the condition that the existing goat semen freezing generally adopts a two-step dilution method, the cryopreservation agent containing the epimedium polysaccharide can meet the requirement of cryopreservation by matching with a one-step dilution method freezing program.)

淫羊藿多糖用于制备山羊***冷冻保存稀释液的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及淫羊藿多糖用于山羊***冷冻保存稀释液及一步稀释法冷冻程序的应用。

背景技术

现有山羊***的冷冻保存技术中，相较于一步稀释法，两步稀释法的效果较为理想，但两步稀释法的程序相对复杂。

发明内容

结合现有技术的缺陷或不足，本发明提供了淫羊藿多糖用于制备山羊***冷冻保存稀释液的应用。

进一步，本发明提供了一种山羊***冷冻保存稀释液。为此，本发明提供的冷冻保存稀释液包括Tris、柠檬酸、果糖、淫羊藿多糖、抗生素和卵黄。

进一步，所述的冷冻保存稀释液中含有甘油。

可选的，所述抗生素选自青霉素和链霉素中的一种或两种的任意比例组合。

可选的，所述山羊***冷冻保存稀释液配方为：Tris 200～300mM，柠檬酸80～90mM，果糖65～75mM，卵黄15％～25％(V/V)，淫羊藿多糖1～4mg/mL，青霉素2000IU/mL，链霉素0.4g/mL，超纯水100mL。

进一步，山羊***冷冻保存稀释液配方中含有甘油4％～6％(V/V)。

可选的，所述淫羊藿多糖浓度为2.5～3.5mg/mL。

同时，本发明提供了一种山羊***冷冻保存方法。为此，所提供的方法包括：山羊***与上述包含甘油的冷冻保存稀释液等温混合稀释；接着将混合稀释液逐步降温至3～5℃，在3～5℃条件下平衡后冷冻保存。

可选的，所述混合稀释采用多步稀释法，所述多步稀释法包括经一步或多步中间浓度稀释至最终浓度。

另一种山羊***冷冻保存方法包括：山羊***与上述不含甘油的冷冻保存稀释液等温混合稀释，接着将混合稀释液逐步降温至3～5℃，在3～5℃条件下平衡后，将平衡后的混合稀释液与上述含甘油的冷冻保存稀释液等温混合稀释，继续在3～5℃条件下平衡后冷冻保存。

本发明采用淫羊藿多糖作为山羊***的冷冻保存剂有效成分，能够在山羊***冷冻保存过程中很好地保护***的生理活性，包括一步稀释法和两步稀释法。

尤其是，相对于现有山羊***冷冻普遍采用两步稀释法的情况，本发明的含有淫羊藿多糖的冷冻保存稀释液配合一步稀释法冷冻程序即可达到冷冻保存的要求。

附图说明

图1为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后活率的影响；

图2SYBR-14/PI双染色法，A：活***荧光图；B：死***荧光图；C：***质膜完整率荧光图；

图3为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后头部质膜完整率的影响；

图4为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后尾部质膜完整率的影响；

图5为实施例1山羊***冻后顶体完整率的检测，A：***顶体染色荧光图；B：***核染色荧光图；C：Merge图；

图6为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后顶体完整率的影响；

图7为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后总抗氧化能力(T-AOC)的影响；

图8为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后丙二醛(MDA)含量的影响；

图9为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后活性氧(ROS)含量的影响；

图10为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后过氧化氢酶(CAT)活性的影响；

图11为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响；

图12为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后ATP含量的影响；

图13为实施例1淫羊藿多糖对山羊***冻后线粒体膜电位的影响；

图14为实施例1山羊***冷冻保存超微结构(扫描电镜)，A-H分别是随机取样进行扫描电镜得到的山羊***冷冻保存超微结构；

图15为实施例1山羊***冷冻保存超微结构(透射电镜)，A-F分别是随机取样进行透射电镜得到的山羊***冷冻保存超微结构；

图16为实施例1与2中山羊***冻后活率的影响；

图17为实施例1与2中山羊***冻后头部质膜完整率的影响；

图18为实施例1与2中山羊***冻后尾部质膜完整率的影响；

图19为实施例1与2中山羊***冻后顶体完整率的影响。

具体实施方式

除非有特殊说明，本文中的术语根据本领域常规认识理解。

淫羊藿(Epimediumbrevicornu Maxim)又名仙灵脾、三叉凤等，首载于《神农本草经》，是一种属于小檗科的多年生草本植物，是传统补益中药，

有补肾壮阳/益精补气等功能。淫羊藿多糖是天然中药淫羊藿中最主要的活性成分，由半乳糖醛酸(GalA)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、***糖(Ara)和甘露糖(Man)组成。以下实施例中的淫羊藿多糖购自西安万方生物科技有限公司，纯度≥98％。

本发明所述一步稀释法是指将***用冷冻保存稀释液(含甘油)等温混合稀释到一定浓度，降温到3～5℃后冷冻；两步稀释法，即第一步用不含甘油的冷冻保存稀释液在30℃左右稀释到一定浓度，第二步降温到3～5℃，再用含有甘油的冷冻保存稀释液稀释后冷冻。

以下是发明人提供的采用淫羊藿多糖冷冻保存稀释液及一步稀释法和两步稀释法对山羊***进行冷冻保存的实施例。

实施例1：一步稀释法

(1)基础稀释液：Tris 300mM，柠檬酸80mM，果糖65mM，超纯水100mL，混匀，保存于4℃冰箱备用；

(2)淫羊藿多糖稀释液：共设置6组，分别在基础稀释液中添加0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL淫羊藿多糖，每个梯度设置5个重复；

(3)冷冻保存稀释液：***稀释前，在基础稀释液中添加青霉素钠2000IU/mL，硫酸链霉素0.4g/mL，卵黄15％(体积百分比，V/V)；在其基础上添加甘油，使其终浓度为4％(体积百分比，V/V)；

(4)***后，将检查合格的***按照***：冷冻保存稀释液＝1:8的比例同温稀释后，经多层纱布或毛巾包裹后，在4℃条件下平衡1.5～3h；优选的，稀释可采取多步稀释法进行，先用***和冷冻稀释液1:1稀释、摇匀，进一步再以1:3比例稀释，摇匀，使***和稀释液比例最终达到1:8；

(5)在4℃条件下，将***吸入冷冻细管中，封口，然后将封装好的细管平铺在熏蒸架上，在4℃条件下二次平衡1.5h，然后置于液氮面上方3～5cm处，熏蒸5～10min，熏蒸结束后迅速将冻精细管投入液氮内进行冷冻保存。

实施例2：两步稀释法

(1)基础稀释液：Tris 200mM，柠檬酸90mM，果糖75mM，超纯水100mL，混匀，保存于4℃冰箱备用；

(2)淫羊藿多糖稀释液：共设置6组，分别在基础稀释液中添加0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL淫羊藿多糖，每个梯度设置5个重复；

(3)冷冻稀释I液：***稀释前，在基础稀释液中添加青霉素钠2000IU/mL，硫酸链霉素0.4g/mL，卵黄25％体积百分比(V/V)；

(4)冷冻稀释II液：在***稀释I液的基础上添加甘油，使其终浓度为6％体积百分比(V/V)；

(5)将检测合格后的***按照1:4的比例加入等温冷冻稀释I液，经多层纱布或毛巾包裹后皮筋扎紧，放置于4℃条件下降温平衡1.5h；再将第一次稀释平衡后的***按照1:1的比例加入等温的冷冻稀释II液(4℃平衡后的稀释液，与***同步平衡)进一步稀释，经多层纱布或毛巾包裹后，在4℃条件下平衡1.5h；

(6)在4℃条件下，将***吸入0.25mL的冷冻细管中，封口，然后将封装好的细管平铺在熏蒸架上，置于液氮面上方3～5cm处，熏蒸5～10min，熏蒸结束后迅速将冻精细管投入液氮内进行冷冻保存。

对上述实施例的的保存效果进行如下评价：

保存两周后将冻精细管小心从液氮罐中取出，迅速投入40℃水浴中，解冻30s，用于***品质评定。

1.***活率

将冻精细管解冻后放入37℃孵育，取10μL***样品滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于37℃恒温载物台上，400×光学显微镜下观察5个视野，每个视野至少数200个***，直线运动***数与总***数量的比值为***活率。

2.顶体完整率

采用异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA)染色的方法对***进行顶体完整率检测，吸取解冻孵育后的***样品30μL均匀涂抹于干净载玻片上，待自然风干后；甲醇固定10min，然后加入30μL FITC-PNA染液，保证覆盖样品，置于37℃湿盒，避光孵育30min；孵育后使用PBS冲洗玻片三次，自然风干盖上盖玻片，用无色指甲油封片，置于荧光显微镜下观察，选择5个以上清晰视野，每个视野***数200个以上，计算***顶体完整率(全程避光操作)。

3.***头部质膜完整率

使用Live/Dead Sperm Viability Kit试剂盒对山羊***进行染色SYBR-14/PI双染色，检测***质膜完整情况，操作步骤参考试剂盒说明书，并在其基础上进一步优化试验流程。

(1)配置工作液，在试剂盒SYBR-14原始染液中加入900μL DMSO配成工作液；

(2)将置于-20℃冰箱保存的SYBR-14、PI工作液取出并置于室温解冻，将保存的***混匀，取解冻孵育后的***100μL置于PCR管中，每个抽检样品各加入0.1μL解冻完全的SYBR-14工作液，37℃下水浴10min；向抽检样品中分别加入0.5μL的PI工作液，37℃下再次水浴10min；

(3)在研究级正置荧光显微镜下对染色***的***质膜进行检测并拍照；

(4)拍照时，要求选择至少5个清晰的视野，每个视野至少包含200个***。同一视野下分别拍摄绿色荧光照片一张，红色荧光照片一张，合成后统计***质膜完整率。

注：本试验所有的操作步骤不宜在强光刺激条件下进行。

4.***尾部质膜完整率

按照0.49g柠檬酸钠、0.9g果糖，100mL双蒸水配制低渗液。采用低渗肿胀(HOST)试验进行检测***质膜完整率，取20μL解冻孵育后的***加入等温HOST低渗溶液200μL混匀，37℃孵育30min后取10μL均匀涂抹于载玻片上，在400倍光学显微镜下观察5个视野，每个视野***数200个以上，计算***弯尾率。

5.测定山羊***冻后的总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)含量、过氧化氢酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)、ATP含量、线粒体膜电位以及超微结构的变化按照试剂盒说明书进行(见附图说明)。

对上述两个实施例的的保存效果评定结果如下：

1.评定结果A

利用本发明的山羊***冷冻保存的淫羊藿多糖稀释液，其保存效果的评定结果如下：

由图1可知，淫羊藿多糖组***冻后活率显著高于对照组(P＜0.05)，最高为52.10％。

由图2可知，图2A***头部呈现绿色荧光的为质膜完整的***(即活***)，图2B***头部呈现红色荧光的为质膜破损的***(即死***)，图2C***质膜完整数占总***数的比例表示***质膜完整率。

根据图3可知，淫羊藿多糖组均能够显著提升山羊***冻后的头部质膜完整率(P＜0.05)，最高为57.01％。

由图4可知，淫羊藿多糖组***冻后尾部质膜完整率显著高于对照组(P＜0.05)，最高为52.37％。

由图5可知，图5A中红色箭头指示***头部呈现明亮而均匀的绿色荧光为顶体完整的***，白色箭头指示***头部不发绿色荧光或微弱荧光不完整的为顶体受损的***；图5B***核发明亮而均匀的蓝色荧光为***核染色示意图；图5C为***顶体荧光染色和核荧光染色的Merge图。

根据图6可知，淫羊藿多糖组均能够显著提升山羊***冻后顶体完整率(P＜0.05)，最高为52.45％。

由图7可知，淫羊藿多糖能够提高***冻后的总抗氧化能力。

由图8可知，淫羊藿多糖能够显著降低***冻后MDA含量(P＜0.05)。

由图9可知，淫羊藿多糖能够降低***冻后ROS水平。

由图10可知，淫羊藿多糖均能有效提高***冻后CAT活性。

由图11可知，淫羊藿多糖能有效提高***冻后SOD活性。

由图12可知，淫羊藿多糖能显著提高***冻后ATP水平。

由图13可知，淫羊藿多糖可有效提高***冻后高线粒体膜电位的***比率。

由图14可知，图14A为头、颈、体、尾部(主段、中段、尾端)结构完整的山羊***；图14B表示***头部顶体结构完整、边界清晰、边缘整齐；图14C中红色箭头为***头部膜破损；图14D为头颈部轻度断裂；图14E中红色箭头表示头颈部中度断裂，蓝色箭头指示头部膜表面破损；图14F中红色箭头指示头颈部严重断裂；图14G中红色箭头指示***头尾断裂，已分离；图14H中红色箭头为***尾部断裂。

由图15可知，图15A为山羊***头部质膜、顶体外膜结合完整；图15B中黑色箭头为***头部质膜破裂，部分消失；图15C黑色箭头表示质膜过度膨胀，呈大泡状。红色箭头为顶体外膜肿胀；图15D为黑色箭头只是***尾部质膜膨胀，有空泡状；图15E为***尾部横切面，由粗变细，红色箭头表示尾部末端，黑色尖头表示尾部主段，蓝色箭头指示尾部中段；图15F中黑色箭头指示***尾部质膜膨胀。

该研究结果表明，山羊***冷冻保存稀释液中添加一定浓度淫羊藿多糖能够显著提高山羊***总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性，同时降低了山羊***中ROS和MDA的含量，表现出良好的抗氧化效果。除此之外，淫羊藿多糖不仅能够提高***的抗氧化酶(SOD、CAT)活性，从而保护山羊***免受氧化损伤，为山羊***保存过程中拥有良好的微环境提供了保障，同时为山羊***冷冻保存技术应用于生产实践中奠定了坚实的基础。

2.评定结果B

利用本发明的不同稀释方法的山羊***冷冻保存的稀释液，其保存效果的评定结果如下：

由图16可知，两种稀释方法中，淫羊藿多糖的稀释液均可有效提高***冻后活率。

由图17可知，两种稀释方法中，淫羊藿多糖稀释液均可确保***冻后头部质膜完整率。

由图18可知，两种稀释方法中，淫羊藿多糖稀释液均可有效保证***冻后尾部质膜完整率。

由图19可知，两种稀释方法中，淫羊藿多糖稀释液均可提高***冻后顶体完整率。

说明本发明的山羊***稀释液可采用一步稀释法的冷冻程序对山羊***进行保存，便于冻精细管的规模化生产。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以优化和变换，而所有这些优化和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。