阅读说明：本技术 一种调节细胞因子、增强免疫功能的复合菌剂及其应用 (Complex microbial inoculant for regulating cell factors and enhancing immune function and application thereof ) 是由 焦顺昌 张文东 吴志勇 魏东 于 2020-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种调节细胞因子、增强免疫功能的复合菌剂,该复合菌剂包括一株丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1以及必要的辅剂,所述复合菌剂的使用方法：(1)丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1的种子液制备：(2)用上述复合菌剂进行发酵的方法。所述步骤(2)如下：(1)配置专用培养基,步骤如下：3％葡萄糖,2％木糖,0.5％菊粉,2％鲜沙棘果浆、2％刺梨果浆、1％覆盆子果浆、1％铁皮石斛果浆等；(2)好氧发酵：(3)获得上清液。(The invention discloses a compound microbial inoculum for regulating cell factors and enhancing immune function, which comprises Monascus pilosus (Monascus pilosus) YL-1 and necessary auxiliary agents, and a using method of the compound microbial inoculum comprises the following steps: (1) preparation of Monascus pilosus (Monascus pilosus) YL-1 seed solution: (2) a method for fermenting by using the composite microbial inoculum. The step (2) is as follows: (1) preparing a special culture medium, comprising the following steps: 3% of glucose, 2% of xylose, 0.5% of inulin, 2% of fresh sea-buckthorn fruit pulp, 2% of roxburgh rose fruit pulp, 1% of raspberry fruit pulp, 1% of dendrobium officinale fruit pulp and the like; (2) aerobic fermentation: (3) the supernatant was obtained.)

一种调节细胞因子、增强免疫功能的复合菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种调节细胞因子、增强免疫功能、治疗病毒性疾病的复合菌剂及其应用，属于微生物治疗技术领域。

背景技术

增强免疫力是指通过一定手段来使自身免疫力加强。免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)、处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。免疫力是指机体抵抗外来侵袭，维护体内环境稳定性的能力。空气中充满了各种各样的微生物：细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等等。在人体免疫力不足的情况下，它们都可以成为感早班的病原体。虽然人体对不同的病原体会产生相应的抗体，以抵御再次感染，但抗体具有专一性和时限性，比如链球菌抗体只能在较短时期内保护机体不受链球菌的再次侵犯，也并不能抵御其他病毒的感染。免疫力低下的人根本无法抵御感冒病毒的侵袭，这才是他频繁感冒的真正原因。

免疫方式有两种，分别为细胞免疫和体液免疫。在细胞免疫中，益生菌能激活巨噬细胞，它可以吞噬和杀灭多种病原微生物，同时诱导其释放两种武器----肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素6号(IL-6)。肿瘤坏死因子，顾名思义，就是对癌细胞有杀伤作用，引起肿瘤出血坏死的活性因子。白细胞介素也是很重要的免疫活性因子，它参与炎症反应，调节机体免疫功能。益生菌菌体胞外产物和细胞壁肽聚糖都具有一定免疫活性。完整细胞(或完整肽聚糖)可发挥免疫佐剂活性。但研究表明菌体细胞破碎液甚至双歧杆菌基因组DNA也能激活巨噬细胞。这就是为什么普通无活菌的酸奶也具有一定的免疫功能。益生菌也可以激活T细胞和NK细胞(Natural Killer Cell，自然杀伤细胞)，两者都能起到细胞杀伤作用，阻断入侵细胞。还有一些研究显示某些益生菌能促进脾细胞增殖，脾脏重量增加，使免疫功能增强。以及能产生其它细胞因子如白细胞介素-1，白细胞介素-10(IL-1，IL-10)或干扰素。

本发明的目的是开发一种调节细胞因子、增强免疫功能的复合菌剂及其应用，通过特定的菌剂协同作用，并对培养基进行进一步的优化，从而产生具有提高免疫力的培养物。

发明内容

本发明的目的是开发一种调节细胞因子、增强免疫功能的复合菌剂及其应用，通过特定的菌剂协同作用，并对培养基进行进一步的优化，从而产生具有提高免疫力的培养物。本发明所述复合菌剂及其发酵培养物有助于病毒性疾病的辅助治疗以及预防，也可以直接应用于食品发酵。

颜丽等在中国酿造，2020年第39卷第1期，“梁山大曲中高酯化力菌株的筛选及鉴定”中公开了一株丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1，该菌株的已知功能是高产酯类，能够提高大曲的香气和风味。该菌株从传统食品中获得，是一种安全的菌株，可用于食品发酵。本申请人承诺20年内向公众发放。

申请人研发团队在研发中发现，一般而言丛毛红曲霉的发酵液并无显著提高免疫力的作用，而丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1的发酵液却具有较为明显的提高免疫力的作用。

研发团队进一步对其发酵培养基进行优化，以期进一步提高免疫力增强的功效。本项目的主要筛选方向是从传统保健植物中进行筛选，这样安全性有保证，可刺激菌株发酵，发酵残留也可以直接食用且能增加保健效果。

经筛选，多种天然草本植物果实具有提高菌株功效的作用，但是效果并不会很显著，但是有4种果物在联合复配使用时，可以大大提高菌株的保健效果，具有显著的协同作用，分别是：沙棘、刺梨、覆盆子、铁皮石斛。

沙棘果实营养丰富，据测定其果实中含有多种维生素、脂肪酸、微量元素、亚油素、沙棘黄酮、超氧化物等活性物质和人体所需的各种氨基酸。其中维生素C含量极高，每100克果汁中，维生素C含量可达到825—1100毫克，是猕猴桃的2—3倍，素有维生素C之王的美称。含糖7.5％—10％，含酸3％—5％。沙棘叶片含粗蛋白15.75％、粗脂肪9.48％、粗纤维14.04％、无氮浸出物54.84％，用沙棘叶可制作保健茶。沙棘油中含有206种对人体有益的活性物质，其中有46种生物活性物质，含有大量的维生素E、维生素A、黄酮等，具有抗疲劳和增强机体活力及抗癌等特殊药理性能，具有保护和加速修复胃黏膜、增加肠道双歧杆菌的药性，有降减血浆胆固醇、减少血管壁中胆固醇含量的作用，能防治高血脂症和动脉粥样硬化症，并有促进伤口愈合的作用。

刺梨主要含有下列营养物质，包括：①碳水化合物：刺梨果实中礅水化合物的总量约为13％，主要成分为纤维、蔗糖、葡萄糖、果糖等。其中纤维素的含量为4％-7％，蔗糖为1.4％-3.5％，葡萄糖为0.1％-0.9％，果糖为0.6％-1.2％；②蛋白质及氨基酸：蛋白质为0.6％-0.7％；氨基酸类包括天门冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸等18种氨基酸。其中8种是人体必需氨基酸，2种是半必需氨基酸；③维生素及单宁类：主要有维生索C、维生素P、维生素B族(维生素B1、B2等)、维生素E、叶酸和胡萝卜素等多种维生素及单宁酸，其中维生素C含量较高。营养学家罗登义、宋圃菊教授检测发现，每100克刺梨果肉含维生素C2075～2725mg，是苹果的800倍、香蕉的400倍、红桔的100倍、西红柿的22倍、猕猴桃的10倍，称“维生素c大王”，雄居一切水果、蔬菜之冠；④微量元素：主簧有铁(Fe)、锌(Zn)、锶(Sr)、硒(Se)、铷(Rb)、锰(Mn)、铜(Cu)、钴(Co)、镍(Ni)、氟(F)、铝(A1)、钒(v)、硅(Si)等。其中Fe、Zn、Se、Mn、Cu、Co、Ni、F、V和Si为人体必需微量元素；⑤酶类：主要有超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶等。

覆盆子果供食用，在欧洲久经栽培，有多数栽培品种作水果用。覆盆子果实含有相当丰富的维生素A、维生素C、钙、钾、镁等营养元素以及大量纤维。每100克覆盆子，水分占87％，含蛋白质0.9克、纤维4.7克，能提供209.3千焦的热量。覆盆子能有效缓解心绞痛等心血管疾病，但有时会造成轻微的腹泻。覆盆子果实酸甜可口，有“黄金水果”的美誉。树莓含有丰富的水杨酸、酚酸等物质。水杨酸被称为“天然阿斯匹林”，广泛用于镇痛解热，抗血凝，能有效预防血栓。长期食用树莓，能有效地保护心脏，预防高血压、血管壁粥样硬化、心脑血管脆化破裂等心脑血管疾病。

经过现代科学的研究，也证明了铁皮石斛里面的石斛多糖等多种有效成分可以增加体内T细胞和B细胞的活力，从而提高身体免疫力。同时，铁皮石斛对稳定血糖、降血脂、缓解失眠和促进胃肠健康、缓解便秘、明目都有很好的效果。尤其是年轻的女性朋友常吃铁皮石斛，能有效的改善年期症状，对美容养颜、延缓衰老有明显的效果。资料引用于CNKI(中国期刊网)中的石斛相关文献。在九大仙草之中，铁皮石斛是唯一不沾地气的仙草。野生的铁皮石斛长自悬崖峭壁的石缝，或者古树之上，一旦沾到地气就会停止生长。它是吸收阳光雨露生长、却不接地气的仙草。故，仙草有比喻之意。03.不是所有的石斛，都是铁皮石斛。铁皮石斛是中国七十多种石斛中药效最佳的一种，富含的多糖及石斛碱都是其它品种石斛的数倍。

本发明首次发现丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1的的发酵液具有提高免疫力的作用，也首次发现沙棘、刺梨、覆盆子、铁皮石斛联合使用能够大大进一步显著提高免疫力。

本发明的技术方案如下：

一种调节细胞因子、增强免疫功能的复合菌剂，其特征在于：

包括一株丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1以及必要的辅剂。

丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1的种子液制备：

称取保藏的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1，接种到固体培养基中培养24小时，挑取平板中长势较好的单菌落接种至液体培养基中活化，培养24h后定量成5*10⁷(CFU/ml)丛毛红曲霉种子液。培养条件：30℃，200r/min。

固体培养基：按照重量比，1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，2％琼脂粉，其余为为水。

液体培养基：按照重量比，1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，其余为为水。

用上述复合菌剂进行发酵的方法，其步骤如下：

(1)配置专用培养基，步骤如下：按照重量比，3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，2％鲜沙棘果浆、2％刺梨果浆、1％覆盆子果浆、1％铁皮石斛果浆，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80，其余为水；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；

(2)好氧发酵：

按照2％的接种量接种活化后的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。

(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。

本发明的优点：

本发明首次发现丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1的的发酵液具有提高免疫力的作用，也首次发现沙棘、刺梨、覆盆子、铁皮石斛联合使用能够大大进一步显著提高免疫力。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的具体实施例如以下说明。

本发明所述接种量均为v/v。

实施例1：

菌种的种子液制备：

称取保藏的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1，接种到固体培养基中培养24小时，挑取平板中长势较好的单菌落接种至液体培养基中活化，培养24h后定量成5*10⁷(CFU/ml)丛毛红曲霉种子液。培养条件：30℃，200r/min。

固体培养基：按照重量比，1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，2％琼脂粉，其余为为水。

液体培养基：按照重量比，1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，其余为为水。

用上述复合菌剂进行发酵的方法，其步骤如下：

(1)配置专用培养基，步骤如下：按照重量比，3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，2％鲜沙棘果浆、2％刺梨果浆、1％覆盆子果浆、1％铁皮石斛果浆，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80，其余为水；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；

(2)好氧发酵：

按照2％的接种量接种活化后的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。

(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。

实施例2

对比例1实验方法同实施例1，但是使用另外一种毛红曲霉菌，为CGMCC3.550。

对比例2实验方法同实施例1，但是培养基不加4种果浆：

用上述复合菌剂进行发酵的方法，其步骤如下：

(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；

(2)好氧发酵：

按照2％的接种量接种活化后的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。

(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。

对比例3实验方法同实施例1，但是只加沙棘：

用上述复合菌剂进行发酵的方法，其步骤如下：

(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，2％鲜沙棘果浆、1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；

(2)好氧发酵：

按照2％的接种量接种活化后的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。

(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。

对比例4实验方法同实施例1，但是只加刺梨：

用上述复合菌剂进行发酵的方法，其步骤如下：

(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，2％刺梨果浆，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；

(2)好氧发酵：

按照2％的接种量接种活化后的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。

(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。

对比例5实验方法同实施例1，但是只加覆盆子：

用上述复合菌剂进行发酵的方法，其步骤如下：

(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％覆盆子果浆、1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；

(2)好氧发酵：

按照2％的接种量接种活化后的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。

(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。

对比例6实验方法同实施例1，但是只加铁皮石斛果浆：

用上述复合菌剂进行发酵的方法，其步骤如下：

(1)配置专用培养基，步骤如下：3％葡萄糖，2％木糖，0.5％菊粉，1％铁皮石斛果浆，1％蛋白胨，七水合硫酸镁0.05％，重质碳酸钙3％，适量吐温80；用蒸汽加热至95℃，杀菌30s密封后，冷却至室温；

(2)好氧发酵：

按照2％的接种量接种活化后的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1种子液，好氧发酵，发酵时间36h、发酵温度30℃，转速150r/min。

(3)用蒸汽加热至95℃，杀菌1min后，1000r/min离心10min，获得上清液。

实施例3：

免疫力测试

1、免疫功能低下小鼠制备和给药：选用90只SPF级雄性BALB/c小鼠，体质量18-22g，4-5周龄，随机分为9组，为实施例1组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组、对比例6组、阳性对照组、阴性对照组，每组10只。实验前小鼠适应实验室环境3天。各组小鼠给药途径方式如下：

实施例1组：灌胃实施例1上清液(100mg/kg)D1-21

对比例1组：灌胃对比例1上清液(100mg/kg)D1-21

对比例2组：灌胃对比例2上清液(100mg/kg)D1-21

对比例3组：灌胃对比例3上清液(100mg/kg)D1-21

对比例4组：灌胃对比例4上清液(100mg/kg)D1-21

对比例5组：灌胃对比例5上清液(100mg/kg)D1-21

对比例6组：灌胃对比例5上清液(100mg/kg)D1-21

阳性对照组：灌胃蒸馏水(100mg/kg)D1-21

阴性对照组：灌胃蒸馏水(100mg/kg)D1-21

在灌胃第17天(D17)，实施例1组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组、对比例6组、阳性对照组小鼠腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg)，连续5天；阴性对照组小鼠注射相同体积的生理盐水。

2、各组小鼠脾脏指数和胸腺指数检测

末次给药1h后，将小鼠处死，分离小鼠的胸腺和脾脏，剔除筋膜等组织后称质量。根据以下公式计算脾脏指数和胸腺指数：脏器指数＝脏器质量/动物体质量*100％。结果如表1所示：

表1不同组别脾脏指数和胸腺指数检测

	胸腺指数(mg/g)	脾脏指数(mg/g)
			实施例1组	1.69±0.15	4.15±0.11
对比例1组	1.29±0.17	3.28±0.30
			对比例2组	1.39±0.14	3.70±0.16
对比例3组	1.40±0.15	3.68±0.13
			对比例4组	1.38±0.10	3.71±0.14
对比例5组	1.41±0.10	3.70±0.13
			对比例6组	1.42±0.18	3.72±0.11
阳性对照组	1.21±0.15	3.23±0.13
			阴性对照组	1.88±0.15	4.61±0.11

结果显示，阴性对照组的胸腺指数和脾脏指数最高。在环磷酰胺导致免疫低下小鼠模型中，阳性对照组的胸腺指数和脾脏指数最低。对比例3效果好于对比例2组，说明单用丛毛红曲霉(Monascus pilosus)YL-1的的发酵液具有抵抗环磷酰胺导致的免疫力低下的作用，其他丛毛红曲霉效果不好，同时实施例3-6组也证实，只有沙棘、刺梨、覆盆子、铁皮石斛联合使用时候，才能够大大进一步显著提高免疫力。

3、ELISA法测定各组小鼠血清IFN-γ

在末次给药1h后,将小鼠处死,摘除眼球收集血液样品，离心收集上清液，将每个处理组均设3个复孔,并预留空白孔。加入血清和标准品,37℃反应90min洗板2次，加入IFN-γ生物素化抗体工作液,37℃反应60min，加酶结合物工作液，37℃反应60min，洗板3次，加酶结合物工作液(除空白孔外),37℃反应30min，洗板3次，TMB显色，测量OD值(450nm)，测定出小鼠血清IFN-γ水平。结果如表2所示：

表2不同组别小鼠血清IFN-γ水平检测

	IFN-γ(pg/ml)
		实施例1组	89.22±7.13
对比例1组	22.23±1.54
		对比例2组	34.23±3.41
对比例3组	36.23±4.26
		对比例4组	32.24±5.12
对比例5组	35.40±2.45
		对比例6组	36.40±2.65
阳性对照组	18.25±2.54
		阴性对照组	96.83±6.23

IFN-γ是重压而免疫调节细胞因子，其水平下降可能引起免疫因子紊乱，导致免疫功能下降结果显示，阴性对照组的IFN-γ最高。在环磷酰胺导致免疫低下小鼠模型中，阳性对照组的IFN-γ最低。对比例3效果好于对比例2组，说明单用丛毛红曲霉(Monascuspilosus)YL-1的的发酵液具有提高IFN-γ的作用，其他丛毛红曲霉效果不好，同时实施例3-6组也证实，只有沙棘、刺梨、覆盆子、铁皮石斛联合使用时候，才能够大大进一步显著提高免疫力。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例。

若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。