阅读说明：本技术 牛樟芝三萜在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用 (Application of antrodia camphorata triterpene in preparation of medicines for treating neurodegenerative diseases ) 是由 邹仙果 杨开 蔡铭 能静 王龑 孙培龙 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了牛樟芝菌丝体三萜提取物在制备治疗神经退行性疾病尤其是帕金森病药物中的应用。本发明提供了牛樟芝菌丝体三萜提取物在细胞神经保护方面的功效,为挖掘牛樟芝三萜类提取物在治疗帕金森病方面的药理作用提供一定的参考价值,为研究开发天然新型帕金森病治疗药物提供了依据。(The invention discloses an application of an antrodia camphorata mycelium triterpene extract in preparing a medicament for treating neurodegenerative diseases, in particular Parkinson's disease. The invention provides the effect of the antrodia camphorata mycelium triterpene extract on the aspect of protecting cell nerves, provides a certain reference value for excavating the pharmacological action of the antrodia camphorata triterpene extract on the aspect of treating the Parkinson disease, and provides a basis for researching and developing natural novel Parkinson disease treatment medicines.)

牛樟芝三萜在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用

(一)技术领域

本发明涉及牛樟芝菌丝体三萜提取物在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。

(二)背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种中老年常见的神经退行性疾病，是由于在中脑黑质致密部中的多巴胺(dopamine，DA)能神经元的进行性变性和缺失以及残存的DA能神经元出现α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)的聚集化所导致的。目前关于PD发生的确切机制尚不明确，但过量活性氧(ROS)引起的氧化损伤、调控DA含量关键蛋白的异常表达和α-syn积聚导致的细胞凋亡被认为是关键机制之一。

ROS是导致细胞氧化应激的重要因素，其在许多器官损害引起的细胞损伤中扮演着重要的角色，操控着细胞凋亡。

DA是参与运动、认知、情感及内分泌调节的重要神经递质，由DA能神经元合成并储存在囊泡中，通过胞裂外排的方式由神经元释放。如果该递质含量发生改变，就会影响整个多巴胺能神经系统的功能，从而引发相应疾病。酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)是负责催化氨基酸L-酪氨酸转变为二羟基苯丙氨酸(多巴)的限速酶，它和多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)是DA能神经系统通路中合成和转运DA的重要蛋白质，他们在维持突触间隙中DA含量平衡中发挥着主要作用。如果这些蛋白功能失调，则脑内DA水平就会失衡，从而引起帕金森等神经系统疾病。

α-syn的结构在正常、错误折叠及其寡聚化之间维持一种动态平衡，当这种平衡被打破，α-syn原纤维迅速聚集成大分子，形成不可溶性纤维，进一步形成路易小体以避免神经元受到更大的损害，但是α-syn的病理性积聚、沉淀，最终会导致细胞凋亡或死亡。PD的临床表现主要有运动迟缓、静止性震颤、肌肉强直和步态不稳等。

目前，临床上用于治疗PD的药物主要有左旋多巴、金刚烷胺、多巴胺受体激动剂和抗胆碱能药等。但这些药物不能减缓PD的发展进程，在治疗的同时又带来很多不良反应，限制了其临床应用。因此，寻找更为有效的治疗PD的药物或者活性成分具有非常重要的现实意义。近年来，从传统药食两用资源中寻求延缓PD发病进程的活性成分已成为研究的热点。

牛樟芝(Antrodia cinnamomea，AC)，又名“牛樟菇”、“樟菇”、“樟芝”等，属于真菌界担子菌门(Basidiomycota)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌属(Antrodia)的多年生覃菌类，是一种独特而珍贵的台湾地道的药食两用真菌，素有“森林中的红宝石”之称。牛樟芝具有多种生理活性成分，包括三萜类、多糖类、腺苷、超氧化物歧化酶(SOD)等。而其中的三萜类物质是牛樟芝的主要有效成分之一。目前关于牛樟芝三萜类物质的研究多集中于提取制备方法和工艺的优化，其生理活性的研究较少。

现有技术中，牛樟芝三萜类化合物提取制备方法较为成熟，且其具有抗肿瘤、预防酒精性肝损伤生理活性功能，鲜见其神经保护药理活性的报道。在先申请CN106692211B公开了一种牛樟芝菌丝体三萜类提取物的制备方法，该方法的优点是采用超声辅助提取结合溶剂萃取与大孔树脂纯化制备了纯度高达70％～90％的牛樟芝三萜提取物。但采用该方法得到的牛樟芝三萜提取物在神经保护方面的功效尚不清楚。

(三)

发明内容

本发明的目的是提供牛樟芝菌丝体三萜提取物在制备神经退行性疾病药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

牛樟芝菌丝体三萜提取物在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。

优选的，所述神经退行性疾病为帕金森病。

本发明提供了牛樟芝菌丝体三萜类提取物在细胞神经保护方面的功效及其作用机制，为挖掘牛樟芝三萜类提取物在治疗帕金森病方面的药理作用提供一定的参考价值，为研究开发天然新型帕金森病治疗药物提供了依据。

具体的，所述牛樟芝菌丝体三萜提取物按如下方法制得：取牛樟芝菌丝体粉末，用60％～80％乙醇水溶液超声提取1～3次，合并提取液，浓缩、冷冻干燥，得到粗提物；粗提物分散于10～20倍质量的水中得到分散液，分散液加入等体积30～60℃石油醚脱脂，所得脱脂液加入乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层减压蒸除溶剂，得到浓缩物；浓缩物加入20％～30％乙醇水溶液中，调节pH2～5，大孔吸附树脂纯化，依次用去离子水、20％～40％乙醇水溶液、60％～90％乙醇水溶液洗脱，收集60％～90％乙醇洗脱液，减压蒸除溶剂，冷冻干燥，即得所述牛樟芝菌丝体三萜提取物，其三萜纯度为70～90％。

本发明的有意效果主要体现在：本发明提供了牛樟芝菌丝体三萜提取物在细胞神经保护方面的功效，为挖掘牛樟芝三萜类提取物在治疗帕金森病方面的药理作用提供一定的参考价值，为研究开发天然新型帕金森病治疗药物提供了依据。

(四)附图说明

图1为牛樟芝三萜提取物对PC12细胞的神经保护作用机制示意图。

(五)

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

实施例中所用原料和仪器如下：

牛樟芝固体栽培菌丝体：由丽水瑞草药用真菌研究所提供；

真空干燥箱：德国宾德Binder VD23；

FS-1200型超声波细胞破碎器：上海生析仪器公司；

离心机：TD5A-WS，配NO.4转子，湖南湘仪离心机仪器有限公司；

旋转蒸发仪：R2002B，配循环水泵，上海申生科技有限公司

AB-8大孔吸附树脂：安徽三星树脂科技有限公司。

实施例1：牛樟芝菌丝体三萜提取物的获得

(1)将牛樟芝固体栽培菌丝体(由丽水瑞草药用真菌研究所提供)于50℃真空干燥、粉碎过筛至80目，称取牛樟芝菌丝体粉末50g，以料液质量比1：30加入1500g 80wt％乙醇水溶液中进行超声辅助提取，提取功率为100W，时间为40min，5000r/min离心，收集上清液，滤渣重复超声提取2次，合并各次所得上清液，在50℃、真空度0.05Mpa条件下旋转蒸发，浓缩至原体积1/5，之后冷冻干燥，得到牛樟芝三萜粗提物；

(2)取步骤(1)所得牛樟芝三萜粗提物，超声分散于300mL纯净水中，得到分散液；然后加入与所得分散液等体积的60℃石油醚进行脱脂，重复脱脂3次，得到脱脂液；接着加入与所得脱脂液等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复萃取3次，收集萃取液减压蒸除溶剂，得到浓缩物；

(3)将步骤(2)所得浓缩物加入400mL 30wt％乙醇水溶液中，原始pH为5.5，用0.1N盐酸水溶液调节pH至2.5，随后进行AB-8大孔吸附树脂柱纯化，玻璃层析柱：2.6×80cm，上样浓度20.4mg/mL，上样体积0.15倍柱体积，上样流速1.0mL/min，先分别用4倍柱体积的去离子和30wt％乙醇水溶液洗脱除杂，再用6倍柱体积的90wt％乙醇水溶液洗脱，收集90wt％乙醇洗脱液，减压蒸除溶剂，冷冻干燥，得产品牛樟芝菌丝体三萜类提取物3.9g。

经分析检测，所得产品提取率为7.8％，三萜含量为86.3％。

实施例2：

(1)于DMEM培养基中培养PC12神经细胞，将长至80％融合度的细胞接种至96孔板培养24h，300μM 6-OHDA处理细胞4h即为损伤组；1000ppm牛樟芝三萜纯化物先孵育4h，再经300μM 6-OHDA处理细胞4h即为药物组；用DMEM培养的细胞为阴性对照组。

(2)经步骤(1)处理后，采用MTT法检测细胞存活率，明确牛樟芝三萜纯化物对神经细胞的保护作用。

检测方法：处理结束后移去培养液，加入100μL含有10％的MTT培养液，在37℃培养箱中培养4小时后，移去培养液，每孔加入100μL DMSO溶解MTT结晶，在检测波长为570nm，参考波长为655nm的条件下测定吸光值，记为A。细胞存活率的表示为百分比，细胞存活率(％)＝(实验组A值-空白组A值)/(阴性对照组A值-空白组A值)。

检测结果：MTT法检测细胞存活率，与阴性对照组相比，损伤组细胞存活率为39.40％，药物组细胞存活率为55.76％。

(3)经步骤(1)处理后，采用荧光分光光度法检测ROS水平，明确牛樟芝三萜纯化物对神经细胞损伤的改善作用。

检测方法：处理结束后移去培养液，加入300μM的6-OHDA损伤4小时。加入含有DCFH-DA(20μM)的培养液避光处理1小时。用PBS清洗细胞3次，通过荧光分光光度计测定荧光强度，其激发波长为485nm，发射波长为535nm，荧光强度记为B。ROS水平(％)＝(实验组B值-空白组B值)/(阴性对照组B值-空白组B值)。

检测结果：荧光分光光度法检测ROS水平，与阴性对照组相比，损伤组ROS水平为192.01％，药物组ROS水平为144.73％。

(4)经步骤(1)处理后，采用蛋白免疫印迹法检测DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平，明确牛樟芝三萜纯化物对神经细胞保护的机制。

检测方法：BCA法测定蛋白浓度，加入6×loading buffer将蛋白样品在100℃加热5min变性，制成SDS-PAGE上样蛋白；制备5％浓缩胶和10％分离胶，每孔加入60μg上样蛋白和Marker，电泳分离(先80V、40min，再100V、60min)，结束后将胶取出，制成滤纸、胶、PVDF膜和海绵垫结构，放入200mA转膜仪中转膜12h；用5％Milk/TBST封闭1h，加入相应的一抗4℃过夜孵育，用TBST清洗PVDF膜(3次，每次5min)，然后用二抗孵育1h，TBST清洗；加入ECL化学发光液(A、B液按1:1比例混合)，避光反应30s。用ChemiDoc^TM XRS+化学发光成像仪对目的条带显影。

检测结果：与阴性对照组相比，损伤组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为25.78％、20.04％、161.21％、164.89％，药物组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为50.24％、60.21％、134.72％、141.31％。

实施例3：

细胞处理分组：于DMEM培养基中培养PC12神经细胞，损伤组为300μM6-OHDA处理细胞4h；药物组为先加100ppm牛樟芝三萜纯化物孵育4h，再经300μM 6-OHDA处理细胞4h；阴性对照组为用DMEM培养的细胞。

指标检测和结果：MTT法检测细胞存活率，与阴性对照组相比，损伤组细胞存活率为39.40％，药物组细胞存活率为64.05％；荧光分光光度法检测ROS水平，与阴性对照组相比，损伤组ROS水平为192.01％，药物组ROS水平为121.31％；蛋白免疫印迹法检测DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平，与阴性对照组相比，损伤组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为25.78％、20.04％、161.21％、164.89％，药物组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为55.21％、68.28％、125.06％、135.10％。

实施例4：

细胞处理分组：于DMEM培养基中培养PC12神经细胞，损伤组为300μM 6-OHDA处理细胞4h；药物组为先加10ppm牛樟芝三萜纯化物孵育4h，再经300μM 6-OHDA处理细胞4h；阴性对照组为用DMEM培养的细胞。

指标检测和结果：MTT法检测细胞存活率，与阴性对照组相比，损伤组细胞存活率为39.40％，药物组细胞存活率为69.23％；荧光分光光度法检测ROS水平，与阴性对照组相比，损伤组ROS水平为192.01％，药物组ROS水平为115.45％；蛋白免疫印迹法检测DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平，与阴性对照组相比，损伤组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为25.78％、20.04％、161.21％、164.89％，药物组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为59.70％、75.45％、117.79％、130.43％。

实施例5：

细胞处理分组：于DMEM培养基中培养PC12神经细胞，损伤组为300μM 6-OHDA处理细胞4h；药物组为先加1ppm牛樟芝三萜纯化物孵育4h，再经300μM 6-OHDA处理细胞4h；阴性对照组为用DMEM培养的细胞。

指标检测和结果：MTT法检测细胞存活率，与阴性对照组相比，损伤组细胞存活率为39.40％，药物组细胞存活率为79.40％；荧光分光光度法检测ROS水平，与阴性对照组相比，损伤组ROS水平为192.01％，药物组ROS水平为135.11％；蛋白免疫印迹法检测DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平，与阴性对照组相比，损伤组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为25.78％、20.04％、161.21％、164.89％，药物组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为70.01％、85.45％、109.34％、121.47％。

实施例6：

细胞处理分组：于DMEM培养基中培养PC12神经细胞，损伤组为300μM 6-OHDA处理细胞4h；药物组为先加0.1ppm牛樟芝三萜纯化物孵育4h，再经300μM 6-OHDA处理细胞4h；阴性对照组为用DMEM培养的细胞。

指标检测和结果：MTT法检测细胞存活率，与阴性对照组相比，损伤组细胞存活率为39.40％，药物组细胞存活率为78.40％；荧光分光光度法检测ROS水平，与阴性对照组相比，损伤组ROS水平为192.01％，药物组ROS水平为141.01％；蛋白免疫印迹法检测DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平，与阴性对照组相比，损伤组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为25.78％、20.04％、161.21％、164.89％，药物组DAT、TH、α-syn和caspase-3蛋白表达水平分别为65.21％、78.76％、115.23％、128.79％。

结论：通过以上实验可以看出，牛樟芝菌丝体三萜提取物可通过促进细胞存活、下调ROS引起的细胞氧化损伤、促进调控DA产生的DAT、TH关键蛋白的表达以及抑制α-syn积聚和细胞凋亡蛋白caspase 3的表达来保护PC12神经细胞。因此牛樟芝菌丝体三萜提取物可作为治疗神经退行性疾病尤其是帕金森病的天然药物，与合成药物相比，具有药效好、副作用低等优点，具有较好应用前景。