阅读说明：本技术 一种快周期油菜在油菜功能基因研究领域的应用及方法 (Application and method of fast-cycle rape in rape functional gene research field ) 是由 杨梅 杨铭浩 邓扬菲 杨峻辉 孟冬林 杨峻烨 莫从古 许兴旺 钱汇海 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物基因工程领域,具体涉及一种快周期油菜在油菜功能基因组学研究领域的应用,并进一步公开一种基于快周期甘蓝型油菜进行油菜功能基因编辑的方法以及通过化学诱变制备突变体的方法。本发明方案基于快周期油菜进行油菜功能基因突变的相关研究,具体包括油菜基因的编辑和/或油菜基因突变体的制备,基于所述生育期短且植株小的优势,可以替代拟南芥实现短周期内对油菜基因的研究。(The invention belongs to the field of plant genetic engineering, particularly relates to application of fast-cycle rape in the field of rape functional genomics research, and further discloses a method for carrying out rape functional gene editing based on fast-cycle cabbage type rape and a method for preparing mutants by chemical mutagenesis. The scheme of the invention is based on the fast-cycle rape to carry out the related research of rape functional gene mutation, particularly comprises the editing of rape gene and/or the preparation of rape gene mutant, and can replace arabidopsis thaliana to realize the research of rape gene in short cycle based on the advantages of short growth period and small plant.)

一种快周期油菜在油菜功能基因研究领域的应用及方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种快周期油菜在功能基因组学研究领域的应用，并进一步公开一种基于快周期甘蓝型油菜进行功能基因编辑的方法以及通过化学诱变制备功能基因突变体的方法。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国广泛种植的一种重要的油料作物，在我国长江流域、云贵高原和西北气候冷凉区均有大面积种植，年种植总面积约1亿亩。其基因组为AACC，染色体19对，大小约1200-1280Mb(Song Jia-Ming等，2020)，且结构复杂，同源片段较多。油菜喜冷凉，需一定时间的低温处理才能开花(通常为4-10℃)，南方秋播生育期长达200余天，西北夏播也达120天左右，且株型高大。这些生物学特性，决定了油菜在组织培养、基因诱变、基因定位、组学特别是功能基因组学等研究中，难以实现高通量培养(即在有限的时间、空间内大规模种植)。因此，在现有技术条件下，研究人员在进行油菜基因功能验证时，如果采用转基因法，从T0代至T2代需2-3年才能获得结果；即使采用基因编辑技术，从T0代至T1获得表型验证，也得1-2年。所以，为节省时间，研究人员经常不得不使用同为十字花科物种的拟南芥作为模式植物，替代油菜进行基因克隆或功能验证。这主要是因为与油菜相比，拟南芥在长日照条件下生育期短，植株矮小利于高通量培养(实验室内可大规模每年种植6代)，且基因组结构简单也利于克隆基因。

然而，随着油菜育种和基础研究的发展，以拟南芥作为替代的局限性越来越明显，这是因为:(1)拟南芥基因组小，油菜中存在很多拟南芥中没有的基因，特别是与产量或杂种优势利用相关的基因，如油菜显性核不育基因MS5(Xin Qiang等2016)，只有以油菜为供体时才能获得克隆或验证；(2)拟南芥花蕾比油菜的小，杂交试验有一定难度；(3)更重要的是，拟南芥本身是一种杂草，在大田生产实践中无直接利用价值，其阳性试验产物也就无法投入生产实践。但用油菜作基因突变、转基因或基因编辑等研究的受体时，阳性产物可能具有直接的大田推广价值。

因此，开发一种直接利用油菜进行基因功能研究的高通量方法，对于油菜基因工程领域的发展具有积极的意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用快周期甘蓝型油菜作供体在油菜功能基因组学基因编辑方面和功能基因诱变方面的应用；

本发明所要解决的第一个技术问题在于提供一种基于快周期油菜进行油菜基因编辑的方法；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于快周期油菜制备功能基因突变体的方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种快周期油菜在功能基因研究领域的应用：

所述快周期油菜为完成一个生命周期很短的一种甘蓝型油菜(Brassica napus)，其在22℃、16小时光/8小时暗培养条件下，从出苗到成熟周期仅约60天；

所述功能基因研究包括基因编辑和/或基因突变体的制备。

本发明公开了一种基于快周期油菜进行油菜基因编辑的方法，所述方法采用所述快周期油菜作为供体进行目标基因的定向编辑，外植体接种后80天左右即可收获基因编辑子代，具体包括如下步骤

(1)取所述快周期油菜的种子进行表面消毒后播种，制备得到外植体，备用；

(2)根据目标基因的序列结构，构建基因编辑载体，并转化大肠杆菌感受态细胞；

(3)将得到的大肠杆菌感受态细胞与农杆菌电击融合后，并以所得农杆菌液浸染步骤(1)中获得的外植体；

(4)将浸染过所述农杆菌液的外植体转到M1培养基中，置于22℃暗室进行共培养36-48h；

(5)将步骤(4)培养后的外植体从M1培养基转移到M2培养基中，并于22℃进行光照培养2周；

(6)将培养后的外植体转入到M3培养基中，经常规培养形成小苗；

(7)对选定的编辑位点进行测序，确定为阳性单株的小苗移栽到温室进行培养，成活后按常规苗管理，即得。

具体的，所述步骤(4)中，所述M1培养基包括如下含量的成分：MS成品粉末4.4g，蔗糖30g，D-甘露糖醇18g，2,4-二氯苯氧乙酸1mg，激动素0.3mg，Phytagel 5.5g，ddH₂O定容至1L，调节pH值5.88；高温灭菌后加入乙酰丁香酮100μmol，混合均匀。

具体的，所述步骤(5)中，所述M2培养基包括如下含量的成分：M S成品粉末4.4g，蔗糖30g，D-甘露糖醇18g，2,4-二氯苯氧乙酸1mg，激动素0.3mg，Phytagel 5.5g，ddH₂O定容至1L，调节pH值5.86；高温灭菌后加入硫代硫酸银150μl及特美汀300mg，硫酸卡那霉素25mg。

具体的，所述步骤(5)中，所述光照培养中，控制光照条件为16小时光照/8小时黑暗。

具体的，所述步骤(6)中，所述M3培养基包括如下含量的成分：MS成品粉末4.4g，蔗糖30g，Phytagel 5.5g，ddH₂O定容至1L，调节pH值5.84-5.88；高温灭菌后加入特美汀300mg。

具体的，所述步骤(6)中，控制培养时间控制在2周，即试管苗在2叶期，否则时间超过24天小苗在试管中即会开花。

具体的，所述步骤(7)中，所述培育步骤的培养条件为22℃、16小时光/8小时暗，可以不受季节限制，无需低温春化即可开花，从移栽成活至收获T1种子仅需40天左右。

本发明还公开了一种基于快周期油菜制备功能基因突变体的方法，所述方法采用所述快周期油菜作为供体，进行诱变处理，具体包括如下步骤：

(1)取所述快周期油菜的种子M0进行浸水吸胀预处理，备用；

(2)将所述快周期油菜进行诱变处理，获得快周期M1种子，备用；

(3)将所得快周期M1种子播种于培养间，筛选突变表型自交获得快周期M2种子，备用；

(4)将所述快周期M2种子继续播种于培养间，验证其突变表型是否可遗传，并收集突变株继续自交，获得M3突变株；

(5)取所述M3突变株种成家系，无分离的突变株系继续自交，即可获得纯合的M4突变体。

具体的，所述步骤(2)中，所述诱变步骤包括化学诱变和物理诱变。

具体的，所述步骤(3)、(4)、(5)中，控制培养条件为：温度22℃，光照16小时光/8小时暗，可以不受季节限制，无需低温春化即可开花，实现规模化室内培养。

本发明方案基于快周期油菜进行功能基因组学的相关研究，具体包括但不限于油菜基因的编辑和/或油菜基因突变体的制备，基于所述快周期油菜生育期短且个体较小的优势，可以替代拟南芥实现短周期内对油菜基因的研究。

本发明所述基于快周期甘蓝型油菜为供体进行基因编辑的方法，以快周期油菜替代拟南芥或传统油菜作为功能验证等试验的供体，对目标基因进行编辑，可快速获得基因功能验证结果。本发明所述基因编辑方法，虽然与普通油菜基因编辑技术相似，但从接种快周期外植体至收获T1阳性苗种子整个流程仅约80天，植株矮小所占空间很少，且不再受季节限制；而普通油菜最快80余天仅能获得试管苗，继移栽后还需低温春化处理才能开花。因此，使用快周期油菜作为供体，可以节省研究时间和培养空间，实现高通量研究，从而加快油菜基础研究进程，并且实验产物具有直接用于大田生产的潜力。

本发明所述基于快周期油菜进行制备功能基因突变体的方法，采用所述快周期油菜替代拟南芥或传统油菜作为供体，用作基础研究和育种实践的工具而进行诱变处理，可实现在室内进行规模化快速鉴定突变体，而且，重要性状相关基因经诱变获得的快周期油菜新品系，可以满足基因定位、Tilling等高通量实验需求，并且实验产物具有直接应用于育种实践的潜力。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明实施例1所述双靶点CRISPR/Cas9双元载体的结构示意图；

图2为本发明实例1中所述快周期油菜水平胶检测Fad2基因编辑苗Cas9元件检测结果。

具体实施方式

本发明下述各实施例中，所述快周期甘蓝型油菜的获得按照中国专利CN110100723A(一种快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法及其应用)中记载的方法，并选用Percival Scientific公司生产的“Percival AR-41L”型人工培养箱，该品种在人工培养箱中，播种后27天即开花(22℃，16h光/8h暗)，无需低温春化，植株高仅约50厘米，结实正常，整个生育期短至60天。

实施例1

本实施例以快周期油菜作供体用于Fad2基因编辑，创制高油酸新快周期油菜。油酸是菜籽油脂肪酸的主要成份之一，具有降“三高”(高血脂、高血糖、高血压)及预防肿瘤功能(Piccinin等，2019)，因此，高油酸(油酸含量>75％)育种是近年油菜品质育种的重要目标之一。油菜中油酸的合成由Fad2基因控制(Yang等，2012)，当野生型Fad2突变成fad2时，表现高油酸表型。本实施例以快周期油菜Fad2基因编辑过程为例，将快周期油菜A基因组上的Fad2基因定向突变为fad2，获得高油酸新快周期油菜。

本实施例所述通过基因编辑获得高油酸新快周期油菜的方法，包括如下步骤：

(1)靶位点选择

根据前人QTL定位结果表明，在甘蓝型油菜中控制油酸含量的主效QTL位于A5连锁群上，该QTL解释了89％的油酸含量表型变异(Yang等，2012)，故选取A5连锁群上的Fad2基因，使用在线软件http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/针对每个拷贝分别设计两个特异性靶位点(表1)。

表1.快周期油菜A5连锁群Fad2基因靶位点序列

注：粗体碱基标识的为PAM识别序列

(2)基因编辑载体构建与大肠杆菌感受态细胞制备

CRISPR/gRNA载体以Kan抗性pKSE401载体为骨架经过改造而获得，大小约为626bp，如图1所示。为了便于gRNA表达盒的连接，采用BsaⅠ单酶切gRNA载体。为降低假阳性克隆出现，载体设计时将gRNA区排列在U3/U6启动子区上游，中间用载体骨架隔开，设计引物时选用靠近U3/U6启动子区以及gRNA区的载体骨架序列设计上下游引物，由于延伸时间限制，未被酶切的载体不被PCR扩增(参考Xing等2014)。

操作时，以稀释100倍的gRNA靶点表达盒模板质粒pCBC-DT1T2(100ng/l，中国农业大学陈其军老师提供)为模板进行四接头引物(接头引物序列见表2，反应体系见表3)PCR扩增(程序为：94℃3min，1个反应；94℃30s，59℃30s，72℃40s，35个循环反应；72℃5min，4℃20min，1个反应),纯化回收PCR产物；同时用BsaⅠ单酶切扩增产物与CRISPR/Cas9载体，T4连接酶组装载体(反应体系见表4，反应程序：37℃5小时，50℃5分钟，80℃10分钟)。取连接反应产物5ul直接转化大肠杆菌感受态，在Kan抗性平板上筛选。U626-IDF和U629-IDR引物对扩增平板上生长的单克隆，其中扩增产物为726bp的菌落培养后送公司测序鉴定sgRNAs序列是否正确，测序引物U626-IDF和U629-IDF，具体引物序列如下：

U626-IDF:TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC；

U629-IDF:TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC；

U629-IDR:AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC

(rc:GTTGATGGATCGAAAGAAGAGGGCT)

表2 CRISPR/Cas9载体靶点接头引物

接头	方向	引物序列
			BsF	正向	ATATATGGTCTCGATTGACCGCTACGCTGCTGTCCAGTT
F0	正向	TGACCGCTACGCTGCTGTCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
			R0	反向	AACCTACGCTGCTGTCCAAGGACAATCTCTTAGTCGACTCTAC
BsR	反向	ATTATTGGTCTCGAAACCTACGCTGCTGTCCAAGGACAA

表3质粒pCBC-DT1T2为模板进行四接头引物扩增反应体系

表4载体组装的酶切-连接反应体系

成份	体积ul
		PCR片段(626-bp)	2
pHSE401	2
		10xNEB T4 Buffer	1.5
10xBSA	1.5
		BsaI(NEB)	1
T4 Ligase(NEB)/高浓度	1
		ddH2O	6
Total	15

(3)基因编辑载体转化农杆菌

将步骤(2)测序结果中包含正确sgRNAs序列的PKSE401-A5Fad2基因编辑载体(5ng/μl)转化农杆菌GV3101感受态细胞，所得菌液涂布在含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan+)，25mg/L利福平(Rifampicin，Rif+)和50mg/L硫酸庆大霉素(Gentamycinsulfate，Gen+)的LB固体培养基上培养，培养温度28℃，培养时间36小时。

选取生长出来的单克隆进行PCR鉴定，用灭菌枪头蘸取单克隆置于10μl PCR反应体系：

2XTaq Master Mix 5μl；

引物545Cas9-F：GGGACCTACCACGATCTCCT(10μmol/L)0.25μl；

引物545Cas9-R：CCCTTCTGCGTGGTCTGATT(10μmol/L)0.25μl；

ddH₂O 4.5μl。

反应程序：95℃3min，1个反应；95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环反应；72℃5min，4℃20min，1个反应。

选取扩增出产物片段长度为500bp对应的单克隆在含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan+)，25mg/L利福平(Rifampicin，Rif+)和50mg/L硫酸庆大霉素(Gentamycinsulfate，Gen+)的LB液体培养基中培养，28℃恒温摇床培养24-36小时达到OD600值为0.4-0.6，控制转速220rpm。

将培养液送测序公司测序，测序引物U626-IDF和U629-IDR,根据测序结果判断靶点sgRNAs序列是否正确。选择测序正确的PKSE401-A5Fad2载体转化农杆菌后的培养菌液500μl加入等体积的50％的灭菌甘油(纯甘油加等体积超纯水后灭菌)，上下颠倒混合均匀后置于-80℃超低温冰箱保存以待遗传转化实验使用。

(4)快周期油菜种子无菌发芽与农杆菌活化

2ml离心管最多装40粒快周期油菜种子，加入75％酒精，盖盖上下翻转，浸泡种子1min。用移液器吸掉酒精，再加入适量的50％84消毒液(市售，蒸馏水：84消毒液体积1：1)，盖盖上下翻转，浸泡种子3min。吸掉消毒液，加入适量的无菌水冲洗3-5遍，每次均盖盖上下翻转，保持离心管内为无菌环境。用无菌镊子将灭菌种子播入M0培养基，每皿10-12粒。将培养皿放到无菌培养盒中，置暗光24℃下培养6天(可放入纸盒在光照培养室培养)。

快周期油菜播种5天后，即准备农杆菌活化。准备50ml灭菌玻璃培养瓶，吸取10μL含有前述所得正确载体的农杆菌液置于5ml含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan+)，25mg/L利福平(Rifampicin，Rif+)和50mg/L硫酸庆大霉素(Gentamycin sulfate，Gen+)的LB液体培养基中，28℃恒温摇床培养14-18小时，利用分光光度计NanoDrop One测定OD600值为0.4备用。

(5)快周期油菜外植体遗传转化

吸取2ml上述步骤(4)活化好的农杆菌菌液到无菌离心管中，3000rpm离心3min，去除上清，加入1.5mlDM培养基垂悬菌液，3000rpm离心3min，去除上清，再加入1.5ml DM培养基垂悬菌液，置于4℃。将无菌剪刀剪取步骤(4)第6天发芽幼苗下胚轴(也可以用子叶)到无菌的培养皿中，每个外植体长度为0.8-1.0cm，每皿放置大约150-200个外植体。倒入刚才准备好的1.5ml DM培养基垂悬的菌液，补充20ml DM液体培养基，浸染10-15min，用移液器每5min轻轻吹打浸染培养基，保证每一个外植体两端切口处与农杆菌菌液充分接触。当浸染8min时开始用移液器吸出DM菌液，用无菌镊子将外植体转移到无菌滤纸上放置片刻，吸走外植体上多余的菌液。将浸染过菌液的外植体转到M1培养基中进行共培养(24℃暗，36-48小时)。

所述DM培养基(1L)组分成分及浓度为：MS成品粉末(Murashige&Skoog mediumincluding vitamins，Duchefa Biochemie company)4.4g，蔗糖3g，ddH₂O定容至1L，调节pH值5.86；高温灭菌温度降低至37℃加入AS(4′-羟基-3′,5′-二甲氧基苯乙酮、乙酰丁香酮，Sigma-Aldrich，母液100μmol/ml)1ml，混合均匀后置于4℃展示柜保存。

所述M1培养基(1L)组分成分及浓度为：MS成品粉末(Murashige&Skoog mediumincluding vitamins，Duchefa Biochemie company)4.4g，蔗糖30g，D-甘露糖醇(D-Mannitol，Sigma-Aldrich)18g，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，Sigma-Aldrich，母液1mg/ml)1ml，激动素(Kinetin，Sigma-Aldrich，母液0.3mg/ml)1ml，Phytagel(BioReagent，plant cell culture tested，Sigma-Aldrich)5.5g，ddH₂O定容至1L，调节pH值5.88；高温灭菌后待培养基温度降低至50℃加入AS(4′-羟基-3′,5′-二甲氧基苯乙酮、乙酰丁香酮，Sigma-Aldrich，母液100μmol/ml)1ml，混合均匀后分装到直径90cm的玻璃培养皿中。

(6)快周期油菜外植体诱导芽点

将步骤(5)共培养36-48小时后的外植体从M1培养基转移到M2培养基中，在光照培养室中培养2周(22℃，16h光照/8h黑暗)。由于本发明的快周期油菜外植体极易分化成苗，接种后2周即可形成幼芽，省却普通油菜反复继代步骤。

所述M2培养基(1L)组分成分及浓度：MS成品粉末(Murashige&Skoogmediumincluding vitamins，Duchefa Biochemie company)4.4g，蔗糖30g，D-甘露糖醇(DMannitol，Sigma-Aldrich)18g，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，Sigma-Aldrich，母液1mg/ml)1ml，激动素(Kinetin，Sigma-Aldrich，母液0.3mg/ml)1ml，Phytagel(BioReagent，plant cell culture tested，Sigma-Aldrich)5.5g，ddH₂O定容至1L，调节pH值5.86；高温灭菌后待培养基温度降低至50℃加入STS(硫代硫酸银，[Ag(SO3)₂]^2-)150μl，特美汀，新型革兰氏阴性菌抗生素，Timentin，Acmec，母液200mg/ml)1.5ml，硫酸卡那霉素(Kanamycin sulfate，上海生工，母液50mg/ml)500μl。其中，STS配制方法为：0.1mol/L五水硫代硫酸钠和0.1mol/L硝酸银按照4：1体积比配制，将硝酸银溶液非常缓慢地倒入五水硫代硫酸钠溶液中，注意边倒边迅速搅拌。

(7)快周期油菜外植体再生

将步骤(6)获得的具有完整生长点的绿芽转入到M3培养基中生根成苗，直至两叶期(22℃，16h光照/8h黑暗)。因快周期油菜无需低温春化即可开花，2叶期时肉眼即可见幼蕾，所以建议小苗在培养基上生长不应超过3叶期，即培养不超过14天，否则苗龄稍大就会在培养瓶内开花，而开花株在瓶内不能结实。

所述M3培养基(1L体积)的组分及浓度为：MS成品粉末(Murashige&Skoog mediumincluding vitamins，品牌Duchefa Biochemie company)4.4g，蔗糖30g，Phytagel(BioReagent，plant cell culture tested，品牌Sigma-Aldrich)5.5g，ddH₂O定容至1L，调节pH值5.84-5.88；高温灭菌温度降低至50℃加入特美汀(新型革兰氏阴性菌抗生素，Timentin，品牌Acmec，母液200mg/ml)1.5ml。

(8)试管苗移栽管理、阳性苗鉴定与靶位点检测

将步骤(7)获得的幼苗移栽入穴盘，成活后温室中种植约2周即可开花(22℃，16h光照/8h黑暗，自然光不足时用生长灯补光)。用1.5ml离心管夹取叶片，提取DNA作模板，用载体特异Cas9引物(同步骤(3)中Cas9引物)，进行扩增后用琼脂糖凝胶电泳进行检测，pKSE401-A5Fad2载体转化快周期油菜所得植株水平胶检测阳性苗Cas9元件，检测结果见附图2所示。其中，转化快周期植株命名为FF，共24个泳道，FF3和FF21为阳性；Ne CK1：阴性快周期植株；Ne CK2：阴性对照品种Westar；质粒：pKSE401-A5Fad2。

拔去阴性苗，保留阳性苗，开花后套上透明的小硫酸钠纸袋自交，成熟后收获种子，即获得T1代快周期油菜。由于快周期油菜无需低温即可开花，因此温室栽培时应省去低温春化程序，且不必考虑季节限制。温室温度一直保持22℃，光照保持16小时光/8小时暗，可在自然光基础上补光。从3叶期移栽成活至成熟约40天。

以阳性单株的基因组DNA为模板，采用HY267和HY268引物组合进行第一轮PCR扩增，扩增产物送公司测序(测序引物A5Fad2CE)。

PCR反应程序：94℃3min，1个反应；94℃30s，59℃30s，72℃40s，此步35个循环反应；72℃10min，4℃20min，1个反应。

通过初步产物测序，检测靶位点附近是否存在杂峰。将存在杂峰的单株对应的PCR产物进行T-A克隆实验(pMD^TM18-T载体，takara公司生产，操作参考试剂盒说明书)并再测序，对A5Fad2靶位点TA克隆的引物组合为A5Fad2-TA-F和A5Fad2-TA-R，涉及的引物序列信息见表5所示。

表5靶位点扩增所用引物

Primers	Direction	Sequences of primers(5’-3’)
			HY267	forward	CAGGATCCATGGGCGCAGGTGGAAGAAT
HY268	reverse	CAGAGCTCTCATAACTTATTGTTGTACCAG
			A5Fad2CE	forward	TTCAGTTCACTCTCGGCAGC
A5Fad2-TA-F	forward	TTCAGTTCACTCTCGGCAGC
			A5Fad2-TA-R	reverse	GCGTGTCCGTGATATTGTGG

将测序结果与野生型快周期油菜(T0代，即未经基因编辑的野生型快周期油菜)A5Fad2序列进行比对，即可确定靶位点编辑类型。

可见，本发明方案以快周期油菜为供体，可以替代拟南芥实现快速的基因编辑及改造研究，并更加准确的表征油菜的基因功能。

实施例2

本实施例以快周期油菜作供体进行EMS化学诱变，以获得油菜基因突变体。在油菜功能基因组学研究或育种时，经常需要创制各种突变体，物理诱变(如⁶⁰Co-γ射线等)或化学诱变(如EMS等)是常用的处理方式。采用传统油菜，诱变虽然比较简单，但诱变后代的处理却非常麻烦，需要耗费较多的土地资源用于田间种植，受季节限制，且单株间表型差异难以判断是由基因变异引起还是由环境差异引起。但是，如果采用快周期油菜作供体，由于其单株小型化，且无需春化，60天即可收获一个世代，因此能在实验室可控条件下实现规模种植(即高通量种植)，不再受季节限制，且能最大程度上消除环境影响，利于发现突变表型。

本实施例中，各步骤涉及的培养盘中使用培养土成分包括加拿大进口“发发得”1号种植介质(体积比为泥炭：蛭石：珍珠岩＝214：70：100)，用“虹越”牌“20-20-20”型园艺专用肥(1g/L)作为底肥浸透即可。

本实施例以快周期油菜种子EMS(Ethylmethame sulfonate，甲基磺酸乙酯)处理为例，阐明诱变及后代的处理过程，具体包括如下步骤：

(1)取快周期油菜种子(记为M0代)装入纱网袋，置于内盛蒸馏水的烧杯中，在室温(20℃)下浸泡8h，浸泡的目的在于提高细胞膜的透性，加快种子对诱变剂的吸收速度，备用。

(2)淋干M0种子，浸入用pH7.0磷酸缓冲液(PBS)配制的3‰浓度的EMS溶液12h，处理过程中经常搅拌，使处理液与种子充分接触；12小时后立刻用流水冲洗M1种子12h，清除残留在种子上的药物(处理后的种子记为M1)；需要注意的是，EMS溶液的配置及使用均应在通风橱中进行，而且操作人员必须戴防毒面具。

(3)M1种子稍加控干，不相互粘连即可，每3粒一穴点播于营养盘。M0种子每穴1粒点播种于营养盘，作为对照(CK)，种10株即可。播种时行距3cm，株距3cm，培养条件均为16小时光/8小时暗，温度22℃。播种后置实验室培养间的培养架上，出苗后，每穴出苗超过1株的，用剪刀剪掉多余的小苗。收获前注意经常观察表型，可与对照比较。观察到表型变异的M1单株，挂上标签，编号，播种27天开花后罩上透明的小硫酸钠纸袋防止串粉。播种时行距3cm，株距3cm，培养条件均为16小时光/8小时暗，温度22℃。表型变异单株用一次性竹筷固定，以防倒伏，成熟后收获M1所结种子，即为M2代；需要注意的是，由于EMS诱变可能造成种子活力降低，因此每穴放3粒种子以尽量保证不缺苗。

(4)M2和M0种子每穴一粒分别点播于营养盘，M2点播应保证一定的群体规模，M0作为CK种10株即可；播种时行距3cm，株距3cm，培养条件均为16小时光/8小时暗，温度22℃。与CK比较，根据M1代突变表型记录，观察M2群体中是否出现同样变异表型的单株。若有，则表明这种突变可遗传，调查M2群体野生型：突变型分离比，确定遗传规律，且将突变型按单株继续套小透明硫酸钠纸袋自交纯化，成熟时收获M3；若无同样变异出现，则表明M1为生理性变异，不可遗传，予以淘汰。

(5)M3和M0种子每穴一粒分别点播于营养盘，M0作为CK种10株即可。播种时行距3cm，株距3cm，培养条件均为16小时光/8小时暗，温度22℃。与CK比较，选择M3家系不再分离出野生型的单株，自交即可获得纯合的M4新突变型快周期油菜。理论上这种突变体与M0野生型遗传背景高度一致，是基因功能与表型关联验证的极佳遗传材料。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。